DE102005052752A1 - Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft Vorrichtungen und Verfahren zum Nachweis von spezifischen Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen. DOLLAR A Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von Targets, umfassend die folgenden Schritte: DOLLAR A a) Einbringen einer Probe, enthaltend Targets, in eine Reaktionskammer, die zwischen einer ersten Fläche der Vorrichtung und einer zweiten Fläche einer Vorrichtung, die bevorzugt der ersten Fläche gegenüberliegt, gebildet ist, wobei der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche veränderbar ist; DOLLAR A b) Detektieren der Targets. DOLLAR A Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen, umfassend eine Reaktionskammer, die zwischen einer ersten Fläche der Vorrichtung und einer zweiten Fläche der Vorrichtung, die der ersten Fläche gegenüberliegt, gebildet ist, wobei der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche veränderbar ist und Sondenmoleküle in der Reaktionskammer auf der ersten Fläche immobilisiert sind. DOLLAR A Daneben betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen, enthaltend eine Reaktionskammer, die zwischen einer ersten Fläche der Vorrichtung und einer zweiten Fläche der Vorrichtung, die der ersten Fläche gegenüberliegt, gebildet ist, wobei der Abstand zwischen ...

Description

  • Die Erfindung betrifft Vorrichtungen und Verfahren zum Nachweis Targets.
  • Biomedizinische Tests basieren häufig auf dem Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einem Molekül, das in bekannter Menge und Position vorhanden ist (der molekularen Sonde) und einem nachzuweisenden, unbekannten Molekül bzw. nachzuweisenden, unbekannten Molekülen (den molekularen Ziel- oder Targetmolekülen). Bei modernen Tests sind die Sonden in Form einer Substanzbibliothek auf Trägern, den so genannten Microarrays oder Mikroarrays oder Chips abgelegt, so dass eine Probe parallel an mehreren Sonden gleichzeitig analysiert werden kann (siehe z.B. D. J. Lockhart, E. A. Winzeler, Genomics, gene expression and DNA arrays; Nature 2000, 405, 827-836). Für die Herstellung der Microarrays werden die Sonden dabei üblicherweise in vorgegebener Art und Weise auf einer geeigneten, beispielsweise in WO 00/12575 beschriebenen Matrix immobilisiert (siehe z.B. US 5,412,087 , WO 98/36827) bzw. synthetisch erzeugt (siehe z.B. US 5,143,854 ).
  • Voraussetzung für die Bindung eines beispielsweise mit einer Fluoreszenzgruppe markierten Targetmoleküls in Form eines DNA- oder RNA-Moleküls an eine Nukleinsäuresonde des Mikroarrays ist, dass sowohl Targetmolekül als auch Sondenmolekül in Form einer einzelsträngigen Nukleinsäure vorliegen. Nur zwischen solchen Molekülen kann eine effiziente und spezifische Hybridisierung stattfinden. Einzelsträngige Nukleinsäureziel- und Nukleinsäuresondenmoleküle erhält man in der Regel durch Hitzedenaturierung und optimale Wahl von Parametern wie Temperatur, Ionenstärke und Konzentration helixdestabilisierender Moleküle. Somit wird gewährleistet, dass nur Sonden mit nahezu perfekt komplementären, d.h. einander entsprechenden Sequenzen mit der Zielsequenz gepaart bleiben (A.A. Leitch, T. Schwarzacher, D. Jackson, I. J. Leitch, 1994, In vitro Hybridisierung, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin/Oxford).
  • Ein typisches Beispiel für die Verwendung von Mikroarrays in biologischen Testverfahren ist der Nachweis von Mikroorganismen in Proben in der biomedizinischen Diagnostik. Dabei macht man sich die Tatsache zunutze, dass die Gene für ribosomale RNA (rRNA) ubiquitär verbreitet sind und über Sequenzabschnitte verfügen, die für die jeweilige Spezies charakteristisch sind. Diese Spezies-charakteristischen Sequenzen werden in Form von einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden auf ein Mikroarray aufgebracht. Die zu untersuchenden Target-DNA-Moleküle werden zunächst aus der zu untersuchenden Probe isoliert und mit Markern, beispielsweise fluoreszierenden Markern versehen. Anschließend werden die markierten Target-DNA-Moleküle in einer Lösung mit den auf dem Mikroarray aufgebrachten Sonden inkubiert, unspezifisch auftretende Wechselwirkungen werden durch entsprechende Waschschritte entfernt und spezifische Wechselwirkungen durch fluoreszenzoptische Auswertung nachgewiesen. Auf diese Art und Weise ist es möglich, mit einem einzigen Test in einer Probe gleichzeitig z.B. mehrere Mikroorganismen nachzuweisen. Die Anzahl der nachweisbaren Mikroorganismen hängt bei diesem Testverfahren theoretisch nur von der Anzahl der spezifischen Sonden ab, die auf dem Mikroarray aufgebracht worden sind.
  • Der Einsatz von Mikroarrays bzw. Sonden-Arrays ist dabei nicht auf den Nachweis Target-Sonden-Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuremolekülen beschränkt. Bei Targets kann es sich z.B. auch um Proteine handeln, die mittels spezifischer als Sonden fungierenden Antikörpern nachgewiesen werden. In gleicher Weise können Interaktionen zwischen einem Protein und niedermolekularen chemischen Verbindungen identifiziert werden, wenn das Protein als Target und die chemischen Verbindungen, bei denen es sich z.B. um eine Substanzbibliothek handeln kann, als Sonden auf dem Array immobilisiert sind.
  • Targets können auch mit Hilfe von herkömmlichen Immoassays (bspw. Elisas) analysiert werden. Bspw. können Antikörper auf dem Boden eines Wells einer Mikrotiterplatte immobilisiert werden. In dieses Well wird anschließend eine zu analysierende Blutprobe gegeben. Ist das entsprechende Antigen in der Blutprobe vorhanden, wird es an den immbilisierten Antikörper binden und kann dann bspw. über einen zweiten Antikörper, der eine Fluoreszenzmarkierung trägt nachgewiesen werden.
  • Wenn Zellen als Targets nachgewiesen werden sollen oder aber bspw. die Präsenz bestimmter Antigene auf der Oberfläche von Zellen analysiert werden soll, kommen häufig zytometrische Verfahren zum Einsatz. Diese Verfahren basieren üblicherweise darauf, dass zu der zu analysierenden Probe entsprechende bspw. fluoreszenzmarkierte Antikörper hinzugegeben werden. Diese Antikörper binden dann an der Oberfläche de Zellen bzw. an den dort präsentierten Antigenen. Die so behandelte Probe wird anschließend in einer geeigenten Vorrichtung und in einer geeigneten Lösung durch eine entsprechende Kapillare geleitet. Neben der Kapillare ist ein Detektor angeordnet, der detektiert, wie oft in einem bestimmten Zeitraum durch eine vorbeifließende markierte Zelle ein Signal ausgelöst wird. Aus der Flussgeschwindigkeit und den gezählten Signalen lässt sich dann mehr oder weniger genau die Anzahl der gesuchten Zellen je Volumeneinheit ermitteln. Apparaturen für derartige Zwecke sind aufwändig in der Herstellung und im Betrieb. Abgesehen davon sind die etablierten Verfahren vor allem bei geringen Zellzahlen relativ ungenau und störanfällig. Außerdem müssen die zu analysierenden Zellen aufwändig von ungebundenen Nachweisreagenzien abgetrennt werden.
  • Zur Detektion molekularer Wechselwirkungen mit Hilfe von Mikroarrays bzw. Sonden-Arrays auf festen Oberflächen sind eine Reihe von Methoden und technischen Systemen beschrieben, von denen einige auch kommerziell erhältlich sind.
  • Klassische Systeme zur Detektion molekularer Wechselwirkungen beruhen auf dem Vergleich der Fluoreszenzintensitäten spektral selektiv angeregter, mit Fluorophoren markierter Targetmoleküle. Fluoreszenz ist die Eigenschaft von bestimmten Molekülen, bei Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge selber Licht zu emittieren. Dabei ergibt sich ein charakteristisches Absorptions- und Emissionsverhalten. Bei der Analyse wird mit steigender markierter Moleküldichte auf der funktionalisierten Oberfläche, z.B. durch steigende Effizienz der molekularen Wechselwirkung zwischen Target- und Sondenmolekülen, eine proportionale Zunahme des Fluoreszenzsignals angenommen.
  • Die insbesondere quantitative Detektion von Fluoreszenzsignalen wird mit modifizierten Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie vorgenommen. Dabei wird das Licht der Absorptionswellenlänge von dem der Emissionswellenlänge mittels Filter oder Dichroiten getrennt und das Messsignal mittels optischer Elemente wie Objektiven und Linsen auf geeignete Detek toren wie z.B. zweidimensionale CCD-Arrays bildgebend abgebildet. Die Analyse erfolgt im Allgemeinen durch digitale Bildverarbeitung.
  • Bislang bekannte technische Lösungen unterscheiden sich hinsichtlich ihres optischen Aufbaus und der verwendeten Komponenten. Probleme und Limitationen können resultieren aus dem Signalrauschen (dem Hintergrund), das durch Effekte wie Bleichen und Quenching der verwendeten Farbstoffe, Autofluoreszenz der Medien, Assemblierungselemente und optischen Komponenten sowie Streuungen, Reflexionen und Fremdlicht im optischen Aufbau wesentlich bestimmt wird.
  • Daraus resultiert ein hoher technischer Aufwand zum Aufbau hochsensitiver Fluoreszenz-Detektoren zum qualitativen und quantitativen Vergleich von Sonden-Arrays. Insbesondere zum Screening mit mittleren und hohen Durchsätzen sind speziell angepasste Detektionssysteme erforderlich, die einen gewissen Automatisierungsgrad besitzen.
  • Zur Optimierung von Standardepifluoreszenz-Aufbauten zum Auslesen molekularer Arrays sind CCD-basierte Detektoren bekannt, die zur Diskriminierung von optischen Effekten wie Streuung und Reflexionen die Anregung der Fluorophore im Dunkelfeld durch Auflicht oder Durchlicht realisieren (siehe z.B. C. E. Hooper et al., Quantitative Photon Imaging in the Life Sciences Using Intensified CCD Cameras, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence (1990), S. 337-344). Die Abbildung der Arrays erfolgt dabei entweder in einer Belichtung oder durch ein Rastern unter Verwendung von höher auflösender Optik. Die Verwendung von multispektralen Belichtungsquellen ermöglicht einen relativ einfachen Zugang zu verschiedenen Fluorophoren durch die Verwendung verschiedener Anregungsfilter (-kombinationen). Nachteilig ist allerdings, dass Autofluoreszenz und systembedingte optische Effekte wie die Beleuchtungshomogenität über dem Array komplizierte Beleuchtungsoptiken und Filtersysteme erfordern.
  • Weitere Methoden zur quantitativen Detektion von Fluoreszenzsignalen basieren auf der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie. Beispielsweise in US 5,304,810 beschriebene konfokale Scanning-Systeme beruhen auf der Selektion der Fluoreszenzsignale entlang der optischen Achse mittels zweier Pinholes. Daraus ergibt sich ein hoher Justieraufwand der Proben bzw. die Etablierung eines leistungsfähigen Autofokussystems. Solche Systeme sind in der technischen Lösung hochkomplex. Erforderliche Komponenten wie Laser, Pinholes, gegebenenfalls gekühlte Detektoren wie z.B. PMT, Avalanche-Dioden oder CCD, komplexe hochgenaue mechanische Translationselemente und Optiken müssen mit erheblichem Aufwand aufeinander optimiert und integriert werden (siehe z.B. US 5,459,325 ; US 5,192,980 ; US 5,834,758 ). Miniaturisierungsgrad und Preis sind durch die Vielzahl und Funktionalität der Komponenten limitiert.
  • Analysen basierend auf Sonden-Arrays werden zum derzeitigen Zeitpunkt in der Regel fluoreszenzoptisch ausgelesen (siehe z.B. A. Marshall und J. Hodgson, DNA Chips: An array of possibilities, Nature Biotechnology, 16, 1998, 27-31; G. Ramsay, DNA Chips: State of the Art, Nature Biotechnology, 16, Jan. 1998, 40-44). Nachteilig an den vorstehend beschriebenen Detektionsvorrichtungen und -verfahren ist jedoch der hohe Signalhintergrund, der zu einer eingeschränkten Genauigkeit führt, der teilweise erhebliche technische Aufwand sowie die hohen Kosten, die mit den Nachweisverfahren verbunden sind.
  • Es sind eine Reihe insbesondere konfokaler Systeme bekannt, die für die Detektion von niederintegrierten Substanzbibliotheken im Array-Format geeignet sind, die in fluidischen Kammern angebracht sind (siehe z.B. US 5,324,633 , US 6,027,880 , US 5,585,639 , WO 00/12759).
  • Zur Detektion von hochintegrierten molekularen Arrays, die insbesondere in fluidischen Systemen angebracht sind, sind die oben beschriebenen Methoden und Systeme vor allem wegen der dort auftretenden Streuungen, Reflexionen und optischen Aberrationen allerdings nur sehr bedingt adaptierbar. Ferner werden bei derartigen hochintegrierten Arrays hohe Anforderungen hinsichtlich der räumlichen Auflösung gestellt, die jedoch bislang technisch nicht realisiert werden konnten.
  • Es besteht folglich ein Bedarf an Vorrichtungen, mit denen mit relativ geringem technischem Aufwand die Wechselwirkung zwischen Sonden und Targets mit hoher Genauigkeit qualitativ und/oder quantitativ nachgewiesen werden kann.
  • Die Erhöhung der Selektivität und der Zugang zu alternativen Komponenten motiviert die Etablierung alternativer Imaging-Technologien wie Fluoreszenz-Polarisation und zeitaufgelöste Fluoreszenz für festkörpergebundene Assays. Der Effekt der Verdrehung der Polarisationsachse durch polarisiert angeregte Fluorophore wird zur Quantifizierung im Mikrotiter-Format angewandt. Es gibt ferner Ansätze, durch die Verwendung entsprechend modifizierter Polymerfolien als Polarisationsfilter kostengünstige Systeme mit hohem Durchsatz (HTS-Systeme) aufzubauen (siehe I. Gryczcynski et al., Polarisation sensing with visual detection, Anal. Chem. 1999, 71, 1241-1251).
  • Neuere Entwicklungen nutzen die Fluoreszenz von anorganischen Materialien, wie zum Beispiel von Lanthaniden (M. Kwiatowski et al., Solid-phase synthesis of chelate-labelled oligonucleotides: application in triple-color ligase-mediated gene analysis, Nucleic Acids Research, 1994, 22, 13) und Quantendots (M. P. Bruchez et. al., Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels, Science 1998, 281, 2013). Farbstoffe mit langer Emissionsdauer im Mikrosekunden-Bereich wie Lanthanid-Gelate erfordern eine Umwandlung der Farbstoffe in eine mobile Phase, so dass eine ortsaufgelöste Detektion nicht möglich ist.
  • In der internationalen Patentanmeldung WO 00/72018 sind optische Aufbauten zur Detektion von mittels Goldbeads markierten Proben und deren Sichtbarmachung mittels Silber verstärkung beschrieben. Die dortigen Vorrichtungen sind allerdings lediglich für eine Detektion bei statischer Messung geeignet. Bei der statischen Messung wird nach der Wechselwirkung der Targets mit dem auf dem Sondenarray angeordneten Sonden sowie nach Beginn der Reaktion, die zu einem Niederschlag auf Array-Elementen führt, an denen eine Wechselwirkung stattgefunden hat, ein Bild aufgenommen und den gemessenen, von dem Grad der Niederschlagsbildung abhängigen Grauwerten Konzentrationen zugeordnet.
  • In WO 02/02810 wurde ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von Targets in einer Probe durch molekulare Wechselwirkungen zwischen Sonden und Targets auf Sonden-Arrays bereitgestellt, bei dem der zeitliche Verlauf der Niederschlagsbildung an den Array-Elementen in Form von Signalintensitäten detektiert wird, d.h. eine dynamische Messung durchgeführt wird. Jedem Array-Element wird dann anhand einer Kurvenfunktion, die die Niederschlagsbildung als Funktion der Zeit beschreibt, ein Wert zugeordnet, der die Wechselwirkung zwischen Sonde und Target auf einem Array-Element und damit die Menge an gebundenen Targets quantifiziert.
  • Für eine derartige dynamische Messung ist die Aufnahme von Bilderserien unter z.B. bestimmten thermischen Bedingungen bzw. in einem bestimmten Verfahrensstadium, z.B. bei Vorhandensein bestimmter Lösungen zur Zeit der Aufnahme, erforderlich. Dies bedingt ein komplexes Zusammenwirken der einzelnen Bauteile eines hochintegrierten Arrays insbesondere bei Anwendungen im Bereich des Genotyping.
  • Bei vielen Tests in der biomedizinischen Diagnostik tritt ferner das Problem auf, dass die Targetmoleküle zunächst nicht in einer für eine Detektion ausreichenden Menge vorhanden sind und deshalb häufig zunächst vor dem eigentlichen Testverfahren aus der Probe vervielfältigt werden müssen. Die Vervielfältigung von DNA-Molekülen geschieht typischerweise durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Für die Vervielfältigung von RNA müssen die RNA-Moleküle durch reverse Transkription in entsprechend komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt werden. Diese cDNA kann dann ebenfalls durch PCR vervielfältigt (amplifiziert) werden. Bei der PCR handelt es sich um eine Labor-Standardmethode (wie z.B. in Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • Die Vervielfältigung von DNA durch PCR ist verhältnismäßig schnell, ermöglicht durch miniaturisierte Verfahren einen hohen Probendurchsatz in geringen Ansatzvolumina und ist durch Automatisierung arbeitseffizient.
  • Eine Charakterisierung von Nukleinsäuren durch eine alleinige Vervielfältigung ist jedoch nicht möglich. Vielmehr ist es notwendig, nach der Amplifikation Analysemethoden wie Nukleinsäuresequenzbestimmungen, Hybridisierung und/oder elektrophoretische Trenn- und Isolationsverfahren zur Charakterisierung der PCR-Produkte einzusetzen.
  • Generell sollten Vorrichtungen und Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren und deren Nachweis so konzipiert sein, dass möglichst wenige Eingriffe seitens eines Experimentators notwendig sind. Die Vorteile von Verfahren, die eine Vervielfältigung von Nukleinsäuren und deren Nachweis ermöglichen und in deren Verlauf ein Experimentator nur minimal eingreifen muss, liegen auf der Hand. Zum einen werden Kontaminationen vermieden. Zum anderen ist die Reproduzierbarkeit solcher Verfahren wesentlich erhöht, da sie einer Automatisierung zugänglich sind. Dies ist auch im Hinblick auf die arzneimittelrechtliche Zulassung von diagnostischen Verfahren extrem wichtig.
  • Es gibt gegenwärtig eine Vielzahl von Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren und deren Nachweis, bei denen zunächst das Target-Material durch PCR-Amplifikation vervielfältigt wird und die Identität bzw. der genetische Zustand der Zielsequenzen anschließend durch Hybridisierung gegen einen Sondenarray bestimmt wird. Die Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäure- bzw. Target-Moleküle ist in der Regel notwendig, um ausreichende Mengen für einen qualitativen und quantitativen Nachweis im Rahmen der Hybridisierung zur Verfügung zu haben.
  • Sowohl die PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren als auch deren Nachweis durch Hybridisierung ist einer Reihe von grundlegenden Problemen unterworfen. Dies gilt in gleicher Weise für Verfahren, die eine PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren und deren Nachweis durch Hybridisierung kombinieren.
  • Werden in einem Verfahren, das eine PCR-Amplifikation und deren Nachweis durch Hybridisierung kombiniert, detektierbare Marker beispielsweise in Form von Fluoreszenzmarkierten Primern in die nachzuweisenden Nukleinsäuren bzw. Target-Moleküle eingebracht, wird üblicherweise vor der eigentlichen Detektion ein Waschschritt durchgeführt. Ein derartiger Waschschritt dient der Entfernung der im Vergleich zum Amplifikationsprodukt in großem Überschuss vorliegenden, nicht umgesetzten Primer sowie solcher mit einem Fluoreszenzmarker versehenen Nukleotide, die nicht an der Nachweisreaktion teilnehmen bzw. nicht spezifisch mit den Nukleinsäuresonden des Mikroarrays hybridisieren. Auf diese Weise soll der hohe Signalhintergrund vermindert werden, der durch diese Moleküle verursacht wird. Durch einen derartigen zusätzlichen Verfahrensschritt wird allerdings das Nachweisverfahren deutlich verlangsamt. Ferner wird das detektierbare Signal auch für die nachzuweisenden Nukleinsäuren deutlich verringert, die spezifisch mit den Nukleinsäuresonden des Mikroarrays hybridisieren. Letzteres beruht vor allem darauf, dass das Gleichgewicht zwischen den durch Hybridisierung gebundenen und in Lösung befindlichen Targets nach dem Waschschritt nicht mehr gegeben ist. Nukleinsäuren, die bereits mit den auf dem Array befindlichen Nukleinsäuresonden hybridisiert hatten, werden von der Bindungsstelle durch das Waschen abgelöst und somit mit den in Lösung befindlichen Molekülen weggewaschen. Es bleibt überhaupt nur dann ein detektierbares Signal zurück, wenn der Wasch- bzw. Spülschritt der in Lösung befindlichen Moleküle schneller vollzogen wird als die Ablösung der bereits hybridisierten Nukleinsäuren erfolgt.
  • Die oben dargestellte Problematik eines hohen Signalhintergrunds beim Nachweis von Targets ist eine generelles Problem und nicht auf den Nachweis von Nukleinsäuren mittels hochintegrierter Sonden-Arrays beschränkt.
  • Auch bei Antikörper-Arrays, die z.B. zum Nachweis von Proteinen in einer Probenlösung eingesetzt werden, besteht das Problem, dass es durch unspezifische Bindung von mit Markern versehenen Proteinen an die Antikörper zu unsezifischen Signalen kommen kann, denen man mit entsprechenden Waschschritten zu begegnen versucht. Auch beim Testen einer in Sonden-Form immobilisierten Substanzbibliothek gegen Targetproteine sind im allgemeinen Maßnahmen wie Waschschritte notwendig, um unspezifische Wechselwirkungen zu unterdrücken bzw. zu entfernen. Selbst bei Einhalten von stringenten Waschbedingungen kann es wegen der oben dargestellten Problematik der Einstellung eines Gleichgewichts zwischen den an Sonden gebundenen markierten Targets und markierten Targets in der Waschlösung zu erheblichen Signalhintergrundssignalen kommen.
  • Außerdem ist das Problem des Auftretens von störenden Hintergrundssignalen, die auch als „noise" bezeichnet werden, kein Spezifikum von Nachweisverfahren, die an Mikroarrays bzw. Sondenarrays durchgeführt werden. Diese Probleme treten gleichermaßen auf, wenn z.B. eine einzelne Sondenart an einer Fläche immobilisiert ist. Wenn z.B. eine einzelne immobilisierte Sonde zum Nachweis eines spezifischen Proteintargets in einer Proteinmischung eingesetzt werden soll, kann es durch unspezifische Bindung von anderen Proteinen als dem Targetprotein zu den angesprochen Signalhintergrundsproblemen kommen.
  • Vielmehr ist es ein allgemeines Anliegen bei allen Arten von Nachweisreaktionen das Auftreten von Hintergrundssignalen, die auf unspezifischen Einflüssen anderer Komponenten als der nachzuweisenden Targets beruhen, soweit wie möglich zu verhindern.
  • Es besteht folglich ein Bedarf an Vorrichtungen und Verfahren, mit denen mit relativ geringem technischem Aufwand der Nachweis von Targets und bevorzugt die Wechselwirkung zwischen Sonden und Targets mit hoher Genauigkeit qualitativ und/oder quantitativ nachgewiesen werden kann.
  • Es besteht ferner ein Bedarf an Vorrichtungen, die die Durchführung von PCR und Analysereaktion, wie z.B. einer Hybridisierungsreaktion, in einem Reaktionsraum ermöglichen.
    •
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, die vorstehend genannten Probleme des Standes der Technik, die sich insbesondere durch die mangelnde Kompatibilität der spezifischen Nachweisverfahren mit dem Testsystem ergeben, zu überwinden.
  • Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Vorrichtungen bzw. Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit denen molekulare Wechselwirkungen zwischen Sonden und Targets auf Sonden-Arrays mit hoher Genauigkeit und hoher Empfindlichkeit und auf einfache und kostengünstige Weise qualitativ und/oder quantitativ nachgewiesen werden können.
  • Ferner ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren bzw. Vorrichtungen zur Amplifikation und zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Molekülen wie z.B. Nukleinsäuren, Proteinen, niedermolekularen chemischen Verbindungen aber auch Zellen bzw zellulären Strukturen zur Verfügung zu stellen, bei denen die Eingriffe seitens des Experimentators in das Nachweisverfahren minimiert werden können.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren bzw. Vorrichtungen zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von Targets zur Verfügung zu stellen, mit denen ein hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis bei der Detektion von Wechselwirkungen gewährleistet wird, ohne die Wechselwirkung zwischen den Target- und den Sondenmolekülen zu beeinträchtigen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Vorrichtungen bzw. Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit denen eine hohe dynamische Auflösung bei der Detektion erreicht wird, d.h. der Nachweis schwacher Sonden/Target-Wechselwirkungen neben starken Signalen gewährleistet bleibt.
  • Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde, Vorrichtungen bzw. Verfahren zur Verfügung zu stellen, die eine nahezu gleichzeitige Vervielfältigung und Charakterisierung von Nukleinsäuren mit einem hohen Durchsatz ermöglichen.
  • Diese und weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
  • Erfindungsgemäß werden Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis Targets, insbesondere von molekularen Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen zur Verfügung gestellt, bei denen auf den Austausch und/oder die Entfernung von Lösungen, d.h. insbesondere auf Wasch- bzw. Spülschritte, verzichtet werden kann.
  • Derartige erfindungsgemäße Verfahren umfassen insbesondere die folgenden Schritte:
    • a) Einbringen einer Probe enthaltend Targets in eine Reaktionskammer, die zwischen einer ersten Fläche der Vorrichtung und einer zweiten Fläche der Vorrichtung, die bevorzugt der ersten Fläche gegenüber liegt, gebildet ist, wobei der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche veränderbar ist;
    • b) Detektieren der Targets.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, dass durch die Verringerung des Abstands zwischen den Flächen Lösungskomponenten, die für unspezifische Hintergrundssignale verantwortlich sind, aus der Reaktionskammer herausgedrängt werden. Im Fall von immobilisierten Sonden, an die markierte Targets gebunden sind, werden dadurch die Anzahl an markierten Komponenten der Analytlösung, die nicht an Sonden gebunden sind, reduziert. Bevorzugt musst dabei vorher kein Lösungsaustausch vorgenommen werden.
  • Bei einer Ausführungsform der Erfindung können die Targets direkt nachgewiesen werden, ohne dass auf Sonden zum Nachweis zurückgegriffen werden muss. Bei anderen erfindungsgemäßen Nachweisverfahren können die Targets durch Sonden nachgewiesen werden, die wiederum auf einer der Flächen, vorzugsweise auf einem Substrat, immobilisiert sein können. Eine weitere Ausführungsform sieht vor, dass die Sondenmoleküle nicht immobilisert sind, sondern zusammen mit den Targets in der Reaktionskammer in Lösung vorliegen.
  • Ferner werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Vorrichtungen bereitgestellt, die zur Durchführung derartiger Verfahren geeignet sind.
  • Insbesondere wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen zur Verfügung gestellt, umfassend:
    eine Reaktionskammer, die zwischen einer ersten Fläche der Vorrichtung und einer zweiten Fläche der Vorrichtung, die der ersten Fläche gegenüber liegt, gebildet ist, wobei der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche veränderbar ist und Sondenmoleküle in der Reaktionskammer mindestens auf einer der beiden Flächen, vorzugsweise der ersten Fläche immobilisiert sind.
  • Eine weitere erfindungsgemäße Vorrichtung, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, umfasst eine Reaktionskammer, die zwischen einer ersten Fläche der Vorrichtung und einer zweiten Fläche der Vorrichtung, die der ersten Fläche gegenüber liegt, gebildet ist, wobei der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche veränderbar ist und mindestens eine der beiden Flächen über eine Verdrängerstruktur verfügt, die in dem Bereich der Fläche positioniert ist, in dem die Detektion der Targets erfolgen soll. Bei Annäherung der beiden Flächen führt die Verdrängerstruktur zu einer im wesentlichen vollständigen Verdrängung der Analytlösung, die für das Hintergrundsignalrauschen verantwortlich ist, aus dem Bereich, in dem die Detektion der Targets erfolgen soll. Bevorzugt ist diese Verdrängerstruktur in dem Bereich der zweiten Fläche lokalisiert, die dem Bereich der ersten Fläche, in dem Sondenmoleküle immobilisiert sein können, gegenüber liegen. Bevorzugt kann es sich bei der Verdrängerstruktur um eine Erhöhung handeln.
  • Üblicherweise stellt bei den erfindungsgemäßen Vorrichtungen die Ebene der Reaktionskammer, an der keine Sondenmoleküle immobilisiert sind, die Detektionsebene dar.
  • Den erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen ist gemeinsam, dass sie keine Mikroarrays bzw. Sondenarrays verwenden, wobei für den Begriff des Mikroarrays bzw. Sondenarrays die unten angegebenen Definitionen zu Grunde zu legen sind. Insbesondere umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen keine Verfahren und Vorrichtungen aus der internationalen Patentanmeldung PCT/EP2005/004929, soweit diese sich auf Mikroarrays bzw. Sondenarrays bezieht.
  • Insbesondere ermöglicht die Variabilität des Abstands zwischen den Flächen der Reaktionskammer, dass der Signalhintergrund, der durch markierte Targets verursacht wird, die keine spezifische Affinität zu den verwendeten Sonden aufweisen und deshalb nicht mit diesen wechselwirken, wesentlich vermindert bzw. vollständig vermieden werden kann.
  • Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen zur Verfügung gestellt, das die folgenden Schritte umfasst:
    • a) Einbringen einer Probenlösung umfassend Targets in eine Reaktionskammer einer wie vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung; und
    • b) Detektieren einer Wechselwirkung zwischen den Targets und den verwendeten Sonden.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis von Targets sind so konzipiert, dass zur Durchführung des Nachweisverfahrens und ggf. einer Amplifikation der Targets möglichst wenige Eingriffe seitens eines Experimentators in die Reaktionskammer notwendig sind. Dies bietet den wesentlichen Vorteil, dass dadurch Kontaminationen vermieden werden. Ferner ist die Reproduzierbarkeit der erfindungsgemäßen Verfahren im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren wesentlich erhöht, da das erfindungsgemäße Verfahren aufgrund der Minimierung externer Eingriffe einer Automatisierung zugänglich ist. Die vorstehend genannten Vorteile spielen im Hinblick auf die Zulassung von diagnostischen Verfahren eine bedeutende Rolle.
  • Zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden ferner unter anderen folgende Definitionen verwendet:
    Unter einer Sonde bzw. einem Sondenmolekül bzw. einer molekularen Sonde wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Molekül verstanden, das zum Nachweis anderer Moleküle durch ein bestimmtes, charakteristisches Bindungsverhalten bzw. eine bestimmte Reaktivität verwendet wird. Als Sonde kommt jede Art von Molekül in Frage, das zum Nachweis eines anderen Moleküls geeignet ist, d.h. das eine spezifische Affinität für ein bestimmtes Target aufweist. Dabei ist es hinsichtlich der erfindungsgemäßen Verfahren keine Voraussetzung, dass Sonden sich an feste Oberflächen wie z.b. Substrate koppeln lassen.
  • Insbesondere kommen als Sonden solche Moleküle in Frage die eine spezifische Affinität aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um Biopolymere, insbesondere um Biopolymere aus den Klassen der Peptide, Proteine, Antigene, Antikörper, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren und/oder deren Analoga und/oder Mischpolymere der vorstehend genannten Biopolymere. Auch niedermolekulare chemische Verbindungen, wie sie typischerweise Bestandteil von Substanzbibliotheken sind, kommen als Sonden in Frage. In einer bevorzugten Ausführungsform lassen sich die Sonden an eine feste Oberfläche koppeln.
  • Als Sonde werden insbesondere Nukleinsäuremoleküle definierter und bekannter Sequenz bezeichnet, die benutzt werden, um in Hybridisierungsverfahren Target-Moleküle nachzuweisen. Als Nukleinsäuren können sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle verwendet werden. Beispielsweise kann es sich bei den Nukleinsäurensonden bzw. Oligonukleotidsonden um Oligonukleotide mit einer Länge von 10 bis 100 Basen, vorzugsweise 15 bis 50 Basen und besonders bevorzugt von 20 bis 30 Basen Länge handeln. Typischerweise handelt es sich erfindungsgemäß bei den Sonden um einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle oder Moleküle von Nukleinsäureanaloga, bevorzugt einzelsträngige DNA-Moleküle oder RNA-Moleküle, die mindestens über einen Sequenzbereich verfügen, der zu einem Sequenzbereich der Target-Moleküle komplementär ist. Je nach Nachweisverfahren und Anwendung können die Sonden auf einem festen Trägersubstrat immobilisiert sein. Darüber hinaus können sie je nach Nachweisverfahren radioaktiv oder nicht radioaktiv markiert sein, so dass sie über im Stand der Technik übliche Nachweisverfahren nachgewiesen werden können.
  • Gleichermaßen bevorzugt sind Antikörper bzw. Liganden, für die bekannt ist, dass sie spezifisch an Antigene bzw. Zellen oder zelluläre Strukturen binden.
  • Unter einem Target wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ganz allgemein die nachzuweisende Substanz verstanden.
  • In der Regel wird es sich bei Targets um Moleküle handeln; grundsätzlich soll der Begriff „Target" aber auch z.B. zellulären Strukturen bzw. Zelltypen, Zellklassen oder Zellgewebe umfassen. Bei manchen der erfindungsgemäßen Verfahren wird z.B. der Nachweis von bestimmten Zellen des Gewebes, wie z.B. Fibroblasten, oder des Immunsystems, wie z.B. B-Zellen oder T-Zellen angestrebt. Abhängig davon, für welche zellulären (Sub)strukturen die zum Nachweis der Targets verwendeten Sonden spezifisch sind, kann auch ein Nachweis von Zelluntergruppen, wie z.B. CD4+ oder CD8+ Zellen erfolgen.
  • Bevorzugt wird unter einem Target bzw. einem Targetmolekül im Rahmen der vorliegenden Erfindung das mit einer molekularen Sonde nachzuweisende Molekül verstanden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den zu detektierenden Targets um Biopolymere aus den Klassen der Peptide, Proteine, Antigene, Antikörper, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren und/oder deren Analoga und/oder Mischpolymere der vorstehend genannten Biopolymere. Bei Targets kann es sich aber auch um niedermolekulare Verbindungen, wie sie Bestandteil von Substanzbibliotheken sind, handeln. Unter einem Target werden aber auch anorganische Materialien, bspw. Metalle, Schwermetalle verstanden, die sich mit Hilfe von Nachweisreagenzien (bspw. Komplexbildner) spezifisch nachweisen lassen.
  • Falls es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung bei den Targets um Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäuremoleküle handelt, die durch eine Hybridisierung gegen immobilisierte Sonden nachgewiesen werden, umfassen diese Target-Moleküle in der Regel Sequenzen mit einer Länge von 40 bis 10.000 Basen, bevorzugt von 60 bis 2.000 Basen, ebenfalls bevorzugt von 60 bis 1.000 Basen, insbesondere bevorzugt von 60 bis 500 Basen und am meisten bevorzugt von 60 bis 150 Basen. Ihre Sequenz beinhaltet gegebenenfalls die Sequenzen von Primern, sowie die durch die Primer definierten Sequenzbereiche des Templates. Bei den Target-Molekülen kann es sich insbesondere um einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle handeln, von denen ein Strang oder beide Stränge radioaktiv oder nicht radioaktiv markiert sind, so dass sie in einem der im Stand der Technik üblichen Nachweisverfahren nachgewiesen werden können.
  • Als Target-Sequenz wird erfindungsgemäß der Sequenzbereich des Targets bezeichnet, der durch Hybridisierung mit der Sonde nachgewiesen wird. Erfindungsgemäß wird auch davon gesprochen, dass dieser Bereich durch die Sonde adressiert wird.
  • Unter einer Substanzbibliothek wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl von unterschiedlichen Molekülen verstanden, vorzugsweise mindestens zwei bis 1.000.000 unterschiedliche Moleküle, besonders bevorzugt mindestens 10 bis 10.000 unterschiedliche Moleküle und am meisten bevorzugt zwischen 100 und 1.000 unterschiedlichen Molekülen. Bei speziellen Ausgestaltungen kann eine Substanzbibliothek auch nur mindestens 50 oder weniger oder mindestens 30.000 unterschiedliche Moleküle umfassen.
  • Unter einem Trägerelement bzw. Träger bzw. bzw. Substrat wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Bauteil verstanden, auf dem Sonden immobilisiert sein können, ohne dass es sich dabei um einen Mikroarray handelt. Der Begriff Substrat soll für den Fall, dass keine Sonden immobilisiert sind, den Bereich der ersten Fläche bzw. der zweiten Fläche definieren, in dem im Zustand der komprimierten Reaktionskammer die Detektion der Targets erfolgen soll. In beiden Fällen (d.h. immobilisierte Sonde bzw. nicht-immobilisierte Sonde) muss das Substrat nicht ein eigenes Bauteil darstellen, sondern kann einen Bereich der ersten Fläche (immobilisierte Sonden) bzw. der ersten und/oder zweiten Fläche (nicht-immobilisierte Sonden) darstellen. Bei Substraten kann es sich z.B. um Objektträger oder Wafer oder aber auch keramische Materialien handeln. Bei einer speziellen Ausgestaltung können die Sonden auch direkt auf einer der sich bevorzugt gegenüberliegenden Flächen der Reaktionskammer, vorzugsweise auf einem Teilbereich der Fläche, immobilisiert sein.
  • Unter einem Sonden-Array wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Anordnung von molekularen Sonden bzw. einer Substanzbibliothek auf einem Träger verstanden, wobei die Position einer jeden Sonde separat bestimmt ist. Vorzugsweise umfasst der Array definierte Stellen bzw. vorbestimmte Bereiche, so genannte Array-Elemente, die besonders bevorzugt in einem bestimmten Muster angeordnet sind, wobei jedes Array-Element üblicherweise nur eine Spezies an Sonden beinhaltet. Die Anordnung der Moleküle bzw. Sonden auf dem Träger kann durch kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkungen erzeugt werden. Die Sonden sind dabei auf der dem Reaktionsraum zugewandten Seite des Trägers angeordnet. Eine Position innerhalb der Anordnung, d.h. des Arrays, wird üblicherweise als Spot bezeichnet.
  • Unter einem Array-Element bzw. einem vorbestimmten Bereich bzw. einem Spot bzw. einem Array-Spot wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein für die Deposition einer molekularen Sonde bestimmtes Areal auf einer Oberfläche verstanden, die Summe aller belegten Array-Elemente ist das Sonden-Array.
  • Selbstverständlich ist dem Fachmann bewusst, dass auch bei Mikroarrays die Immobilisierung der Sonden auf Substraten stattfindet, d.h. in definierter räumlicher Anordnung die Spots. Die Gesamtheit aus in Array-Anordnung auf dem Substrat abgelegten Molekülen bzw. der in Array-Anordnung auf dem Substrat bzw. der Detektionsfläche abgelegten Substanzbibliothek und dem Träger bzw. Substrat wird häufig auch als "Chip", "Mikroarray", "Microarray", "DNA-Chip", Sondenarray", "Sonden-Array" etc. bezeichnet, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung synonym verwendet werden. Erfindungsgemäßen Vorrichtungen und Verfahren, verwenden solche Mikrorarrays nicht.
  • Arrays bzw. Mikroarrays, wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht eingesetzt werden sollen, umfassen etwa 50 bis 10.000, vorzugsweise 150 bis 2.000 unterschiedliche Spezies von Sondenmolekülen auf einer, vorzugsweise quadratischen, Fläche von z.B. 1 mm bis 4 mm × 1 mm bis 4 mm, vorzugsweise von 2 mm × 2 mm. In weiteren Ausgestaltungen umfassen Mikroarrays im Rahmen der vorliegenden Erfindung etwa 50 bis etwa 80.000, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 65.000, besonders bevorzugt etwa 1.000 bis etwa 10.000 unterschiedliche Spezies von Sondenmolekülen auf einer Fläche von mehreren mm2 bis mehreren cm2, vorzugsweise etwa 1 mm2 bis 10 cm2, besonders bevorzugt 2 mm2 bis 1 cm2 und am meisten bevorzugt etwa 4 mm2 bis 6,25 mm2. Beispielsweise weist ein herkömmliches Mikroarray von 100 bis 65.000 unterschiedliche Spezies von Sondenmolekülen auf einer Fläche von 2 mm × 2 mm auf.
  • Als Detektionsebene wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt die Fläche der erfindungsgemäßen Vorrichtung bezeichnet, auf der keine Sonden immobilisert sind, wenn die Detektion z.B. im Auflichtverfahren erfolgt. Wenn die Detektion im Durchlichtverfahren erfolgt, muss dagegen keine Detektionsfläche definiert werden bzw. in diesem Fall können die erste und die zweite Fläche als Detektionsfläche fungieren. Vorzugsweise befinden sich die auf der anderen Fläche abgelegten Sonden bei der Detektion der Wechselwirkung zwischen Sonden und Targets im Wesentlichen in der Ebene der zweiten Fläche, insbesondere dadurch, dass der Abstand zwischen den Sonden der ersten Fläche und zweiter Fläche auf etwa null verringert ist.
  • Bei Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren, bei denen der Nachweis der Targets entweder ohne Sonden oder mit nicht-immobilisierten Sonden erfolgt, können ebenfalls beide Flächen als Detektionsfläche verwendet werden. In diesem Fall erfolgt der Nachweise der Targets bzw. der Target-Sonden bevorzugt ebenfalls bei der Detektion in der Detektionsebene, was bevorzugt wiederum dadurch erreicht wird, dass der Abstand zwischen der ersten Fläche und zweiter Fläche auf etwa null verringert ist.
  • Unter einem Kammerkörper wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der die Reaktionskammer bildende Festkörper verstanden. Für den Fall, dass immobilisierte Sonden eingesetzt werden, ist der Substanzträger üblicherweise Teil des Kammerkörpers, wobei der Substanzträger aus einem anderen Material gebildet sein kann als der übrige Kammerkörper.
  • Unter einer Reaktionskammer bzw. einem Reaktionsraum wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Raum bezeichnet, der zwischen der ersten Fläche und der zweiten Fläche gebildet ist und vorzugsweise als veränderbarer Kapillarspalt ausgestaltet ist. Der Reaktionsraum kann bevorzugt seitlich durch Seitenwände begrenzt sein, die z.B. als elastische Dichtungen ausgeführt sein können. Im Fall von immobilisierten Sonden befinden diese sich auf der dem Innenraum der Reaktionskammer zugewandten Seite. Die Grundfläche der Reaktionskammer bzw. des Reaktionsraums ist durch die Größe der ersten Fläche bzw. der zweiten Fläche definiert. Die Grundfläche der Reaktionskammer kann auch durch Ausschnitte der ersten bzw. der zweiten Fläche definiert sein. Als Dicke des Reaktionsraums bzw. der Reaktionskammer bzw. des Kapillarspalts wird insbesondere der Abstand zwischen erster und zweiter Fläche und bevorzugt zwischen zweiter Fläche und Oberfläche der immobiliserten Sonden auf der ersten Fläche bezeichnet. Üblicherweise weist ein Reaktionsraum im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Dicke auf, durch die ein Volumen zur Verfügung gestellt wird, das für die jeweilige nachzuweisende Interaktion optimal ist. Der Reaktionsraum kann beispielsweise eine Dicke von höchstens 1 cm, vorzugsweise von höchstens 5 mm, besonders bevorzugt von höchstens 3 mm und am meisten bevorzugt von höchstens 1 mm haben.
  • Unter dem Abstand zwischen immobilisierten Sonden und der zweiten Fläche wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Abstand zwischen der Oberfläche des Substrats, d.h. der dem Reaktionsraum zugewandten Seite des Substrats, auf dem die Sonden aufgebracht sind, und der dem Reaktionsraum zugewandten Seite der zweiten Fläche verstanden. Ist dieser Abstand etwa null, bedeutet dies, dass die Oberfläche des Substrats bündig auf der zweiten Fläche aufliegt.
  • Unter einem Kapillarspalt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Reaktionsraum bezeichnet, der durch Kapillarkräfte, die zwischen der ersten Fläche und der zweiten Fläche wirken, befüllbar ist. Üblicherweise weist ein Kapillarspalt eine geringe Dicke z.B. von höchstens 1 mm, vorzugsweise von höchstens 750 µm und besonders bevorzugt von höchstens 500 µm auf. Als Dicke des Kapillarspalts ist erfindungsgemäß ferner eine Dicke im Bereich von 10 bis 300 µm, von 15 µm bis 200 µm bzw. von 25 µm bis 150 µm bevorzugt. Bei speziellen Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung weist der Kapillarspalt eine Dicke von 50 µm, 60 µm, 70 µm, 80 µm oder 90 µm auf. Weist der Reaktionsraum bzw. die Reaktionskammer eine Dicke von mehr als 2 mm auf, wird der Reaktionsraum bzw. die Reaktionskammer im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht mehr als Kapillarspalt bezeichnet.
  • Unter einer Kartusche oder Reaktionskartusche wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Einheit aus der Reaktionskammer mit einem Kammerkörper und einer entsprechenden Umhausung verstanden.
  • Die für die erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Vorrichtungen können unterschiedliche Formen annehmen. Es kann sich z.B. um die erwähnten Kammerkörper der PCT/EP2005/004929 ohne Mikroarrays handeln, die weiter unten noch ausführlich beschrieben werden. Es kann sich aber z.B. auch um Reaktionsgefäße wie Küvetten oder andere Reaktionsgefäße handeln, sofern diese über sich zwei gegenüberliegende Flächen verfügen, deren Abstand gegeneinander veränderbar ist. Ein Beispiel findet sich in 5 oder 6. Daher kommen alle Reaktionsgefäße mit elastischen Flächen, die es erlauben, einen Kapillarspalt mit veränderlicher Größe zu bilden, als Vorrichtungen für die erfindungsgemäßen Verfahren in Frage. Insbesondere sollten die erste bzw. zweite Fläche Reaktionsgefäße in den Bereichen elastisch sein, in dem Sonden immobilisiert sind.
  • Die erste und zweite Fläche der für die erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren Vorrichtungen müssen nicht unbedingt Bestandteil des gleichen Gegenstands sein. Z.B. kann eine Reaktionskammer generiert werden, indem z.B. in ein Reaktionsgefäß wie eine Küvette ein Gegenstand wie ein Stößel eingeführt wird. Dieser Gegenstand, der in das Reaktionsgefäß eingeführt wird, sollte so, dimensioniert sein, dass er sich passgenau in das Reaktionsgefäß einfügen lässt und dabei einen Spalt belässt, der die Reaktionskammer darstellt, aber ausreichend schmal ist, um eine Verdrängung der Lösung, die für das Signalrauschen verantwortlich ist, zu bewirken. Bei solchen Ausführungsformen kann z.B. die erste Fläche der Reaktionskammer durch das Reaktionsgefäß und die zweite Fläche durch den einzuführenden Gegenstand zur Verfügung gestellt werden.
  • Bei all diesen Ausführungsformen ist entweder die erste und/oder bevorzugt die zweite Fläche aus einem transparenten Material gebildet, das eine optische Detektion der Targets erlaubt.
  • Unter einem konfokalen Fluoreszenzdetektionssystem wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Fluoreszenzdetektionssystem verstanden, in der das Objekt in der Brennebene des Objektivs durch eine Punktlichtquelle beleuchtet wird. Punktlichtquelle, Objekt und Punktlichtdetektor liegen dabei in exakt optisch konjugierten Ebenen. Beispiele für konfokale Systeme sind in A. Diaspro, Confocal and 2-photon-microscopy: Foundations, Applications and Advances, Wiley-Liss, 2002 beschrieben.
  • Unter einem das gesamte Volumen der Reaktionskammer abbildenden fluoreszenzoptischen System wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein nicht-konfokales Fluoreszenzdetektionssystem verstanden, also ein Fluoreszenzdetektionssystem, in der die Beleuchtung durch die Punktlichtquelle nicht auf das Objekt begrenzt ist. Ein derartiges Fluoreszenzdetektionssystem weist somit keine fokale Begrenzung auf.
  • Eine Markierung oder ein Marker bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine detektierbare Einheit, beispielsweise ein Fluorophor oder eine Ankergruppe, an die eine detektierbare Einheit gekoppelt werden kann.
  • Eine Vervielfältigungsreaktion bzw. eine Amplifikationsreaktion umfasst im Rahmen der vorliegenden Erfindung üblicherweise 10 bis 50 oder mehr Amplifikationszyklen, vorzugsweise etwa 25 bis 45 Zyklen, besonders bevorzugt etwa 40 Zyklen. Eine zyklische Amplifikationsreaktion ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR).
  • Als Amplifikationszyklus wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein einzelner Verstärkungsschritt der zyklischen Amplifikationsreaktion bezeichnet. Ein Verstärkungsschritt der PCR wird auch als PCR-Zyklus bezeichnet.
  • Als Amplifikationsprodukt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Produkt aus der Verstärkung bzw. Vervielfältigung bzw. Amplifikation der zu amplifizierenden Nukleinsäuremoleküle durch die zyklische Amplifikationsreaktion, vorzugsweise durch die PCR bezeichnet. Ein durch PCR vervielfältigtes Nukleinsäuremolekül wird auch als PCR-Produkt bezeichnet.
  • Unter der Denaturierungstemperatur wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Temperatur verstanden, bei der die doppelsträngige DNA im Amplifikationszyklus aufgetrennt wird. Die Denaturierungstemperatur beträgt, insbesondere bei einer PCR, üblicherweise mehr als 90°C, vorzugsweise etwa 95°C.
  • Unter der Annealing-Temperatur wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Temperatur verstanden, bei der die Primer an die nachzuweisende Nukleinsäure hybridisieren.
  • Die Annealing-Temperatur liegt, insbesondere bei einer PCR, üblicherweise im Bereich von 50°C bis 65°C und beträgt vorzugsweise etwa 60°C.
  • Unter der Kettenverlängerungs- bzw. Extensions-Temperatur wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Temperatur verstanden, bei der die Nukleinsäure durch Einbau der Monomerbausteine synthetisiert wird. Die Extensionstemperatur liegt, insbesondere bei einer PCR, üblicherweise im Bereich von etwa 68°C bis etwa 75°C und beträgt vorzugsweise etwa 72°C.
  • Als Oligonukleotid-Primer bzw. Primer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Oligonukleotid bezeichnet, das an die nachzuweisende DNA, auch Target-DNA genannt, bindet bzw. hybridisiert, wobei von der Bindungsstelle die Synthese des Gegenstrangs der nachzuweisenden DNA bei der zyklischen Amplifikationsreaktion startet. Insbesondere wird als Primer üblicherweise ein kurzes DNA- oder RNA-Oligonukleotid mit vorzugsweise etwa 12 bis 30 Basen bezeichnet, das komplementär zu einem Abschnitt eines größeren DNA- oder RNA-Moleküls ist und über eine freie 3-OH-Gruppe an seinem 3'-Ende verfügt. Aufgrund dieser freien 3'-OH-Gruppe kann der Primer als Substrat für beliebige DNA- oder RNA-Polymerasen dienen, die in 5'-3'-Richtung Nukleotide an den Primer synthetisieren. Die Sequenz der neu synthetisierten Nukleotide ist dabei durch die Sequenz des mit dem Primer hybridisierten Templates vorgegeben, die jenseits der freien 3'-OH-Gruppe des Primers liegt. Primer üblicher Länge umfassen zwischen 12 bis 50 Nukleotide, bevorzugt zwischen 15 und 30 Nukleotide.
  • Als Template oder Template-Strang werden üblicherweise ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül oder ein Nukleinsäurestrang bezeichnet, der als Vorlage zur Synthese von komplementären Nukleinsäuresträngen dient.
  • Unter einer molekularen Wechselwirkung bzw. einer Wechselwirkung wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere eine spezifische, kovalente oder nicht-kovalente Bindung zwischen einem Targetmolekül und einem immobilisierten Sondenmolekül verstanden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Wechselwirkung zwischen Sonden- und Targetmolekülen eine Hybridisierung.
  • Als Hybridisierung wird die Bildung von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen oder Duplexmolekülen aus komplementären einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen bezeichnet. Dabei findet die Assoziation vorzugsweise immer zu Paaren von A und T bzw. G und C statt. Im Rahmen einer Hybridisierung können z.B. DNA-DNA-Duplexes, DNA-RNA- oder RNA-RNA-Duplexes gebildet werden. Durch eine Hybridisierung können auch Duplexes mit Nukleinsäureanaloga gebildet werden, wie z.B. DNA-PNA-Duplexes, RNA-PNA-Duplexes, DNA-LNA-Duplexes und RNA-LNA-Duplexes. Hybridisierungsexperimente werden üblicherweise benutzt, um die Sequenzkomplementarität und damit die Identität zwischen zwei verschiedenen Nukleinsäuremolekülen nachzuweisen.
  • Unter Prozessierung werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere Aufreinigungs-, Aufkonzentrierungs-, Markierungs-, Amplifikations-, Wechselwirkungs- bzw. Hybridisierungs- und/oder Wasch- und Spülschritte, sowie weitere zum Nachweis bzw. zur Detektion von Targets mit Hilfe von Substanzbibliotheken durchgeführte Verfahrensschritte verstanden. Die Detektion selbst fällt nicht unter den Begriff Prozessierung.
  • Als Probe bzw. Probenlösung bzw. Analyt bzw. Lösung wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine zu analysierende Flüssigkeit bezeichnet, die insbesondere die nachzuweisenden und ggf. zu amplifizierenden Targetmoleküle enthält. Eine derartige Lösung kann ferner u.a. neben üblichen Zusatzstoffen wie beispielsweise Puffern auch für die Durchführung von Amplifikationsreaktionen erforderliche Substanzen wie Primer enthalten.
  • Unter einem Austauschen von Lösungen in der Reaktionskammer aus der Reaktionskammer werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere Spül- bzw. Waschschritte verstanden. Das Austauschen von Lösungen dient z.B. zur Beseitigung von mit detektierbaren Markern versehenen Molekülen, welche nicht spezifisch mit Sonden wechselwirken, in dem nach erfolgter Wechselwirkung die Probenlösung gegen eine nicht markierte Lösung ausgetauscht wird. Moleküle, welche nicht spezifisch mit Sonden wechselwirken, sind z.B. mit einem detektierbaren Marker versehene Primern, die nicht während der Amplifikationsreaktion umgesetzt worden sind, oder mit einem detektierbaren Marker versehene Targetmoleküle, zu denen keine komplementäre Sonde vorliegt, die spezifisch mit diesem Targetmolekül wechselwirkt.
  • Unter einem Entfernen von Lösungen aus der Reaktionskammer werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Schritte verstanden, mit denen mit detektierbaren Markern versehene Moleküle, welche nicht spezifisch mit Sonden wechselwirken, aus der Reaktionskammer entfernt werden. Moleküle, welche nicht spezifisch mit Sonden wechselwirken, sind z.B. mit einem detektierbaren Marker versehene Primern, die nicht während der Amplifikationsreaktion umgesetzt worden sind, oder mit einem detektierbaren Marker versehene Targetmoleküle, zu denen keine komplementäre Sonde vorliegt, die spezifisch mit diesem Targetmolekül wechselwirkt.
  • Wenn im Rahmen der vorliegenden Erfindung zwischen dem Einbringen der Probe enthaltend Targetmoleküle in eine Reaktionskammer und dem Detektieren der Wechselwirkung kein Austauschen von Lösungen in der Reaktionskammer und/oder Entfernen von Lösungen aus der Reaktionskammer erfolgt, ist es jedoch denkbar, dass in diesem Zeitraum Lösungen zusätzlich in die Reaktionskammer eingebracht werden können, ohne dass ein Austausch bzw. ein Entfernen von bereits in der Reaktionskammer vorliegenden Lösungen erfolgt.
  • Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfasst somit ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von Targets und insbesondere molekularen Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen, umfassend insbesondere die folgenden Schritte:
    • a) Einbringen einer Probe enthaltend Targetmoleküle in eine Reaktionskammer, die zwischen einer ersten Fläche einer Vorrichtung und einer zweiten Fläche einer Vorrichtung gebildet ist, wobei der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche veränderbar ist;
    • b) Detektieren der Targets.
  • Bevorzugt muss nach dem Einbringen der Probe enthaltend Targetmoleküle und vor bzw. während dem Detektieren kein Austauschen von Lösungen in der Reaktionskammer und/oder Entfernen von Lösungen aus der Reaktionskammer erfolgen.
  • Ein solches Verfahren kann z.B. zur Absorptionsmessung in Lösungen eingesetzt werden, ohne dass zum Nachweis der Targets Sonden notwendig wären. Nach dem Lambert-Beerschen Gesetz ist die Extinktion einer Lösung proportional zur Konzentration der Lösung und deren Schichtdicke, in der die Lösung vorliegt. Üblicherweise wird bei Lösungen zu hoher Konzentration, d.h. bei Lösungen, bei denen die Absorption so hoch ist, dass diese nicht mehr zuverlässig bestimmt werden kann, eine Verdünnungsreihe angefertigt, welche dann anschließend analysiert wird. Die hier aufgezeigte Möglichkeit beruht auf der Variation des zweiten Parameters, der Schichtdicke. Alternativ zur Verringerung der Konzentration wird hier die Schichtdicke definiert soweit verringert, bis die Absorption der Lösung zuverlässig messbar ist. Da die Dicke der gemessenen Schicht bestimmbar ist, kann die Konzentration der Lösung zuverlässig bestimmt werden.
  • Eine solche Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann z.B. zur Konzentrationsbestimmung von Lösungen verwendet werden.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen, umfassend insbesondere die folgenden Schritte:
    • a) Einbringen einer Probe enthaltend Targetmoleküle in eine Reaktionskammer, die zwischen einer ersten Fläche einer Vorrichtung und einer zweiten Fläche einer Vorrichtung gebildet ist, wobei der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche veränderbar ist;
    • b) Detektieren einer Wechselwirkung zwischen den Targetmolekülen und den auf dem Substrat immobilisierten Sondenmolekülen.
  • Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens bei diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, dass die Detektion einer Wechselwirkung zwischen den nachzuweisenden Targetmolekülen und den auf dem Substrat des Mikroarrays immobilisierten Sondenmolekülen erfolgt, ohne dass ein Austauschen von Lösungen in der Reaktionskammer bzw. ein Entfernen von Lösungen aus der Reaktionskammer erfolgt. D.h., das Detektieren der Wechselwirkung zwischen Targets und Sonden kann erfolgen, ohne dass im Anschluss an die Wechselwirkungsreaktion Spül- bzw. Waschschritte erforderlich sind und/oder ohne dass im Anschluss an die Wechselwirkungsreaktion Moleküle aus der Reaktionskammer entfernt werden, die nicht spezifisch mit Sonden auf dem Mikroarray wechselwirken.
  • Bei dieser Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren können die Sonden auf der ersten Fläche immobilisiert sein, müssen es aber nicht. Dies soll in allgemeiner Form unter Bezug auf die 34 erläutert werden.
  • Z.B. kann an der ersten Fläche einer der genannten Vorrichtungen eine Sonde immobilisiert sein, wobei die Sonden nicht in Array-Form angeordnet sind. Es handelt sich also um ein Verfahren zum Nachweis von Targets durch Einsatz von an eine Oberfläche gebundenen Sondenmolekülen, gekennzeichnet dadurch, dass
    • • die Oberfläche der ersten Fläche komplett oder teilweise mit mindestens einer Sorte von Sondenmolekülen beschichtet ist;
    • • der Nachweis in einem Schritt erfolgt, indem alle Reagenzien, die hierfür benötigt werden zusammengemischt werden und keine weiteren Spülschritte benötigt werden um nicht an Sonden gebundenes Material zu entfernen
    • • der Nachweis vorzugsweise unter chemischen Gleichgewichtsbedingungen erfolgt,
    • • und das nicht an Sonden gebundene Material bspw. durch mechanische räumliche Verdrängung aus dem Detektionsvolumen entfernt wird. Dies kann bspw. durch Zusammendrücken der Reaktionskammer erfolgen oder durch Einbringen eines separaten Verdrängungskörpers (bspw. ein Kolben) oder eine nicht im eigentlichen Reaktionsmedium lösliche Flüssigkeit wie z.B. einem Mineralöl bei wässrigen Reaktionsmedien.
  • In der 34 stellt A) eine Küvette mit einer Reaktionslösung dar, die Targetmoleküle enthält. Die Küvette ist innen mit Sondenmolekülen beschichtet, bei denen es sich z.B. um Antikörper handeln kann. In diese Küvette wird die zu untersuchende Lösung inklusive der Nachweisreagenzien unter geeigneten Bedingungen inkubiert. Dabei findet eine Bindung der Targets an die Sonden statt.
  • In 34, B) ist die Küvette dann mit an Sonden gebundenen Targets gezeigt, wobei die überflüssige Reaktionslösung mit Hilfe eines passgenauen Stößels verdrängt wird, der bevorzugt einen kleinen Spalt als Reaktionskammer bildet. Der Stößel kann aus einem optisch durchlässigen Material, z.B. aus Quarzglas bestehen, so dass eine Detektion der gebundenen Targets durch den Stößel hindurch erfolgen kann. Der Stößel kann jedoch auch aus anderen Materialien bestehen, so z.B. aus einem nicht-fluoreszierenden licht-undurchlässigen Material. Die Detektion könnte dann bspw. durch Auflicht(fluoreszenz)(mikroskopie)-detektion erfolgen. Der Stößel kann zusätzlich mit einem Material beschichtet sein, welches die Verdrängungswirkung bei Oberflächenkontakt verbessert. Solche als „Verdränger" bezeichneten Materialien werden weiter unten noch eingehend beschrieben. Die Küvette besteht in beiden Fällen mindestens an einer Fläche bevorzugt auch aus lichtdurchlässigen Materialien.
  • Die in 34, B) gezeigte Ausführungsform stellt ein Beispiel dar, bei dem die erste und zweite Fläche der Reaktionskammer durch unterschiedliche Gegenstände zur Verfügung gestellt werden, nämlich Stößel und Küvette.
  • In 34, C) ist die Küvette wiederum mit gebundenen Targets gezeigt, wobei diesmal die überflüssige Reaktionslösung durch Zusammenquetschen der sich gegenüberliegenden Flächen der Küvette aus dem Detektionsvolumen verdrängt wird. In diesem Fall ist die Küvette wiederum aus lichtdurchlässigen Materialien, die zudem elastisch sind. Die Detektion kann beispielsweise entlang der Achse einer Vorrichtung zum Zusammendrücken erfolgen.
  • Diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann beispielsweise in einem Probenkarussell zum Einsatz kommen. Mehrere Probenröhrchen sind dabei bspw. in einem High-Throughput-Screening-Roboter in einem Karussell angeordnet. Der Roboter pipettiert die zu analysierenden Proben in die Röhrchen. Diese werden dann an einem Detektor vorbeigeführt und mittels einer geeigneten Vorrichtung definiert gegen diesen Detektor gepresst.
  • Bei beiden beschriebenen Ausführungsformen kommt es im Detektionsbereich zu einer Verringerung der Lösung, die nicht gebundene, aber markierte Targets enthält. Dies bewirkt eine Reduzierung des unspezifischen Hintergrundsignals und einer Verbesserung des Signal/Rauschen-Verhältnis.
  • Selbstverständlich ist dem Fachmann klar, dass die geschilderten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren auch in anderen Reaktionsgefäßen als der beschriebenen Küvette durchgefürt werden können. Dazu gehören unter anderem auch die weiter unten beschriebenen Reaktionskartuschen.
  • Grundsätzlich kann die Reaktionskammer kann jede äußere Form annehmen; ihr Volumen muss jedoch verringerbar sein.
  • Ein besonderer Vorteil liegt den bisher geschilderten Ausführungsformen wie auch allen anderen Ausführungsformen der Erfindung darin, dass es möglich ist, die Zunahme eines während einer Reaktion gebildeten Produktes zu analysieren, in dem das gebildeten Produkt als Target an der ersten Fläche der Reaktionskammer an die dort immobilisierten Sonden gebunden wird, die Reaktionskammer anschließend gequetscht wird, um ihr Volumen zu verringern, und das Signal detektiert wird. Anschließend kann die Reaktionskammer wieder entspannt werden, so dass die Reaktion weiterhin stattfinden kann. Nach einer geeigneten Zeit wird die Reaktionskammer erneut gequetscht und die Zunahme des Signals durch die erhöhte Menge des an die Sonden gebundenen Produktes detektiert. Dieser Vorgang kann beliebig oft durchgeführt werden.
  • Dieses Verfahren eignet sich auch zur Erstellung von Bindungskinetiken, indem die Reaktionskammer bspw. mit einem Protein als Sonde beschichtet wird, und anschließend ein weiteres Protein als Target hinzugegeben wird, dessen Bindung an das erste Protein untersucht werden soll. Dieses zweite Protein kann bspw. direkt mit einem Fluoreszenzmarker definiert sein oder mit einem mit einem Fluoreszenzmarker markierten Antikörper markiert sein. In Abhängigkeit von der Zeit wird dann die Zunahme des Signals in der Reaktionskammer detektiert, wobei die über der Sonde befindliche Lösung durch die oben beschriebene Verringerung des Kammervolumens reversibel verdrängt wird.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren, d.h. der Nachweis von Target-Sonden-Wechselwirkungen durch Verringerung des Volumens der Reaktionskammer, um die Entfernung der für unspezifische Signale verantwortlichen Lösungen zu bewirken, kann auch eingesetzt werden, ohne dass eine Immobilisierung der Sonden notwendig ist.
  • Dieses Prinzip soll anhand des Einsatz der erfindungsgemäßen Verfahren in zytometrischen Verfahren erläutert werden.
  • Üblicherweise basieren zytometrische Verfahren darauf, dass speziell markierte Zellen in einer geeigneten Lösung durch eine entsprechende Kapillare geleitet werden. Neben der Kapillare ist ein Detektor angeordnet, der detektiert, wie oft in einem bestimmten Zeitraum durch eine vorbeifließende markierte Zelle ein Signal ausgelöst wird. Aus der Flussgeschwindigkeit und den gezählten Signalen lässt sich dann mehr oder weniger genau die Anzahl der gesuchten Zellen je Volumeneinheit ermitteln.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden nicht-immobilisierte Sonden eingesetzt. Diese Sonden werden mit den nachzuweisenden Targets kombiniert. Bei den Targets kann es sich bei zytometrischen Anwendungen z.B. um Zellypen handeln. Die Sonden können z.B. Zelltyp-spezifische Fluoreszenz-markierten Antikörpern sein.
  • Die Sonden und Targets enthaltende Lösung wird in die Reaktionskammer eingebracht, deren Detektionsvolumen veränderlich ist. Dann wird die Reaktionskammer definiert zusammengedrückt wird, so dass das von der Oberfläche der Zellen ausgehende zu detektierende Signal die Signalintensität der Umgebung übersteigt.
  • Die 35 soll dieses Prinzip verdeutlichen. In 35, A) sind die nachzuweisenden Targets mit geeigneten Nachweisreagenzien in einer Reaktionskammer verbracht, deren Detektionsvolumen in der oben beschrieben Weise veränderlich ist und unter geeigneten Bedingungen inkubiert. Dabei binden die Sonden (bspw. Antikörper, die bestimmte Antigene auf der Zelloberfläche erkennen) auf der Zelloberfläche der Targets, wodurch es zu einer relativen Erhöhung der Dichte von Sondenmolekülen gegenüber der umgebenden Lösung kommt. In 35, B) wird zur Detektion die Reaktionskammer auf einen definierten Spalt zusammengepresst, wobei Analytlösung aus der Reaktionskammer herausgepresst wird, deren Volumen bestimmt werden kann. Ein gewisser Anteil markierter Zellen verbleibt im Kapillarspalt, deren Fluoreszenz dann detektiert werden kann, da sie heller leuchten als die noch vorhandenen fluoreszierenden Komponenten der Analytlösung. Nach 35, C) können die markierten Zellen dann vor dem Hintergrund abgebildet werden und bspw. mit Hilfe einer geeigneten Software ausgezählt werden. Durch ein- oder mehrfache Wiederholung der Schritte B) und C) kann ein Mittelwert über die Anzahl der detektierten Zellen je Volumeneinheit gebildet werden und so die Genauigkeit der Messung weiter erhöht werden.
  • 36 verdeutlicht den theoretischen Hintergrund der Detektion von Targets wie Zellen bzw. Partikeln vor einem fluoreszierenden Hintergrund basierend auf der Anreicherung von Fluoreszenzmarkierten Molekülen auf der Oberfläche der Partikel. Grundlage für die Berechnung bildet die Annahme, dass ein Sondenmolekül eine Fläche von 2500nm2 (daraus resultiert eine Dichte von Sondenmolekülen von 400 Molekülen je μm2 Zelloberfläche) bzw. 400nm2 (dies entspricht eher den realen Bedingungen, es resultiert eine max. Belegungsdichte von 2500 Molekülen je μm2 Zelloberfläche) belegt. Für die Berechung der Hintergrundfluoreszenz werden Quenching Effekte etc. vernachlässigt. Es wird davon ausgegangen, dass sich die Hintergrundfluoreszenz proportional zur Anzahl der fluoreszierenden Moleküle im entsprechenden Volumenelement verhält.
  • Es ist deutlich zu sehen, dass bereits bei einer niedrigen Belegungsdichte der Zelloberfläche mit fluoreszierendem Material eine Unterscheidung vom Hintergrund möglich ist, wenn das Detektionsvolumen entsprechend eingeengt wird.
  • Prinzipiell können mit diesem Verfahren auch unterschiedliche Targets parallel detektiert werden. Dazu können auf der einen Seite unterschiedliche Sonden (bspw. unterschiedlich spezifische Antikörper, die verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe tragen) eingesetzt werden, auf der anderen Seite kann jedoch auch bei einer entsprechenden Vergrößerung die geometrische Form der nachzuweisenden Target analysiert werden. Hier können bspw. unterschiedlich große Beads oder beads verschiedener Geometrien, die verschieden spezifisch binden, eingesetzt werden.
  • Grundsätzlich ist den Verfahren der vorliegenden Erfindung gemeinsam, dass sie in Reaktionskammern durchgeführt werden, die aus einer ersten Fläche und eine zweiten Fläche gebildet werden, wobei die zweite Fläche der ersten Fläche gegenüber liegt und der Abstand zwischen Flächen derart veränderbar ist, dass das Volumen der Reaktionskammer auf Kapillarspaltgröße und kleiner verringerbar ist.
  • Als Vorrichtung bei solchen Anwendungen können insbesondere die unten für Reaktionskartuschen beschriebenen Reaktionskammern verwendet werden.
  • Eine Detektion von Target-Sonden-Wechselwirkungen kann insbesondere durch fokiselektive Detektionsmethoden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gewährleistet werden, wie z.B. durch konfokale Techniken [R.B.1] oder durch auf der Anwendung einer tiefenselektiven Beleuchtung aufgrund der z.B. auf totaler Reflexion beruhenden evaneszenten Auskopplung von Anregungslicht (TIRF) im Probensubstrat oder der Verwendung von Wellenleitern beruhende Methoden. Derartige fokiselektive Verfahren sind insbesondere dann zu bevorzugen, wenn eine weitere Ausgrenzung der durch die in der Flüssigkeit vorhandenen, d.h. nicht hybridsierten Fluoreszenzmoleküle verursachten Hintergrundsignale erforderlich ist, um die Sensitivität zu erhöhen. Bei Verwendung von fluoreszenzmarkierten Targetmolekülen können somit die spezifischen Wechselwirkungssignale von der Hintergrundfluoreszenz durch Einsatz von Verfahren wie Total Internal Reflection-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) oder konfokaler Fluoreszenzmikroskopie diskriminiert werden.
  • Beispiele hierfür sind CCD-basierte Detektoren, die zur Diskriminierung von optischen Effekten wie Streuung und Reflexionen die Anregung der Fluorophore im Dunkelfeld durch Auflicht oder Durchlicht realisieren (siehe z.B. C. E. Hooper et al., Quantitative Photone Imaging in the Life Sciences Using Intensified CCD Cameras, Journal of Bioluminescence and Chemoluminescence (1990), 337-344). Weitere Alternativen für Fluoreszenzdetektionssysteme, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind Weißlichtaufbauten wie sie z.B. in WO 00/12759, WO 00/25113 und WO 96/27025 beschrieben sind; konfokale Systeme, wie sie z.B. in US 5,324,633 , US 6,027,880 , US 5,585,639 und WO 00/12759 beschrieben sind; auf Nipkow-Scheiben basierende konfokale Anregungssysteme bei bildgebender konfokaler Abbildung, wie z.B. in US 5,760,950 beschrieben sind; auf strukturierter Anregungsverteilung basierende Systeme, wie sie z.B. in WO 98/57151 beschrieben sind; Fluoreszenzdetektionssysteme in hoher Integration unter Verwendung von Mikrooptiken, wie sie z.B. in WO 99/27140 beschrieben sind; und Laserscanningsysteme, wie sie z.B. in WO 00/12759 beschrieben sind. Ein allgemeiner Ablauf von Fluoreszenzdetektionsverfahren unter Verwendung derartiger herkömmlicher Fluoreszenzdetektionssysteme ist z.B. in US 5,324,633 beschrieben.
  • Für die Durchführung eines erfindungsgemäßen Nachweisverfahren ohne Austauschen von Lösungen in der Reaktionskammer und/oder Entfernen von Lösungen aus der Reaktionskammer vor der Detektion sind insbesondere die in WO 2004/087951 beschriebenen Vorrichtungen geeignet, in denen die Reaktionskammer durch einen Kapillarspalt gebildet wird. Auf den diesbezüglichen Inhalt von WO 2004/087951 wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen; allerdings sind nur solche Vorrichtungen Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die keine Mikroarrays bzw. Sondenarrays aufweisen.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird das Austauschen und/oder Entfernen von Lösungen aus der Reaktionskammer dadurch vermieden, dass der Nachweis durch Detektion der Massenänderung auf der Fläche, wie z.B. in WO 03/004699 beschrieben, erfolgt. Auf den diesbezüglichen Inhalt von WO 03/004699 wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird das Austauschen und/oder Entfernen von Lösungen aus der Reaktionskammer dadurch vermieden, dass der Nachweis durch Detektion von akustischen Oberflächenwellen, wie beispielsweise in Z. Guttenberg et al., Lab Chip. 2005; 5(3):308-17 beschrieben, erfolgt.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird das Austauschen und/oder Entfernen von Lösungen aus der Reaktionskammer dadurch vermieden, dass der Nachweis durch elektrochemische Detektion mittels Elektroden auf der Oberfläche des Substrats erfolgt, auf dem die Sonden immobilisiert sind, wie beispielsweise durch Messung der Änderung von Redoxpotentialen (siehe z.B. X. Zhu et al., Lab Chip. 2004; 4(6):581-7) oder zyklische Voltometrie (siehe z.B. J. Liu et al., Anal Chem. 2005; 77(9):2756-2761; J. Wang, Anal Chem. 2003; 75(15):3941-5) erfolgt.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird das Austauschen und/oder Entfernen von Lösungen aus der Reaktionskammer dadurch vermieden, dass der Nachweis durch elektrische Detektion mittels Elektroden auf der Oberfläche des Substrats erfolgt, auf dem die Sonden immobilisiert sind, wie beispielsweise durch Impedanzmessung (siehe u.a. S.M. Radke et al., Biosens Bioelectron. 2005; 20(8):1662-7).
  • Bei einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird das Austauschen und/oder Entfernen von Lösungen aus der Reaktionskammer dadurch vermieden, dass ein Substrat mit FRET-Sonden (FRET, fluorescence resonance energy transfer) eingesetzt wird. Die Verwendung derartiger FRET-Sonden basiert auf der Bildung von Fluoreszenz-Quencher-Pärchen, so dass nur dann ein Fluroeszenzsignal entsteht, wenn ein Targetmolekül an die komplentäre Sonde auf der Oberfläche gebunden hat. Die Verwendung von FRET-Sonden ist beispielsweise beschrieben in B. Liu et al., PNAS 2005, 102, 3, 589-593; K. Usui et al., Mol Divers. 2004; 8(3):209-18; J.A. Cruz-Aguado et al., Anal Chem. 2004; 76(14):4182-8 und J. Szollosi et al., J Biotechnol. 2002;82(3):251-66.
  • Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird das Austauschen und/oder Entfernen von Lösungen aus der Reaktionskammer dadurch vermieden, dass eine wie nachstehend im Detail beschriebene erfindungsgemäße Vorrichtung zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen eingesetzt wird, wobei die Vorrichtung umfasst: eine Reaktionskammer, die zwischen einer ersten Fläche der Vorrichtung und einer zweiten Fläche der Vorrichtung gebildet ist, wobei der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche veränderbar ist und Sondenmoleküle in der Reaktionskammer mindestens auf einer der beiden Flächen imobilisiert sind.
  • Bei einer gleichermaßen bevorzugte Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird das Austauschen und/oder Entfernen von Lösungen aus der Reaktionskammer dadurch vermieden, dass eine wie nachstehend im Detail beschriebene erfindungsgemäße Vorrichtung zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen eingesetzt wird, wobei die Vorrichtung umfasst: eine Reaktionskammer, die zwischen einer ersten Fläche der Vorrichtung und einer zweiten Fläche der Vorrichtung gebildet ist, wobei der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche veränderbar ist und eine der beiden Flächen über eine Verdrängerstruktur verfügt, die bei Annäherung der beiden Flächen in einem Bereich der Reaktionskammer zu einer Volumenverkleinerung führt. Bevorzugt ist diese Verdrängerstruktur in dem Bereich der zweiten Fläche lokalisiert, die dem Bereich der ersten Fläche, in dem Sondenmoleküle immobilisiert sind, gegenüber liegen.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von FRET-Sondenmolekülen wie vorstehend beschrieben und/oder Detektionsverfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Total Internal Reflection-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) wie vorstehend beschrieben, konfokaler Fluoreszenzmikroskopie wie vorstehend beschrieben, Verfahren zur Detektion der Massenänderung wie vorstehend beschrieben, Verfahren zur Detektion von akustischen Oberflächenwellen wie vorstehend beschrieben, Verfahren zur elektrochemischen und/oder elektrischen Detektion wie vorstehend beschrieben, zur Vermeidung eines Austauschens von Lösungen in einer Reaktionskammer und/oder Entfernens von Lösungen aus einer Reaktionskammer zwischen bzw. nach dem Einbringen einer Probe enthaltend Targetmoleküle in die Reaktionskammer und vor bzw. während der Detektion bei einem Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen, das insbesondere die folgenden Schritte umfasst:
    • a) Einbringen einer Probe enthaltend Targets in eine Reaktionskammer in einer der oben beschriebenen Vorrichtungen;
    • b) Detektieren der Targets, bevorzugt durch Nachweisen einer Wechselwirkung zwischen den Targetmolekülen und den Sondemolekülen, die bevorzugt auf einem Substrat auf einer der beiden Flächen immobilisiert sind.
  • Nach erfolgter Wechselwirkung zwischen Sondenmolekülen und Targetmolekülen wird durch die in der Probenlösung vorliegenden markierten Moleküle, die nicht mit den Sondenmolekülen wechselwirken, ein unerwünschter Hintergrund verursacht. Handelt es sich bei den Sonden- und/oder Targetmolekülen um Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäureanaloga, so wird dieser Hintergrund insbesondere durch die in der Probenlösung vorliegenden markierten Primer und/oder markierten Nukleinsäuren verursacht, die nicht mit den Sondenmolekülen hybridisiert sind.
  • Eine bekannte Möglichkeit zur Entfernung störender Hintergrundsignale ist der Austausch der Probenlösung nach erfolgter Wechselwirkung gegen eine nicht markierte, beispielsweise nicht fluoreszierende Lösung. Diese Variante ist jedoch im Allgemeinen bedingt durch Korrosion, Alterung der Lösungen und Dichtigkeitsprobleme, aufwendig und störanfällig.
  • Wesentliches Merkmal der erfindungsgemäßen Vorrichtungen ist, dass das Volumen des Bereichs der Reaktionskammer, in dem der Nachweis der Targets erfolgt, durch Veränderung des Abstands zwischen der ersten und der zweiten Fläche verringerbar ist. Ein variabler Abstand zwischen erster und zweiter Fläche bedeutet, dass die Reaktionskammer der erfindungsgemäßen Vorrichtung komprimierbar ist. Insbesondere ist der Abstand zwischen erster und zweiter Fläche derart variabel, dass die erste Fläche bündig und/oder reversibel an der zweiten Fläche anliegen kann bzw. auf diese gedrückt werden kann. Bei einer Ausführungsform ist der Abstand dabei insbesondere in dem Bereich der ersten oder zweiten Fläche verringerbar, in dem die Sonden immobilisiert sind und/oder in dem die Verdrängerstruktur angebracht ist.
  • Eine komprimierbare Reaktionskammer ermöglicht somit durch Verringerung des Abstands zwischen erster und zweiter Fläche vor Durchführung der Detektion die Verdrängung von Probenlösung, die markierte Moleküle enthält, die nicht mit den Sondenmolekülen wechselwirken und somit einen unerwünschten Hintergrund darstellen. Auf diese Weise ist eine Detektion von Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen mit beliebigen optischen Detektionssystemen möglich, ohne die Probenlösung vor der Detektion gegen eine nicht markierte Lösung auszutauschen. Beispielsweise ist eine einfache fluoreszenzmikroskopische Abbildung bei Nukleinsäuresonden und -targets zur Detektion der Wechselwirkungssignale mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ohne Austausch der Probenlösung gegen eine nicht markierte, insbesondere fluoreszenzarme Flüssigkeit möglich.
  • Schließlich wird insbesondere durch die im Folgenden beschriebenen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung gewährleistet, dass eine Fokussierung von optischen Detektionssystemen nicht mehr erforderlich ist. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht somit beispielsweise, dass im Gegensatz zu den bislang verwendeten fluoreszenzoptischen Detektionssystemen zum Nachweis von Nukleinsäuren ein einfaches Fluoreszenzmikroskopgerät ohne Autofokus-Funktion als Auslesegerät für die Detektion der Hybridisierung zwischen Targets und Sonden verwendet werden kann, ohne dass flüssigkeitshandhabende Schritte wie insbesondere Waschschritte zur Entfernung nicht an Sonden gebundener Targetmoleküle, wie z.B. nicht hybridisierter Target-Nukleinsäuren, erforderlich sind.
  • Dadurch wird trotz der mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchführbaren multifunktionalen Probenbehandlung und Analyse ein äußerst kostengünstiges System zum Nachweis und ggf. Amplifizieren von Targetmolekülen in einer Probe bereitgestellt. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen, insbesondere in Verbindung mit einem optischen Detektionssystem, sind ferner derart robust, dass sie auch für den mobilen Einsatz verwendet werden können.
  • Durch die geeignete Wahl von Substraten mit oder ohne immobilisierten Sonden, Verarbeitungsprotokollen und Analysechemikalien ist die erfindungsgemäße Vorrichtung für unterschiedlichste Arten von Genanalysen wie z.B. Prädispositionsdiagnostik, Erregerdiagnostik und Typisierung einsetzbar. In der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die auch als Einweg-Kartusche ausgeführt sein kann, ist somit eine vollständige genetische Analyse mit geringem apparativem Aufwand durchführbar. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht damit die Durchführung von Nachweisverfahren am Ort des Geschehens, z.B. bei einer Blutspende. Ein Messergebnis kann innerhalb kurzer Zeit, vorzugsweise innerhalb % h bis 2 h, vorliegen. Sämtliche mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchführbaren Schritte wie Aufreinigung, Aufarbeitung, Amplifikation von Nukleinsäuren und die eigentliche Hybridisierung sind automatisch durchführbar. Der Operator muss lediglich mit der Probenentnahme, der Aufgabe der Probe in die erfindungsgemäße Vorrichtung sowie der Kenntnisnahme der Analysenergebnisse vertraut sein.
  • Das gleiche gilt bei Konzentrationsbestimmungen von Targets ohne Verwendung von Sonden, wenn die Targets über absorbierende Eigenschaften verfügen, bzw. bei zytometrischen Anwendungen bzw. Target-Sonden-Wechselwirkungen, die z.B. auf Protein-Protein-Wechselwirkungen beruhen.
  • Vorzugsweise ist der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche in einem Bereich von etwa 0 bis etwa 1 cm veränderbar. Weitere bevorzugte untere Grenzen für den Abstand zwischen erster und zweiter Fläche sind etwa 0,1 µm, etwa 1 µm und etwa 10 µm. Weitere bevorzugte obere Grenzen für den Abstand zwischen erster und zweiter Fläche sind etwa 0,01 mm, etwa 0,5 mm, etwa 1 mm und am meisten bevorzugt etwa 0,3 mm. Überraschenderweise wird die Wechselwirkung zwischen Sonden und Targets auch dann nicht beeinträchtigt, wenn der Abstand zwischen Substrat-Oberfläche und zweiter Fläche nahezu null bzw. etwa null ist.
  • Vorzugsweise umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung ferner ein Detektionssystem. Dabei ist es bevorzugt, dass das Detektionssystem ein optisches System ist. Beispiele für im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete optische Systeme sind Detektionssysteme basierend auf Fluoreszenz, optischer Absorption, Resonanztransfer u. dgl.. Vorzugsweise ist das optische Detektionssystem ein fluoreszenzoptisches System. Besonders bevorzugt ist das fluoreszenzoptische System ein Fluoreszenzmikroskop ohne Autofokus, z.B. ein Fluoreszenzmikroskop mit Fixfokus.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das Detektionssystem mit mindestens einem Abstandshalter verbunden, der bei Auflage auf der zweiten Fläche einen Abstand zwischen dem Detektionssystem und der zweiten Fläche einstellt. Ist der Abstand zwischen erster und zweiter Fläche in etwa null, so legt der Abstandshalter auch den Abstand zwischen der Oberfläche des Chips und dem optischen System des Detektionsgerätes fest. Dies ermöglicht es, die Varianz des Abstands zwischen optischer Detektionsvorrichtung und der Substrat-Oberfläche, auf der die Sonden immobilisiert sind sehr gering zu halten. Die Varianz umfasst lediglich die Dickenvarianz der zweiten Fläche, im Allgemeinen eine Glasfläche, die Durchbiegung der zweiten Fläche sowie die Dicke einer durch etwaige Verunreinigungen an den Anpressflächen zwischen erster und Detektionsebene bzw. zwischen Abstandshalter und Detektionsebene verursachten Schicht. Dadurch wird eine Nachfokussierung zur Scharfstellung der optischen Systems überflüssig, was die Handhabung des Gerätes erheblich vereinfacht und/oder eine kostspielige Autofokuseinrichtung überflüssig macht.
  • In einer weiteren Ausführungsform sind für den zwischen der ersten und zweiten Fläche gebildeten Reaktionsraum seitlich begrenzende Ausgleichsbereiche vorgesehen, die bei Verringerung des Abstands zwischen erster und zweiter Fläche das Volumen in der Reaktionskammer in Wesentlichen konstant halten.
  • Vorzugsweise ist ferner der zwischen der ersten und zweiten Fläche gebildete Reaktionsraum seitlich durch elastische Dichtungen begrenzt. Bei den elastischen Dichtungen handelt es sich besonders bevorzugt um Silikonkautschuk.
  • Um die Detektion von Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen zu gewährleisten, ist die zweite Fläche insbesondere aus einem optisch durchlässigen Material, vorzugsweise Glas ausgestaltet.
  • In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die erste Fläche zumindest in dem Bereich der ersten Fläche, in dem Sonden immobilisiert werden können, derart ausgestaltet, dass die erste Fläche relativ zur zweiten Fläche so führbar ist, dass der Abstand zwischen erster und der zweiten Fläche in dem Bereich der Reaktionskammer veränderbar ist, in dem der Nachweis der Targets erfolgen soll.
  • Dabei kann die erste Fläche zumindest im Bereich, in dem Sonden immobilisiert sein können, derart ausgestaltet sein, dass dieser Bereich in Richtung der zweiten Fläche so führbar ist, dass der Abstand zwischen der ersten Fläche und der zweiten Fläche verringerbar ist und/oder dass die erste Fläche in einer Richtung entgegengesetzt zur zweiten Fläche so führbar ist, dass der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche vergrößerbar ist.
  • Bei dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, dass die erste Fläche zumindest im Bereich, in dem Sonden immobilisiert werden können, elastisch verformbar ist. Besonders bevorzugt ist die erste Fläche aus einem elastischen Kunststoff, z.B. einer elastischen Membran, ausgestaltet.
  • Ferner kann es bevorzugt sein, dass die erste Fläche mittels zweier übereinander liegender Schichten ausgestaltet ist, wobei eine äußere Schicht der beiden übereinander liegenden Schichten zumindest im Bereich, in dem Sonden immobilisiert werden können, eine Aussparung aufweist. Bei dieser Ausgestaltung ist es bevorzugt, dass eine innere der beiden übereinander liegenden Schichten aus einer elastischen Dichtung bzw. einer Dichtungsmembran gebildet ist, die üblicherweise auch den Reaktionsraum seitlich begrenzt (siehe 6). Die Dichtungsmembran ist in Richtung der zweiten Fläche führbar. Durch die Dichtungsmembran wird eine Aussparung der äußeren Schicht, die üblicherweise der Unterseite des Kammerkörpers entspricht, verschlossen. Bei Durchführung einer PCR in der Reaktionskammer entsteht durch die bei einer PCR vorliegenden höheren Temperaturen ein Innendruck, der dazu führt, dass die Reaktionskammer trotz der relativ labilen Dichtungsmembran druckfest ist. Diese Ausgestaltung entspricht somit einem selbst schließenden Ventil. Um die Elastizität der Dichtungsmembran zu gewährleisten, ist die Membran vorzugsweise mit einer Ausgleichsfalte versehen (siehe 6).
  • Ferner kann es vorgesehen sein, dass die Vorrichtung mindestens ein Mittel umfasst, mit dem der Bereich, in dem Sonden immobilisiert werden können, relativ zur zweiten Fläche führbar ist. Dieses Mittel wird im Folgenden auch als Mittel zur Führung der ersten Fläche bezeichnet. Das Mittel zur Führung der ersten Fläche wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Stab, einem Stift, einem Stößel und einer Schraube.
  • Dabei kann die Vorrichtung mindestens ein Mittel zur Führung der ersten Fläche umfassen, mit dem Bereiche der ersten Fläche in Richtung zur zweiten Fläche so führbar sind, dass der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche verringerbar ist, und/oder mit die erste Fläche in einer Richtung entgegengesetzt zur zweiten Fläche so führbar ist, dass der Abstand zwischen der ersten Fläche und der zweiten Fläche vergrößerbar ist.
  • Besonders bevorzugt ist mindestens ein bereich der ersten Fläche durch Druck und/oder Zug des Mittels auf die erste Fläche relativ zur zweiten Fläche führbar.
  • Dabei können die vorstehend genannten auf der zweiten Fläche aufliegenden Abstandshalter als Widerlager für das Mittel zur Führung der ersten Fläche dienen.
  • Ferner kann es bevorzugt sein, dass die erste Fläche durch das Mittel zur Führung der ersten Fläche in Vibration, insbesondere in eine Vibration mit einer Frequenz von 10 bis 30 Hz, besonders bevorzugt von etwa 20 Hz versetzbar ist. Auf diese Weise können oberhalb des Bereichs, in dem Sonden immobilisiert werden können, vorliegende Blasen, die eine Detektion behindern würden, entfernt werden und/oder die Wechselwirkungsgeschwindigkeit, z.B. die Hybridisierungsgeschwindigkeit, durch eine durch die Vibration des Mittels zur Führung der ersten Fläche bedingte Durchmischung erhöht werden.
  • Ebenso kann es bevorzugt sein, dass die zweite Fläche relativ zur ersten Fläche so führbar ist, dass der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche veränderbar ist.
  • Dabei kann die zweite Fläche relativ zur ersten Fläche so führbar sein, dass der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche verringerbar ist und/oder dass der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche vergrößerbar ist.
  • Dies kann insbesondere dadurch gewährleistet werden, indem die zweite Fläche durch Druck und/oder Zug des Abstandshalters auf die zweite Fläche relativ zur ersten Fläche so führbar ist, dass der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche zumindest in dem Bereich, in dem die Detektion der Targets erfolgen soll, veränderbar ist.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist sowohl die erste Fläche als auch die zweite Fläche so führbar, dass der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche veränderbar ist.
  • Bevorzugt sind die erste und/oder zweite Fläche zumindest in den Bereichen, in denen sie gegeneinander führbar sind, aus elastischen Materialien. Solche Materialien sind bevorzugt Silikonelastomere, wie z.B. Sylgard 184, Kautschuk, Silikonkautschuk oder auch elastische Kunststoffe. Als Materialien können auch TEP, Poylurethane und Acryle oder Acrylate in Frage kommen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind diese elastischen Materialien optisch transparent, wie z.B. Silikonkautschuk (bspw. Sylgard 184).
  • Bevorzugt sind die vorgenannten Materialien nicht fluoreszierend.
  • Besonders bevorzugt sind 2-komponentige platinvernetzende Silikonkautschuke (wie z.B. PDMS (Sylgard 184 von Dow Corning)). Diese transparent, biologisch inert und nichtfluoreszent.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Vorrichtung so ausgestaltet, dass die erste Fläche zusammen mit eventuell immobilisierten Sonden bereits im ursprünglichen Zustand auf der die Detektionsebene bildenden zweiten Fläche aufliegt, vorzugsweise bündig aufliegt. Die erste Fläche ist so führbar, dass der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche vergrößerbar ist. Vorzugsweise ist die erste Fläche dabei aus einem elastischen Material gebildet.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die erste Fläche um eine Drehachse schwenkbar ausgestaltet. Die Drehachse unterteilt die erste Fläche in zwei Schenkelabschnitte. Die Sonden können bei dieser Ausgestaltung auf einem ersten Schenkelabschnitt der ersten Fläche angeordnet sein. Die Drehachse für die Schwenkbewegung verläuft vorzugsweise in der Mitte der ersten Fläche, d.h. die beiden Schenkelabschnitte sind vorzugsweise gleich groß. Die erste Fläche ist vorzugsweise aus einem elastischen Material ausgestaltet.
  • In einer ersten Position der schwenkbaren ersten Fläche ist die erste Fläche im Wesentlichen parallel zur zweiten Fläche angeordnet. Die Oberfläche der ersten Fläche liegt zumindest in dem Bereich, in dem Sonden immobilisiert sein können in der ersten Position im Wesentlichen bündig an der zweiten Fläche an, d.h. die Substratoberfläche mit den darauf immobilisierten Sondenmoleküle ist im Wesentlichen nicht von der Probenlösung benetzt. Zwischen dem zweiten Schenkelabschnitt der ersten Fläche und der zweiten Fläche ist in dieser ersten Position ein Raum gebildet, der im Folgenden auch als Prozessierungskammer bezeichnet ist. Diese Prozessierungskammer kann als Kammer für die Prozessierung der Probenlösung dienen.
  • In einer zweiten Position der schwenkbaren ersten Fläche ist die erste Fläche in einem Winkel verschieden von 180° zu der zweiten Fläche angeordnet. Der Bereich der ersten Fläche, in dem Sonden immobilisiert sein können, liegt bei dieser zweiten Position nicht an der zweiten Fläche an, d.h. die auf dem Substrat immobilisierten Sondenmoleküle sind für die in der Probenlösung vorliegenden Targetmoleküle frei zugänglich und können so mit diesen wechselwirken. Die Prozessierungskammer ist in der zweiten Position komprimiert.
  • Die schwenkbare erste Fläche ist vorzugsweise durch Zug auf den ersten Schenkelabschnitt der ersten Fläche und/oder durch Druck auf den zweiten Schenkelabschnitt der ersten Fläche schwenkbar. Der Zug und/oder Druck kann durch ein wie vorstehend beschriebenes Mittel zur Führung der ersten Fläche ausgeübt werden.
  • Der Substrate in den Bereichen der ersten Fläche, in denen Sonden immobilisiert sein können, bzw. die erste Fläche kann vorzugsweise aus Silizium, keramische Materialien wie Aluminiumoxid-Keramiken, Borofloat-Gläsern, Quarzglas, einkristallinem CaF2, Saphir-Scheiben, Topas, PMMA, Polycarbonat und/oder Polystyrol bestehen. Die Wahl der Materialien ist ebenfalls am späteren Verwendungszweck der Vorrichtung auszurichten. Werden die Vorrichtungen zum Beispiel für die Charakterisierung von PCR-Produkten verwendet, dürfen nur solche Materialien eingesetzt werden, die einer Temperatur von 95°C standhalten können.
  • Die Substrate bzw. die Bereiche der ersten Fläche, in denen Sonden immobilisiert sein können, sind bevorzugt durch Nukleinsäuremoleküle, insbesondere durch DNA- oder RNA-Moleküle funktionalisiert. Sie können aber auch durch Peptide und/oder Proteine, wie zum Beispiel Antikörper, Rezeptormoleküle, pharmazeutisch aktive Peptide und/oder Hormone, Kohlenhydrate und/oder Mischpolymere dieser Biopolymere funktionalisiert sein.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die molekularen Sonden über einen Polymer-Linker, beispielsweise eine modifizierte Silanschicht, auf der Substratoberfläche immobilisiert. Ein derartiger polymerer Linker kann der Derivatisierung der Substratoberfläche und somit der Immobilisierung der molekularen Sonden dienen. Im Falle einer kovalenten Anbindung der Sonden finden Polymere, z.B. Silane, Verwendung, die mit reaktiven Funktionalitäten wie Epoxiden oder Aldehyden funktionalisiert bzw. modifiziert sind. Des Weiteren ist dem Fachmann auch die Aktivierung einer Oberfläche durch Isothiocyanat, Succinimidester und Imidoester bekannt. Hierfür werden häufig aminofunktionalisierte Oberflächen entsprechend derivatisiert. Ferner können durch die Zugabe von Kupplungsreagenzien, wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid, entsprechende Immobilisierungen der molekularen Sonden gewährleistet werden.
  • Der Kammerkörper der Reaktionskammer besteht vorzugsweise aus Materialien wie Glas, Kunststoff und/oder Metallen wie Edelstahl, Aluminium und Messing. Zu seiner Herstellung können beispielsweise Spritzguss-geeignete Kunststoffe verwendet werden. Unter anderem sind Kunststoffe wie Makrolon, Nylon, PMMA und Teflon denkbar. Bei speziellen Ausgestaltungen sind elektrisch leitfähige Kunststoffe wie Polyamid mit 5-30% Kohlefasern, Polycarbonat mit 5-30% Kohlefasern, Polyamid mit 2-20% rostfreien Stahlfasern und PPS mit 5-40% Kohlenstofffaser und insbesondere 20-30% Kohlenstofffaser bevorzugt. Alternativ und/oder zusätzlich kann der Reaktionsraum zwischen erster und zweiter Fläche aber auch durch Septen abgeschlossen sein, die beispielsweise ein Befüllen des Reaktionsraums mittels Spritzen ermöglichen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform besteht der Kammerkörper aus optisch durchlässigen Materialien wie Glas, PMMA, Polycarbonat, Polystyrol und/oder Topas. Dabei ist die Wahl der Materialien dem Verwendungszweck der Vorrichtung anzupassen. Zum Beispiel sind die Temperaturen, denen die Vorrichtung ausgesetzt sein wird, bei der Wahl der Materialien zu beachten. Soll die Vorrichtung zum Beispiel für die Durchführung einer PCR verwendet werden, dürfen z.B. nur solche Kunststoffe eingesetzt werden, die über längere Zeiträume bei Temperaturen wie 95°C stabil sind.
  • Der Kammerkörper ist insbesondere so ausgestaltet, dass die erste Fläche zumindest in dem Bereich, in dem Sonden immobilisiert werden können bzw. in dem die Detektion der Targets erfolgen soll mit seiner aktiven Seite, d.h. der Seite des ersten Fläche, auf der z.B. die Nukleinsäuresonden immobilisiert sind, bündig und/oder reversibel an die zweite Fläche gedrückt werden kann.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung Module ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Kammerkörper, vorzugsweise aus Kunststoff; einem die Reaktionskammer abdichtenden Septum bzw. einer Dichtung; und/oder einer zweiten optisch transparenten Fläche, vorzugsweise einer Glasplatte, dienen kann (siehe 2 und 3). Kammerkörper und Dichtung sind bei dieser Ausführungsform elastisch ausgeführt, so dass der Bereich, auf dem z.B. Sonden immobilisiert sind, bündig und reversibel mit seiner aktiven Seite an den Glasdeckel gedrückt werden kann. Dadurch wird die zwischen dem Bereich mit den immobiliserten Sonden und Detektionsfläche befindliche markierte Analyseflüssigkeit komplett verdrängt (siehe 5 und 6). Auf diese Weise kann eine hochempfindliche Fluoreszenzdetektion, z.B. eine computerbildgebende Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden, die nicht durch eine Hintergrundfluoreszenz der Probenlösung beeinträchtigt wird.
  • Die zweite Fläche des Kammerkörpers besteht vorzugsweise aus transparenten Materialien wie Glas und/oder optisch durchlässigen Kunststoffen, z.B. PMMA, Polycarbonat, Polystyrol oder Acryl.
  • Vorzugsweise ist die Reaktionskammer als Kapillarspalt mit variabler Dicke zwischen der zweiten Fläche und der ersten Fläche ausgestaltet. Durch die Ausbildung eines Kapillarspalts zwischen erster und zweiter Fläche können Kapillarkräfte zur sicheren Befüllung der Reaktionkammer genutzt werden. Diese Kapillarkräfte liegen bereits im nicht komprimierten Zustand der Reaktionskammer vor, können jedoch durch Zusammendrücken der Reaktionskammer erhöht werden. Besonders bevorzugt weist der Kapillarspalt eine Dicke im Bereich von etwa 0 µm bis etwa 100 µm auf.
  • Durch die Möglichkeit, den Reaktionsraum komprimieren zu können und damit die Spaltbreite zwischen erster und zweiter Fläche zumindest in dem Bereich, in dem Sonden immobilisiert sein können bzw. die Detektion der Targets stattfinden soll, verringern zu können, ergeben sich weitere Möglichkeiten für die Handhabung der Flüssigkeit innerhalb der Reaktionskammer. So sind bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung anstelle einer einzigen Kammer mehrere Unterkammern vorgesehen, wobei die Abtrennungen zwischen den Unterkammern nicht bis zur zweiten Fläche hochgezogen sind, so dass zwischen den Unterkammern im nicht komprimierten Zustand der Reaktionskammer eine fluidische Verbindung besteht. Durch Komprimierung der Reaktionskammer können die Kammern voneinander abgetrennt werden. Damit lassen sich die Zwischenwände zwischen den Kammern durch Zusammenpressen wie Ventile handhaben.
  • Eine spezielle Ausgestaltung dieser durch Ventile getrennten Unterkammern ist die Unterteilung des Reaktionsraums der erfindungsgemäßen Vorrichtung in verschiedene PCR-Kammern. In jede Kammer werden individuelle Primer vorgelegt. Die Unterkammern werden zu Beginn mit dem Analyten, d.h. der die Targets enthaltenden Lösung, gleichzeitig befüllt. Anschließend wird der Reaktionsraum komprimiert. Danach durchläuft der Reaktionsraum den Temperaturzyklus für die PCR. Da jede Unterkammer mit unterschiedlichen Primern befüllt ist, findet in jeder Kammer eine andere Amplifikationsreaktion statt. Ein Austausch zwischen den Kammern findet nicht statt.
  • Nachdem die PCR durchgeführt wurde, findet die Hybridisierung statt. Dabei kann jede Unterkammer individuelle Sonden beinhalten. Es ist aber auch möglich, durch Vergrößerung des Abstands zwischen erster und zweiter Fläche eine fluidische Verbindung zwischen den Unterkammern zu ermöglichen, so dass sich die verschiedenen Amplifikate miteinander vermischen und auf diese Weise an den Sonden hybridisieren.
  • Der Vorteil dieser Ausführungsform mit durch Ventile getrennten Unterkammern besteht in der Erhöhung der Multiplexität der PCR, also der Anzahl von einander unabhängigen PCR's mit einer Probe, die bei einer Eintopfreaktion aus biochemischen Gründen limitiert ist. So ist es möglich, die Zahl der PCR's der möglichen Anzahl an Sonden anzupassen.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Reaktionskammer somit mindestens zwei Unterkammern, wobei in einem ersten nicht komprimierten Zustand die Unterkammern fluidisch miteinander verbunden sind und in einem zweiten komprimierten Zustand keine fluidische Verbindung zwischen den Unterkammern besteht.
  • Besonders bevorzugt ist jede Unterkammer definierten Bereichen der ersten Fläche zugeordnet.
  • Die Unterkammern können insbesondere dadurch gebildet sein, indem die erste Fläche und/oder die zweite Fläche mit Kavitäten versehen sind, die als Wände zwischen den Unterkammern dienen.
  • Besonders bevorzugt sind die Wände zwischen den Unterkammern durch elastische Dichtungen gebildet.
  • Selbstverständlich kann diese Ausgestaltung der Prozesseinheit mit durch Ventile getrennten Unterkammern mit sämtlichen vorstehend beschriebenen Kompressionsprinzipen beliebig kombiniert werden.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die erste Fläche aus einem teilweise deformierbaren elastischen Material gebildet, z.B. aus einer elastischen Membran. Indem nur ein Teil des Reaktionsraums zusammengedrückt werden kann, können unter anderem Unterkammern, in denen die erste Fläche in Richtung der zweiten Fläche geführt wird, Unterkammern, die sich voneinander trennen lassen, sowie Unterkammern, die sich nicht verändern können, erzeugt werden. Dadurch lassen sich im Reaktionsraum einfache Pumpensysteme realisieren, die z.B. dafür verwendet werden können, am Ende einer Vervielfältigungsreaktion Salze in die Hybridisierungskammer zu pumpen. Dies kann vorteilhaft sein, um z.B. die chemischen Hybridisierungsbedingungen des PCR-Puffers zu optimieren, wobei der PCR-Puffer nur für die Durchführung der PCR optimiert ist.
  • Bei Unterteilung der Reaktionskammer in mehrere Unterkammern ist es bevorzugt, mehrere Mittel zur Agitierung einzusetzen. Üblicherweise sind die Mittel zur Agitierung identisch mit den Mitteln zur Führung der ersten Fläche. Dadurch lassen sich einzelne Kammern gezielt agitieren. Dies kann z.B. sinnvoll sein, um getrennte Vervielfältigungsräume und/oder Hybridisierungsräume zu realisieren.
  • Selbstverständlich kann auch diese Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit mehreren Agitationsmitteln mit sämtlichen vorstehend beschriebenen Kompressionsprinzipen beliebig kombiniert werden.
  • Die vorstehend beschriebenen Bauteile bzw. Module der erfindungsgemäßen Vorrichtung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Kammerkörper, den Reaktionsraum seitlich begrenzenden Dichtungen, erster Fläche und Detektionsfläche, bilden die sog. Prozesseinheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung. In der Prozesseinheit sind z.B. PCR, Hybridisierungsreaktionen, Detektion und/oder Auswertung durchführbar. Dies gilt gleichermaßen wenn Sonden und Targets z.B. Antikörper und nachzuweisende Proteine sind, eine PCR also nicht durchgeführt werden braucht. Dennoch werden die folgenden Ausführungen vor allem im Hinblick auf Nachweisverfahren mit Nukleinsäuretarrgets bzw. -sonden gemacht. Dem Fachmann ist aber klar, wie er die im folgenden beschrieben Einheiten modifizieren muss, um sie für andere Anwendungen zu adaptieren.
  • Die Prozesseinheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist vorzugsweise modular aufgebaut. Das heißt, die Prozesseinheit kann eine beliebige Kombination der Module umfassen. Die Module können auch während der Analyse ausgetauscht werden.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung zusätzlich eine Temperatursteuerungs- und/oder -regeleinheit zur Steuerung und/oder Regelung der Temperatur in der Reaktionskammer. Eine derartige Temperatursteuerungs- und/oder -regeleinheit zur Steuerung und/oder Regelung der Temperatur in der Reaktionskammer umfasst insbesondere Heiz- und/oder Kühlelemente bzw. Temperaturblöcke. Die Heiz- und/oder Kühlelemente bzw. die Temperaturblöcke können dabei so angeordnet sein, dass sie die erste Fläche und/oder die zweite Fläche kontaktieren. Durch einen Kontaktierung sowohl der ersten als auch der zweiten Fläche wird eine besonders effektive Temperatursteuerung und -regelung gewährleistet.
  • Bei dieser Ausführungsform ist das Substrat, auf dem Sonden immobilisiert sein können bzw. die erste Fläche und/oder die zweite Fläche mit Heiz- und/oder Kühlelementen und/oder Temperaturblöcken verbunden und sollte dann bevorzugt aus Materialien bestehen, die gut wärmeleitend sind. Derartige wärmeleitfähige Materialien bieten den wesentlichen Vorteil, dass sie ein homogenes Temperaturprofil über die gesamte Fläche des Reaktionsraums gewährleisten und somit temperaturabhängige Reaktionen wie beispielsweise eine PCR in der gesamten Reaktionskammer homogen, mit hoher Ausbeute und mit hoher Genauigkeit steuerbar bzw. regelbar durchführbar sind.
  • Somit bestehen das Substrat, auf dem Sonden immobilisiert sein können, bzw. die erste Fläche bzw. die zweite Fläche bei einer bevorzugten Ausführungsform aus Materialien mit einer hohen Wärmeleitfähigkeit, vorzugsweise mit einer Wärmeleitfähigkeit im Bereich von 15 bis 500 Wm–1K–1, besonders bevorzugt im Bereich von 50 bis 300 Wm–1K–1 und am meisten bevorzugt im Bereich von 100 bis 200 Wm–1K–1, wobei die Materialien üblicherweise nicht optisch transparent sind. Beispiele für geeignete wärmeleitfähige Materialien sind Silizium, keramische Materialien wie Aluminiumoxid-Keramiken und/oder Metalle wie Edelstahl, Aluminium, Kupfer oder Messing.
  • Besteht das Substrat, auf dem Sonden immobilisiert sein können, bzw. die erste Fläche bzw. die zweite Fläche der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Wesentlichen aus keramischen Materialien, so werden vorzugsweise Aluminiumoxid-Keramiken eingesetzt. Beispiele für derartige Aluminiumoxid-Keramiken sind die Keramiken A-473, A-476 sowie A-493 der Firma Kyocera (Neuss, Deutschland).
  • Vorzugsweise ist das Substrat, auf dem Sonden immobilisiert sein können, bzw. die erste Fläche bzw. die zweite Fläche auf der Rückseite, d.h. der der Reaktionskammer abgewandten Seite mit ggf. miniaturisierten Temperaturfühlern und/oder Elektroden versehen bzw. weist dort Heizerstrukturen auf, so dass ein Temperieren der Probenflüssigkeit sowie eine Durchmischung der Probenflüssigkeit durch einen induzierten elektroosmotischen Fluss möglich ist.
  • Die Temperaturfühler können beispielsweise als Nickel-Chrom-Dünnfilm-Widerstandstemperaturfühler ausgeführt sein.
  • Die Elektroden können beispielsweise als Gold-Titan-Elektroden und insbesondere als Quadrupol ausgeführt sein.
  • Die Heiz- und/oder Kühlelemente können vorzugsweise so gewählt werden, dass ein schnelles Erhitzen und Abkühlen der Flüssigkeit in der Reaktionskammer möglich ist. Unter schnellem Erhitzen und Abkühlen wird dabei verstanden, dass durch die Heiz- und/oder Kühlelemente Temperaturänderungen in einem Bereich von 0,2 K/s bis 30 K/s, vorzugsweise von 0,5 K/s bis 15 K/s, besonders bevorzugt von 2 K/s bis 15 K/s und am meisten bevorzugt von 8 K/s bis 12 K/s oder etwa 10 K/s vermittelt werden können. Vorzugsweise können durch die Heiz- und/oder Kühlelemente auch Temperaturänderungen von 1 K/s bis 10 K/s vermittelt werden.
  • Die Heiz- und/oder Kühlelemente, z.B. Widerstandsheizer, können beispielsweise als Nickel-Chrom-Dünnfilm-Widerstandsheizer ausgeführt sein.
  • Für weitere Einzelheiten über die Spezifikation und Dimension der Temperaturfühler, Heiz- und/oder Kühlelemente bzw. Mittel zur Temperaturbeaufschlagung und der Elektroden wird auf den Inhalt der internationalen Patentanmeldung WO 01/02094 verwiesen.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Temperierung der Reaktionskammer dadurch gewährleistet, dass ein Kammerkörper aus elektrisch leitfähigem Material eingesetzt wird. Ein derartig elektrisch leitfähiges Material ist vorzugsweise ein elektrisch leitfähiger Kunststoff, wie z.B. Polyamid, ggf. mit 5-30% Kohlefasern, Polycarbonat, ggf. mit 5-30% Kohlefasern und/oder Polyamid, ggf. mit 2-20% rostfreien Stahlfasern. Vorzugsweise wird als elektrisch leitfähiger Kunststoff PPS (Polyphenylensulfid) mit 5-40% Kohlenstofffaser, besonders bevorzugt 20-30% Kohlenstofffaser eingesetzt. Ferner ist es bevorzugt, dass der Kammerkörper so ausgestaltetet ist, dass er Verdickungen bzw. Verjüngungen aufweist. Derartige Verdickungen bzw. Verjüngungen im Kammerkörper ermöglichen eine gezielte Beheizung der Reaktionskammer bzw. der entsprechenden Flächen. Die Verwendung derartiger Volumenleiter hat ferner den Vorteil, dass auch bei ggf. geringerer Wärmeleitfähigkeit des eingesetzten Materials eine homogene Temperierung der Kammer bzw. der entsprechenden Flächen gewährleistet ist, da in jedem Volumenelement Wärme freigesetzt wird.
  • Die Einkopplung und Abführung der Wärme in den Reaktionsraum kann auf unterschiedliche Arten erfolgen. Es ist unter anderem vorgesehen, die Wärme über externe Mikrowellenstrahlung, interne oder externe Widerstandsheizung, interne Induktionsschleifen oder -flächen, durch Wasserkühlung und -heizung, durch Reibung, durch Bestrahlung mit Licht, insbesondere IR-Licht, durch Luftkühlung und/oder -heizung, durch Reibung, durch Temperaturstrahler sowie durch Peltierelemente einzubringen.
  • Die Temperaturmessung im Reaktionsraum kann auf unterschiedlichen Arten erfolgen, beispielsweise durch integrierte Widerstandssensoren, Halbleitersensoren, Lichtwellenleitersensoren, pyrochrome Farbstoffe, pyrochrome Flüssigkristalle, externe Pyrometer wie IR-Strahlung und/oder im Mittel zur Führung der ersten Fläche integrierte Temperatursensoren aller Art.
  • Die Messung der Temperatur in der Reaktionskammer kann ferner vorgenommen werden durch Integration eines Temperatursensors in den Kammerkörper, z.B. durch Einspritzen im Laufe des Herstellungsprozesses der Kammerkörpers, durch berührungsfreie Messung mit Hilfe eines Pyrometers, eines IR-Sensors und/oder Thermopiles, durch berührende Messung, z.B. durch einen in der Vorrichtung integrierten und eine geeignete Fläche oder ein geeignetes Volumen des Kammerkörpers oder der Kammer kontaktierenden Temperatursensor, durch Messung der temperaturabhängigen Änderung des Brechungsindex an der Detektionsfläche, durch Messung der temperaturabhängigen Änderung der Farbe von speziellen Molekülen z.B. in der Lösung, auf der ersten Fläche bzw. dem Substrat, auf dem Sonden immobilisiert sein können, bzw. in der Kammerdichtung und/oder durch Messung der temperaturabhängigen Änderung des pH-Wertes der verwendeten Lösung durch Messung der Farbänderung eines pH-sensitiven Indikators bspw. durch Messung von dessen Absorption Außerdem kann eine selbsttätige Begrenzung der Temperatur durch einen sprunghaften Anstieg des Widerstandes des Heizers erfolgen, wobei die entsprechende Sprungtemperatur vorzugsweise in einem Bereich von 95°C bis 110°C liegt. Bei der Sprungtemperatur ändert sich der Widerstand des Heizers sprungartig nach oben, wodurch nahezu kein Strom mehr fliest und demzufolge kaum mehr Wärme frei wird. Als Material für derartige Heizer können insbesondere Polymere wie elektrisch leitfähige Polyamide eingesetzt werden, deren Widerstand sich bei der Sprungtemperatur aufgrund der Veränderung der Matrix des Polymers oder einer Phasenänderung erhöht.
  • Die Temperatursteuerungs- und -regeleinheit kann bei einer Ausgestaltung in die erste Fläche und/oder zweite Fläche integriert sein. Bei dieser Ausführungsform ist die Prozesseinheit insbesondere mit einem Heizer ausgestattet (siehe 4), der zur Realisierung der Temperaturwechsel bei PCR und Hybridisierung dient.
  • Die Prozesseinheit weist vorzugsweise eine geringe Wärmekapazität auf, so dass bei geringem Energiebedarf maximale Temperaturwechselgeschwindigkeiten von z.B. mindestens 5 K/s realisierbar sind. Um eine schnelle Abkühlung der Prozesseinheit zu gewährleisten, ist bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die Bereitstellung einer Kühlung, z.B. einer Luftkühlung, vorgesehen.
  • Die Abkühlung der Prozesseinheit kann bevorzugt auch dadurch erreicht werden, dass der die Prozesseinheit umgebende Raum permanent auf einer erniedrigten Temperatur temperiert und die Kartusche dadurch passiv gekühlt wird. Dadurch wird eine aktive Kühlung der Reaktionskartusche unnötig.
  • Bei einer weiteren Ausgestaltung kann die Temperatursteuerungs- und -regeleinheit Temperaturblöcke umfassen, die jeweils auf eine definierte Temperatur vorgeheizt sind. Insbesondere weist die Prozesseinheit bei dieser Ausführungsform keinen integrierten Heizer auf. Durch den Wegfall einer integrierten Heizeinrichtung kann die Bereitstellung der Prozesseinheit noch kostengünstiger durchgeführt werden.
  • Die Wärmeübertragung zwischen den Temperaturblöcken der Temperatursteuerungs- und -regeleinheit wird vorzugsweise dadurch gewährleistet, dass die Temperaturblöcke die erste Fläche und/oder zweite Fläche der erfindungsgemäßen Vorrichtung kontaktieren. Die Temperaturblöcke können vorzugsweise linear oder auf einem Drehteller angeordnet sein und so beispielsweise in der Detektionsvorrichtung integriert sein. 7 zeigt einen Drehteller, der mehrere Temperaturblöcke aufweist, die jeweils auf eine definierte Temperatur eingestellt sind. Durch Wechsel der Temperaturblöcke unter der Prozesseinheit wird die Prozesseinheit auf eine jeweilige durch den Temperaturblock definierte Temperatur gebracht. Die Temperaturblöcke sind vorzugsweise so gefertigt, dass sie eine deutlich höhere Wärmekapazität als die Prozesseinheit aufweisen, so dass auch bei dieser Ausführungsform maximale Temperaturwechselgeschwindigkeiten von z.B. mindestens 5 K/s realisierbar sind. Vorzugsweise werden die Temperaturblöcke lediglich thermostatisiert und nicht geheizt oder gekühlt, so dass auch hier der Energiebedarf minimal ist. Auf eine Kühlung der Prozesseinheit kann bei dieser Ausführungsform verzichtet werden.
  • Bei einer weiteren Ausgestaltung ist die Temperatursteuerungs- und regeleinheit in das bzw. die Mittel zur Führung der ersten Fläche und/oder das bzw. die Mittel zur Agitierung und/oder den Abstandshalter integriert. Die Wärmeübertragung erfolgt bei dieser Ausgestaltung durch Kontaktierung des Mittels und/oder des Abstandshalters mit der ersten Fläche und/oder der zweiten Fläche.
  • Vorzugsweise umfasst die Vorrichtung zusätzlich eine Aufarbeitungseinheit zur Reinigung und/oder Aufkonzentration der Probenlösung und/oder Steuerung des Be- und/oder Entladens der Reaktionskammer mit Fluiden. Unter Fluiden werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Flüssigkeiten oder Gase verstanden. Darüber hinaus kann die Analysenlösung in der Aufarbeitungseinheit umgepuffert werden. Die Aufarbeitungseinheit kann schließlich auch zur Bereitstellung mit den notwendigen Analysenchemikalien genutzt werden. Die Verbindung der Fluidbehälter mit der Reaktionskammer kann beispielsweise wie in der internationalen Patentanmeldung WO 01/02094 ausgeführt sein.
  • Besonders bevorzugt sind bei dieser Ausführungsform die Reaktionskammer und die Aufarbeitungseinheit über zwei Kanülen miteinander verbunden, wobei die Kanülen so angeordnet sind, dass eine erste Kanüle die Zuführung von Fluiden aus der Aufarbeitungseinheit in die Reaktionskammer gewährleistet und eine zweite Kanüle das Entweichen der durch die zugeführten Fluide aus der Reaktionskammer verdrängten Luft gewährleistet. Eine in die Aufarbeitungseinheit gegebene Probe kann so über die Kanülen in die Reaktionskammer der Prozesseinheit gelangen. Zu diesem Zweck sind die Kanülen derart angeordnet, dass sie durch die Kanülenführung in die Reaktionskammer reichen.
  • Die Aufarbeitungseinheit kann so ausgestaltet sein, dass sie von der Prozesseinheit abtrennbar ist. Nach Befüllung der Reaktionskammer mit der Probenlösung und ggf. weiteren Reaktionsflüssigkeiten kann so die Aufarbeitungseinheit von der Prozesseinheit getrennt, vorzugsweise abgezogen, und ggf. entsorgt werden.
  • Im Folgenden werden Ausführungsformen von integrierten oder nicht integrierten Einheiten zur Befüllung der Reaktionskammer beschrieben, die im Folgenden auch als Befülleinheit oder Aufarbeitungseinheit bezeichnet wird.
  • Üblicherweise wird die Reaktionslösung mit einem geeigneten Werkzeug, beispielsweise mit einer Pipette in eine bestimmte Öffnung der Befülleinheit eingebracht. Die Beförderung der Flüssigkeiten in die Vorrichtung erfolgt über den Druck der Pipette, oder durch ein weiteres druckerzeugendes Werkzeug wie z.B. eine Spritze oder einer automatisierten Einheit, die beispielsweise funktionaler Bestandteil eines Prozessierungsautomaten ist.
  • Die Befülleinheit ist vorzugsweise in ergonomisch sinnvoller Weise für die manuelle Bedienbarkeit ausgestaltet. Ferner weist sie vorzugsweise leicht zugängliche Öffnungen an den Außenseiten zur Einbringung der reaktiven Substanzen auf.
  • Eine Befülleinheit umfasst ferner vorzugsweise ein geeignetes fluidisches Interface zum Durchdringen der Dichtung des Kammerkörpers. Hierzu werden insbesondere Kanülen verwendet, die beispielsweise aus Edelstahl oder Polymeren sind und üblicherweise Durchmesser von 0.05 mm bis 2 mm aufweisen. Vorzugsweise sind mindestens eine oder mehrere Kanülen angeordnet, besonders bevorzugt zwei, wobei eine zum Befüllen mit einer reaktiven Flüssigkeit und eine andere zum Entlüften des Reaktionsraumes und zur Aufnahme von Überschüssigen Flüssigkeiten Verwendung finden kann. Derartige Kanülen können fest oder austauschbar mit der Befülleinheit verbunden sein, wobei vorzugsweise eine vom Anwender nichtlösbare Verbindung zur Realisierung von Befüll-Einwegartikeln realisiert ist.
  • Die Befülleinheit kann ferner eine Einheit zur Abdeckung der Kanülen umfassen, so dass nach der Trennung der Systeme verhindert werden kann, dass sich der Anwender an den Kanülen verletzt oder die Umgebung kontaminiert wird.
  • Die Befülleinheit umfasst ferner vorzugsweise ein geeignetes mechanisches Interface zur passgenauen Kontaktierung der Reaktionskartusche. Dieses Interface kann z.B. durch spezielle Schnappverschlüsse ausgeführt sein. Auf diese Art und Weise kann eine Durchdringung der Dichtung der Kammerkörpers an bevorzugten Stellen gewährleistet werden.
  • Bei der Prozessierung der Reaktionskartusche in entsprechenden Prozessierungsautomaten sind geeignete mechanische Vorkehrungen zu treffen, die eine Justage und lagegenaue Positionierung in den Geräten zulassen. Dieses bezieht sich insbesondere auf die Positionierung für den Austausch und/oder die Zufuhr von Flüssigkeiten und die Positionierung der Reaktionskartusche zur Detektion der Signale nach der Durchführung der Reaktionen in der Reaktionskammer.
  • Die Vorrichtung bzw. die Befülleinheit kann ferner einen integrierten Abfallbehälter umfassen, der zur Aufnahme überschüssiger oder verdrängter gasförmiger oder flüssiger Medien wie z.B. Schutzgasfüllungen oder Puffer dient. Der Abfallbehälter kann beispielsweise mit einem weiteren gasförmigen, flüssigem oder festem Medium gefüllt sein, welches die flüssigen oder gasförmigen Substanzen reversibel oder irreversibel bindet, wie z.B. Zellulose, Filtermaterialien, Silicagele. Des Weiteren kann der Abfallbehälter über eine Entlüftungsöffnung verfügen oder zur Verbesserung des Befüllverhaltens der Gesamteinheit mit einem Unterdruck ausgestattet sein.
  • Der Abfallbehälter kann alternativ auch als getrenntes Modul ausgeführt sein. In diesem Falle ist die Befülleinheit mit entsprechenden nach außen führenden fluidischen Interfaces, die kommerziellen Standards wie z.B. LuerLock entsprechen können, ausgestattet. Solche Interfaces können einen Form- oder Kraftschluß zu weiterführenden Systemen aufweisen.
  • Bei einer ersten speziellen Ausführungsform erfolgt die Befüllung mit einer abnehmbaren Befülleinheit mit integriertem Abfallbehälter. Die Befülleinheit dient insbesondere zur einmaligen Befüllung der Reaktionskammer. Die Befülleinheit ist beispielsweise so ausgeführt, dass diese an die Kartusche gesteckt oder vorübergehend befestigt wird, die Proben in den Reaktionsraum eingebracht werden, und nach erfolgter Befüllung die Befülleinheit wieder der Kartusche getrennt und entsorgt wird. Bei dieser speziellen ersten Ausführungsform umfasst die Befülleinheit ferner einen integrierten Abfallbehälter, der wie vorstehend beschrieben ausgestaltet sein kann. Ein Beispiel für diese Ausführungsform ist in 22 gezeigt. Der Ablauf zur Befüllung einer Reaktionskartusche mit einer modularen Befülleinheit ist in 23 gezeigt.
  • Bei einer zweiten speziellen Ausführungsform erfolgt die Befüllung mit einer integrierten Befülleinheit. Hier ist die Befülleinheit integrativer Bestandteil der Reaktionskartusche und wird demzufolge nicht von dieser getrennt, die Entsorgung der Befülleinheit und der Kartusche erfolgt gleichzeitig. Die Befülleinheit wird dabei vorzugsweise zur einmaligen Befüllung der Reaktionskammer und möglicherweise für weitere prozessinterne Fluidschritte verwendet. Die Befülleinheit umfasst bei dieser Ausführungsform ferner vorzugsweise eine technische Einrichtung, die eine Vorzugsstellung der Kanülen im System realisiert, insbesondere um ein unbeabsichtigtes Einstechen der Kanülen in die Dichtung des Kammerkörpers zu verhindern. Es ist aber auch denkbar, dass in dieser Vorzugsstellung die Kanülen in die Dichtung des Kammerkörpers einstechen. Diese technische Einrichtung kann beispielsweise durch das Einbringen von Federn, elastischen Elementen oder bestimmten Vertiefungen und Erhöhungen zur Realisierung einer Rastung realisiert werden. Die Befülleinheit umfasst bei dieser Ausführungsform ferner einen Befüll- und Abfallkanal, welcher entsprechende nach außen führende fluidische Interfaces umfasst, die auch kommerziellen Standards wie z.B. LuerLock entsprechen können. Solche Interfaces können einen Form- oder Kraftschluß zu weiterführenden Systemen aufweisen und dienen der Zuführung und/oder Abführung gasförmiger und/oder flüssiger Medien. Ein Beispiel für diese Ausführungsform ist in 24 gezeigt. Der Ablauf zur Befüllung einer Reaktionskartusche mit einer integrierten Befülleinheit ist in 25 gezeigt.
  • Bei einer dritten speziellen Ausführungsform erfolgt die Befüllung mit einer integrierten Befülleinheit mit integriertem Abfallbehälter. Die Befülleinheit ist bei dieser Ausführungsform integrativer Bestandteil der Reaktionskartusche und wird demzufolge nicht von dieser getrennt, die Entsorgung der Befülleinheit und der Kartusche erfolgt gleichzeitig. Die Befülleinheit wird dabei vorzugsweise zur einmaligen Befüllung der Reaktionskammer und möglicherweise für weitere prozessinterne Fluidschritte verwendet. Die Befülleinheit umfasst auch bei dieser Ausführungsform ferner vorzugsweise eine technische Einrichtung, die eine Vorzugsstellung der Kanülen im System realisiert, vorzugsweise um ein unbeabsichtigtes Einstechen der Kanülen in die Dichtung des Kammerkörpers zu verhindern. Es ist aber auch denkbar, dass in dieser Vorzugsstellung die Kanülen in die Dichtung des Kammerkörpers einstechen. Diese technische Einrichtung kann beispielsweise durch das Einbringen von Federn, elastischen Elementen oder bestimmten Vertiefungen und Erhöhungen zur Realisierung einer Rastung realisiert werden. Die Befülleinheit umfasst bei dieser Ausführungsform ferner einen integrierten Abfallbehälter, der wie vorstehend beschrieben ausgestaltet sein kann. Ein Beispiel für diese Ausführungsform ist in 26 gezeigt. Der Ablauf zur Befüllung einer Reaktionskartusche mit einer integrierten Befülleinheit und integriertem Abfallbehälter kann beispielsweise durch Kombination der in den 23 und 25 beschriebenen Vorgehensweisen erfolgen.
  • Im Folgenden wird eine spezielle Ausführungsform zur Anordnung von Kanülen zum Druckausgleich während des Quetschvorgangs beschrieben. Die Kanülen eines Befülltools für die Kartusche können beispielsweise derart angeordnet sein, dass sowohl eine Befüllung im entspannten Zustand als auch die Überführung der überschüssigen Reaktionslösungen bei Zusammenquetschen des Reaktionsraumes möglich ist. Erreicht werden kann dies vorzugsweise durch eine angepasste Konstruktion der Dichtung und der Kanülenanordnung, bei der die Kanülen bevorzugt in die Ausgleichsbereiche innerhalb der Reaktionskammer einstechen. Eine solche Anordnung ist insbesondere sinnvoll, wenn das überschüssige Volumen nicht durch eine spezielle Dichtungsgestaltung aufgenommen werden kann. Ein Beispiel für eine mögliche vertikale Kanülenanordnung bei unveränderter Dichtungsform ist in 27 gezeigt.
  • Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann ferner eine mit dem Detektionssystem verbundene Einheit zur Steuerung des Testablaufs und/oder zur Verarbeitung von durch das Detektionssystem aufgenommenen Signalen umfassen. Die Steuerungs- und/oder Verarbeitungseinheit kann ein Mikrocontroler oder Industrierechner sein. Diese Kopplung von Detektiereinheit und Verarbeitungseinheit, die die Umwandlung der Reaktionsergebnisse in das Analyseergebnis gewährleistet, erlaubt unter anderem den Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Handgerät beispielsweise in der medizinischen Diagnostik.
  • Ferner weist die erfindungsgemäße Vorrichtung vorzugsweise zusätzlich eine Schnittstelle für externe Rechner auf. Dies erlaubt unter anderem die Übertragung von Daten zur Speicherung außerhalb der Vorrichtung.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Vorrichtung mit einer Codierung, vorzugsweise einer Datenmatrix und/oder einem Barcode, versehen, die Informationen über die Substanzbibliothek und/oder die Durchführung der Vervielfältigungs- und/oder Nachweisreaktion enthält. Durch eine derartige individuelle Identifikationsnummer kann das Auslese- bzw. Detektionsgerät automatisch erkennen, welcher Test durchgeführt wurde. Dazu wird bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ein Datensatz in einer Datenbank gespeichert, welcher Informationen über die Substanzbibliothek, die Durchführung der Nachweisreaktion und dergleichen enthält. So kann der Datensatz insbesondere Informationen über die Art und Anordnung der Sonden sowie Informationen darüber enthalten, wie die Auswertung am vorteilhaftesten zu erfolgen hat. Der Datensatz bzw. die Datenmatrix kann ferner Informationen über das Temperatur-Zeit-Regime einer ggf. durchzuführenden PCR zur Vervielfältigung der Zielmoleküle enthalten. Der so erstellte Datensatz erhält vorzugsweise eine Nummer, die in Form der Datenmatrix auf der Halterung angebracht wird. Über die in der Datenmatrix verzeichnete Nummer kann dann ggf. beim Auslesen der Substanzbibliothek der angelegte Datensatz aufgerufen werden. Schließlich kann die Datenmatrix von der Temperatursteuerungs- bzw. -regeleinheit und anderen Controllern wie z.B. einer Steuerung für die Be- und Entfüllung der Reaktionskammer über die Fluidbehälter ausgelesen werden und so eine automatische Durchführung von Vervielfältigungs- und Nachweisreaktion gewährleistet werden.
  • Die Codierung wie eine Datenmatrix muss nicht zwingend die komplette Information beinhalten. Sie kann auch einfach eine Identifikation bzw. Kennung enthalten, mittels der dann aus einem Rechner oder von einem Datenträger die erforderlichen Daten zugeladen werden.
  • Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist äußerst fertigungsfreundlich. In 3 ist gezeigt, dass die Prozesseinheit aus nur vier Einzelbauteilen bestehen kann, die auf einfache Weise ineinander gelegt werden. Wenn das Substrat der 3 nicht als eigenes Bauteil ausgeführt ist, sondern lediglich einen Bereich in der ersten Fläche, d.h. der elastischen Membran darstellt, werden sogar nur vier Einzelbauteile benötigt. In den 10 und 11 sind Ausführungsformen dargestellt, die aufgrund der erfindungsgemäßen Konstruktion ebenfalls fertigungsfreundlich sind, obwohl sie aus mehreren Teilen bestehen. Die geometrischen Toleranzen der Abmessungen der Einzellbauteile können mit z.B. 1/10 bis 2/10 mm sehr groß ausfallen, so dass z.B. die Spritzgussfertigung von Dichtung und Kammerkörper großtechnisch äußerst kostengünstig durchgeführt werden kann. Die geringen Toleranzen werden durch das Anpressen z.B. des Substrats bzw. des Teils der ersten Fläche, in dem Sonden immobilisiert sein können bzw. in dem der Nachweis der Targets erfolgt, an die Detektionsebene ermöglicht, da dadurch der optische Weg zum Detektionsmikroskop kaum durch die Bauteile der Prozesseinheit beeinflusst wird. Die einzigen geometrischen Größen, die eine geringe Toleranz aufweisen, sind die x,y-Lage des Chips und die Dicke der Detektionsebene. Hingegen spielt die Varianz der z-Lage des Substrats nur eine untergeordnete Rolle. Trotz dieser geringen technischen Anforderungen ist eine Fokussierungseinrichtung am optischen System, z.B. einem Fluoreszenzdetektionsmikroskop, nicht erforderlich. Diese Eigenschaften verdeutlichen die Eignung der erfindungsgemäßen Vorrichtung für den mobilen Vororteinsatz.
  • Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen bereitgestellt, dass die folgenden Schritte umfasst:
    • a) Einbringen einer Probe, vorzugsweise einer Probenlösung umfassend Targets bzw. Targetmoleküle in eine Reaktionskammer einer wie vorstehend beschriebenen Vorrichtung; und
    • b) Detektieren einer Wechselwirkung zwischen den Targetmolekülen und den Sondenmolekülen, die z.B. auf einem Substrat immobilisiert sein können.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht den qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen in einer Reaktionskammer, ohne dass nach der erfolgten Wechselwirkung und vor der Detektion ein Austausch der Proben- bzw. Reaktionsflüssigkeiten zur Entfernung eines störenden Hintergrunds erforderlich ist.
  • Der Nachweis einer Wechselwirkung zwischen der Sonde und dem Targetmolekül erfolgt im Rahmen der vorliegenden Erfindung z.B. folgendermaßen: Nach der Fixierung der Sonde bzw. der Sonden in vorgegebener Art und Weise an ein Substrat, bei dem es sich z.B. um einen Bereich der ersten Fläche einer oben beschriebenen Vorrichtung handeln kann, werden die Targets in einer Lösung mit den Sonden in Kontakt gebracht und unter definierten Bedingungen inkubiert. Infolge der Inkubation findet zwischen Sonde und Target eine spezifische Wechselwirkung bzw. Hybridisierung statt. Die Sonden müssen aber nicht immobilisiert sein. Vielmehr ist es ausreichend, dass es zu einer stabilen Wechselwirkung zwischen Sonden und Targets kommt. Die dabei auftretende Bindung ist deutlich stabiler als die Bindung von Targetmolekülen an Sonden, die für das Targetmolekül nicht spezifisch sind.
  • Der Nachweis bzw. die Detektion der spezifischen Wechselwirkung zwischen einem Target und seiner Sonde kann dann durch eine Vielzahl von Methoden erfolgen, die in der Regel von der Art des Markers abhängen, der vor, während oder nach der Wechselwirkung des Targetmoleküls mit der Sonde in Targetmoleküle eingebracht worden ist. Typischerweise handelt es sich bei solchen Markern um fluoreszierende Gruppen, so dass spezifische Target-Sonden-Wechselwirkungen mit hoher Ortsauflösung und im Vergleich zu anderen herkömmlichen Nachweismethoden, vor allem massensensitiven Methoden, mit geringem Aufwand fluoreszenzoptisch ausgelesen werden können (siehe z.B. A. Marshall, J. Hodgson, DNA chips: An array of possibilities, Nature Biotechnology 1998, 16, 27-31; G. Ramsay, DNA Chips: State of the an, Nature Biotechnology 1998, 16, 40-44).
  • In Abhängigkeit von den verwendeten Sonden und der chemischen Natur der Targetmoleküle können anhand dieses Testprinzips Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und Nukleinsäuren, zwischen Proteinen und Proteinen sowie zwischen Nukleinsäuren und Proteinen untersucht werden (zur Übersicht siehe F. Lottspeich, H. Zorbas, 1998, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin).
  • Als Sonden, die immobilisiert werden können, kommen dabei insbesondere Mitglieder von Antikörper-Bibliotheken, Rezeptor-Bibliotheken, Peptid-Bibliotheken und Nukleinsäure-Bibliotheken in Frage.
  • Sonden aus Nukleinsäure-Bibliotheken nehmen die mit Abstand wichtigste Rolle ein.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Abstand zwischen erster und zweiter Fläche vor dem Detektieren in Schritt b) in einer Position gehalten, die das Prozessieren der Probenlösung und/oder die Wechselwirkung zwischen den Targetmolekülen und evtl. immobilisierten Sondenmolekülen, beispielsweise das Amplifizieren von nachzuweisenden Nukleinsäuren und/oder die Hybridisierung zwischen nachzuweisenden Nukleinsäuren und evtl. immobilisierten Nukleinsäuresonden, ermöglicht.
  • Ferner ist es bevorzugt, dass in Schritt b) der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche verändert, vorzugsweise verringert wird. D.h. die Detektion wird vorzugsweise bei einem verringerten Abstand zwischen zumindest einem Bereich der erster Fläche, in dem die Detekzion erfolgen soll bzw. in dem Sonden immobilisiert sein können, und Detektionsebene durchgeführt. Besonders bevorzugt ist der Abstand zwischen erster Fläche und Detektionsebene bei der Detektion in etwa gleich null.
  • Bei einer Ausgestaltung wird zur Verringerung des Abstands zwischen erster und zweiter Fläche die erste Fläche in Richtung der zweiten Fläche geführt. Dies wird vorzugsweise durch Druck mindestens eines Mittels zur Führung der ersten Fläche, beispielsweise eines Stößels, eines Stabs, eines Stifts und/oder einer Schraube, auf die erste Fläche gewährleistet, wobei der Druckpunkt des Mittels insbesondere unterhalb des Bereichs liegt, in dem Sonden immobilisiert sein können bzw. in dem die Detektion der Targets erfolgen soll.
  • Das Herandrücken der ersten an die zweite Fläche bzw. die Detektionsebene kann dadurch ermöglicht sein, dass die erste Fläche zumindest im Bereich unterhalb des Bereichs, in dem Sonden immobilisiert sein können bzw. in dem die Detektion der Targets erfolgen soll, elastisch verformbar ist. Alternativ kann die erste Fläche mittels zweier übereinander liegender Schichten ausgestaltet sein, wobei eine äußere Schicht der beiden übereinander liegenden Schichten zumindest im Bereich, in dem Sonden immobilisiert sein können bzw. in dem die Detektion der Targets erfolgen soll, eine Aussparung aufweist und eine innere der beiden übereinander liegenden Schichten aus einer elastischen Dichtung gebildet ist. Der Druck wird dann mit dem Mittel zur Führung der ersten Fläche auf die innere Schicht im Bereich der Aussparung ausgeübt.
  • Das Mittel zur Führung der ersten Fläche, z.B. ein Stift, ein Stab, ein Stößel und/oder eine Schraube, kann aber nicht nur zur Ausübung eines Drucks auf die erste Fläche dienen. Sollten in der Reaktionskammer Blasen entstehen, die eine Detektion erschweren würden, so lassen sich diese durch Agitation durch das Mittel zur Führung der ersten Fläche, z.B. mit einer an der ersten Fläche, insbesondere in Form einer elastischen Membran, angelegten Vibrationsfrequenz von etwa 20 Hz, entfernen.
  • Ferner besteht häufig das Problem, dass die Wechselwirkung, z.B. die Hybridisierung, in dem Bereich, in dem Sonden immobilisiert sein können bzw. in dem die Detektion der Targets erfolgen soll, sehr lange dauert. Dies liegt unter anderem daran, dass die Wechselwirkungs- bzw. Hybridisierungsgeschwindigkeit diffusionsbestimmt ist. Vorzugsweise lässt sich Wechselwirkungs- bzw. Hybridisierungsgeschwindigkeit durch Agitation über das Mittel zur Führung der ersten Fläche, z.B. mit einer an der ersten Fläche, insbesondere in Form einer elastischen Membran, angelegten Vibrationsfrequenz von etwa 20 Hz, erhöhen, da die Agitation bzw. Vibration zu einer Durchmischung in der Reaktionskammer führt.
  • Bei einer weiteren Ausgestaltung wird zur Verringerung des Abstands zwischen erster und zweiter Fläche die zweite Fläche in Richtung der ersten Fläche geführt. Dies kann insbesondere dadurch gewährleistet werden, dass die zweite Fläche durch Druck des Abstandshalters auf die zweite Fläche in Richtung der ersten Fläche geführt wird.
  • Bei einer weiteren Ausgestaltung wird zur Verringerung des Abstands zwischen erster und zweiter Fläche die erste Fläche in Richtung der zweiten Fläche und die zweite Fläche in Richtung der ersten Fläche geführt.
  • Im Folgenden werden weitere Ausführungsformen zum Führen der ersten Fläche relativ zur zweiten Fläche bzw. der zweiten Fläche relativ zur ersten Fläche beschrieben. Diese Ausführungsformen sind nicht nur zur Positionierung der ersten Fläche bzw. des Bereichs, in dem Sonden immobilisiert sein können bzw. in dem die Detektion der Targets erfolgen soll, relativ zur zweiten Fläche bzw. der Detektionsfläche geeignet, sondern können insbesondere auch eingesetzt werden, um die erste Fläche relativ zur Detektionsfläche zu bewegen. Durch eine derartige Bewegung kann beispielsweise eine Agitation der Lösung in der Reaktionskammer erreicht werden.
  • In einer Ausführungsform wird die das Substrat, auf dem Sonden immobilisiert sein können bzw. das den Bereich darstellt, in dem die Detektion der Targets erfolgen soll, und das in diesem fall nicht in die erste Fläche integriert isz, mit Hilfe eines Magnetfeldes gegen relativ zur Detektionsfläche geführt oder in der Kammer bewegt. Beispielsweise enthält das Substrat und/oder die zweite Fläche ein magnetisches Material bzw. enthält eine Komponente, der ein magnetisches Material beigemischt ist und/oder ist in einer Fassung aus einem ganz oder teilweise magnetischen Material eingefasst. Ferner kann es bevorzugt sein, dass das Substrat und/oder die zweite Fläche passiv bewegt werden, indem mittels eines magnetischen Feldes ein magnetischer Körper bewegt wird, der unter der jeweiligen Fläche angeordnet ist und beispielsweise mit dieser verbunden ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird das Substrat durch Einwirken der Schwerkraft relativ zur Detektionsfläche bewegt und/oder positioniert.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird das Substrat durch eine in der Reaktionskammer erzeugte Strömung relativ zur Detektionsfläche bewegt und/oder positioniert. Dazu kann die Vorrichtung beispielsweise so ausgestaltet sein, dass, wenn das Substrat von einer Flüssigkeit umströmt wird, auf einer Seite der Reaktionskammer ein Unterdruck und auf der gegenüberliegenden Seite ein Überdruck entsteht, wodurch eine Bewegung des Substrats in der Reaktionskammer erfolgt. Eine solche Strömung kann z.B. durch eine Wärmeströmung, welche durch lokale Temperaturunterschiede in der Kammer hervorgerufen wird, realisiert werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird das Substrat durch Einwirken eines elektrischen Feldes relativ zur Detektionsfläche bewegt und/oder positioniert.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird durch lokale Überhitzung unter dem Substrat eine Gasblase erzeugt, welche dazu führt, dass das Subtstrat in der Kammer bewegt bzw. gegen die Detektionsfläche geführt wird.
  • Durch die Verringerung des Abstands zwischen erster und zweiter Fläche vor der Detektion wird die Probenlösung aus dem Bereich zwischen erster Fläche bzw. zumindest dem Bereich der ersten Fläche, in dem z.B. Sonden entweder auf der ersten Fläche oder einem Substrat immobilisiert sein können bzw. in dem die Detektion der Targets erfolgen soll, und Detektionsebene vorzugsweise im Wesentlichen vollständig entfernt. Dadurch werden die Hintergrundsignale, die durch nicht an Sonden gebundenen markierte Moleküle, z.B. durch markierte Primer und/oder nicht an die Sonden gebundene markierte Targetmoleküle, verursacht werden, vermindert.
  • Besonders bevorzugt wird somit bei der Detektion in Schritt b) erfindungsgemäßen Verfahren der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche so verändert, dass die Probenlösung zwischen der ersten und der zweiten Fläche im Wesentlichen entfernt ist. Die nachzuweisenden Target-Sonden-Komplexe liegen dann entweder wegen immobilisierten Sonden bzw. der Größe der Target-Sonden-Komplexe im Wesentlichen in erhöhter Konzentration in der Detektionsebene und ein störender Hintergrund wird nahezu vollständig vermieden.
  • Bei einer weiteren alternativen Ausführungsform liegt die erste Fläche bereits im ursprünglichen Zustand der Vorrichtung bündig an der die Detektionsebene bildenden zweiten Fläche an und wird nicht erst durch Führen der ersten Fläche in Richtung der zweiten Fläche und/oder Führen der zweiten Fläche in Richtung der ersten Fläche in die Detektionsebene gebracht. Während der Prozessierungsschritte ist die erste Fläche bei dieser Ausgestaltung nicht von der Probenlösung benetzt. Zur Durchführung der Wechselwirkungsreaktion, z.B. einer Hybridisierung, wird die erste Fläche, die vorzugsweise aus einem elastischen Material, z.B. einer elastischen Membran, gebildet ist, von der Detektionsfläche weggeführt. Dadurch werden die immobilisierten Sonden bzw. der Bereich, in dem die Detektion der Targets erfolgen soll, von der Detektionsfläche entfernt und von der Probenlösung benetzt. Die Wechselwirkung, z.B. eine Hybridisierung, kann stattfinden. Zur Durchführung der Detektion und der weiteren Prozessierung wird die erste Fläche, z.B. in Form einer elastischen Membran, wieder freigelassen, wodurch sie in ihre ursprünglich eingestellte Position zurückschnellt, was durch Druck mit einem Mittel zur Führung der ersten Fläche, z.B. einem Stift, einem Stab, einer Schraube und/oder einem Stößel, beschleunigt werden kann. Dadurch wird die erste Fläche wieder an die Detektionsebene gedrückt und die Detektion kann hintergrundfrei durchgeführt werden.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine wie vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Vorrichtung eingesetzt, deren erste Fläche um eine Drehachse schwenkbar ausgestaltet ist.
  • In einer ersten Position, die auch als Ausgangstellung bezeichnet wird, liegt die Oberfläche des Bereichs, in dem z.B. auf der ersten Fläche direkt bzw. auf einem Substrat Sonden immobilisiert sein können und in dem die Targets nachgewiesen werden sollen, im Wesentlichen bündig an der zweiten Fläche an, d.h. die Substratoberfläche mit den darauf z.B. immobilisierten Sondenmoleküle ist im Wesentlichen nicht von der Probenlösung benetzt. In dem in der ersten Position zwischen dem zweiten Schenkelabschnitt der ersten Fläche und der zweiten Fläche gebildeten Raum, der Prozessierungskammer, erfolgt vorzugsweise in dieser ersten Position die Prozessierung der Reaktionslösung, d.h. insbesondere Aufreinigungs-, Aufkonzentrierungs-, Wasch- und Spül- und/oder Amplifikationsschritte.
  • Anschließend wird die schwenkbare erste Fläche in eine zweite Position gebracht, in der die erste Fläche in einem Winkel verschieden von 180°, vorzugsweise in einem Winkel von 45°, zu der zweiten Fläche angeordnet ist. Dies erfolgt vorzugsweise durch Zug auf den ersten Schenkelabschnitt der ersten Fläche und/oder durch Druck auf den zweiten Schenkelabschnitt der ersten Fläche durch ein wie vorstehend beschriebenes Mittel zur Führung der ersten Fläche. Durch Führen der ersten Fläche in die zweite Position wird der erwähnte Bereich der ersten Fläche von der zweiten Fläche weggeführt und die Probenlösung dringt in den entstehenden Hohlraum zwischen erster und zweiter Fläche ein. Die z.B. auf dem Substrat immobilisierten Sondenmoleküle sind für die in der Probenlösung vorliegenden Targetmoleküle frei zugänglich, so dass eine Wechselwirkungsreaktion zwischen Sonden- und Targetmolekülen stattfinden kann. Die Ausübung eines Drucks und/oder Zugs auf die erste Fläche hat bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens den Vorteil, dass auf diese Weise die Probenlösung bewegt wird und so die Wechselwirkungsreaktion beschleunigt werden kann.
  • Zur Durchführung der Detektion und ggf. einer weiteren Prozessierung wird die schwenkbare erste Fläche wieder in die erste Position geführt, beispielsweise durch Druck auf den ersten Schenkelabschnitt der ersten Fläche und/oder durch Zug an dem zweiten Schenkelabschnitt der ersten Fläche bzw. bei elastischer Ausgestaltung der ersten Fläche durch Freilassen des ersten Schenkelabschnitts. Der erwähnte Bereich der ersten Fläche liegt nun wiederum im Wesentlichen bündig an der zweiten Fläche an, so dass die Probenlösung zwischen der zweiten Fläche und dem erwähnten Bereich der ersten Fläche in dieser Position im Wesentlichen verdrängt wird und eine im Wesentlichen hintergrundsfreie Detektion erfolgen kann.
  • Die zu untersuchenden Targets können in jeder Art von Probe, vorzugsweise in einer biologischen Probe vorliegen.
  • Vorzugsweise werden die Targets vor ihrer Detektion und Quantifizierung durch das erfindungsgemäße Verfahren isoliert, gereinigt, kopiert und/oder amplifiziert.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht ferner die Amplifikation und den qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von Nukleinsäuren in einer Reaktionskammer, wobei der Nachweis von molekularen Wechselwirkungen bzw. Hybridisierungen nach Abschluss einer zyklischen Amplifikationsreaktion erfolgen kann, ohne dass ein Austausch der Proben- bzw. Reaktionsflüssigkeiten erforderlich ist. Ferner gewährleistet das erfindungsgemäße Verfahren auch eine zyklische Detektion von Hybridisierungsereignissen bei der Amplifikation, d.h. einen Nachweis der Hybridisierung auch während der zyklischen Amplifikationsreaktion. Schließlich können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens die Amplifikationsprodukte während der Amplifikationsreaktion sowie nach Ablauf der Amplifikationsreaktion quantifiziert werden.
  • Die Amplifikation erfolgt üblicherweise durch herkömmliche PCR-Methoden oder durch ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren zur parallelen Durchführung von Amplifikation der zu analysierenden Zielmoleküle durch PCR und Nachweis durch Hybridisierung der Zielmoleküle mit den vorzugsweise immobilisierten Sonden.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform wird die Amplifikation als Multiplex-PCR in einem zweistufigen Prozess ausgeführt (siehe auch WO 97/45559). In einer ersten Stufe wird eine Multiplex-PCR durchgeführt, indem Fusionsprimer eingesetzt werden, deren 3'-Enden genspezifisch sind und deren 5'-Enden eine universelle Region darstellen. Letztere ist bei allen in der Multiplex-Reaktion eingesetzten forward- und reverse-Primern gleich. In dieser ersten Stufe ist die Primermenge limitierend. Dadurch können alle Multiplex-Produkte bis zu einem einheitlichen molaren Niveau amplifiziert werden, vorausgesetzt, dass die Zyklenzahl hinreichend ist, um für alle Produkte Primerlimitation zu erreichen. In einer zweiten Stufe sind universelle Primer zugegen, die identisch mit den 5'-Regionen der Fusionsprimer sind. Es erfolgt Amplifikation bis zur gewünschten DNA-Menge.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Detektion während der zyklischen Amplifikationsreaktion und/oder nach Abschluss der zyklischen Amplifikationsreaktion. Vorzugsweise erfolgt die Detektion während der Amplifikationsreaktion bei jedem Amplifikationszyklus. Alternativ kann die Detektion aber auch bei jedem zweiten Zyklus oder jedem dritten Zyklus oder in beliebigen anderen Intervallen bestimmt werden.
  • Bei der Durchführung einer linearen Vervielfältigungsreaktion, bei der sich die Target-Menge mit jedem Schritt um ein bestimmte Menge erhöht, oder einer exponentiellen Vervielfältigungsreaktion, z.B. einer PCR, bei der sich die DNA-Target-Menge mit jedem Schritt vervielfältigt, in der Prozesseinheit kann somit nach jedem Vervielfältigungsschritt die erste Fläche an die Detektionsebene gedrückt werden und damit die Detektion durchgeführt werden. Damit ist es möglich, eine Online-Überwachung der Vervielfältigungsreaktion durchzuführen. Insbesondere bei nichtlinearen Vervielfältigungsreaktionen ist es dadurch möglich, die Ausgangskonzentration der DNA- Target-Menge zu bestimmen. In analoger Weise können im Fall von Proteintargets und -sonden z.B. Bindungskinetiken aufgenommen werden, wie dies oben bereits erwähnt wurde.
  • Des Weiteren lässt sich so die Anzahl der Vervielfältigungsschritte online optimieren. Hat die DNA-Target-Menge eine bestimmte Konzentration erreicht, bricht man die Vervielfältigung ab. Ist die Target-Start-Konzentration klein, erhöht man die Zahl der Vervielfältigungsschritte, um eine sichere Analyse der Produkte durchführten zu können. Bei verminderter Reaktionszeit von Positiv-Kontrollen kann der Analyseprozess sehr früh abgebrochen werden.
  • Die für die Durchführung einer Amplifikationsreaktion erforderlichen Chemikalien wie z.B. Polymerase, Puffer, Magnesiumchlorid, Primer, markierte, insbesondere fluoreszenzmarkierte Primer, dNTP's etc. können in die Reaktionskammer beispielsweise gefriergetrocknet vorgelegt werden.
  • Vorzugsweise ist die zyklische Amplifikationsreaktion eine PCR. Bei der PCR werden für jeden PCR-Zyklus herkömmlicherweise drei Temperaturen durchfahren. Vorzugsweise lösen sich die hybridisierten Nukleinsäuren bei der höchsten Temperatur, d.h. der Denaturierungstemperatur von den Sonden ab. Ein bevorzugter Wert für die Denaturierungstemperatur beträgt 95°C. Somit kann bei dieser Denaturierungstemperatur ein Hybridisierungssignal bestimmt werden, der als Nullwert bzw. Bezugswert für die bei dem jeweiligen PCR-Zyklus detektierten Nukleinsäuren dienen.
  • Bei der im PCR-Zyklus nachfolgenden Temperatur, einer Annealing-Temperatur von beispielsweise etwa 60°C, wird eine Hybridisierung zwischen nachzuweisenden Nukleinsäuren und den evtl. immobilisierten Nukleinsäurensonden ermöglicht. Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt deswegen der Nachweis bzw. die Detektion von bei einem PCR-Zyklus vorliegenden Targetnukleinsäuren bei der Annealing-Temperatur.
  • Um die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu erhöhen, kann es ferner vorteilhaft sein, die Temperatur unter die Annealing-Temperatur zu senken, so dass die Detektion bevorzugt bei einer Temperatur unterhalb der Annealing-Temperatur eines Amplifikationszyklus erfolgt. Beispielsweise kann die Detektion bei einer Temperatur im Bereich von 25°C bis 50°C und vorzugsweise im Bereich von 30°C bis 45°C erfolgen.
  • Bei einer weiteren alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Hybridisierung zwischen nachzuweisenden Nukleinsäuren und den evtl. immobilisierten Nukleinsäurensonden zunächst bei einer niedrigen Temperatur durchgeführt, um anschließend die Hybridisierungstemperatur zu erhöhen. Eine derartige Ausführungsform bietet den Vorteil, dass die Hybridisierungszeit gegenüber Hybridisierungen bei Temperaturen von über 50°C vermindert wird, ohne dabei an Spezifität in den Wechselwirkungen einzubüßen.
  • Wird von dem bei der bzw. unterhalb der Annealing-Temperatur bestimmten Messwert der bei der Denaturierungstemperatur bestimmte Nullwert bzw. Bezugswert abgezogen, so erhält man ein von Störeinflüssen freies Messergebnis, in dem Schwankungen und Drift eliminiert sind.
  • Üblicherweise werden die nachzuweisenden Targetmoleküle mit einem detektierbaren Marker versehen. Der Nachweis erfolgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren somit vorzugsweise dadurch, dass die gebundenen Targets mit mindestens einer Markierung versehen sind, die in Schritt b) detektiert wird.
  • Wie bereits vorstehend erwähnt, ist die Markierung, die an die Targets oder Sonden gekoppelt ist, vorzugsweise eine detektierbare Einheit oder eine über eine Ankergruppe an die Targets oder Sonden gekoppelte detektierbare Einheit. Hinsichtlich der Möglichkeiten der Detektion bzw. der Markierung ist das erfindungsgemäße Verfahren äußerst flexibel. So ist das erfindungsgemäße Verfahren mit einer Vielzahl physikalischer, chemischer oder biochemischer Detektionsverfahren kompatibel. Voraussetzung ist lediglich, dass die zu detektierende Einheit bzw. Struktur direkt an eine Sonde oder ein Target, beispielsweise ein Oligonukleotid gekoppelt bzw. über eine mit dem Oligonukleotid koppelbare Ankergruppe verknüpft werden kann.
  • Die Detektion der Markierung kann auf Fluoreszenz, Magnetismus, Ladung, Masse, Affinität, enzymatischer Aktivität, Reaktivität, einer Goldmarkierung u.dgl. beruhen. So basiert die Markierung vorzugsweise auf der Verwendung von Fluorophor-markierten Strukturen bzw. Bausteinen. In Verbindung mit der Fluoreszenz-Detektion kann die Markierung ein beliebiger an Targets oder Sonden während oder nach deren Synthese koppelbarer Farbstoff sein. Beispiele hierfür sind Cy-Farbstoffe (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), Alexa-Farbstoffe, Texas-Rot, Fluoreszein, Rhodamin (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA), Lanthanide wie Samarium, Ytterbium und Europium (EG&G, Wallac, Freiburg, Deutschland).
  • Besonders bevorzugt ist dieser detektierbare Marker ein Fluoreszenzmarker. Wie bereits vorstehend erwähnt, gewährleistet der Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung in dem erfindungsgemäßen Verfahren das Detektieren der Fluoreszenzmarker mittels eines Fluoreszenzmikroskops ohne Autofokus, z.B. eines Fluoreszenzmikroskops mit Fixfokus.
  • Neben Fluoreszenz-Markern können im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Markierung bzw. als Detektiereinheit, die mit den Targets bzw. Sonden gekoppelt ist, auch Lumineszenz-Marker, Metall-Marker, Enzym-Marker, radioaktive Marker und/oder polymere Marker eingesetzt werden.
  • Ebenso kann eine Nukleinsäure als Markierung (Tag) genutzt werden, die durch Hybridisierung mit einem markierten Reporter detektiert werden kann (Sandwich- Hybridisierung). Einsatz zum Nachweis des Tags finden diverse molekularbiologische Nachweisreaktionen wie Primer-Extension, Ligation und RCA.
  • Bei einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die detektierbare Einheit über eine Ankergruppe mit den Targets oder Sonden gekoppelt. Bevorzugt verwendete Ankergruppen sind Biotin, Digoxygenin u.dgl. Die Ankergruppe wird in einer anschließenden Reaktion mit spezifisch bindenden Komponenten, beispielsweise Streptavidin-Konjugaten oder Antikörper-Konjugaten umgesetzt, die selbst detektierbar sind oder eine detektierbare Reaktion auslösen. Bei Einsatz von Ankergruppen kann die Umsetzung der Ankergruppen in detektierbare Einheiten vor, während oder nach Zugabe der Probe umfassend die Targets bzw. ggf. vor, während oder nach der Spaltung einer selektiv spaltbaren Bindung in den Sonden erfolgen. Derartige selektiv spaltbare Bindungen in den Sonden sind z.B. in der internationalen Patentanmeldung WO 03/018838 beschrieben, auf deren diesbezüglichen Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
  • Die Markierung kann erfindungsgemäß auch durch Wechselwirkung eines markierten Moleküls mit den Sonden-Molekülen erfolgen. Beispielsweise kann die Markierung durch Hybridisierung eines wie vorstehend beschrieben markierten Oligonukleotids mit einer Oligonukleotid-Sonde bzw. einem Oligonukleotid-Target erfolgen.
  • Weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Markierungsverfahren und Nachweissysteme sind beispielsweise in Lottspeich und Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, 1998, Kapitel 23.3 und 23.4 beschrieben.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren werden Nachweisverfahren eingesetzt, die im Ergebnis ein Addukt mit einem bestimmten Löslichkeitsprodukt, das eine Präzipitation zur Folge hat, liefern. Zur Markierung werden insbesondere Substrate bzw. Edukte eingesetzt, die in ein schwer lösliches, üblicherweise gefärbtes Produkt umgesetzt werden können. Beispielsweise können bei dieser Markierungsreaktion Enzyme verwendet werden, die den Umsatz eines Substrats in ein schwer lösliches Produkt katalysieren. Reaktionen, die geeignet sind, um zu einem Niederschlag zu führen, sowie Möglichkeiten für die Detektion des Niederschlags sind beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung WO 00/72018 und in der internationalen Patentanmeldung WO 02/02810 beschrieben, auf deren diesbezüglichen Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
  • Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die gebundenen Targets mit einer Markierung versehen, die die Reaktion eines löslichen Substrats bzw. Edukts zu einem schwer löslichen Niederschlag auf der ersten Fläche katalysiert, an dem eine Sonden/Target-Wechselwirkung stattgefunden hat bzw. die als Kristallisationskeim für die Umwandlung eines löslichen Substrats bzw. Edukts zu einem schwer löslichen Niederschlag auf der ersten Fläche wirkt, an dem eine Sonden/Target-Wechselwirkung stattgefunden hat.
  • Der Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt auf diese Weise die simultane qualitative und quantitative Analyse einer Vielzahl von Sonden/Target-Wechselwirkungen.
  • In der Immunzytochemie und bei immunologischen Mikrotiterplatten-basierten Tests ist der Einsatz von enzymatischen Markierungen bekannt (siehe E. Lidell und I. Weeks, Antibody Technology, BIOS Scientific Publishers Limited, 1995). So katalysieren beispielsweise Enzyme den Umsatz eines Substrats in ein schwerlösliches, in aller Regel gefärbtes Produkt.
  • Besonders bevorzugt ist die zur Bildung eines Niederschlags auf der ersten Fläche führende Reaktion eine durch ein Enzym katalysierte Umsetzung eines löslichen Substrats bzw. Edukts in ein schwer lösliches Produkt. Bei einer speziellen Ausführungsform ist die zur Bildung eines Niederschlags an an den Sonden führende Reaktion eine durch eine Peroxidase katalysierte Oxidation von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin.
  • Vorzugsweise wird als Peroxidase für die Oxidation von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin Meerrettichperoxidase eingesetzt. Dem Fachmann sind jedoch weitere Peroxidasen bekannt, die zur Oxidation von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin eingesetzt werden können.
  • Es wird angenommen, dass 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin unter der katalytischen Einwirkung einer Peroxidase in einem ersten Schritt zu einem blau gefärbten Radikalkation oxidiert wird (siehe z.B. Gallati und Pracht, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1985, 23, 8, 454). Dieses blau gefärbte Radikalkation wird mittels eines Polyanions wie z.B. Dextransulfat als Komplex ausgefällt. Die Fällungsreaktion durch Peroxidase-katalysierte Oxidation von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin ist beispielsweise in EP 0 456 782 beschrieben.
  • Die nachfolgende Tabelle 1 gibt, ohne den Anspruch zu erheben, vollständig zu sein, einen Überblick über eine Reihe von in Frage kommenden Reaktionen, die geeignet sind, um zu einem Niederschlag an der ersten Fläche zu führen, wenn dort eine Wechselwirkung zwischen Target und Sonde erfolgt ist: Tabelle 1
    Figure 00830001
    Figure 00840001
  • Der Nachweis und/oder die Detektion von Sonde/Target-Wechselwirkungen über unlösliche Präzipitate sind insbesondere in WO 02/02810 beschrieben.
  • Im Folgenden werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben, die zur Überwindung von generell bei der Detektion von molekularen Wechselwirkungen auf festen Trägern möglicherweise auftretenden Problemen wie beispielsweise zur Verhinderung der etwaigen Ausbildung von Newtonschen Ringen zwischen Detektionsebene und erster Fläche dienen können.
  • Die Ausprägung von Newtonschen Ringen wird im Wesentlichen durch die Art der Beleuchtung, die Wellenlänge des zur Detektion eingesetzten Lichtes, den Abstand zwischen Detektionsebene und erster Fläche sowie den Brechungsindex der in der Kammer befindlichen Lösung bestimmt. Derartige Newtonsche Ringe können beispielsweise vermieden werden durch Änderung der Wellenlänge des zur Detektion eingesetzten Lichtes, Verwendung einer Lösung mit gleichem oder ähnlichem Brechungsindex wie dem der Detektionsebene und/oder der ersten Fläche und/oder die Verwendung einer Immersionsflüssigkeit zwischen Detektionsebene und erster Fläche.
  • Ferner können Newtonsche Ringe durch Aufbringen von Abstandshaltern auf der ersten Fläche bzw. der Bereiche, in denen Sonden immobilisiert werden können bzw. in denen die Detektion der Targets erfolgen soll, und/oder der ersten Fläche bzw. den Bereichen, in denen Sonden immobilisiert werden können bzw. in denen die Detektion der Targets erfolgen sollzugewandten Seite der Detektionsfläche verhindert werden.
  • Ferner können Newtonsche Ringe durch Aufbringen der ersten Fläche bzw. der Bereiche, in denen Sonden immobilisiert werden können bzw. in denen die Detektion der Targets erfolgen soll, auf eine raue Trägeroberfläche verhindert werden.
  • Ferner können Newtonsche Ringe durch Aufbringen des ersten Fläche bzw. der Bereiche, in denen Sonden immobilisiert werden können bzw. in denen die Detektion der Targets erfolgen soll, auf eine lichtabsorbierende Oberfläche verhindert werden.
  • Als weitere Möglichkeit kann während der Detektion der Anpressdruck, mit welchem die erste Fläche relativ zur Detektionsfläche geführt wird, permanent variiert werden. Dadurch wird die Spaltdicke zwischen erster Fläche und Detektionsfläche und so auch die Lage der Newtonschen Ringe verändert. Durch die Integration des zu detektierenden Fluoreszenzsignals über die Zeit wird auf diese Weise eine Verfälschung der Messwerte der Spots relativ zueinander vermieden.
  • Eine weitere besonders bevorzugte Möglichkeit zur Verhinderung von Newtonschen Ringen ist die Verwendung mehrerer Lichtquellen aus unterschiedlichen Richtungen zur Beleuchtung und damit zur Anregung der Fluorophore der gebundenen Targets.
  • Hintergrundfluoreszenz, die durch die Fluorophore ungebundener Targets in der verdrängten Flüssigkeit hervorgerufen wurde, kann zu einer Verfälschung des detektierten Signals führen. Dies kann vorzugsweise durch Einsatz einer Blende verhindert werden, die z.B. auf die Detektionsfläche oder die erste Fläche bzw. die Bereiche, in denen Sonden immobilisiert werden können bzw. in denen die Detektion der Targets erfolgen soll, aufgebracht und/oder um die Bereiche der ersten Fläche, in denen Sonden immobilisiert werden können bzw. in denen die Detektion der Targets erfolgen soll, herum oder in der Abbildungsoptik angeordnet wird und derart ausgestaltet ist, dass nur die Fläche der Bereiche der ersten Fläche, in denen Sonden immobilisiert werden können bzw. in denen die Detektion der Targets erfolgen soll, beleuchtet bzw. abgebildet wird.
  • Bei der Verwendung entsprechender Beleuchtungsquellen wie z.B. Laser kann es, bedingt durch die Kohärenz des Lichtes, zu Inhomogenitäten in der Beleuchtung kommen. Derartige Inhomogenitäten können durch Einsatz von Wellenleitern und/oder Mischfiltern und/oder Licht verschiedener Wellenlängen verringert bzw. vermieden werden. Ebenso ist eine Bewegung der Beleuchtungsquelle zur Beseitigung derartiger Effekte denkbar.
  • Durch Einsatz einer organischen oder anorganischen lichtabsorbierenden und im gewählten Wellenlängenbereich nicht fluoreszierenden Schicht auf dem Substrat, wenn ein Substrat eingesetzt wird, kann Fluoreszenzhintergrundsignal, das durch das Subtrat oder die erste Fläche und/oder dahinter befindliche Elemente verursacht wird, verringert bzw. verhindert werden. Vorzugsweise wird eine Schwarzchromschicht als Schutzschicht eingesetzt.
  • Bei sämtlichen vorstehend beschriebenen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren ist eine Voramplifikation des zu analysierenden Materials nicht erforderlich. Von dem aus Bakterien, Blut oder anderen Zellen extrahierten Probenmaterial können gezielte Teilbereiche mit Hilfe einer PCR (Polymerase-Kettenreaktion) insbesondere in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Vorrichtungen wie in DE 102 53 966 beschrieben amplifiziert und an den Träger hybridisiert werden. Dies stellt eine wesentliche Vereinfachung des Arbeitsaufwands dar.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren sind somit insbesondere zur parallelen Durchführung von Amplifikation der zu analysierenden Zielmoleküle durch PCR und Nachweis durch Hybridisierung der Zielmoleküle mit den evtl. immobilisierten Sonden geeignet. Dabei wird die nachzuweisende Nukleinsäure zunächst durch eine PCR amplifiziert, wobei der Reaktion zu Anfang vorzugsweise mindestens ein Kompetitor zugesetzt wird, der die Bildung eines der beiden durch die PCR amplifizierten Template-Stränge inhibiert. Insbesondere wird bei der PCR ein DNA-Molekül zugesetzt, das mit einem der zur PCR-Amplifikation des Templates verwendeten Primer um die Bindung an das Template konkurriert, und nicht enzymatisch verlängert werden kann. Die durch die PCR amplifizierten einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküle werden dann durch Hybridisierung mit einer komplementären Sonde nachgewiesen. Alternativ wird die nachzuweisende Nukleinsäure zunächst im Einzelstrangüberschuss durch eine PCR amplifiziert und durch eine anschließende Hybridisierung mit einer komplementären Sonde nachgewiesen, wobei der PCR-Reaktion zu Anfang ein Kompetitor zugesetzt wird, bei dem es sich um ein DNA-Molekül oder ein Molekül eines Nukleinsäure-Analogons handelt, das an einen der beiden Stränge des Templates hybridisieren kann, aber nicht an den Bereich, der durch die Sonden-Hybridisierung nachgewiesen wird, und das enzymatisch nicht verlängerbar ist.
  • Als Kompetitor in der PCR kann jedes Molekül eingesetzt werden, das eine bevorzugte Amplifikation nur eines der beiden in der PCR-Reaktion vorhandenen Template-Stränge bewirkt. Bei Kompetitoren kann es sich daher erfindungsgemäß um Proteine, um Peptide, tun DNA-Liganden, um Interkalatoren, um Nukleinsäuren oder deren Analoga handeln. Als Kompetitoren werden bevorzugt Proteine bzw. Peptide eingesetzt, die in der Lage sind, einzelsträngige Nukleinsäuren mit Sequenz-Spezifität zu binden und über die oben definierten Eigenschaften verfügen. Besonders bevorzugt werden als Sekundärstrukturbrecher Nukleinsäuremoleküle und Nukleinsäure-Analoga-Moleküle eingesetzt.
  • Durch anfängliche Zugabe des Kompetitors zur PCR während der Amplifikation wird die Bildung eines der beiden Template-Stränge im Wesentlichen inhibiert. "Im Wesentlichen inhibiert" bedeutet, dass im Rahmen der PCR ein ausreichender Einzelstrangüberschuss und eine ausreichende Menge des anderen Template-Strangs hergestellt werden, um einen effizienten Nachweis des amplifizierten Strangs durch die Hybridisierung zu gewährleisten. Die Amplifikation erfolgt damit nicht einer exponentiellen Kinetik der Form 2n (mit n = Anzahl der Zyklen), sondern einer gedämpften Amplifikationskinetik der Form <2n.
  • Der durch die PCR erzielte Einzelstrangüberschuss beträgt gegenüber dem nicht-amplifizierten Strang den Faktor 1,1 bis 1000, bevorzugt den Faktor 1,1 bis 300, ebenfalls bevorzugt den Faktor 1,1 bis 100, besonders bevorzugt den Faktor 1,5 bis 100, ebenfalls besonders bevorzugt den Faktor 1,5 bis 50, insbesondere bevorzugt den Faktor 1,5 bis 20 und am meisten bevorzugt den Faktor 1,5 bis 10.
  • Typischerweise wird die Funktion eines Kompetitors darin bestehen, dass er selektiv an einen der beiden Template-Stränge bindet und damit die Amplifikation des entsprechenden komplementären Stranges behindert. Als Kompetitoren kommen daher einzelsträngige DNA- oder RNA-bindende Proteine mit Spezifität für einen der beiden in einer PCR zu amplifizierenden Template-Stränge in Frage. Ebenso kann es sich um Aptamere handeln, die Sequenz-spezifisch nur an bestimmte Bereiche eines der beiden zu amplifizierenden Template-Stränge binden.
  • Bevorzugt werden Nukleinsäuren oder Nukleinsäure-Analoga als Kompetitoren eingesetzt. Üblicherweise werden die Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäure-Analoga dadurch als Kompetitor der PCR wirken, dass sie entweder mit einem der zur PCR verwendeten Primer um die Primer-Bindungsstelle konkurrieren oder, aufgrund einer Sequenz-Komplementarität mit einem Bereich eines nachzuweisenden Template-Strangs hybridisieren können. Bei diesem Bereich handelt es sich nicht um die Sequenz, die durch die Sonde nachgewiesen wird. Solche Nukleinsäure-Kompetitoren sind enzymatisch nicht verlängerbar.
  • Bei den Nukleinsäure-Analoga kann es sich z.B. um sogenannte Peptid-Nukleinsäuren (peptide nucleic acids, PNA) handeln. Bei Nukleinsäure-Analoga kann es sich aber auch um Nukleinsäuremoleküle handeln, bei denen die Nukleotide über eine Phosphothioat-Bindung anstelle einer Phosphat-Bindung miteinander verknüpft sind. Ebenso kann es sich um Nukleinsäure-Analoga handeln, bei denen die natürlich vorkommenden Zuckerbausteine Ribose bzw. Deoxyribose gegen alternative Zucker wie z.B. Arabinose oder Trehalose etc. ausgetauscht wurden. Weiterhin kann es sich bei dem Nukleinsäurederivat um „locked nucleic acid" (LNA) handeln. Weitere übliche Nukleinsäure-Analoga sind dem Fachmann bekannt.
  • Bevorzugt werden als Kompetitoren DNA- oder RNA-Moleküle, insbesondere bevorzugt DNA- oder RNA-Oligonukleotide bzw. deren Analoga eingesetzt.
  • Abhängig von der Sequenz der als Kompetitoren eingesetzten Nukleinsäuremoleküle bzw. Nukleinsäure-Analoga beruht die Inhibierung der Amplifikation eines der beiden Template-Stränge im Rahmen der PCR-Reaktion auf unterschiedlichen Mechanismen. Dies wird im Folgenden beispielhaft anhand eines DNA-Moleküls diskutiert.
  • Wenn als Kompetitor z.B. ein DNA-Molekül verwendet wird, kann dies eine Sequenz aufweisen, die mit der Sequenz eines der zu PCR verwendeten Primer zumindest teilweise derart identisch ist, dass eine spezifische Hybridisierung des DNA-Kompetitor-Moleküls mit dem entsprechenden Template-Strang unter stringenten Bedingungen möglich ist. Da das zur Kompetition verwendete DNA-Molekül erfindungsgemäß in diesem Fall nicht durch eine DNA-Polymerase verlängerbar ist, kompetiert das DNA-Molekül mit dem jeweiligen Primer während der PCR-Reaktion um die Bindung an das Template. Je nach Mengenverhältnis des DNA-Kompetitor-Moleküls zum Primer kann auf diese Weise die Amplifikation des durch den Primer definierten Template-Strangs derart inhibiert werden, dass die Herstellung dieses Template-Strangs deutlich reduziert ist. Die PCR verläuft dabei nach einer exponentiellen Kinetik, die höher ist, als bei den verwendeten Kompetitor-Mengen zu erwarten wäre. Auf diese Weise entsteht ein Einzelstrangüberschuss in einer Menge, die ausreichend für einen effizienten Nachweis der amplifizierten Target-Moleküle durch Hybridisierung ist.
  • Bei dieser Ausführungsform dürfen die zur Kompetition verwendeten Nukleinsäuremoleküle bzw. Nukleinsäureanaloga enzymatisch nicht verlängerbar sein. "Enzymatisch nicht verlängerbar" bedeutet, dass die zur Amplifikation verwendete DNA- oder RNA-Polymerase den Nukleinsäure-Kompetitor nicht als Primer verwenden kann, d.h. nicht in der Lage ist, 3' von der durch den Kompetitor definierten Sequenz den jeweiligen Gegenstrang zum Template zu synthetisieren.
  • Alternativ zu der oben dargestellten Möglichkeit kann das DNA-Kompetitor-Molekül auch über eine Sequenz verfügen, die zu einem Bereich des nachzuweisenden Template-Strangs komplementär ist, der nicht durch eine der Primer-Sequenzen adressiert wird, und die enzymatisch nicht verlängerbar ist. Im Rahmen der PCR wird das DNA-Kompetitor-Molekül dann an diesem Template-Strang hybridisieren und die Amplifikation dieses Stranges entsprechend blockieren.
  • Dem Fachmann ist bekannt, dass die Sequenzen von DNA-Kompetitor-Molekülen oder allgemein Nukleinsäure-Kompetitor-Molekülen entsprechend gewählt werden können. Wenn die Nukleinsäure-Kompetitor-Moleküle eine Sequenz aufweisen, die nicht mit der Sequenz eines der zur PCR verwendeten Primer im Wesentlichen identisch, sondern zu einem anderen Bereich des nachzuweisenden Template-Strangs komplementär ist, ist diese Sequenz so zu wählen, dass sie nicht in den Bereich der Template-Sequenz fällt, der im Rahmen der Hybridisierung mit einer Sonde nachgewiesen wird. Dies ist deswegen notwendig, da zwischen der PCR und der Hybridisierungsreaktion keine Aufarbeitungsreaktion stattfinden muss. Würde als Kompetitor ein Nukleinsäuremolekül verwendet, das in den nachzuweisenden Bereich fällt, würde dies mit dem einzelsträngigen Target-Molekül um die Bindung an die Sonde kompetieren.
  • Bevorzugt hybridisieren solche Kompetitoren in der Nähe der Template-Sequenz, die durch die Sonde nachgewiesen wird. Die Positionsangabe "in der Nähe" ist dabei erfindungsgemäß so zu verstehen, wie sie für Sekundärstrukturbrecher angegeben ist. Allerdings können die erfindungsgemäßen Kompetitoren auch in unmittelbarer Nachbarschaft der nachzuweisenden Sequenz hybridisieren, d.h. exakt ein Nukleotid von der nachzuweisenden Target-Sequenz entfernt.
  • Wenn als kompetitierende Moleküle enzymatisch nicht verlängerbare Nukleinsäuren oder Nukleinsäure-Analoga verwendet werden, sind diese hinsichtlich ihrer Sequenz oder Struktur so zu wählen, dass sie nicht enzymatisch durch DNA- oder RNA-Polymerasen verlängert werden können. Bevorzugt ist das 3'-Ende eines Nukleinsäure-Kompetitors so ausgelegt, dass es keine Komplementarität zum Template aufweist und/oder anstelle der 3-OH-Gruppe am 3'-Ende einen anderen Substituenten trägt.
  • Weist das 3'-Ende des Nukleinsäure-Kompetitors keine Komplementarität zum Template auf, unabhängig davon, ob der Nukleinsäure-Kompetitor an eine der Primer-Bindungsstellen des Templates oder an eine der durch die PCR zu amplifizierenden Sequenzen des Templates bindet, kann der Nukleinsäure-Kompetitor wegen der fehlenden Basen-Komplementarität am 3'-Ende nicht durch die gängigen DNA-Polymerasen verlängert werden. Diese Art der Nicht-Verlängerbarkeit von Nukleinsäure-Kompetitoren durch DNA-Polymerasen ist dem Fachmann bekannt. Bevorzugt weist der Nukleinsäure-Kompetitor an seinem 3'-Ende bezüglich der letzten 4 Basen, besonders bevorzugt bezüglich der letzten 3 Basen, insbesondere bevorzugt bezüglich der letzten 2 Basen und am meisten bevorzugt bezüglich der letzten Base keine Komplementarität zu seiner Zielsequenz auf. Solche Kompetitoren können an den genannten Positionen auch nicht-natürliche Basen aufweisen, die keine Hybridisierung erlauben.
  • Nukleinsäure-Kompetitoren, die enzymatisch nicht verlängerbar sind, können auch eine 100%-ige Komplementarität zu ihrer Zielsequenz aufweisen, wenn sie in ihrem Rückgrat oder an ihrem 3'-Ende derart modifiziert sind, dass sie enzymatisch nicht verlängerbar sind.
  • Weist der Nukleinsäure-Kompetitor an seinem 3'-Ende eine andere Gruppe als die OH-Gruppe auf, handelt es sich bei diesen Substituenten bevorzugt um eine Phosphat-Gruppe, um ein Wasserstoff-Atom (Dideoxynukleotid), eine Biotingruppe oder eine Aminogruppe. Diese Gruppen können durch die gängigen Polymerasen nicht verlängert werden.
  • Besonders bevorzugt wird bei einem derartigen Verfahren als Kompetitor ein DNA-Molekül verwendet, das mit einem der beiden zur PCR verwendeten Primer um die Bindung an das Template kompetiert und welches am 3'-Ende während der chemischen Synthese mit einem Aminolink versehen wurde. Solche Kompetitoren können 100%-ige Komplementarität zu ihrer Zielsequenz haben.
  • Nukleinsäure-Analoga-Kompetitoren wie z.B. PNAs müssen dagegen nicht über eine blockierte 3'-OH-Gruppe oder eine nicht-komplementäre Base an ihrem 3'-Ende verfügen, da sie aufgrund des durch die Peptid-Bindung veränderten Rückgrats nicht durch die DNA-Polymerasen erkannt und somit auch nicht verlängert werden. Entsprechende andere Modifikationen der Phosphatgruppe, die durch die DNA-Polymerasen nicht erkannt werden, sind dem Fachmann bekannt. Dazu gehören u.a. Nukleinsäuren mit Rückgratmodifikationen wie z.B. 2'-5' Amid-Bindungen (Chan et al. (1999) J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 315-320), Sulfid-Bindungen (Kawai et al. (1993) Nucleic Acids Res., 1 (6), 1473-1479), LNA (Sorensen et al. (2002) J. Am. Chem. Soc., 124 (10), 2164-2176) und TNA (Schoning et al. (2000) Science, 290 (5495), 1347-1351).
  • Es können auch mehrere Kompetitoren, die an unterschiedliche Bereiche des Templates (z.B. u.a. die Primer-Bindungsstelle) hybridisieren, gleichzeitig in einer PCR eingesetzt werden.
  • Wenn die Kompetitoren über Sekundärstrukturbrechereigenschaften verfügen, kann dadurch die Effizienz der Hybridisierung zusätzlich gesteigert werden.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann das DNA-Kompetitor-Molekül über eine zu einem der Primer komplementäre Sequenz verfügen. Solche z.B. Antisense-DNA-Kompetitor-Moleküle können dann je nach Mengenverhältnis zwischen Antisense-DNA-Kompetitor-Molekül und Primer dazu verwendet werden, den Primer in der PCR-Reaktion zu titrieren, so dass dieser nicht mehr mit dem jeweiligen Template-Strang hybridisiert und entsprechend nur der durch den anderen Primer definierte Template-Strang amplifiziert wird. Dem Fachmann ist bewusst, dass bei dieser Ausführungsform der Erfindung der Nukleinsäure-Kompetitor enzymatisch verlängerbar sein kann, aber nicht muss.
  • Wenn im Rahmen dieser Erfindung von Nukleinsäure-Kompetitoren gesprochen wird, schließt dies Nukleinsäure-Analoga-Kompetitoren mit ein, wenn sich nicht aus dem Kontext etwas anderes ergibt. Der Nukleinsäure-Kompetitor kann an den entsprechenden Strang des Templates reversibel oder irreversibel binden. Die Bindung kann durch kovalente bzw. nicht kovalente Wechselwirkungen erfolgen.
  • Bevorzugt erfolgt die Bindung des Nukleinsäure-Kompetitors über nicht-kovalente Wechselwirkungen und ist reversibel. Insbesondere bevorzugt erfolgt die Bindung an das Template durch Ausbildung von Watson-Crick Basenpaarungen.
  • Die Sequenzen der Nukleinsäure-Kompetitoren richten sich in der Regel nach der Sequenz des Template-Strangs, der nachgewiesen werden soll, bei antisense-Primern dagegen nach den zu titrierenden Primer-Sequenzen, die aber wiederum durch die Template-Sequenzen definiert sind.
  • Bei der PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren handelt es sich um eine Labor-Standardmethode, mit deren vielfältigen Variations- und Ausgestaltungsmöglichkeiten der Fachmann vertraut ist. Prinzipiell ist eine PCR dadurch charakterisiert, dass das doppelsträngige Nukleinsäure-Template, üblicherweise ein doppelsträngiges DNA-Molekül, zuerst einer Hitze-Denaturierung für 5 Minuten bei 95° C unterworfen wird, wodurch die beiden Stränge voneinander getrennt werden. Nach einer Abkühlung auf die sogenannte "annealing"-Temperatur (definiert durch den Primer mit der niedrigeren Schmelztemperatur) lagern sich die in der Reaktionslösung vorhandenen "forward"- und "reverse"-Primer an die zu ihrer Sequenz komplementären Stellen in den jeweiligen Template-Strängen an. Die "annealing"-Temperatur der Primer richtet sich dabei nach der Länge und Basenzusammensetzung der Primer. Sie kann aufgrund theoretischer Überlegungen kalkuliert werden. Angaben zur Kalkulation von "annealing"-Temperaturen finden sich z.B. in Sambrook et al. (vide supra).
  • Nach dem Annealen der Primer, das typischerweise in einem Temperaturbereich von 40-75 °C, bevorzugt von 45-72 °C und insbesondere bevorzugt von 50-72 °C erfolgt, folgt ein Elongationsschritt, bei dem durch die Aktivität der in der Reaktionslösung vorhandenen DNA-Polymerase Desoxyribonukleotide mit dem 3'-Ende der Primer verknüpft werden. Die Identität der eingefügten dNTPs richtet sich dabei nach der Sequenz des mit dem Primer hybridisierten Template-Strangs. Da in der Regel thermostabile DNA-Polymerasen eingesetzt werden, läuft der Elongationsschritt üblicherweise zwischen 68-72° C ab.
  • Bei der symmetrischen PCR wird durch eine Wiederholung dieses beschriebenen Zyklus aus Denaturierung, Annealing der Primer und Elongation der Primer eine exponentielle Vermehrung des durch die Primersequenzen definierten Nukleinsäureabschnitts des Targets erreicht. Hinsichtlich der Pufferbedingungen bei der PCR, der verwendbaren DNA-Polymerasen, der Herstellung von doppelsträngigen DNA-Templates, des Designs von Primern, der Wahl der Annealing-Temperatur und Variationen der klassischen PCR steht dem Fachmann zahlreiche Literatur zur Verfügung.
  • Dem Fachmann ist geläufig, dass als Template auch z.B. einzelsträngige RNA, wie z.B. mRNA, eingesetzt werden kann. Diese wird in der Regel vorher durch eine Reverse Transkription in eine doppelsträngige cDNA überführt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird als Polymerase eine thermostabile DNA-abhängige DNA-Polymerase verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine thermostabile DNA-abhängige DNA-Polymerase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Taq-DNA-Polymerase (Eppendorf, Hamburg, Deutschland sowie Qiagen, Hilden, Deutschland), Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA), Tth-DNA-Polymerase (Biozym Epicenter Technol., Madison, USA), Vent-DNA-Polymerase, DeepVent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Beverly, USA), Expand-DNA-Polymerase (Roche, Mannheim, Deutschland) verwendet.
  • Die Verwendung von Polymerasen, die aus natürlich vorkommenden Polymerasen durch gezielte oder evolutive Veränderung optimiert worden sind, ist ebenfalls bevorzugt. Bei der Durchführung der PCR in Gegenwart des Substanzbibliothekenträgers ist insbesondere die Verwendung der Taq-Polymerase der Firma Eppendorf (Hamburg, Deutschland) bzw. des Advantage-cDNA-Polymerase-Mix von Clontech (Palo Alto, CA, USA) bevorzugt.
  • Alle für die erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren erfindungsgemäßen Vorrichtungen können unabhängig davon, ob sie in einem Bereich der ersten Fläche immobilisierte Sondenmoleküle aufweisen oder nicht und unabhängig davon, ob sie z.B. für Nukleinsäuretarget-Sonden-Wechselwirkungen bzw. Proteintarget-Sonden-Wechselwirkungen bzw. für Konzentrationsmessungen von Targets ohne Sonden verwendet werden, in einer bevorzugten Ausführungsform eine sogenannte „Verdrängerstruktur" aufweisen.
  • Wenn die für die erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Vorrichtungen z.B. auf der ersten Fläche immobilisierte Sonden aufweisen wird erfindungsgemäß als Verdrängerstruktur eine Ausgestaltung, vorzugsweise ein Erhebung der zweiten Fläche bezeichnet, die sich zumindest teilweise in dem Bereich der zweiten Fläche befindet, der den immobilisierten Sonden gegenüberliegt, und die auf der Oberfläche der zweiten Fläche angeordnet ist, die den Sonden zugewandt ist.
  • Der Verdränger, der vorzugsweise die Form einer Erhebung auf der Fläche einnimmt, hat zur Aufgabe, die fluoreszierende Lösung zwischen der zweiten Fläche und der ersten Fläche quantitativ zu verdrängen. Bei den bisher beschriebenen Lösungen kann mitunter, das Problem auftreten, dass Reste von fluoreszierender Lösung zwischen den beiden Flächen verbleiben. Dies kann mit durch Einsatz einer Verdrängerstruktur vermieden werden.
  • Für Verdrängerstrukturen, die vorzugsweise als Erhebung der Fläche ausgestaltet sind, können eine Vielzahl an Materialien in Frage kommen, vorzugsweise jedoch elastische oder weiche duktile Materialien. Bevorzugt sind diese Materialine optisch transparent, so dass sie die Detektion nicht nachteilig beeinflussen. Als Materialien kommen z.B. in FrageSilikonelastomere, wie z.B. Sylgard 184, Kautschuk, Silikonkautschuk oder auch elastische Kunststoffe. Als Materialien können auch TEP, Poylurethane und Acryle oder Acrylate in Frage kommen. Bevorzugt sind die vorgenannten Materialien nicht fluoreszierend. Besonders bevorzugt sind 2-komponentige platinvernetzende Silikonkautschuke (wie z.B. PDMS (Sylgard 184 von Dow Corning)). Diese sind transparent, biologisch inert und nichtfluoreszent. Die Verdrängermaterialien müssen nicht optisch transparent sein, sollten aber bevorzugt nicht autofluoreszierend sein.
  • Ebenso kann eine mit der fluoreszierenden Lösung nicht mischbare bzw. in der fluoreszierenden Lösung nicht lösbare Flüssigkeit, bspw. Silikonöl eingesetzt werden. Z.B. kann ein Silikonelastomer (bspw. Dow Corning Sylgard 184), welches nicht ausgehärtet sein muss, eingesetzt werden. Die Flüssigkeit kann optisch transparent sein und ist bevorzugt nicht autofluoreszierend.
  • Je weicher das verwendete Material ist, desto besser gleicht es in der Oberfläche befindliche Unebenheiten bzw. auch die eventuelle Rauheit einer Oberfläche aus. Werden flüssige Materialien eingesetzt, so sollten diese vorzugsweise die Oberfläche benetzen, um eine optimale Verdrängung der fluoreszierenden Lösung zu ermöglichen.
  • Die Verdrängerstruktur sollte eine äußere Form haben, die es erlaubt möglichst effizient Flüssigkeit aus der Reaktionskammer zu verdrängen. Von daher sind geometrische Formen mit einer konvexen Oberfläche bevorzugt. Selbstverständlich können aber auch planare, rechteckige oder runde Formen eingesetzt werden. Die Verdrängerstruktur kann z.B. im komrpimierten Zustand den gesamten Bereich, in dem Sonden immobilisiert sind, bedecken oder nur Teile davon. Konvexe Verdrängerstrukturen sind bevorzugt, weil sie bei Kompression der Reaktionskammer zunächst nur an einem Punkt der gegenüberliegenden Fläche aufsetzen und bei weiterer Kompression dann eine flächige Bedeckung gewährleisten, wobei die Flüssigkeit seitlich aus der Reaktionskammer gedrängt wird. Geometrische Formen, die ähnliches leisten, sind gleichermaßen bevorzugt.
  • Der Verdränger kann aufgeklebt, aufgetropft, mittels einer geeigneten Vorrichtung abgelegt und fixiert werden. Andere Verfahren sind jedoch nicht ausgeschlossen. Z.B. kann die Verdrängerstruktur zusammen mit der zweiten Fläche als ein Element ausgebildet sein und somit aus einem Stück hergestellt sein.
  • Wenn die erfindungsgemäßen Vorrichtungen auf der ersten Fläche keine immobilisierten Sonden aufweisen, kann sich die Verdrängungsstruktur entweder auf der ersten und/oder der zweiten Fläche befinden. Die Verdrängerstruktur ist dabei so positioniert, dass sich auf der Oberfläche der ersten und/oder zweiten Fläche befindet, die dem Reaktionsraum zugewandt ist. Dabei liegt die Verdrängerstrukture dem Bereich der ersten und/oder zweiten Fläche gegenüber, in dem die Detektion der Targets im komprimierten Zustand der Reaktionskammer erfolgen soll. Hinsichtlich Form, Material und Anbringung der Verdrängerstruktur gilt das oben gesagte.
  • Die vorgenannten Möglichkeiten sind beispielhaft in der 32 dargestellt.
  • Im Folgenden sind spezielle Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. des erfindungsgemäßen Verfahren dargestellt.
  • In 5 wird gezeigt, dass die erste Fläche, hier eine elastische Membran, in die vorzugsweise eine Heizvorrichtung integriert ist, durch einen Stift bzw. einen Stößel deformiert und dadurch das Substrat auf der ersten Fläche, auf dem Sonden immobilisiert sein können, wobei es sich nicht um einen Mikroarray handelt, in Richtung der Detektionsebene gedrückt wird. Ferner wird durch einen Abstandshalter auf der zweiten Fläche die Detektionsebene in die Reaktionskammer gedrückt und nähert sich damit von oben dem Substrat, bis die Flüssigkeit zwischen Substrat und Detektionsebene nahezu vollständig verdrängt wird. Durch das Führen der Detektionsfläche in Richtung des Substrats bzw. der ersten Fläche werden die die Reaktionskammer abdichtenden elastischen Dichtungen komprimiert. Die verdrängte Flüssigkeit deformiert die Dichtung derart, dass die Luft in Druckausgleichskammern komprimiert wird.
  • Die Prozesseinheit kann aber auch so gestaltet werden, dass entweder nur die erste Fläche, z.B. in Form einer elastischen Membran, verformt wird oder aber nur die Detektionsebene in die Kammer gedrückt wird.
  • In 6 ist eine weitere technische Ausgestaltung zur Kompression der Prozesseinheit dargestellt. Die Reaktionskammer ist seitlich und auf der der Detektionsebene gegenüberliegenden Seite von einer Dichtungsmembran umschlossen, auf der das Substrat, auf dem Sonden immobilisiert sein können, wobei es sich nicht um einen Mikroarray handelt, befestigt ist. Die Dichtungsmembran verschließt auf der Höhe des Substrats ein Loch an der Unterseite des Kammerkörpers. Das Loch ist etwas kleiner als das Substrat. Bei der Durchführung einer PCR in der Reaktionskammer wird durch den aufgrund der mit der PCR verbundenen höheren Temperaturen entstehenden Innendruck in der Kammer das Loch fest verschlossen. Die Kammer ist also trotz labiler Dichtungsmembran druckfest (Prinzip des selbstschließenden Ventils). Zur Detektion wird ein Stift bzw. ein Stößel durch das Unterseitenloch geschoben. Die Dichtungsmembran wird angehoben und das Substrat gegen die Detektionsebene gedrückt. Um die notwendige Elastizität der Dichtungsmembran zu gewährleisten, kann die Membran mit einer Ausgleichsfalte versehen werden. Durch die verdrängte Flüssigkeit werden auch bei dieser Ausgestaltung die Druckausgleichskammern komprimiert.
    •
  • Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung und sollen in nicht einschränkender Weise ausgelegt werden.
  • Beispiel 1: Aufbau einer Reaktionskartusche ohne integrierte Heizung
  • In den 8 und 9 ist ein Ausführungsbeispiel einer Prozessierungseinheit ohne integrierte Heizung sowie eine Vorrichtung zum Führen eines Substrats, das auf der ersten Fläche aufliegt und auf dem Sonden immobilisiert sein können, wobei es sich nicht um einen Mikroarray handelt, gegen die Detektionsebene dargestellt. Das Substrat in der gezeigten Vorrichtung kann durch ein konventionelles Fluoreszenzmikroskop (z.B. Axioskop, Zeiss, Jena, Deutschland) ausgelesen werden.
  • Beispiel 2: Aufbau einer Reaktionskartusche mit Silizium-Heizsubstrat
  • Bei der in den 10 und 11 dargestellten Variante der Prozessierungseinheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung handelt es sich um eine miniaturisierte Reaktionskartusche mit einem Substrat, das auf der ersten Fläche, die durch ein Heiz/Sensorsubstrat dargestellt wird, aufliegt und auf dem Sonden immobilisiert sein können, wobei es sich nicht um einen Mikroarray handelt, einem Silizium-Heizsubstrat mit integriertem Temperatursensor ("Heizsubstrat") zur Einstellung distinkter Temperaturen in der Reaktionskammer sowie einer Leiterplatte mit optionalem EPROM zur elektrischen Kontaktierung des Heizsubstrates. Die einzelnen Bestandteile sind in zwei aus Kunststoff gefertigten Halbschalen eingebettet. Die gesamte Einheit stellt ein räumlich geschlossenes System dar, in dem alle erforderlichen Reaktionen (z.B. PCR) z.B. temperaturgesteuert vorgenommen werden können.
  • In die untere Halbschale wird als erstes die Leiterplatte (mit dem EPROM nach unten) in den vorgesehenen Schacht eingelegt. Auf der Oberseite der Leiterplatte sind drei elektrische Kontaktierungsflächen ("Kontaktpads") angeordnet, welche die elektrische Verbindung mit dem nachfolgend eingelegten Heizsubstrat gewährleisten, welches ebenfalls drei Kontaktpads trägt. Dieses Heizsubstrat hat eine Größe 8 mm × 6 mm und eine Dicke von etwa 0,6 mm. Das Heizsubstrat gewährleistet eine genaue Einstellung verschiedener Temperaturen (z.B. von 40°C-95°C) innerhalb der durchgeführten Untersuchung. Die Messung der Temperatur in der Reaktionskammer kann dabei entweder über den im Heizsubstrat integrierten Sensor oder aber über eine externe Messeinheit, welche die Temperatur direkt auf der Oberfläche des Heizsubstrates misst, erfolgen. In letzterem Falle kann auf den integrierten Sensor im Heizsubstrat verzichtet werden. Die zum Heizen und/oder zur Temperaturmessung verwendeten integrierten Bauelemente können zum Beispiel Dioden oder auch Transistoren sein. Die dem Reaktionsraum zugewandte Fläche des Silizium-Heizsubstrates enthält keinerlei elektrische Systeme und ist mit einer SiO2-Passivierungsschicht überzogen.
  • Als nächstes Bauteil folgt eine elastische Dichtung, welche den Reaktionsraum seitlich begrenzt.
  • In der Mitte des Reaktionsraumes wird das Substrat so befestigt, dass es der Detektionsebene zugewandt ist. Nach dem Einbau der Detektionsebene in Form einer Glasfläche ragt diese noch 0,2 mm aus der unteren Halbschale hervor. Durch das nachfolgende Anfügen der von Passstiften geführten oberen Halbschale wird die Glasfläche gegen die Dichtung gepresst und gewährleistet auf diese Weise eine optimale Abdichtung der Reaktionskammer.
  • Anschließend kann die Reaktionskammer mit Reaktionslösung befüllt werden. Dabei ist zu beachten, dass nur der Innenraum mit dem Substrat, nicht aber die äußeren Kammern befüllt werden. Die benötigten Flüssigkeiten werden mit Kanülen über die vorgesehene Kanülenführung in den Reaktionsraum eingespritzt.
  • Anschließend können über das Silizium-Heizsubstrat gesteuerte biochemische Reaktionen, wie z.B. PCR und/oder Hybridisierung in der Reaktionskammer durchgeführt werden.
  • Zur Detektion der Zwischenergebnisse oder des Endresultats wird die Detektionsebene mittels der Abstandshalter der Detektionseinheit von oben gegen das Substrat gedrückt, bis der Abstand zwischen Detektionsebene und Substrat etwa null ist. Dabei wird die umliegende Flüssigkeit in die äußeren Kammern verdrängt, wo sie die dortige Luft komprimiert. Dieser Vorgang ist reversibel und kann zum Beispiel nach jedem PCR-Zyklus vorgenommen werden. Das gleiche gilt bei Bindungsassays zwischen Proteintargets und Proteinsonden.
  • Durch das kompakte Design sowie die interne Leiterplatte mit EPROM und das integrierte Heizsubstrat ist diese Variante der erfindungsgemäßen Vorrichtung besonders für den mobilen Einsatz geeignet.
  • Beispiel 3: Nachweis der Abnahme des Hintergrundsignals durch Verdrängung des Analyten
  • Dieses Beispiel wurde mit einem Mikroarray durchgeführt. Es stellt keine Ausführungsform der beanspruchtes Verfahren dar, soll aber belegen, dass durch die oben beschriebenen komprimierbaren Reaktionskammern es tatsächlich möglich das Hintergrundsignal durch Verdrängung der Analytlösung zu reduzieren. Insofern ist zu beachten, dass kein Unterscheid zwischen einer Vorrichtung besteht, bei der auf der ersten Fläche ein Mikroarray positioniert ist, und einer Vorrichtung, bei der auf der ersten Fläche z.B. eine einzige Sonde, die nicht in Arrayform vorliegt, immobilisiert ist
  • Alle in diesem Beispiel beschriebenen Fluoreszenzmessungen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Jena, Deutschland) vorgenommen. Die Anregung erfolgte im Auflicht mit einer Weißlichtquelle und einem für Cyanine 3 geeigneten Filtersatz. Die Signale wurden mit einer CCD-Kamera (PCO-Sensicam, Kehlheim, Deutschland) aufgezeichnet. Die Spaltbreite bezeichnet im Folgenden den Abstand zwischen Mikroarray und Detektionsebene.
  • a) Messung des Fluoreszenzsignals des Analyten in Abhängigkeit von der Spaltbreite
  • Es wurden Kanalmasken mit definierter Kanaltiefe (5 μm, 10 μm, 28 μm) aus Sylgard abgegossen. Die Kanäle wiesen eine Breite von 125 μm auf. Ein Glaschip wurde über die unterschiedlich tiefen Kanäle gelegt. Die Kanäle wurden dann mit einer 200 nM-Lösung eines Cy3-markierten Oligonukleotidesin 2 × SSC + 0,2 %SDS-befüllt und das Signal bei einer Belichtungszeit von 1,5 s gemessen.
  • In 12 sind die Messergebnisse dargestellt. Mit steigender Kanaltiefe steigt das Signal linear an. Es konnte eine Regressionsgerade errechnet werden (Gleichung 1) F(x) = 6,2468x + 50,016 (Gleichung 1)
  • Mit Hilfe der erhaltenen Regressionsgleichung (Gleichung 1) können nun die Schichtdicken zwischen DNA-Chip und Detektionsfläche anhand des Hintergrundfluoreszenzsignals bestimmt werden.
  • Dies wurde überprüft, indem zwei Glasflächen (Chips) aufeinander gelegt wurden, die auf ihrer Oberseite strukturierte Marken trugen (Kreuze, Zahlen und Datamatrix in 14), auf welche fokussiert werden konnte. Die Chips wurden so aufeinander gelegt, dass die strukturierten Marken zueinander orientiert und nur durch eine dünne Flüssigkeitsschicht voneinander getrennt waren. Als Flüssigkeit wurde eine 200 nM-Lösung eines Cy3-markierten Oligonukleotides in 2 × SSC + 0,2 %SDS verwendet. Mit Hilfe der mit einer Skalierung versehenen Fokussierungseinrichtung des Mikroskops konnten der Abstand zwischen den Marken und damit die Schichtdicke des Flüssigkeitfilms direkt bestimmt werden. Die Intensität des Hintergrundes beträgt 158 Grauwerte bei einer Belichtungszeit von 0,75 s. Die am Fluoreszenzmikroskop gemessene Spaltbreite beträgt 40 μm. Unter der Annahme, dass sich die Messgrauwerte linear zur Belichtungszeit verhalten (siehe 13), erhält man mit Gleichung 1 eine Spaltbreite von 42,6 μm. Die so ermittelten Werte für die Dicke der Flüssigkeitsschicht stimmen gut überein.
  • b) Experimente zur Verringerung beziehungsweise Eliminierung der Hintergrundfluoreszenz durch Komprimierung der Prozesseinheit
  • Bei diesen Experimenten wurde das Hybridisierungssignal in Abhängigkeit der Verdrängung des fluoreszierenden Analyten durch Andrücken eines Stößels gemessen. Der experimentelle Aufbau ist in 15 skizziert. Durch das Andrücken des Stößels wurde der Silizium-Chip (3,15 × 3,15 mm) gegen einen Sonden-Chip (DNA-Chip) gedrückt und dabei die zwischen den beiden Flächen liegende Flüssigkeit verdrängt.
  • Zur Durchführung des Experimentes wurde die Kammer mit einer Hybridisierungslösung befüllt, die ein Modellsystem für die Verhälnisse bei einer PCR-Hybridisierung darstellt. Die Hybridisierungslösung enthielt ein Cy3-markiertes Oligonukleotid (Endkonzentration 2 nM in 2 × SSC + 0,2 % SDS), welches Komplementarität zum Sonden-Array aufwies. Zusätzlich enthielt die Hybridisierungslösung ein ebenfalls Cy3-markiertes Oligonukleotid, welches nicht mit dem Sondenarray hybridisiert und daher lediglich zum Fluoreszenz-Hintergrundsignal in der Lösung, nicht aber zu den spezifischen Signalen an den Spots beiträgt.
  • Die Hybridisierung erfolgte für 10 min. Beim anschließenden Auslesen der Hybridisierungssignale wurde eine feste Belichtungszeit von 1,5 s gewählt. Am Versuchsaufbau wurde zwischen jeder Aufnahme der Stößel weiter an den Sonden-Array (Detektionsfläche) gedrückt, so dass sich der mit Hybridisierungslösung gefüllte Spalt zwischen Array und 2. Fläche verringerte.
  • 16 zeigt eine Aufnahme des Hybridisierungssignals bei einer Spaltbreite von 10 μm. Die Messergebnisse für Hintergrundsignal und Hybridisierungssignal an den Spots sind in 17 dargestellt. Beide Signale verhalten sich erwartungsgemäß linear zur Spaltbreite. Daher verändert sich das um den Hintergrund korrigierte Spotsignal nicht mit der Spaltbreite.
  • Bei Erreichen eines Grauwertes von 255 ist das Messinstrument übersteuert. Das heißt, mit einer Spaltbreite von etwa 17 μm ist eine Messung der Spotintensität nur durch Verringerung der Belichtungszeit möglich. Damit sinkt dann die Messempfindlichkeit.
  • Durch Verringerung der Spaltbreite erhöht sich somit der dynamische Meßbereich. Durch Hintergrundbereinigung der Spotsignale (Differenzbildung) kann die Spaltbreite über einen weiten Bereich ohne eine Beeinträchtigung der Messung und Messergebnisse, variiert werden Bei sehr großen Spaltbreiten (> 20 μm) wird die Messung durch Übersteuerung des Detektors stark beeinträchtigt.
  • c) Amplifikation, Hybridisierung und Detektion als Eintopfreaktion
  • Es wurden zwei Prozesseinheiten mit einem Aufbau entsprechend 15 montiert und durchnumeriert.
  • Es wurden zwei identische Reaktionsansätze mit folgender Zusammensetzung hergestellt: Reaktionsansatz:
    20mM dNTPs 0,5 μl
    1 M Kaliumacetat (Kaac) 3 μl
    25mM Mg-acetat Eppendorf 5 μl
    Clontech C-DNA PCR Puffer 5 μl
    Eppendorf Taq-Polymerase 3 μl
    10μM Primer CMV_DP_Cy3 1 μl
  • Cy3_5'TGAGGCTGGGAARCTGACA3'
    10μM Primer CMV_UP_NH2 0,66 μl
    5'GGGYGAGGAYAACGAAATC3'_NH2
    10μM Primer CMV_UP 0,33 μl
    5'GGGYGAGGAYAACGAAATC3'
    10μM Primer Entero_DP_Cy3 1 μl
    Cy3_5'CCCTGAATGCGGCTAAT3'
    10μM Primer Entero_UP_NH2 0,66 μl
    5'ATTGTCACCATAAGCAGCC3'_NH2
    10μM Primer Entero_UP 0,33 μl
    5'ATTGTCACCATAAGCAGCC3'
    10μM Prime HSV1_DP_Cy3 1 μl
    Cy3_5'CTCGTAAAATGGCCCCTCC3'
    10μM Primer HSV1_UP_NH2 0,66 μl
    5'CGGCCGTGTGACACTATCG3'_NH2
    10μM Primer HSV1_UP 0,33 μl
    5'CGGCCGTGTGACACTATCG
    10μM Primer HSV2_UP_Cy3 1 μl
    Cy3_5'CGCTCTCGTAAATGCTTCCCT3'
    10μM Primer HSV2_DP_NH2 0,66 μl
    5'TCTACCCACAACAGACCCACG3'_NH2
    10μM Primer HSV2_DP 0,33 μl
    5'TCTACCCACAACAGACCCACG3'
    10μM Primer VZV_DP_Cy3 1 μl
    Cy3_5'TCGCGTGCTGCGGC
    10μM Primer VZV_UP_NH2 0,66 μl
    5'CGGCATGGCCCGTCTAT3'_NH2
    10μM Primer VZV_UP 0,33 μl
    5'CGGCATGGCCCGTCTAT
    Template CMV 1 μl
    PCR-Grade Water 22,5 μl
    total 50 μl
  • Die Prozesseinheiten wurden mit je 50 μl Reaktionsansatz befüllt. und nach folgendem Temperatur-Zeit-Regime prozessiert.
    1 Denaturieren 95 °C
    Dauer 300 s
    2 Denaturieren 95 °C
    Dauer 10 s
    3 Annealing/Extension 60 °C
    Dauer 20 s
    Wiederholung von Schritt 2 bis 3 35 mal
    4 Denaturierung 95 °C
    Dauer 300 s
    5 Hybridisierung 40 °C
    Dauer 3600 s
  • Anschließend wurden die beiden Prozesseinheiten unterschiedlichen Behandlungen unterzogen. Im ersten Fall (Prozesseinheit 1) wurde die Hintergrundfluoreszenz durch Verdrängung des Analyten verringert. Dies wurde gewährleistet, indem der Stößel nach oben in Richtung der Detektionsfläche gedrückt wurde, so dass sich der mit der Reaktionslösung gefüllte Spalt weitestgehend verkleinert.
  • Im zweiten Fall (Prozesseinheit 2) wurde der Analyt gegen eine nicht fluoreszierende Lösung ausgetauscht. Der Austausch der Lösung erfolgte mit 2 × SSC-Puffer bei einer Flussrate von 300 μl/min und einem Spülvolumen von 900 μl. Diese Vorgehensweise entspricht dem Stand der Technik.
  • Anschließend wurden die beiden Strategien zur Verringerung der Hintergrundfluoreszenz miteinander verglichen. Dazu wurden die Hybridisierungssignale in beiden Prozesseinheiten mit Hilfe des beschriebenen Fluoreszenzmikroskop-Kamera-Aufbaus detektiert.
  • Die Belichtungszeit betrug 5 s (siehe 18 und 19). Der Vergleich der Spotintensitäten erfolgte anhand des Spots mit der Substanz_CMV_S_21-3 (5'-NH2TGTTGGGCAACCACCGCACTG-3'). Der Ort der Sonden ist in den 18 und 19 gekennzeichnet.
  • In 20 ist das Ergebnis des Experimentes zusammengefasst. Durch die Spülung der Reaktionskammer in der Prozesseinheit 2 verringert sich das Hybridisierungssignal gegenüber der Verdrängung in Prozesseinheit 1. Es wird angenommen, dass eine Ausblutung der Sonden dafür verantwortlich ist.
  • Die Methode der Analytverdrängung durch das erfindungsgemäße Verfahren ist somit dem Austausch der Lösungen vorzuziehen.
  • Um einen Nachweis über Menge und Integrität des Amplifikationsproduktes zu erhalten, wurden zusätzlich 5 μl jeder Reaktionslösung auf einem 2 %-igen Agarosegel analysiert. Das Ergebnis (Ethidiumbromid-gefärbtes Gel detektiert auf eine UV Transilluminator) ist in 21 zu sehen.
  • Gleiches sollte gelten, wenn Sonden, die nicht in Arrayform vorliegen, auf ersten Fläche bzw. auf einem Substrat, das auf der ersten Fläche aufliegt, immobilisiert werden. Außerdem sollten diese Erkenntnisse auch gelten, wenn die Sonden überhaupt nicht immobilisiert sind.
  • Beispiel 4: Gerät zur Prozessierung und Detektion von erfindungsgemäßen Reaktionskartuschen
  • Ein Gerät zur Prozessierung und Detektion von erfindungsgemäßen Reaktionskartuschen gemäß diesem Ausführungsbeispiel ist in 28 gezeigt.
  • Das Gerät zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahrens mit erfindungsgemäßen Reaktionskartuschen besteht üblicherweise aus mehreren Komponenten, welche in einem Gerät vereint, aber auch modular aus mehreren Teilgeräten zusammengestellt sein können. Die Vorrichtung kann dabei wahlweise über einen integrierten Rechner oder eine Schnittstelle zu einem externen Rechner angesteuert werden. Der Aufbau der Vorrichtung ist in 28 veranschaulicht.
  • Ein beispielhafter Ablauf findet wie folgt statt:
    Das Fluid-Interface der Reaktionskartusche wird vom Anwender manuell in die Befüllstellung gebracht, bei der die Kanülen die Dichtung des Kammerkörpers durchstechen. Anschließend füllt der Anwender das Reaktionsgemisch mit Hilfe einer Standard-Laborpipette in die Reaktionskammer ein. Beide Schritte können auch von einer entsprechend ausgeführten Vorrichtung übernommen werden. Das Fluidinterface wird nun wieder in die Ausgangsstellung bewegt, wobei auch dieser Vorgang von einer entsprechend ausgeführten Vorrichtung durchgeführt werden kann.
  • Die Reaktionskartusche wird daraufhin in das Gerät eingelegt. Ein in der Vorrichtung angeordneter Datamatrix-Reader erkennt die auf der Reaktionskartusche angebrachte eineindeutige Datamatrix und lädt anhand eines vom Nutzer übermittelten Datensatzes die Kenndaten für die Kartusche sowie für den durchzuführenden Test in den Steuerrechner. Dieser steuert dann die einzelnen Prozessschritte, welche beispielsweise eine Amplifikation und Hybridisierung umfassen können. Über den integrierten Drückmechanismus wird anschließend zur Detektion der Kapillarspalt in der Reaktionskammer erfindungsgemäß verringert.
  • Die Detektion kann mit herkömmlichen fluoreszenzoptischen bild- oder nichtbildgebenden Systemen erfolgen. Die gewonnenen Daten werden anschließend an einen Steuerrechner übermittelt, welcher diese auswertet und auf einer internen oder externen Schnittstelle präsentiert oder speichert.
  • Anschließend kann die Reaktionskartusche durch den Anwender aus dem Gerät entnommen und entsorgt werden.
  • Beispiel 5: Reaktionskartusche aus elektrisch leitfähigem Kunststoff
  • Eine wie in 29 dargestellte Reaktionskartusche wird hergestellt.
  • Die untere Halbschale (1) der Reaktionskartusche besteht aus elektrisch leitfähigem Kunststoff als Boden der Reaktionskammer (Conduct 2, RKT, Deutschland). Auf der Unterseite des Kammerbodens wird ein Folien-Pt100 Temperatursensor mit Hilfe eines geeigneten Klebers, z.B. Loctite 401 (Loctite, Deutschland) fixiert. Die untere Halbschale bildet gemeinsam mit der Dichtung (3) und dem Deckglas (4) die Reaktionskammer der erfindungsgemäßen Kartusche.
  • Die Kartusche weist ferner eine Gewindebohrung (2) zum Einsetzen von Schrauben zur elektrischen Kontaktierung, eine obere Halbschale (5) der Reaktionskartusche, z.B. aus Acryl, eine Bohrung (6) zur Befestigung der oberen Halbschale sowie ein Detektionsfenster (7) in der oberen Halbschale auf.
  • Ein Standard-PCR-Reaktionsmix wird hergestellt:
    30,5 µl deionisiertes Wasser
    5 µl 10 × PCR-Puffer (z.B. 10 × cDNA PCR Reaction Buffer, Clontech, Deutschland)
    5 µl Mg-Acetat, 25 mM (z.B. Eppendorf, Deutschland)
    0,5 µl dNTP, 20 mM each
    1 µl 16sfD1 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'), 10 mM
    1 µl 16sRa (5'-TACCGTCACCATAAGGCTTCGTCCCTA-3'), 10 mM
    3 µl Taq DNA Polymerase (z.B. Genaxxon, Deutschland)
    1 µl Template
  • Mit Hilfe einer Insulinspritze (Becton Dickinson, Deutschland) wird die Reaktionskammer mit dem Reaktionsgemisch gefüllt. Zum Entlüften während des Befüllvorganges wird eine zweite Kanüle durch die Dichtung des Kammerkörpers gestochen. Nach der Befüllung werden Entlüftungskanüle und Insulinspritze fachgerecht entsorgt.
  • Die Kammer wird anschließend über die beiden dafür vorgesehenen Schrauben an einer Regeleinheit angeschlossen (CLONDIAG chip technologies GmbH, Deutschland) Ebenso wird der Temperatursensor auf der Unterseite der unteren Halbschale an diese Regeleinheit angeschlossen. Diese Regeleinheit ist in der Lage, nach einem vorgegebenen Programm bestimmte Temperaturen in der unteren Halbschale zu regeln.
  • Auf diese Weise wird das nachfolgende PCR-Programm durchgeführt: 5 min 95°C, 30 × (30 s 95°C, 30 s 62°C, 50 s 72°C).
  • 30 zeigt eine Aufnahme der Reaktionskartusche mit einer Wärmebildkamera bei einer Temperatur von 95°C.
  • Nach Abschluss des Programms wird das Reaktionsprodukt mit Hilfe einer Insulinspritze aus der Reaktionskammer entfernt. Zur Belüftung während der Leerung der Reaktionskammer wird analog zur Befüllung eine Kanüle durch die Dichtung des Kammerkörpers gestochen.
  • Das Reaktionsprodukt wird nun durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Dazu werden 5µl der Reaktionslösung mit einem geeigneten Puffer (z.B. 5 µl 250 mM in 50% Glycerin, Bromphenolblau) in die Tasche eines 2% Agarosegels aufgetragen und eine Elektrophorese durchgeführt. Das Resultat ist in 31 dargestellt.
  • Wie deutlich zu erkennen ist, konnte in allen Fällen ein Amplifikationsprodukt der korrekten Größe und in zur Positivkontrolle vergleichbarer Menge erhalten werden.
  • Beispiel 6: Reaktionskartusche mit Verdrängerstruktur auf der zweiten Fläche
  • Eine wie in 5 oder 6 dargestellte Reaktionskartusche wird hergestellt. In der Mitte der zweiten Fläche der erfindungsgemäßen Vorrichtung, wird mit Hilfe einer Nadel ein Tropfen (ca. 20µl) Sylgard 184 abgesetzt. Anschließend wird diese zweite Fläche mit diesem Silkontropfen in bspw. einem Ofen bei 120°C für eine Stunde inkubiert, um das Sylgard zu vernetzen. Anschließend wird diese zweite Fläche in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung assembliert. Auf der ersten Fläche wird ein DNA-Sondenarray aufgebracht. Damit ist das im folgenden beschriebene Verfahren kein Gegenstand der beanspruchten Verfahren bzw.
  • Vorrichtungen. Es ist aber als Beleg dafür anzusehen, dass Verdrängerstrukturen in der Tat eine Verringerung des Hintergrundsignals bewirken können. Insofern wird kein Unterschied zwischen eine DNA-Sondenarray oder einen Substrat bestehen, auf dem eine DNA-Sonde in Nicht-Array Form, immobilisiert ist.
  • Ein PCR-Ansatz nach folgendem Schema wird hergestellt:
    10 × Clontech cDNA-Puffer 20 µl
    25mM Mg-Acetat Eppendorf 20 µl
    dNTP's 20mM each 2 µl
    Genaxxon Taq-Polymerase 12 µl
    Bidest 122 µl
    Primer 1 10µM mit Cy3-Markierung 4 µl
    Primer 2 10µM 4 µl
    1M K-acetat 12 µl
    Template DANN 4 µl
  • 20µl dieses Ansatzes werden in die erfindungsgemäße Vorrichtung gegeben. Anschließend wird die Vorrichtung an einen entsprechenden Regler angeschlossen (Prototyp, Join, Jena) und eine PCR nach dem folgenden Schema durchgeführt.
  • Figure 01130001
  • Figure 01140001
  • Danach wird die erste Fläche gegen die zweite Fläche geführt bis der Verdränger die Oberfläche der ersten Fläche berührt. Durch das Breitdrücken des elastischen Verdrängers auf der Oberfläche des Arrays wird die den Hintergrund verursachende fluoreszierende Lösung vollständig verdrängt und das Signal kann detektiert werden. (Siehe 33)
  • Beispiel 7: Nachweis von CD4 Antigenen auf Lymphozyten
  • Wie oben erwähnt wurde können die erfindungsgemäßen Verfahren auch mit Vorrichtungen durchgeführt werden, bei denen die aus einer ersten und zweiten Fläche gebildete Reaktionskammer durch unterschiedliche Gegenstände gebildet wird. Als Beispiel wurde auf ein Reaktionsgefäß verwiesen, in das ein passgenauer Stößel, Kolben oder Stempel eingeführt wird, um eine entsprechend schmale Reaktionskammer zu bilden, aus der die Anayltflüssigkeit verdrängt wird. Dieses Prinzip ist anhand 34 erläutert worden.
  • Im konkreten Fall wird eine Mikrotiterplatte aus Polystyrol mit einer Aminomodifizierten Oberfläche (bspw. nunc Immobilizer F96 Micro Well Plate-Amino)) mit anti-CD4 Antikörper (Molecular Probes) beschichtet. Der Antikörper wird in einer Konzentration von 0.2µg/µl in 1 × PBS Puffer in der Platte bei 23°C für 1h in der Platte inkubiert und die Platte anschließend mit 1 × PBS Puffer gewaschen.
  • 40 µl einer Blutprobe werden mit 160 µl deionisiertem Wasser, 40 µl 0.5M EDTA Lösung und 5 µl einer Lösung eines mit dem Fluoreszenzfarbstoff Phycoerythrin markierten anti-CD4-Antikörpers in 1 × PBS(Molecular Probes, Stammkonzentration 0,2mg/ml) versetzt, kurz geschüttelt und in eine Vertiefung der mit dem Fängerantikörper beschichteten Platte überführt.
  • Nach kurzer Inkubation (15min) in einem Schüttler (500 U/min) bei Raumtemperatur wird die Platte auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop ausgelesen. Hierzu werden in die Vertiefungen der Platte Stößel eingelassen, die direkt auf der Oberfläche der Platte zum liegen kommen und die Eigenschaft haben, die Flüssigkeit im Wesentlichen zu verdrängen und selbst kein Fluoreszenzlicht im gewählten Detektionsbereich (Anregung: 541nm, Emission:576nm) zu emittieren. Das Signal wird mit einer CCD Kamera aufgenommen und mit dem gemessenen Signal in anderen Vertiefungen der Platte verglichen.
  • Beispiel 8: Nachweis der Anzahl von CD4 Antigen tragenden Lymphozyten
  • Wie oben erwähnt wurde können die erfindungsgemäßen Verfahren auch durchgeführt werden, wenn die Sonden nicht an die erste Fläche der Reaktionskammer immobilisiert sind. Dieser Aspekt der Erfindung wurde anhand 35 und 36 erläutert.
  • Im konkreten Fall werden 1 µl einer Blutprobe mit 4 µl deionisiertem Wasser, 1 µl 0.5M EDTA Lösung und 0.5 µl einer Lösung eines mit dem Fluoreszenzfarbstoff Phycoerythrin markierten anti-CD4-Antikörpers in 1 × PBS (Molecular Probes, Stammkonzentration 0,2mg/ml) versetzt, kurz geschüttelt und eine quetschbare Detektionskammer überführt.
  • Die beispielhafte quetschbare Detektionskammer wird hergestellt durch Verwendung einer Kartusche, wie sie oben beschrieben wurde und z.B. in den 3-6 oder den 10 und 11 dargestellt ist, jedoch ohne den mit dem Heizsensor versehenen Chip zu benutzen.
  • Anstelle dessen wird eine ca. 0.3µm dicke PDMS Membran als erste Fläche verwendet. Zur Detektion wird diese Membran gegen die Detektionsfläche gedrückt und mit einem Fluoreszenzmikroskop (Axioskop, Zeiss, Deutschland, Anregung: 541nm, Emission:576nm)
  • Das Ergebnis ist in 37 dargestellt.
  • Die dunklen Flecken (a), (beispielhaft) sind Erythrocyten, welche nicht durch den anti-CD4-Antikörper erkannt werden. Die hellen Flecken (b) sind Lymphocyten. Im vorliegenden Experiment können also 5 Lymphocyten im Detektionsvolumen detektiert werden.
  • Wenn in einer der vorgenannten Abbildungen ein Substrat erwähnt ist, ist das als eine Substrat zu verstehen, in dem Sonden immobilisiert sein können, ohne dass es sich dabei um einen Mikroarray handelt. Der Begriff Substrat soll in diesem Zusammenhang für den Fall, dass keine Sonden immobilisiert sind, den Bereich der ersten Fläche bzw. der zweiten Fläche definieren, in dem im Zustand der komprimierten Reaktionskammer die Detektion der Targets erfolgen soll. In beiden Fällen (d.h. immobilisierte Sonde bzw. nicht-immobilisierte Sonde) muss das Substrat nicht eine eigenes Bauteil darstellen, sondern kann einen Bereich der ersten Fläche (immobilisierte Sonden) bzw. der ersten und/oder zweiten Fläche (nicht-immobilisierte Sonden) darstellen.
  • Abbildungen
  • 1:
  • Übersicht über die erfindungsgemäße Vorrichtung umfassend eine Auslesegerät und die Prozesseinheit.
  • 2:
  • Darstellung der erfindungsgemäßen Prozesseinheit.
  • 3:
  • Explosionszeichung der erfindungsgemäßen Prozesseinheit umfassend die Detektionsfläche, Dichtung, Substrat, auf dem Sonden immobilisiert sein können bzw. das den Bereich darstellt, in dem die Detektion der Targets erfolgen soll, und Kammerkörper. Der Kammerkörper weist eine reversibel deformierbare elastische Membran auf.
  • 4:
  • Darstellung des Kammerkörpers mit kunstoffumspritzten Heizmeander in der elastischen Membran.
  • 5:
  • Darstellung des Zustandes der erfindungsgemäßen Prozesseinheit im Auslesegerät A) während der PCR, B) vor der Detektion, und C) während der Detektion.
  • 6:
  • Darstellung der Funktionsweise der erfindungsgemäßen Prozesseinheit mit Membrandichtung, Ausgleichsfalte und Unterseitenloch. In A) ist die Prozesseinheit in der Normalstellung zu sehen. In B) ist die Prozesseinheit in der komprimierten Form zu sehen, bei der die fluoreszierende Lösung zwischen Substrat, auf dem Sonden immobilisiert sein können bzw. das den Bereich darstellt, in dem die Detektion der Targets erfolgen soll, und Detektionsfläche verdrängt ist.
  • 7:
  • Darstellung eines Drehtellers, auf dem vier Temperaturblöcke installiert sind. Die Temperaturblöcke sind auf jeweils eine Temperatur thermostatisiert. Durch Drehbewegung des Tellers und/oder der Prozesseinheit lässt sich die Temperatur in der Reaktionskammer wechseln.
  • 8:
  • Abbildung eines Ausführungsbeispiels einer gefrästen und verschraubten Prozesseinheit.
  • 9:
  • Abbildung eines Ausführungsbeispiels einer Komprimierungs- bzw. Verquetschungsapparatur für die erfindungsgemäße Prozesseinheit zur Detektion der Hybridisierungssignale in einem konventionellen Fluoreszenzmikroskop.
  • 10:
  • Darstellung einer erfindungsgemäßen Prozesseinheit mit einer Platine als elektrischem Anschluss für Heizer und Temperatursensor. Der Heizer ist als Halbleiterbauteil ausgeführt.
  • 11:
  • Explosionzeichnung der in 10 gezeigten Prozesseinheit.
  • 12:
  • Darstellung der Regressionsgeraden zur Ermittlung der Breite eines mit Fluorophor befüllten Spaltes.
  • 13:
  • Darstellung des linearen Verlaufs des Fluoreszenzsignals mit steigender Belichtungszeit über den gemessenen Bereich.
  • 14:
  • Fluoreszenz-Aufnahme zweier übereinander gelegter, im Zwischenraum mit 200 nM Cy3-Fluorophor befüllter Chips. Die Intensität des Hintergrundes beträgt 158 Grauwerte bei einer Belichtungszeit von 0,75 s. Die am Fluoreszenzmikroskop gemessene Spaltbreite beträgt 40,00 µm. Unter der Annahme, dass sich die Messgrauwerte linear zur Belichtungszeit verhalten (siehe 13), erhält man mit Gleichung 1 eine Spaltbreite von 42,6 µm. Die so ermittelten Schichtdickenwerte stimmen gut überein.
  • 15:
  • Darstellung des Versuchsaufbaus zur spülungsfreien Detektion von DNA-Arrays.
  • 16:
  • Fluoreszenzaufnahme eines Arrays mit angedrücktem Chip. An den weißen Rändern ist die Hintergrundstrahlung durch die verdrängte Probenlösung zu erkennen.
  • 17:
  • Abnahme der absoluten Intensitäten von Signal und Hintergrund bei Verringerung der Spaltbreite. Die Differenz beider Werte bleibt über den Messbereich konstant.
  • 18:
  • Detektion der Sondensignale durch Verdrängung der Hintergrundfluoreszenz. Am linken Rand ist die nicht verdrängte Flüssigkeit zu erkennen.
  • 19:
  • Detektion der Sondensignale eines durch Spülung hintergrundbereinigten DNA-Arrays.
  • 20:
  • Zusammenfassung der Messergebnisse zum experimentellen Vergleich zwischen dem Verdrängen und dem Austausch des Analyten.
  • 21:
  • Referenzanalytik der PCR in einer Prozesseinheit mittels Gelelektrophorese.
  • 22:
  • Schematische Darstellung einer abnehmbaren Befülleinheit zur Befüllung von Reaktionskartuschen mit reaktiven Substanzen oder Puffern. Hierfür werden folgende Bezugszeichen verwendet:
    • 1
    Befülleinheit
    1.1
    mechanisches Interface Befülleinheit-Kartusche
    2
    Kartusche
    2.1
    mechanisches Interface Kartusche-Befülleinheit
    2.2
    Dichtung
    2.3
    Reaktionskammer
    2.4
    Bevorzugte Öffnung für die Kanülen in der Kartusche
    3
    Befüllungskanal
    3.1
    Fluidisches und mechanisches Interface zu probenbeaufschlagenden Werkzeugen
    3.2
    Befüllungskanüle
    4
    Abfallkanal mit Abfallbehälter
    4.1
    Entlüftungsloch
    4.2
    Abfallkanüle
  • 23:
  • Darstellung des Ablaufs zur Befüllung einer Reaktionskartusche mit einer modularen Befülleinheit.
  • 24:
  • Schematische Darstellung einer integrierten Befülleinheit zur Befüllung von Reaktionskartuschen mit reaktiven Substanzen oder Puffern in der Vorzugsstellung ohne Penetration der Dichtung des Kammerkörpers. Hierfür werden folgende Bezugszeichen verwendet:
    • 1
    Befülleinheit-Kartusche
    1.1
    mechanisches Interface Kartusche-Befülleinheit
    2
    Reaktionskartusche
    2.1
    mechanisches Interface Kartusche-Befülleinheit
    2.2
    Dichtung
    2.3
    Reaktionsraum
    2.4
    Bevorzugte Öffnung für die Kanülen im Kartuschengehäuse-Gehäuse
    3
    Befüllungskanal
    3.1
    Fluidisches und mechanisches Interface zu probenzuführenden Werkzeugen
    3.2
    Befüllungskanüle
    4
    Abfallkanal mit Abfallbehälter
    4.1
    Fluidisches und mechanisches Interface zu probenabführenden Einheiten
    4.2
    Abfallkanüle
    5
    Einrichtung für Vorzugsstellung, hier Feder
  • 25:
  • Darstellung des Ablaufs zur Befüllung einer Reaktionskartusche mit einer integrierten Befülleinheit.
  • 26:
  • Schematische Darstellung einer integrierten Befülleinheit mit integriertem Abfallbehälter zur Befüllung von Reaktionskartuschen mit reaktiven Substanzen oder Puffern in der Vorzugsstellung ohne Penetration der Dichtung des Kammerkörpers. Hierfür werden zusätzlich zu den Bezugszeichen aus 24 folgende Bezugszeichen verwendet:
    • 4
    Abfallkanal mit Abfallbehälter
    4.1
    Entlüftungsloch
  • 27:
    • a) Befüllung des Reaktionsraumes bei Abführung der überschüssigen Flüssigkeit in einen Abfallbehälter oder -kanal
    • b) Abführung überschüssiger Flüssigkeit bei der Verringerung des Reaktionsraumes zur Detektion
  • Hierbei werden folgende Bezugszeichen verwendet:
    • 1
    Reaktionskammer
    2
    Dichtung
    3
    Drückmechanismus
    4
    Fluidinterface
    4.1
    abführende Kanüle
    4.2
    zuführende Kanüle
  • 28:
  • Gerät zur Prozessierung und Detektion von erfindungsgemäßen Reaktionskartuschen gemäß dem Ausführungsbeispiel 4. Hierbei werden folgende Bezugszeichen verwendet:
    • 1
    Reaktionkartusche
    1.1
    Reaktionskammer mit Micro-Array
    1.2
    Fluidsystem-Interface
    1.3
    Dichtung des Kammerkörpers
    1.4
    Elektrische Anschlüsse für Heizsystem, evtl. auch Temperatursensoren
    1.5
    Substrat, auf dem Sonden immobilisiert sein können bzw. das den Bereich darstellt, in dem die Detektion der Targets erfolgen soll,
    1.6
    Lagesicherungssystem zur Realisierung einer Vorzugslage und Führung der Kanülen
    1.7
    Kanülen
    2
    Drückmechanismus
    3
    Identifikationssystem, z.B. Barcode oder Datamatrix
    3.1
    Identifikationsoptik, z.B. Barcode- oder Datamatrix-Reader
    4
    Detektionsoptik
    5
    Fluidanschlüsse
  • 29:
  • Reaktionskartusche gemäß Ausführungsbeispiel 5.
  • 30:
  • Aufnahme der Reaktionskartusche gemäß Ausführungsbeispiel 5 mit einer Wärmebildkamera bei einer Temperatur von 95°C.
  • 31:
  • Analyse des Reaktionsprodukts gemäß Ausführungsbeispiel 5 durch Agarosegel-Elektrophorese. Dabei bedeuten:
    • 1, 5:
    Positivkontrolle aus dem Thermocycler
    2-4:
    Reaktionsprodukten aus Kartuschen
    6:
    100bp Standard
  • 32:
  • Skizze, die beispielhaft die Anordnung der Verdrängungstruktur darstellt. (A) Fall, in dem Verdrängungsstruktur auf der zweiten Fläche positioniert ist, und Sonden auf der ersten Fläche immobilisiert sind, ohne dass es sich um einen Mikroarray handelt. (B) Fall, in dem keine Sonden auf der ersten Fläche positioniert sind und die Verdrängungsstruktur auf der zweiten Fläche positioniert ist.
    • 1:
    zweite Fläche
    2:
    erste Fläche
    3:
    Verdrängerstruktur
    4:
    Lösung
    5:
    immobilisierte Sonde
  • 33:
  • Auswertung der Ergebnisse von Beispiel 6, in dem die Hybridisierungsergebnisse an einem Sondenarray bei Detektion mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in einer Reaktionskammer mit Verdrängerstruktur beschrieben wird.
  • 34:
  • Darstellung von Vorrichtungen mit einer Reaktionskammer mit einer ersten und zweiten Fläche, deren Abstand veränderlich ist. (A) zeigt die an eine Fläche des Reaktionsgefäß immobilisierten Sonden und die Target-haltige Analytlösung. (B) zeigt eine Situation, in der die zweite Fläche durch einen zweiten Gegenstand wie einen Stößel zur Verfügung gestellt wird. (C) zeigt ein Reaktionsgefäß mit elastischen sich gegenüberliegenden Flächen, die die erste und zweite Fläche der Reaktionskammer darstellen.
  • 35:
  • Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem die Sonden nicht an eine erste Fläche der Reaktionskammer immobilisiert sind. Ein solches Verfahren kann z.B. für zytometrische Anwendungen eingesetzt werden.
  • 36:
  • Theoretische Darstellung des Einflusses der Kammer bzw. Zelldicke auf die Stärke des Hintergrundrauschens bzw. Signal/Hintergrund-Verhältnisses.
  • 37:
  • Zytometrische Bestimmung von CD4+ positiven Lymphozyten, wie sie in Beispiel 8 beschrieben wird. (a) zeigt nicht markierte Erythrozyten, (b) zeigt CD4+ positive Lymphozyten.

Claims (60)

  1. Vorrichtung zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen, enthaltend: eine Reaktionskammer, die zwischen einer ersten Fläche der Vorrichtung und einer zweiten Fläche der Vorrichtung, die der ersten Fläche gegenüber liegt, gebildet ist, wobei der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche veränderbar ist und Sondenmoleküle in der Reaktionskammer auf mindestens einer, vorzugsweise der ersten Fläche immobilisiert sind.
  2. Vorrichtung zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen Sonden- und Targetmolekülen, enthaltend: eine Reaktionskammer, die zwischen einer ersten Fläche der Vorrichtung und einer zweiten Fläche der Vorrichtung, die der ersten Fläche gegenüber liegt, gebildet ist, wobei der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche veränderbar ist und mindestens eine der beiden Flächen über eine Verdrängerstruktur verfügt, die in dem Bereich der Fläche positioniert ist, in dem die Detektion der Targets erfolgen soll.
  3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Verdrängerstruktur auf der Oberfläche der zweiten Fläche angeordnet ist, die der Reaktionskammer zugewandt ist.
  4. Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei die Verdrängerstruktur so auf der Oberfläche der zweiten Fläche angeordnet ist, dass sie auf der ersten Fläche immobilisierten Sonden im komprimierten Zustand der Reaktionskammer zumindest teilweise gegenüberliegt.
  5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Verdrängerstruktur aus einem elastischen Material gebildet ist, dass vorzugsweise optisch transparent und nicht autofluoreszierend ist und besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe der 2-komponentigen Platinvernetzenden Silikonkautschuke
  6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Verdrängerstruktur aus einem flüssigen, vorzugsweise optisch transparenten und nicht autofluoreszierendem Material wie Silikonöl oder nicht vernetztem Silikonelastomer ausgewählt ist.
  7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Verdrängerstruktur ein konvex gewölbte Form aufweist und als Erhebung der zweiten Fläche ausgestaltet ist.
  8. Vorrichtung nach einem der vorgehenden Ansprüche, wobei der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche mindestens in dem Bereich, in dem Sonden immobilisiert sein können bzw. in dem die Detektion der Targets erfolgen soll, in einem Bereich von etwa 0 bis etwa 1 mm veränderbar ist
  9. Vorrichtung nach einem der vrogehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung zusätzlich eine Temperatursteuerungs- und/oder -regeleinheit zur Steuerung und/oder Regelung der Temperatur in der Reaktionskammer umfasst.
  10. Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei die Temperatursteuerungs- und -regeleinheit in die erste Fläche integriert ist.
  11. Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei die Vorrichtung Temperatursteuerungs- und regeleinheit Temperaturblöcke umfasst, die jeweils auf eine definierte Temperatur vorgeheizt sind.
  12. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die Temperaturblöcke linear oder auf einem Drehteller angeordnet sind.
  13. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung ein Detektionssystem umfasst.
  14. Vorrichtung nach Anspruch 13, wobei das Detektionssystem ein optisches System, vorzugsweise ein fluoreszenzoptisches System ist.
  15. Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei das fluoreszenzoptische System ein Fluoreszenzmikroskop ohne Autofokus ist.
  16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei das Detektionssystem mit einem Abstandshalter verbunden ist, der bei Auflage auf der zweiten Fläche einen Abstand zwischen dem Detektionssystem und der zweiten Fläche einstellt.
  17. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei für den zwischen der ersten und zweiten Fläche gebildeten Reaktionsraum seitlich begrenzende Ausgleichsbereiche vorgesehen sind, die bei Verringerung des Abstands zwischen erster und zweiter Fläche das Volumen in der Reaktionskammer im Wesentlichen konstant halten.
  18. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste und/oder zweite Fläche aus einem optisch durchlässigen Material, vorzugsweise Glas ausgestaltet ist.
  19. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der zwischen der ersten und zweiten Fläche gebildete Reaktionsraum seitlich durch elastische Dichtungen begrenzt ist.
  20. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Fläche zumindest in dem Bereich, in dem Sonden immobilisiert sein können bzw. in dem die Detekktion der Targets erfolgen soll, derart ausgestaltet ist, dass dieser Bereich der ersten Fläche relativ zur zweiten Fläche so führbar ist, dass der Abstand zwischen diesem Bereich der ersten Fläche und der zweiten Fläche veränderbar ist.
  21. Vorrichtung nach Anspruch 20, wobei die erste Fläche zumindest in dem genannten Bereich elastisch verformbar ist.
  22. Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei die erste Fläche aus einem elastischen Kunststoff ausgestaltet ist.
  23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei die erste Fläche mittels zweier übereinander liegender Schichten ausgestaltet ist, wobei eine äußere Schicht der beiden übereinander liegenden Schichten zumindest in dem Bereich der ersten Fläche, in dem Sonden immobilisiert sein können bzw. in dem die Detekktion der Targets erfolgen soll, eine Aussparung aufweist.
  24. Vorrichtung nach Anspruch 23, wobei eine innere der beiden übereinander liegenden Schichten aus einer elastischen Dichtung gebildet ist.
  25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 24, wobei die Vorrichtung mindestens ein Mittel umfasst, mit dem die erste Fläche zumindest in dem Bereich der ersten Fläche, in dem Sonden immobilisiert sein können bzw. in dem die Detekktion der Targets erfolgen soll, relativ zur zweiten Fläche führbar ist.
  26. Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei der Bereich bzw. die erste Fläche durch Druck und/oder Zug des Mittels auf die erste Fläche relativ zur zweiten Fläche führbar ist.
  27. Vorrichtung nach Anspruch 25 oder 26, wobei der Bereich bzw. die erste Fläche durch das Mittel in Vibration versetzbar ist.
  28. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweite Fläche relativ zur ersten Fläche so führbar ist, dass der Abstand zwischen der ersten Fläche und der zweiten Fläche veränderbar ist.
  29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 28, wobei die zweite Fläche durch Druck und/oder Zug des Abstandshalters auf die zweite Fläche relativ zur ersten Fläche so führbar ist, dass der Abstand zwischen der ersten Fläche zumindest in dem Bereich der ersten Fläche, in dem Sonden immobilisiert sein können bzw. in dem die Detekktion der Targets erfolgen soll, und der zweiten Fläche veränderbar ist.
  30. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Fläche und die zweite Fläche so führbar sind, dass der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche veränderbar ist.
  31. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Reaktionskammer ein Kapillarspalt zwischen der ersten und der zweiten Fläche ist.
  32. Vorrichtung nach Anspruch 31, wobei der Kapillarspalt eine Dicke im Bereich von etwa 0 µm bis etwa 100 µm aufweist.
  33. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reaktionskammer mindestens zwei Unterkammern umfasst, wobei in einem ersten nicht komprimierten Zustand die Unterkammern fluidisch miteinander verbunden sind und in einem zweiten komprimierten Zustand keine fluidische Verbindung zwischen den Unterkammern besteht.
  34. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung zusätzlich eine Befülleinheit und/oder Aufarbeitungseinheit zur Reinigung und/oder Aufkonzentration einer Probenlösung und/oder Steuerung des Be- und/oder Entladens der Reaktionskammer mit Fluiden umfasst.
  35. Vorrichtung nach Anspruch 34, wobei die Reaktionskammer und die Befüll- bzw. Aufarbeitungseinheit über zwei Kanülen miteinander verbunden sind, wobei die Kanülen so angeordnet sind, dass eine erste Kanüle die Zuführung von Fluiden aus der Befüll- bzw. Aufarbeitungseinheit in die Reaktionskammer gewährleistet und eine zweite Kanüle das Entweichen der durch die zugeführten Fluide aus der Reaktionskammer verdrängten Luft gewährleistet.
  36. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung eine mit dem Detektionssystem verbundene Einheit zur Verarbeitung von durch das Detektionssystem aufgenommenen Signalen umfasst.
  37. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung zusätzlich eine Schnittstelle für externe Rechner aufweist.
  38. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung mit einer Codierung, vorzugsweise einer Datenmatrix oder einem Barcode, versehen ist, die Informationen über die Sonden und/oder die Durchführung der Vervielfältigungs- und/oder Nachweisreaktion enthält.
  39. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sonden- und/oder Targets Biopolymere sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, Peptiden, Proteinen, Antigenen, Antikörpern, Kohlenhydraten und/oder deren Analoga und/oder Mischpolymeren der vorstehend genannten Biopolymere.
  40. Vorrichtung nach Anspruch 39, wobei die Sonden- und/oder Targetmoleküle Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäureanaloga sind.
  41. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 38, wobei die Targets niedermolekulare chemische Verbindungen oder Partikel wie z.B. Zellen sind.
  42. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung einen Kammerkörper aus elektrisch leitfähigem Material aufweist.
  43. Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei das elektrisch leitfähige Material elektrisch leitfähiger Kunststoff ist.
  44. Vorrichtung nach Anspruch 43, wobei der elektrisch leitfähige Kunststoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyamid mit 5-30% Kohlefasern, Polycarbonat mit 5-30% Kohlefasern, Polyamid mit 2-20% rostfreien Stahlfasern und PPS mit 5-40% Kohlenstofffaser.
  45. Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von Targets, umfassend die folgenden Schritte: a) Einbringen einer Probe enthaltend Targets in eine Reaktionskammer, die zwischen einer ersten Fläche der Vorrichtung und einer zweiten Fläche einer Vorrichtung, die bevorzugt der ersten Fläche gegenüber liegt, gebildet ist, wobei der Abstand zwischen der ersten und der zweiten Fläche veränderbar ist; b) Detektieren der Targets.
  46. Verfahren nach Anspruch 45, wobei der Abstand zwischen erster und zweiter Fläche vor dem Detektieren in einer Position gehalten wird, die die Wechselwirkung zwischen den Targetmolekülen und evtl. vorhandenen und evtl. immobilisierten Sonden ermöglicht.
  47. Verfahren nach Anspruch 45 oder 46, wobei in Schritt b) der Abstand zwischen erster Fläche bzw. dem Bereich der ersten Fläche, in dem Sonden immobilisiert sein können bzw. die Detektion der Targets erfolgen soll, und der zweiten Fläche verändert, vorzugsweise verringert wird.
  48. Verfahren nach Anspruch 47, wobei in Schritt b) der Abstand zwischen erster Fläche bzw. dem Bereich der ersten Fläche, n dem Sonden immobilisiert sein können bzw. die Detektion der Targets erfolgen soll, und der zweiten Fläche so verändert wird, dass die Probenlösung zwischen der ersten Fläche bzw. dem Bereich der ersten Fläche, in dem Sonden immobilisiert sein können bzw. die Detektion der Targets erfolgen soll, und der zweiten Fläche im Wesentlichen entfernt ist.
  49. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 48, wobei eine Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 44 verwendet wird.
  50. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 49, wobei das Verfahren der Konzentrationsbestimmung der Targets dient, ohne dass Sonden eingesetzt werden.
  51. Verfahren einem der Ansprüche 45 bis 49 wobei eine Wechselwirkung zwischen Targets und Sonden zum Nachweis der Targets verwendet wird.
  52. Verfahren nach Anspruch 51, wobei die Sonden auf der ersten Fläche immobilisiert sind.
  53. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 52, wobei die Targetmoleküle mit einem detektierbaren Marker versehen werden.
  54. Verfahren nach Anspruch 53, wobei der detektierbare Marker ein Fluoreszenzmarker ist.
  55. Verfahren nach Anspruch 53, wobei das Detektieren der Fluoreszenzmarker mittels eines Fluoreszenzmikroskops ohne Autofokus erfolgt.
  56. Verfahren nach Anspruch 53, wobei das Detektieren der Fluoreszenzmarker mittels eines Fluoreszenzmikroskops mit Fixfokus erfolgt.
  57. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 56, wobei die Sonden- und/oder Targetmoleküle Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäureanaloga sind.
  58. Verfahren nach Anspruch 57, wobei die Targetmoleküle in der Reaktionskammer mittels einer zyklischen Amplifikationsreaktion amplifiziert werden.
  59. Verfahren nach Anspruch 58, wobei das Detektieren nach einem oder mehreren Zyklen während der zyklischen Amplifikationsreaktion und/oder nach Abschluss der zyklischen Amplifikationsreaktion erfolgt.
  60. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 59, wobei zwischen dem Einbringen der Probe enthaltend Targetmoleküle in die Reaktionskammer und dem Detektieren kein Austauschen von Lösungen in der Reaktionskammer und/oder Entfernen von Lösungen aus der Reaktionskammer erfolgt.
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