CN102741408A - 用于核酸扩增反应的微芯片及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供能够通过简单方法进行高精度分析的用于核酸扩增反应的微芯片。具体地，本发明提供了一种用于核酸扩增反应的微芯片A，包括：入口（1），液体通过该入口从外部进入；多个井（41、42、43），用作核酸扩增反应的反应场所；以及流道（2、3），从入口进入的液体通过该流道被供给到各个井（41、42、43），其中，反应所需的多个试剂以规定顺序被层压在各个井（41、42、43）中，从而被固定到各个井（41、42、43）上。

Description

用于核酸扩增反应的微芯片及其制造方法

技术领域

本发明涉及用于核酸扩增反应的微芯片及其制造方法，更具体地，涉及用于其中反应所需的多个试剂以规定顺序被层压并且被固定在被配置为用作核酸扩增反应的反应场所的井中的核酸扩增反应的微芯片等。

背景技术

近年来，通过在半导体工业中应用微细加工技术，已发展了在由硅或玻璃制成的基底上形成的用于执行化学和生物分析的具有井和流道的微芯片（例如，参见专利文献1）。在实际医药领域中，这些微芯片已开始被用于（例如）液相色谱的电化学探测器或小型电化学传感器。

使用微芯片的这种分析系统被称为μ-TAS（微全分析系统，micro-Total-Analysis System）、实验室芯片、生物芯片等，并且作为能使化学和生物分析加速、提高效率并且整合，或者减小分析装备的尺寸的技术而引起了关注。

由于μ-TAS能分析少量的样本并且微芯片会是抛弃性的（一次使用），所以期望将其应用于具体处理痕量的珍贵样本或许多测试体的生物分析。

μ-TAS的应用的实例是光电检测器，其将物质引入进微芯片中所设置的多个区域中并且对该物质或其反应产物进行光学检测。光电检测器的实例是在微芯片的井中进行核酸扩增反应并且对被扩增的核酸链进行光学检测或量化的核酸扩增装置（例如，实时PCR装置）。

通常，微芯片型核酸扩增装置采用通过预先混合核酸扩增反应和模板DNA（目标核酸链）所需的所有试剂并且将混合液引入进微芯片中所设置的多个井中以进行反应的方法。因此，困难的是将所需的所有试剂和目标核酸链预先混合。另外，在混合液被引入井中之前需花费一定的时间段，因此存在的问题是在该时间段期间在混合液中进行了反应。一旦在混合液向井中的进入完成之前进行反应，则不能严格地控制反应时间，这会是降低被扩增的核酸链的确定精度的因素。

通常，PCR方法采用被称为热启动的方法以严格控制反应时间。热启动方法是避免低聚核苷酸引物的误退火造成的非特定扩增反应并且提供想要的被扩增的产物的方法。在PCR方法中，热启动方法通过将包括除了酶以外的试剂（通常，来自于耐热菌的DNA聚合酶）和目标核酸链的混合液加热至低聚核苷酸引物的变性温度、仅在达到变性温度之后添加酶、然后执行通常温度循环来实现。

关于本发明，专利文献2公开了在流道中包括核酸扩增反应所需的低聚核苷酸引物、基质、酶以及固态的其他试剂的微流芯片。在微流芯片中，处于液态的反应所需的其余反应物被送至流道，液态的试剂与固态的试剂接触，并且处于固态的试剂被溶解以开始反应。在专利文献2中，并未描述低聚核苷酸引物、基质、酶以及其他试剂被层压并被固定在流道中。

专利文献1：日本专利申请公开第2004-219199号

专利文献2：日本专利申请公开第2007-43998号

发明内容

如上所述，在传统微芯片型核酸扩增装置中，由于试剂等被预先混合并且被引入进井中，所以困难的是其存在下面的问题。反应时间无法严格控制，因此分析的精度降低。

因此，本发明的主要目的是提供允许通过简单方法进行高精度分析的用于核酸扩增反应的微芯片。

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于核酸扩增反应的微芯片，包括：入口，液体通过该入口从外部进入；多个井，被配置为用作核酸扩增反应的反应场所；以及流道，从入口进入的液体通过该流道被供给到各个井，其中，反应所需的多个试剂以规定顺序被层压并被固定在各个井中。

在用于核酸扩增反应的微芯片中，低聚核苷酸引物的固定层可被层压在酶的固定层上面，或者，以相反的方式，酶的固定层可被层压在低聚核苷酸引物的固定层的上面。在所述酶的固定层与所述低聚核苷酸引物的固定层之间可层压反应缓冲液溶质的固定层。

而且，本发明提供了一种制造用于核酸扩增反应的微芯片的方法，包括：第一步骤，在基底层上形成的、被配置为用作核酸扩增反应的反应场所的多个井中的每一个中以规定顺序层压并固定反应所需的多个试剂。

制造用于核酸扩增反应的微芯片的方法还包括：第二步骤，活化并粘合被层压并固定有试剂的基底层的表面，其中，第一步骤包括在各个井中滴入并干燥酶溶液、之后滴入并干燥低聚核苷酸引物溶液的处理。

在制造用于核酸扩增反应的微芯片的方法中，第一步骤优选包括在各个井中滴入并干燥酶溶液之后并且在滴入低聚核苷酸引物溶液之前，滴入并干燥反应缓冲液溶质溶液的处理。

另外，在用于核酸扩增反应的微芯片的方法中，第二步骤可包括通过氧等离子处理或真空紫外光处理来活化基底层的表面的处理。

在本发明中，“核酸扩增反应”包括执行温度循环的传统PCR（聚合酶链反应）方法以及不涉及温度循环的各种等温扩增方法。等温扩增方法的实例包括LAMP（环介导等温扩增）方法、SMAP（智能扩增处理）方法、NASBA（基于核酸序列的扩增）方法、ICAN（等温和嵌合引物引发核酸扩增）方法（商标）、TRC（反转录-转录协同）方法、SDA（链置换扩增）方法、TMA（转录介导扩增）方法、RCA（滚环扩增）方法等。另外，“核酸扩增反应”广义地包括在变温下或在恒温下用于扩增核酸的核酸扩增反应。而且“核酸扩增反应”包括涉及被扩增的核酸链的量化的反应，诸如实时PCR（RT-PCR）方法和RT-RAMP方法。

另外，“试剂”包括在上述核酸扩增反应中用于获得被扩增的核酸链所需的试剂，并且具体包括具有与目标核酸链互补的碱基序列的低聚核苷酸引物、核酸单体（dNTP）、酶、反应缓冲溶液（缓冲液）溶质等。

本发明提供了一种允许通过简单方法进行高精度分析的用于核酸扩增反应的微芯片。

附图说明

图1是用于根据本发明的核酸扩增反应的微芯片的示意性俯视图。

图2是微芯片的示意性截面图（图1，p-p截面）。

图3是示出了在微芯片的各个井中层压的试剂的固定层的示意图。

图4是示出了在微芯片的井中层压的试剂的固定层的可选实例的示意图。

图5是示出了制造用于根据本发明的核酸扩增反应的微芯片的方法的流程图。

图6是示出了在井中层压试剂的固定层的方法的示意图。

具体实施方式

在下文中，将参照附图描述用于实施本发明的优选实施方式。下面描述的实施方式仅示出了本发明的通常实施方式的实例，而本发明的范围并不通过这些实施方式狭隘地解释。将按照下列顺序描述实施方式。

1.用于核酸扩增反应的微芯片

2.制造用于核酸扩增反应的微芯片的方法

（2-1）形成基底层a1

（2-2）将酶和引物固定至井中

（2-3）表面活化并粘合基底层a1和a2

1.用于核酸扩增反应的微芯片

图1中示出了用于根据本发明的核酸扩增反应的微芯片（在下文中简称为“微芯片”）的示意性俯视图，并且在图2中示出了其示意性截面图。图2对应于图1中的p-p截面。

被标示符号A的微芯片包括：入口1，样本溶液通过该入口从外部进入；多个井，被配置为用作核酸扩增反应的反应场所；主流道2，其一端与入口1连通；以及支流道3，其从主流道2分支。主流道2的另一端被配置为将样本溶液排出至外部的出口5。支流道3在至主流道2的入口的连通部与至出口5的连通部之间的位置处从主流道2分支，并且被连接至各个井。样本溶液可包含用作核酸扩增反应中的模板（目标核酸链）的DNA、基因组RNA、mRNA等。

这里，给出了在微芯片A中以三行和三列等间隔地设置总共九个井的情况作为实例。这九个井划分为三个部分。在图1中，上部的三个井通过符号41标示，中部的三个井通过符号42标示，而下部的三个井通过符号43来标示。从入口1进入的样本溶液通过主流道2朝着出口5输送，并且从设置在沿溶液输送方向上游的支流道3和井而依次供给至内部。可选地，在微芯片A中，出口5可以不是必需的部件，微芯片A可被配置为使得从入口1进入的样本溶液不被排出至外部。

通过将基底层a2粘合至基底层a1来构造微芯片A，基底层a1上形成有入口1、主流道2、支流道3、井41、42和43以及出口5。基底层a1或a2的材料可以是玻璃和各种塑料（聚丙烯、聚碳酸酯、环烯烃聚合物、聚二甲硅氧烷）。当在井41、42和43中扩增的核酸链被光学检测或量化时，优选地从具有透光性、较少自发荧光以及因为波长分散较小而光学误差较少的材料选择基底层a1或a2的材料。

核酸扩增反应所需的多个试剂以规定顺序被层压并且固定在井41、42和43中。图3示出了在各个井中层压的试剂的固定层的实例。图3的（A）、（B）和（C）示出了分别在井41、井42和井43中层压的试剂的固定层。

被固定至井中的试剂是在核酸扩增反应中用于获得被扩增的核酸链所需试剂，并且具体包括具有与目标核酸链互补的碱基序列的低聚核苷酸引物、核酸单体（dNTP）、酶、反应缓冲溶液（缓冲液）溶质等。固定的试剂可以是这些中的一种或多种。

层压这些试剂的顺序可以以任意顺序，诸如“低聚核苷酸引物、dNTP、酶、缓冲液溶质”的顺序或“缓冲液溶质、酶、dNTP、低聚核苷酸引物”的顺序。

另外，这些试剂的一部分，例如，引物和缓冲液溶质，或引物和dNTP可被混合并固定。

用于检测和量化被扩增的核酸链的试剂，诸如荧光试剂（荧光颜料）、磷光试剂（磷光颜料），可根据所需被固定在井中，尽管其不是用于获得被扩增的核酸链所必需的。

这里，示出了首先在井41、42和43中形成酶E的固定层，然后在其上层压低聚核苷酸引物（下文中简称为“引物”）P1、P2和P3的固定层的情况。如后面描述的，反应缓冲液溶质的固定层可层压在酶的固定层与引物的固定层之间（细节在下面进行详细描述）。

引物P1、P2和P3可以是具有相同碱基序列的引物，但当多个目标核酸链在微芯片A中被扩增时可以是具有不同碱基序列的引物。例如，当利用微芯片A确定基因型时，具有与各个基因型的碱基序列相对应的不同碱基序列的引物分别被固定至井41、42和43。当利用微芯片A来确定接触传染原时，类似地固定具有与各病毒和微生物的碱基序列相对应的不同碱基序列的引物。在这点上，被固定至各个井的酶E需是相同的。

因此，在微芯片A中，反应所需的反应物被预先固定至井中，使得反应仅通过将其余的反应物和包含目标核酸链的样本溶液从入口1供给至各个井中来开始。这使得会减小预先混合的反应物的数量并且避免了混合的麻烦，这实现了简单分析。

此外，反应所需的所有反应物被预先固定在井中，使得反应仅通过将只包含目标核酸链的样本溶液来开始，这实现了更简单的分析。

另外，在微芯片A中，反应仅在其余反应物和包含目标核酸链的样本溶液被供给至各个井中并且被固定至井中的反应物被溶解之后开始，使得可严格控制反应时间并且可提供高精度分析。

此外，过量地被添加至反应系统并且对于温度等的变化相对稳定的引物的固定层被层压在对于温度的变化、湿度的变化以及光不稳定并且相比于引物、dNTP和缓冲液溶质易于降低活性或被去活化的酶的固定层上，使得引物的固定层可保护酶的固定层。因此，可防止在制造和存储微芯片A时由温度等的变化引起的酶的活性降低或去活化。

尽管通过给出了在微芯片中以三行和三列等间隔设置总共九个井的情况作为实例来说明了上面的描述，但可以使用任意数量和位置的井，并且井的形状不限于图中所示的圆柱形。另外，将从入口1进入的样本溶液供给至各个井的流道的构造不限于图中所示的主流道2和支流道3的方式。此外，尽管描述了在基底层a1上形成入口1等，但可在基底层a1和基底层a2二者的每一个上形成入口1等。组成微芯片的基底层可以是一个或多个。

另外，尽管通过将引物的固定层层压在酶的固定层上的情况来说明了上面的描述，但试剂可以任意顺序层压，例如，酶的固定层可被层压在引物的固定层上（参见图4）。在这种情况下，反应缓冲液溶质的固定层可被层压在酶的固定层与引物的固定层之间（细节在下面进行描述）。

当引物的固定层被层压在顶上时，在引物的固定层被从入口1供给至各个井的样本溶液溶解之后并且在溶解酶以开始反应之前，在先溶解的引物可以在井之间相互扩散（交叉污染）。相反，当酶的固定层被层压在顶上时，因为反应在酶的固定层溶解之后、引物的固定层的溶解一开始就开始，所以可防止引物的交叉污染。

2.制造用于核酸扩增反应的微芯片的方法

接下来，将参照图5中的流程图来描述制造根据本发明的微芯片的方法。作为实例，将在下面以上述微芯片A为例来描述。

（2-1）形成基底层a1

在图5中，符号S1是形成基底层a1的步骤。在此步骤中，在基底层a1上形成入口1、主流道2、支流道3、井41、42和43以及出口5。可通过（例如）玻璃基底层的湿蚀刻或干蚀刻或通过塑料基底层的纳米压印、注塑成型或切削加工来执行基底层a1上入口a1和其他部件的形成。（2-2）将酶和引物固定至井中

符号S2是将酶固定至井的步骤。符号S3是将引物固定至井的步骤。步骤S2和S3对应于将反应所需的多个反应物以规定顺序层压并固定在井中的步骤（第一步骤）。

固定在井中的试剂是用以在核酸扩增反应中提供扩增的核酸链所需的试剂，并且具体包括具有与目标核酸链互补的碱基序列的低聚核苷酸引物、核酸单体（dNTP）、酶、反应缓冲溶液（缓冲液）溶质等。固定的试剂可以是这些中的一种或多种。

层压这些试剂的顺序可以是任意顺序，诸如“引物、dNTP、酶、缓冲液溶质”的顺序或“缓冲液溶质、酶、dNTP、引物”的顺序。

另外，这些反应物的一部分，例如，引物和缓冲液溶质，或引物和dNTP可被混合并固定。

这里，在步骤S2中在井41、42和43中滴入并干燥酶E的溶液，在步骤S3中分别滴入并干燥引物P1、P2和P3的溶液，从而各引物的固定层被层压在酶的固定层之上。引物P1、P2和P3可以是具有相同碱基序列的引物，但当多个目标核酸链在微芯片A中被扩增时可以是具有不同碱基序列的引物。关于这一点，被固定至各个井的酶E需要是相同的。

例如通过空气干燥、真空干燥或冷冻干燥被滴入的溶液，并且优选地通过逐渐干燥来执行试剂的固定。就酶而言，为了防止活性降低或去活化，临界点干燥也是有效的。

此时，在步骤S2中固定的酶可被在步骤S3所滴入的引物溶液所溶解。当酶和引物由于再溶解而被混合时，由于可能发生引物二聚体的扩增所以是不利的。

为了防止酶和引物的混合，在第三步骤中，优选的是预先将微芯片保持在低温（约-10°C），使得被滴入的引物溶液可被冷冻并且被冷冻干燥。

可选地，可使用下面的方法。该方法是，将微芯片预先保持在低温下，滴入水并冷冻它，然后滴入引物溶液并对其进行冷冻干燥，然后空气干燥以蒸发冰的中间层。

另外，更优选的是使用下面的方法。该方法是，将微芯片预先保持在低温下，滴入缓冲液溶质溶液并对其进行冷冻干燥，在酶E的固定层上层压缓冲液溶质B的固定层，之后，滴入引物溶液，然后空气干燥、真空干燥或冷冻干燥。因此，在各个井中形成其中缓冲液溶质的固定层被层压在酶的固定层与引物的固定层之间的三层结构（参见图6）。

而且，当酶的固定层被层压在引物的固定层之上时，可采用这些方法以防止引物的混合。

（2-3）表面活化并粘合基底层a1和a2

符号S4是活化基底层a1和a2的表面的步骤。符号S5是粘合基底层a1和a2的步骤。步骤S4和S5对应于活化并粘合被层压并固定有试剂的基底层的表面的步骤（第二步骤）。

基底层a1和基底层a2可通过例如利用粘合剂或粘合片的粘附、热封、阳极结合或超声波结合来粘合。

而且，可使用通过氧等离子处理或真空紫外光处理活化并粘合基底层的表面的方法。诸如聚二甲硅氧烷的塑料和玻璃具有高亲和性。当它们的表面被活化并被接触时，悬空键被反应以形成强共价键，即，Si-O-Si硅烷醇键，从而提供具有足够强度的粘合。氧等离子处理或真空紫外光处理通过根据基底层的材料设定适当的条件来执行。

因此，通过分别地将酶和引物固定并层压在形成有井的基底层的井中，反应物可在滴入并干燥溶液的过程中、在不激发引物二聚体扩增反应的情况下被固定，这与混合酶和引物并且固定它们的情况不一样。

此外，过量地被添加至反应系统并且对于温度等的变化相对稳定的引物的固定层被层压在对于温度的变化、湿度的变化以及光不稳定并且易于降低活性或被去活化的酶的固定层上，使得可保护酶的固定层在步骤S4中免于受热、等离子或紫外光照射。换言之，当被固定有反应物的基底层的表面通过氧等离子处理或真空紫外光处理被活化时，引物的固定层也保护了下面的酶，由此，可防止通过等离子或紫外光照射所造成的酶的活性降低或去活化。

尽管上面的描述通过将引物的固定层层压在酶的固定层上的情况来说明，但反应物可以任何顺序被层压，例如，酶的固定层可被层压在引物的固定层上面（参见图4）。在这种情况下，反应缓冲液溶质的固定层被层压在酶的固定层与引物的固定层之间也是有效的。

工业应用

根据本发明的用于核酸扩增反应的微芯片允许通过简单方法进行高精度分析。因此，根据本发明的用于核酸扩增反应的微芯片可用于用于基因型确定、接触传染原确定等的微芯片型核酸扩增装置。

符号的描述

A  用于核酸扩增反应的微芯片

E  酶

P1、P2、P3  引物

1  入口

2  主流道

3  支流道

41、42、43  井

5  出口

Claims (8)

1.一种用于核酸扩增反应的微芯片，包括：

入口，液体通过所述入口从外部进入；

多个井，被配置为用作所述核酸扩增反应的反应场所；以及

流道，通过所述入口进入的液体通过所述流道被供给到各个所述井，

其中，反应所需的多个试剂以规定顺序被层压并固定在各个所述井中。

2.根据权利要求1所述的用于核酸扩增反应的微芯片，

其中，低聚核苷酸引物的固定层被层压在酶的固定层的上面。

3.根据权利要求1所述的用于核酸扩增反应的微芯片，

其中，酶的固定层被层压在低聚核苷酸引物的固定层的上面。

4.根据权利要求2或3所述的用于核酸扩增反应的微芯片，

其中，反应缓冲液溶质的固定层被层压在所述酶的固定层与所述低聚核苷酸引物的固定层之间。

5.一种制造用于核酸扩增反应的微芯片的方法，包括：

第一步骤，在基底层上形成的、被配置为用作所述核酸扩增反应的反应场所的多个井中的每一个中以规定顺序层压并固定反应所需的多个试剂。

6.根据权利要求5所述的制造用于核酸扩增反应的微芯片的方法，还包括：

第二步骤，活化并粘合被层压并固定有所述试剂的所述基底层的表面，其中，

所述第一步骤包括在各个所述井中滴入并干燥酶溶液、之后滴入并干燥低聚核苷酸引物溶液的处理。

7.根据权利要求6所述的制造用于核酸扩增反应的微芯片的方法，

其中，所述第一步骤包括在各个所述井中滴入并干燥所述酶溶液之后并且在滴入所述低聚核苷酸引物溶液之前，滴入并干燥反应缓冲液溶质溶液的处理。

8.根据权利要求7所述的制造用于核酸扩增反应的微芯片的方法，

其中，所述第二步骤包括通过氧等离子处理或真空紫外光处理来活化所述基底层的表面的处理。

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