TWI814324B - 整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統及其方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一種整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統，包括至少具有輸送單元、加熱單元和控制單元之本體、以及電源，其中，該控制單元電性連結該輸送單元及該加熱單元，該電源電性連結該本體。本發明還提供一種操作如本發明所述的整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統的方法。

Description

整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統及其方法
本發明是關於一種進行核酸恆溫環狀擴增的系統，尤係關於一種整合式核酸恆溫環狀擴增試條暨行動裝置的系統。
目前對於傳染性病原之快速診斷多半會使用酵素免疫分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)或側流式免疫測定法(Lateral flow immunoassay，LFA)來進行，其中，LFA成本低、易於使用和結果判讀快速因而被廣泛使用。然而，相較於ELISA，LFA之靈敏度與特異性明顯較差，使得LFA在傳染性病原快速診斷的準確性受到質疑。ELISA是利用帶有螢光的抗體以直接或間接的方式，與細菌或病毒表面的蛋白進行結合，達到檢測的目的。雖然ELISA相較於LFA具有較高的靈敏度，但其靈敏度仍不及聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)，無法檢測到極微量的細菌或是病毒的存在。
PCR與恆溫環狀擴增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)技術的靈敏度都相當高，但是操作步驟均較為複雜，且需要專門的技術人員在實驗室進行操作，無法即時對病原進行檢測，尤其PCR更需要昂貴溫度循 環儀器才能完成檢測。綜合上述各檢測方法的諸多缺點，LAMP技術為近幾年較熱門之檢測方法，其優點不僅具備專一性與靈敏度高等特點，同時能在60至70℃恆溫條件下進行，無須精確溫控，對於儀器設備需求相對較低。
LAMP技術是日本學者Notomi等人於2000年所發表的一種新的核酸分子檢測技術。LAMP技術與PCR技術主要不同之處在於前者可以在60至70℃恆溫下進行反應。LAMP反應需要3組引子對(primers)，分別為外引子對(outer primers)、內引子對(inner primers)以及環狀引子對(loop primers)，所述的引子對係針對待測樣品核酸序列的特異區加以設計而得的，使得LAMP反應具有高度的專一性。LAMP反應中除了引子對外，尚要加入Bst DNA聚合酶，這是從一種細菌(Bacillus stearothermophilus)所純化生產的酵素，它可在一個最適溫度(60-65℃)與上述的引子對進行聚合作用，增幅出具有自我互補能力的DNA片段，形成具有莖環(stem-loop)的啞鈴型結構，藉此連續且重複反應，產生大量的DNA片段，在反應的過程中會有焦磷酸的釋放，與反應液中的鎂離子會形成白色的焦磷酸鎂(magnesium pyrophosphate)沉澱，隨著反應時間的增加，用肉眼即可觀察到大量的白色沉澱，亦即表示LAMP反應檢測到目標物。此外，亦可加入核酸染劑溴化乙錠(ethidium bromide)或SYBR Green I，然後用紫外光(UV)照射來觀察反應結果，效果比直接用肉眼觀察白色沉澱更佳。
目前已有許多LAMP小型可攜式檢測儀被開發，但仍需解決有下列需解決的問題：(1)核酸擴增反應試劑未能進行整合並預先製備，該因素將拉長整體檢測時間，每次檢測所配置之試劑也將導致結果間的比較有所誤差，同時試劑的調配需要專門的技術人員才能進行；(2)結果判讀需用間接方式求證，如搭配LFA進一步分析擴增產物，或量測擴增反應過程所釋出知氫離子作為判讀依據；以及(3)檢測時間過長，多半需要耗時40至60分鐘。
鑑於上述需求，本發明提供簡化元件系統、不須使用額外幫浦驅動反應試劑、元件組裝成本低以及如行動電源之電池即可驅動的整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統。
本發明提供一種整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統，係包含：
本體，其包含：
輸送單元，係包含相對設置而形成一夾縫之壓力滾輪及試條轉動滾輪，該輸送單元輸送具有複數隔間的試條，以於該試條在通過該夾縫時，使該壓力滾輪及試條轉動滾輪擠壓破壞該試條之複數隔間；
加熱單元，係包含陶瓷加熱晶片及溫度感測器，以提供適於進行恆溫環狀擴增反應的溫度；及
控制單元，該控制單元電性連結該輸送單元及該加熱單元，以控制該輸送單元及該加熱單元之運作；以及
電源，係用於驅動該輸送單元、加熱單元及控制單元之運作，且該電源電性連結該本體。
於至少一具體實施例中，該試條內之複數隔間包括位於該試條兩側其中之一末端處的第一隔間，係用以注入該待測檢體。於一些具體實施例中，該待測檢體選自包含DNA、RNA、血液、尿液、體液、糞便、分泌物及組織其中之一者。於至少一具體實施例中，該待測檢體為DNA或RNA。
於至少一具體實施例中，該試條內之複數隔間包括第二隔間、第三隔間及第四隔間分別用以置入試劑、引子和聚合酶。
於至少一具體實施例中，該試劑之成分包含dNTP、緩衝溶液及硫酸鎂。
於至少另一具體實施例中，該引子係針對該待測檢體之核酸序列設計而得。
於一些具體實施例中，該聚合酶選自由Bst DNA聚合酶、TwistAmp核酸擴增專用聚合酶、Taq DNA聚合酶、AmpliTaq DNA聚合酶、DNA聚合酶I至V型及其他用於核酸擴增反應之DNA或RNA聚合酶所組成之群組。於至少一具體實施例中，該聚合酶為Bst DNA聚合酶。
於至少一具體實施例中，該試條內之複數隔間復包含第五隔間，用以置入用於標記經恆溫環狀擴增反應所得產物之標記物。
於一些具體實施例中，該標記物選自由溴化乙錠(ethidium bromide)、SYBR Gold、SYBR Safe、Eva Green及SYBR Green I所組成之群組。於至少一具體實施例中，該標記物為溴化乙錠(ethidium bromide)或SYBR Green I。
於至少一具體實施例中，該輸送單元復包含步進馬達、槓桿結構塊、壓縮彈簧及止滑矽膠套，該步進馬達輸出端連接該試條轉動滾輪，以驅動該試條轉動滾輪轉動，且該槓桿結構塊連接該壓力滾輪和壓縮彈簧，該止滑矽膠套設於該試條轉動滾輪之外部，以調節該試條於該輸送單元中之行進路徑。
於一些具體實施例中，該溫度介於4至95℃之間，例如4、5、67、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 90或95℃；於另一些具體實施例中，該溫度介於60至70℃之間，亦可介於66至69℃之間，例如溫度為68℃。
於一些具體實施例中，該恆溫環狀擴增反應時間介於30分鐘至3小時之間，例如30分鐘、1小時、2小時或3小時，於一些具體實施例中，該恆溫環狀擴增反應時間介於30分鐘至1小時之間。
於至少一具體實施例中，該電源可為發電機或電池。較佳地，該電源為如行動電源之電池。
於至少一具體實施例中，所述系統進一步包含攝像單元及紫外光光源。在所述系統不具有攝像單元及紫外光光源之具體實施例中，係於該試條退出系統後，以紫外光光源照射該試條，並以攝像單元拍攝該標記物與產物進行反應產生之螢光，以判讀結果。
本發明還提供一種操作如本發明所述的整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統的方法，其包含：
將預先製備完成並保存於溫度範圍介於-80℃至40℃之間之試條取出，以解凍該試劑，其中，該試條具有第一隔間及分別置入有試劑、引子和聚合酶之第二隔間、第三隔間及第四隔間；
將該待測檢體注入解凍後之該試條內之第一隔間中；
將注入有該待測檢體之該試條置於該輸送單元中，以透過該控制單元驅動該壓力滾輪及試條轉動滾輪擠壓該試條，俾破壞該第一隔間至第四隔間而令該試劑、聚合酶、引子和待測檢體混合；
以該加熱單元加熱已混合該試劑、聚合酶、引子和待測檢體之該試條，俾使該試劑、聚合酶、引子和待測檢體進行恆溫環狀擴增反應；以及
待該恆溫環狀擴增反應結束後，透過該控制單元驅動該滾輪，以將該試條內之進行該恆溫環狀擴增反應所得之產物集中，再將該試條退出該系統。
於一些具體實施例中，進行該恆溫環狀擴增反應的溫度介於4至95℃之間，例如4、5、67、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95℃；於另一些具體實施例中，該溫度介於60至70℃之間，亦可介於66至69℃之間，例如溫度為68℃。
於一些具體實施例中，該恆溫環狀擴增反應時間介於30分鐘至3小時之間，例如30分鐘、1小時、2小時或3小時，於一些具體實施例中，該恆溫環狀擴增反應時間介於30分鐘至1小時之間。
於至少一具體實施例中，該試條復包含第五隔間，係置入有用於標記經恆溫環狀擴增反應所得產物之標記物，且該方法進一步包含於進行恆溫環狀擴增反應後，透過該控制單元驅動該滾輪破壞該試條內含該標記物之第五隔間，以使該標記物與產物混合並集中，再將該試條退出該系統。
於至少一具體實施例中，所述方法進一步包含將經混合該標記物與產物之該試條置於該紫外光光源下，並以攝像單元拍攝該標記物與產物進行反應產生之螢光，以判讀結果。
本發明整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統中的整合式核酸擴增反應試條內含預先製備的多合一試劑，大幅縮短檢測前處理程序，也解決了需要專門的技術人員才有辦法調配之問題。
其次，本發明整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統具有體積輕盈、方便攜帶、操作簡便，並具備檢測高靈敏度與分析數值可直接判讀等特點。
其三，本發明整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統用於待測檢體進行恆溫環狀擴增，可於30分鐘完成，可機動性地變更引子，以檢測不同病原。
1:本體
2:試條
21:第一隔間
22:第二隔間
23:第三隔間
24:第四隔間
25:第五隔間
26:QR條碼樣品識別貼紙
3:輸送單元
31:壓力滾輪
32:試條轉動滾輪
33:槓桿結構塊
34:壓縮彈簧
35:止滑矽膠套
4:加熱單元
41:陶瓷加熱晶片
42:溫度感測器
5:控制單元
6:電源
7:攝像單元
8:紫外光光源
圖1是本發明整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統其中一實施例之方塊示意圖。
圖2是本發明其中一實施例之試條側剖面示意圖。
圖3是本發明其中一實施例之輸送單元與加熱單元之剖面示意圖。
圖4是本發明整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統其中一實施例之操作流程示意圖。
圖5A及圖5B顯示本發明整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統與現行市售PCR機器於檢測效能之比較。圖5A為不同濃度的模板序列於相同條件下進行恆溫環狀擴增反應後所得之產物的螢光強度和電泳圖，圖5B為將恆溫環狀擴增反應後所得之產物的螢光強度量化後之柱狀圖，由圖5A和圖5B的結果可證實，本發明之系統與市售PCR機器兩者間對於核酸擴增反應效能無差別。
圖6A及圖6B顯示本發明之試條於不同保存溫度及不同保存時間的條件下，其保存期限之測試結果。圖6A顯示本發明之試條分別於-20℃及4℃保存1至5週後，以相同濃度的模板序列於相同條件下進行恆溫環狀擴增反應後所得之產物的螢光強度和電泳圖，圖6B為將恆溫環狀擴增反應後所得之產物的螢光強度量化後之柱狀圖，由圖6A和圖6B的結果可發現，本發明之試條在-20℃的 溫度下保存至5週仍可有效擴增模板序列，而保存於4℃的溫度下，則自3週後即無法有效維持其擴增模板序列的效能。
以下係藉由特定的具體實施例說明本揭露之實施方式，本揭露所屬技術領域中具有通常知識者可根據本文所載內容輕易地瞭解本揭露之精神、優點及功效。然而，本文所載之具體實施例並非用以限定本揭露，本揭露亦可藉由其它不同之實施方式加以實現或應用，本文所載各項細節亦可根據不同的觀點與應用，在不悖離本揭露之精神下賦予不同的變化或修飾。
本文所附圖式中所顯示之比例、結構、大小等特徵，僅係用於配合本文所揭示之內容，以供本揭露所屬技術領域中具有通常知識者閱讀及瞭解本揭露，而非用以限定本揭露可實施之範圍，故任何比例關係之改變、結構之修飾、或大小之調整，在不影響本揭露所能達成之目的及所能產生之功效的情形下，均應屬於本文所揭示之技術內容得能涵蓋的範圍。
本文所述「包括」、「包含」或「具有」特定要件時，除非另有說明，否則可另包含其他元件、組成分、結構、區域、部位、裝置、系統、步驟或連接關係等要件，而非排除該等其他要件。
本文所述「上」、「下」、「頂」、「底」、「側」、「前」、「後」等用語，僅係便於闡明本揭露之具體實施例，而非用於限定本揭露可實施之範圍，其相對位置及關係之調整、互換及改變，在不實質變更本揭露技術內容的情形下，皆應當視為本揭露可實施之範圍。
本文所述「第一」或「第二」等具有順序性的用語，僅係便於敘 述或區別元件、組成分、結構、區域、部位、裝置、系統等要件，而非用於限定本揭露可實施之範圍，亦非用於限定該等要件在空間上的順序。此外，除非本文另有明確說明，否則本文所述單數形式之「一」及「該」亦包含複數形式，且本文所述「或」係與「及/或」可互換使用。
本文所述之數值範圍係包含及可合併的，落在本文所述數值範圍內之任何數值，均應被包含在本發明之範圍內，且亦可作為最大值或最小值以導出次範圍；舉例而言，「60至70℃」之數值範圍應可理解為包含60℃、60.5℃、61℃、61.5℃、62℃、62.5℃、63℃、63.5℃、64℃、64.5℃、65℃、65.5℃、66℃、66.5℃、67℃、67.5℃、68℃、68.5、69℃、69.5℃及67℃等數值，且亦包含最小值60℃及最大值70℃之間的任何次範圍，例如：60℃至69℃、61℃至70℃等次範圍。
本文所述「集中」的用語，係指為確保試條反應試劑液流擴散情形之技術手段。由於本發明之試條結構為扁平空間，反應試劑會因空間擠壓而擴散分布。因此，試條反應完成退出裝置系統後，有其「集中」步驟之必要。本文所述的「集中」步驟之技術手段為利用本發明之輸送單元或使用者之手指擠壓推進反應試劑至試條最前端，接著利用QR條碼樣品識別貼紙固定試劑集中之狀態。
本發明之第一態樣係整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統，包括至少具有輸送單元、加熱單元和控制單元之本體以及電源，其中，該輸送單元、該加熱單元和該控制單元設於該本體之內，該控制單元電性連結該輸送單元及該加熱單元，且該電源電性連結該本體。
至少一具體實施例中，本發明之整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統如圖1所示，其中本體1係包括輸送單元3、加熱單元4和控制單元5，其中，該輸送單元3，係用以輸送具有複數隔間且容納用於恆溫環狀擴增反應所需之試劑、聚合酶、引子和待測檢體的試條2，且該輸送單元3設有複數滾輪，用以擠壓而破壞該試條2之複數隔間，例如圖2所示之第一隔間21、第二隔間22、第三隔間23及第四隔間24，俾混合該試劑、聚合酶、引子和待測檢體；該加熱單元4，係用於提供適於該試劑、聚合酶、引子和待測檢體進行恆溫環狀擴增反應的溫度；該控制單元5電性連結該輸送單元3及該加熱單元4，以控制該輸送單元3及該加熱單元之運作4；以及該電源6，係用於驅動該輸送單元3、加熱單元4及控制單元5之運作，且該電源6電性連結該本體1。
本具體實施例中，該試條2之材質為聚丙烯(Polypropylene，簡稱PP)，為一種半結晶的熱塑性塑膠。試條2整體規格與內容物置放之空間設計參照圖2所示。所選用之材質厚度為0.1mm，利用熱壓密封機製作成尺寸大小分別為5mm(寬)及130mm(長)之試條。製備後之結構特徵屬扁平空間狀態，後續注入之酵素、引子及緩衝液須利用熱壓密封保留彼此間隔以避免各組成液流混合之現象。試條前後端皆為密封狀態，於檢測時再利用剪刀裁切一缺口後將樣品注入，再將該缺口進行密封。在一些具體實施例中，可使用例如QR條碼樣品識別貼紙將該缺口進行密封。
如圖2所示，該試條2包含複數個隔間，例如第一隔間21、第二隔間22、第三隔間23及第四隔間24，該第一隔間21位於該試條2兩側其中之一末端處，該第一隔間21用以注入該待測檢體，並使用QR條碼樣品識別貼紙26將該試條進行密封。於至少一些具體實施例中，該待測檢體為選自包含DNA、RNA、 血液、尿液、體液、糞便、分泌物及組織其中之一者。於至少一具體實施例中，該待測檢體為DNA。於至少另一具體實施例中，該待測檢體為RNA。
該試條2內之第二隔間22、第三隔間23及第四隔間24則分別用以預先置入該試劑、引子和聚合酶，其中，該試劑之成分包含dNTP、緩衝溶液及硫酸鎂，該引子係針對該待測檢體之核酸序列設計而得，該聚合酶選自由Bst DNA聚合酶、TwistAmp核酸擴增專用聚合酶、Taq DNA聚合酶、AmpliTaq DNA聚合酶、DNA聚合酶I至V型及其他用於核酸擴增反應之DNA或RNA聚合酶所組成之群組。於一具體實施例中，該聚合酶為Bst DNA聚合酶。
本具體實施例中，該試條2還包含第五隔間25，用以預先置入用於標記經恆溫環狀擴增反應所得產物之標記物，其中，該標記物選自由溴化乙錠(ethidium bromide)、SYBR Gold、SYBR Safe、Eva Green及SYBR Green I所組成之群組。於一具體實施例中，該標記物為溴化乙錠(ethidium bromide)或SYBR Green I。
本具體實施例中，於本體1內部整合輸送單元3及加熱單元4，如圖3所示，該輸送單元3主要包含壓力滾輪31、試條轉動滾輪32、步進馬達(設於本體1內部中央，未示出)、槓桿結構塊33、壓縮彈簧34及止滑矽膠套35等元件，其中，該步進馬達輸出端連接該試條轉動滾輪32，作為驅動該試條轉動滾輪32轉動的動力來源；該槓桿結構塊33連接該壓力滾輪31和壓縮彈簧34；該止滑矽膠套35設於該試條轉動滾輪32之外部，藉以調節該試條2於該輸送單元3中之行進路徑(如圖3之虛線)。此外，該加熱單元4主要包含陶瓷加熱晶片41及溫度感測器42等元件，用於提供適於進行恆溫環狀擴增反應的溫度。
本具體實施例中，控制單元5係由包含控制板及複數個控制按鈕所組成，藉以進行輸送單元3之馬達轉動角度、加熱單元4之加熱時間及加熱溫度等多項調節。在一些具體實施例中，該控制板為Arduino UNO控制板。
本具體實施例中，使用者將試條從本體1左側入口放入，如圖3所示，待試條確實置於壓力滾輪31及試條轉動滾輪32夾縫間時便按下控制單元5之控制按鈕，使設於本體1內部中央之步進馬達以順時針轉動將試條捲入本體1。壓力滾輪31會藉由槓桿結構塊33傳遞壓縮彈簧34之彈力，提供固定之正向力幫助試條2進行擠壓。擠壓過程中會使試條2內部的間隔壁熱壓密封處破裂，使液體流出並達到充份混合之目的。本體1將試條2整體捲入後，試條2內部試劑會混合於陶瓷加熱晶片41區域，此時便自動開啟陶瓷加熱晶片41進行恆溫加熱。加熱完成後步進馬達會自動反轉將試條2退出，以便使用者取出。
於一些具體實施例中，該加熱單元4提供之溫度介於4℃至95℃之間。於其他具體實施例中，該加熱單元4提供之溫度介於60至70℃之間。於其他具體實施例中，該溫度具體可為60℃、60.5℃、61℃、61.5℃、62℃、62.5℃、63℃、63.5℃、64℃、64.5℃、65℃、65.5℃、66℃、66.5℃、67℃、67.5℃、68℃、68.5、69℃、69.5℃及67℃等。於至少一具體實施例中，該溫度介於66至69℃之間。於至少一具體實施例中，該溫度為68℃。
於一些具體實施例中，本發明之恆溫環狀擴增反應時間介於30分鐘至3小時之間。於其他具體實施例中，本發明之恆溫環狀擴增反應時間介於30分鐘至1小時之間。於至少一具體實施例中，本發明之恆溫環狀擴增反應時間約為30分鐘。
本具體實施例中，該電源6為行動電源。於其他具體實施例中，該電源6可為發電機。
本具體實施例中，本發明之整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統包含攝像單元7及紫外光光源8。
本具體實施例中，由於試條2內部含有SYBR Green I寡核苷酸染色標記物，當核酸物質經恆溫擴增反應後該染色標記物便會鑲嵌在雙股螺旋DNA中，此時以藍光波長400至500nm間之光源照射下便可輕易由肉眼觀察到綠色螢光。
本具體實施例中，紫外光光源8照射與攝像單元7動作與主機1間未牽涉操作之空間關係，其中紫外光光源8僅需要帶有藍光波長400至500nm間之LED燈便可激發染色標記物產生螢光。同時，攝像單元7則以一般手機相機拍照擷取畫面便可完成，後續可再透過畫面對比的調整進一步分析核酸擴增之結果。
本發明之第二態樣，係提供一種操作如本發明所述的整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統的方法。至少一具體實施例中，該方法包含如圖4所示之步驟：步驟1：將預先製備完成並保存於-20℃之試條2取出，待試劑解凍，該試條具有第一隔間21及分別置入有試劑、引子和聚合酶第二隔間22、第三隔間23及第四隔間24；步驟2：於經解凍後之該試條2內之第一隔間21注入該待測檢體；步驟3：將包含有該待測檢體之該試條2置於該輸送單元3中，透過該控制單元5驅動該壓力滾輪及試條轉動滾輪擠壓注入有該待測檢體之該試條， 以破壞該第一隔間21至第四隔間24而令於各隔間中的該試劑、聚合酶、引子和待測檢體得以混合；
步驟4：以該加熱單元4加熱經混合該試劑、聚合酶、引子和待測檢體後之試條2，從而使該試劑、聚合酶、引子和待測檢體進行恆溫環狀擴增反應；以及
步驟5：待恆溫環狀擴增反應結束後，透過該控制單元5驅動該滾輪將該試條2內之該試劑、聚合酶、引子、待測檢體和恆溫環狀擴增反應所得之產物集中，並將該試條2退出該系統。
本具體實施例中，進行該恆溫環狀擴增反應的溫度為68℃。於一些具體實施例中，該溫度介於66至69℃之間。
本具體實施例中，進行該恆溫環狀擴增反應的時間約為30分鐘。
本具體實施例中，該試條2復包含第五隔間25，係用於置入有用於標記經恆溫環狀擴增反應所得產物之標記物，且該方法進一步包含於進行恆溫環狀擴增反應後，透過該控制單元5驅動該滾輪破壞該試條內含該標記物之第三隔間23，使得該標記物與產物混合並集中，再將該試條2退出該系統。
本具體實施例中，所述方法進一步包含將經混合該標記物與產物之該試條置於該紫外光光源下，並以攝像單元拍攝該標記物與產物進行反應產生之螢光，以判讀結果。
本發明之另一具體實施例中，係比較本發明之整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統與現行PCR機器之檢測效能。圖5A為不同濃度的模板序列於相同反應條件下進行恆溫環狀擴增後所得之產物的螢光強度和電泳圖，圖5B係將恆溫環狀擴增反應後所得之產物的螢光強度量化後所得之柱狀圖。如圖 5A及5B所示，本發明之系統與現行PCR機器兩者皆可成功擴增不同濃度的檢體，經由產物螢光檢測比對也證實兩者並無明顯差異，表示本發明裝置對於核酸擴增效能與現行PCR機器並無差別。
本發明之又一具體實施例中，係針對本發明之試條的保存期限進行測試。圖6A顯示本發明之試條分別於-20℃及4℃保存1至5週後，以相同濃度的模板序列於相同條件下進行恆溫環狀擴增反應後所得之產物的螢光強度和電泳圖，圖6B為將恆溫環狀擴增反應後所得之產物的螢光強度量化後之柱狀圖。由圖6A和圖6B的結果可發現，本發明之試條在-20℃的溫度下保存至5週仍可有效擴增模板序列，而保存於4℃的溫度下，則自3週後即無法有效維持其擴增模板序列的效能，表示本發明之試條可預先製備並保存於-20℃的條件中，無需目前由專門的技術人員於進行恆溫環狀擴增反應前才進行該些試劑的製備。
本發明之試條為一試劑儲放平台，可視核酸擴增反應方法變更進而替換試劑之種類。屆時所使用之核酸擴增反應試劑之儲存條件，乃包括常溫、冷藏及冷凍等狀態。呈上所述，目前現行針對核酸擴增反應之試劑亦既包括各種不同保存溫度之液態及固態種類。因此，本發明之試條可依照實際需要保存於介於-80℃至40℃之間的溫度條件。
此外，恆溫擴增反應時間在上揭實施例中雖呈現為30分鐘，然而整體時間會因不同核酸擴增方法而不一。目前現行常見的核酸擴增法有：核酸序列基增幅法(Nucleic acid sequence bases amplification，NASBA)、鍊取代核酸增幅法(Strand displacement amplification,SDA)、恆溫環形核酸增幅法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、重組酶聚合酶擴增法(Recombinase polymerase amplification,RPA)以及聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction, PCR)等。因此，當本發明之試條應用不同核酸擴增法時所耗費的時間也不盡相同，因此，本發明之恆溫環狀擴增反應的時間可依照實際需要約為30分鐘至3小時。
由於本發明之試條可應用於不同核酸擴增法，而不同的核酸擴增法有其合適的實施溫度，因此，本發明之恆溫環狀擴增反應的實施溫度可依照實際需要約為4℃至95℃之間。
本發明提供的整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統，較目前習知的許多LAMP小型檢測儀具有以下優點：(1)整合式核酸擴增反應試條內含預先製備的多合一試劑，大幅縮短檢測前處理程序，也解決了需要專門的技術人員才有辦法調配之問題；(2)體積輕盈、方便攜帶、操作簡便，並具備檢測高靈敏度與分析數值可直接判讀等特性；以及(3)恆溫環狀擴增於30分鐘完成，可機動性地變更引子，以檢測不同病原。
上述實施例用以例示性說明本揭露的原理及其功效，而非用於限制本揭露。任何熟習此項技藝的人士均可在不違背本揭露的範圍下，對上述實施例進行修改。因此，本揭露的權利保護範圍，應如後述的申請專利範圍所列。
1:本體
2:試條
3:輸送單元
4:加熱單元
5:控制單元
6:電源
7:攝像單元
8:紫外光光源

Claims (20)

  1. 一種整合式核酸恆溫環狀擴增暨行動裝置系統，係包含：本體，其包含：輸送單元，係包含相對設置而形成一夾縫之壓力滾輪及試條轉動滾輪，該輸送單元輸送具有複數隔間的試條，以於該試條在通過該夾縫時，使該壓力滾輪及試條轉動滾輪擠壓破壞該試條之複數隔間；加熱單元，係包含陶瓷加熱晶片及溫度感測器，以提供適於進行恆溫環狀擴增反應的溫度；及控制單元，係電性連結該輸送單元及加熱單元，以控制該輸送單元及加熱單元之運作；以及電源，係電性連結該本體，以驅動該輸送單元、加熱單元及控制單元之運作。
  2. 如請求項1所述之系統，其中，該試條內之複數隔間包括位於該試條兩側其中之一末端處的第一隔間，係用以注入待測檢體，其中，該待測檢體選自包含DNA、RNA、血液、尿液、體液、糞便、分泌物及組織其中之一者。
  3. 如請求項2所述之系統，其中，該待測檢體為DNA或RNA。
  4. 如請求項2所述之系統，其中，該試條內之複數隔間包括第二隔間、第三隔間及第四隔間分別用以置入試劑、引子和聚合酶。
  5. 如請求項4所述之系統，其中，該試劑之成分包含dNTP、緩衝溶液及硫酸鎂。
  6. 如請求項4所述之系統，其中，該引子係針對該待測檢體之核酸序列設計而得。
  7. 如請求項4所述之系統，其中，該聚合酶選自由Bst DNA聚合酶、TwistAmp核酸擴增專用聚合酶、Taq DNA聚合酶、AmpliTaq DNA聚合酶、DNA聚合酶I至V型及其他用於核酸擴增反應之DNA或RNA聚合酶所組成之群組。
  8. 如請求項7所述之系統，其中，該聚合酶為Bst DNA聚合酶。
  9. 如請求項4所述之系統，其中，該試條之複數隔間復包含第五隔間，用以置入用於標記經恆溫環狀擴增反應所得產物之標記物。
  10. 如請求項9所述之系統，其中，該標記物選自由溴化乙錠(ethidium bromide)、SYBR Gold、SYBR Safe、Eva Green及SYBR Green I所組成之群組。
  11. 如請求項10所述之系統，其中，該標記物為溴化乙錠或SYBR Green I。
  12. 如請求項1所述之系統，其中，該輸送單元復包含步進馬達、槓桿結構塊、壓縮彈簧及止滑矽膠套，該步進馬達輸出端連接該試條轉動滾輪，以驅動該試條轉動滾輪轉動，且該槓桿結構塊連接該壓力滾輪和壓縮彈簧，該止滑矽膠套設於該試條轉動滾輪之外部，以調節該試條於該輸送單元中之行進路徑。
  13. 如請求項1所述之系統，其中，該溫度介於4至95℃之間。
  14. 如請求項1所述之系統，其中，該電源為發電機或電池。
  15. 如請求項1所述之系統，復包含攝像單元及紫外光光源。
  16. 一種操作如請求項1所述的系統的方法，其包含下列步驟： 將預先製備完成並保存於溫度範圍介於-80℃至40℃之間之試條取出，以解凍該試劑，其中，該試條具有第一隔間及分別置入有試劑、引子和聚合酶之第二隔間、第三隔間及第四隔間；將待測檢體注入解凍後之該試條內之第一隔間中；將注入有該待測檢體之該試條置於該輸送單元中，以透過該控制單元驅動該壓力滾輪及試條轉動滾輪擠壓該試條，俾破壞該第一隔間至第四隔間而令該試劑、聚合酶、引子和待測檢體混合；以該加熱單元加熱已混合該試劑、聚合酶、引子和待測檢體之該試條，俾使該試劑、聚合酶、引子和待測檢體進行恆溫環狀擴增反應；以及待該恆溫環狀擴增反應結束後，透過該控制單元驅動該滾輪，以將該試條內之進行該恆溫環狀擴增反應所得之產物集中，再將該試條退出該系統。
  17. 如請求項16所述之方法，其中，進行該恆溫環狀擴增反應的溫度介於4至95℃之間。
  18. 如請求項16所述之方法，其中，進行該恆溫環狀擴增反應的時間介於30分鐘至3小時之間。
  19. 如請求項16所述之方法，其中，該試條復包含第五隔間，係置入有用於標記經恆溫環狀擴增反應所得產物之標記物，且該方法進一步包含於進行恆溫環狀擴增反應後，透過該控制單元驅動該滾輪破壞該試條內含該標記物之第五隔間，以使該標記物與產物混合並集中，再將該試條退出該系統。
  20. 如請求項19所述之方法，進一步包含將經混合該標記物與產物之該試條置於紫外光光源下，並以攝像單元拍攝該標記物與產物進行反應產生之螢光，以判讀結果。
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