JP2009198183A

JP2009198183A - 生体サンプル分析用プレート

Info

Publication number: JP2009198183A
Application number: JP2008036831A
Authority: JP
Inventors: Motohiro Yamashita; 資浩山下
Original assignee: Panasonic Corp
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 2008-02-19
Filing date: 2008-02-19
Publication date: 2009-09-03

Abstract

【課題】プレートの両面に同時にフィルムを熱圧着しても、フィルムがチャンバー内に入り込まず送液を確実に実施することのできる生体サンプル分析用プレートを提供する。
【解決手段】軸心を持ち複数の流路と複数のチャンバーとから形成された流路ユニットを一つ以上備えたプレートと前記プレートの両面を覆うように形成されたフィルムとからなる生体サンプル分析用プレートにおいて、一端が前記流路ユニットの任意のチャンバーと接続し他端が前記プレートの壁面で開口されている空気抜き流路を備えた生体サンプル分析用プレート。
【選択図】図２

Description

本発明はＤＮＡを対象とする分析装置に関し、より詳細にはＤＮＡ増幅と分析を１つのプレートで行う技術に関するものである。

近年、分子生物学分野の発展に伴い、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。また、医療の分野だけでなく、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されてきており、遺伝子はより身近なものとして取り上げられるようになってきた。

これらの技術進歩を大きく飛躍させた技術としてＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎｅＲｅａｃｔｉｏｎ)による核酸増幅技術があげられ、ＰＣＲは生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。先にあげた遺伝子診断や品種判別では、特定の部分（特徴のある部分) のＤＮＡ領域のみをＰＣＲによって大量に増幅させて解析する。また、ＰＣＲ増幅の有無を見ることによって判別することもできる。

ＰＣＲは３つの温度工程からなる。二本鎖のＤＮＡを一本鎖へと解離させる工程（熱変性）、一本鎖に解離したＤＮＡに増幅したい部分の両端の配列と相補的な配列を有したプライマーを結合させる工程(アニーリング) 、プライマーが結合した配列からＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ鎖を伸長させる工程(伸長反応) である。熱変性では９５℃で１分間温度をかけることによって、ＤＮＡを一本鎖の状態にする。アニーリングの工程では５０〜６０℃で３０秒間反応させることにより、増幅したい領域の末端部分にプライマーと呼ばれる２０塩基程度の短いＤＮＡを結合させる。伸長反応は７２℃の温度でポリメラーゼを鋳型に付加し、ＤＮＡ鎖の伸長を行う。これらの温度サイクルを２５〜４０回行うことで、サイクル数に応じて理論的には２の２５乗から２の４０乗増幅できる。実質的には目的の領域を１０の６乗倍に増幅している。

ＰＣＲを行った後は、ＰＣＲ増幅の有無を調べる。主に使用される手法は電気泳動である。電気泳動は内径が１００ミクロン以下程度のガラス細管（キャピラリー）の両端に高電圧を印加すると、試料をキャピラリー内で移動する。電気泳動中の試料は、キャピラリーを移動する際に、その電荷や分子量の差などにより分離するので、この分離状態をＵＶ吸収や蛍光などにより検出する方法がある。最近ではキャピラリー電気泳動を使い易くした「マイクロチップケミストリー」と呼ばれる手法が考案されており、これは、プラスチック基板上に微細溝をつくり、その上に透明なフィルムを接着した構造になっている。（例えば、特許文献１参照）
図７に、特許文献１のプレートを示す。プレート１０には流路と貫通穴９が形成されており、プレート１０は透明フィルム７を熱圧着で接着され、さらに電極８が形成されている。これらプレートにＰＣＲ機能を持たせた場合、流路パターンの形状が複雑になり、３次元の流路構造になる。複雑な形状ではプレートの成型も困難になるため、プレートの構造をフィルムとプレートの２層構造からフィルム、プレート、フィルムの３層構造に増やす必要がある。フィルムを片面ずつ接着しようとした場合、熱圧着ではフィルムの密着性を向上させるために、プレートを事前に１３０℃付近で予備加熱を行い、その後、接着温度が１００℃付近で加圧をしながらフィルムを接着する。よって、もう片方のフィルムを接着する時は、もう一度、プレートを予備加熱する必要がある。しかし、予備加熱の温度が高いため、接着したフィルムが溶けてしまい、もう片方のフィルムは接着することができない。そのため、フィルムは両面同時に接着しなければならない。
特開２０００−３１０６１３号公報

しかしながら、前記従来の構成では、プレートの両面に同時にフィルムを熱圧着すると流路やチャンバーが密閉された状態になるので、プレート冷却時にチャンバー内の空気が圧縮される。その結果、フィルムがチャンバー内に入り込み流路を塞ぐため、送液ができないという課題を有していた。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、プレートの両面に同時にフィルムを熱圧着しても、フィルムがチャンバー内に入り込まず送液を確実に実施することのできる生体サンプル分析用プレートを提供することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、生体サンプル分析用プレートは流路が形成されたプレートと前記流路の上に前記プレートを覆うように取り付けられたフィルムからなる生体サンプル分析用プレートにおいて、前記流路はサンプルを注入するサンプル注入口とサンプルを保持するためのチャンバーと前記チャンバーに接続し、もう一方が前記プレートの外周側面に接続している空気抜け流路が形成されたことを特徴としたものである。

本発明の生体サンプル分析用プレートによれば、微細流路やチャンバーにフィルムが入り込むことがないため、送液が確実に行うことができ、ＰＣＲの増幅から電気泳動による測定までの一連の工程をおこなうことができる。

以下に、本発明の生体サンプル判別プレートの実施の形態を図面とともに詳細に説明する。

（実施の形態１）
最初に、図１〜図６を用いて本発明の実施の形態１における生体サンプル判別プレートについて説明する。

図１に、本実施の形態１における生体サンプル判別プレート１の全体図を示す。破線で囲んだ部分２は、試料の測定を行う流路ユニット２である。本実施の形態では８個設けられている。これら流路ユニット２は、放射線状に形成されており、同時に８検体のＤＮＡ判別が行うことができる。

穴３を設けているが、これは外形を非対称にしておくことで、判別用の読取装置（図示しない）に取り付けた際に、各流路ユニット２の場所を特定できるようにしている。

本実施例の生体サンプル判別プレート１は、フィルム５とベースプレート４とフィルム６の３層構造で構成されており、ベースプレート４の材料はポリプロピレンを使用し、厚みは２ｍｍとした。また、ベースプレート４は、深さ８０μｍ、幅１００μｍから３００μｍの流路パターンが形成された金型を使って射出成形で成型を行った。フィルム５、６はプレート材と同じポリプロピレン材を使用しており、厚みは５０μｍである。プレートとフィルムは熱圧着によって接着することにより、漏れのない密閉流路を形成する。軸心７は本生体サンプル判別プレートの軸心であり、軸心７を中心に本生体サンプル判別プレート１を読取装置の回転部に固定するための回転部固定用穴８を設けている。

図２は図１に示すプレート１に形成された流路ユニット２の詳細形状を示す図である。流路ユニット２は、生体サンプルが注入されるサンプル注入口９と、注入された生体サンプルを一旦保持するためのサンプルチャンバー１０と、サンプルチャンバー１０とベースプレート４の外周部をつなぐ空気抜け流路１１と、ＰＣＲ反応を行うＰＣＲチャンバー１２とサンプルチャンバー１０とＰＣＲチャンバー１２をつなぐ流路１３と、緩衝液が注入される緩衝液注入口１４と注入された緩衝液を一旦保持するための緩衝液チャンバー１５と、ＰＣＲ反応液の一部を定量する定量部１６と余分なＰＣＲ反応液を廃棄する廃棄チャンバー１７と、ＰＣＲチャンバー１２と定量部１６と廃棄チャンバー１７をつなぐ流路１８と、電気泳動時にプラス極１９とマイナス極２０に電圧を印加する電圧印加部２１と、電気泳動を行う電気泳動流路２２とを備える。

図３は流路ユニット２のＡ−Ａ’断面図を示す。空気抜け流路１１と流路１３はフィルム６側に配置されており、それ以外の流路は全てフィルム５側に配置されている。

図４はプレート成型後のベースプレート４からフィルム５とフィルム６を接着するまでの製造工程を示す図である。成型後のベースプレート４には、その表面に油やゴミが付着しているため、中性洗剤液に浸し超音波洗浄を行う。次にプレート表面の水分をとばす効果とベースプレート４の寸法を安定させることを目的として、８０℃で２時間ベーキングを行う。ベーキング後はラミネーター機で熱圧着処理を行うが、ベースプレート４をホットプレートで軟化点付近まで予備加熱することによって、熱圧着時のフィルム５の密着力が増す。予備加熱後はラミネーター機で熱圧着処理を行い、その後、ベースプレート４を冷却して余分なフィルムをカットして生体サンプル判別プレート１が完成する。

図５にベースプレート４とフィルム５、フィルム６とを接着するラミネーター機を示す。２３はベースプレート４を軟化点温度まで予備加熱するためのホットプレート、２４はベースプレート４を搬送するためのベルトコンベア、２５はフィルム５とフィルム６を巻きつけた加熱ヒーター２６が内蔵されているシリコンゴム製のローラー、５と６は熱圧着するためのポリプロピレンフィルムである。

ベースプレート４は、ホットプレート２３でプレートの軟化点温度まで加熱され（予備加熱）、ベルトコンベア２４により２つのローラー２５まで搬送する。その後、２つのローラー２５の間をベースプレート４が通過することで、ローラーから与えられる熱とローラーの圧着力により、フィルム５とフィルム６がベースプレート４と熱圧着される。この時、本発明のプレートには空気抜け流路１１が具備されているため、両面フィルムが接着されていても、チャンバー内の空気を閉じ込めることなく、外気とつながっているため、プレート冷却時によるフィルムの変形は発生しない。熱圧着されたベースプレート４は冷却して、最後に余分なフィルムをカットすれば生体サンプル判別プレート１が完成する。なお、サンプル注入口９と緩衝液注入口１３は液を注入する前に市販のピペットを使って穴を開ける。

次に、図６を用いて、本発明の空気抜け流路１１の有無と、チャンバーへの接続位置の差による送液状況の確認を行い、成形後の効果を確認した。図６（ａ）に空気抜け流路を有さない流路ユニットを持つサンプルを、図６（ｂ）にサンプルチャンバーとの接続部をサンプルチャンバーのサンプル注入口よりもプレート外周側に設けた空気抜け流路を備えた流路ユニットを持つサンプルを、図６（ｃ）にサンプルチャンバー１０との接続部をサンプルチャンバー１０のサンプル注入口よりも内周側に設けた空気抜け流路を備えた流路ユニット持つサンプルを示す。図中の矢印は、プレート１の軸心を示す方向を示す。

これら図６（ａ）から（ｃ）に示したサンプルを８個用意して、プレート内の８個の流路ユニットに生体サンプル２μｌをピペットでサンプルチャンバーに注入した。その後、判別用の読取装置を使って、４０００ｒｐｍで２分間、プレートを回転させて送液の状態を確認した。また、空気抜け流路のプレート外周部出口に、液漏れを確認するためのガーゼを取り付けた。サンプルチャンバー１０から流路１３を通ってＰＣＲチャンバー１２に生体サンプルが漏れなく入った場合を成功としたときの数を調べた。

その結果、図６（ａ）のサンプルでは、成形時にフィルムが熱圧着による流路内への入り込みが起こり、生体サンプルが流路１３に入ることができず、８個全て失敗した。次に、図６（ｂ）のサンプルでは、成形時にフィルムが熱圧着による流路内への入り込みは起こらなかった。しかし、ＰＣＲチャンバー１２に全て生体サンプルが入ったものは３個で、残りの５個はプレート回転中に生体サンプルの一部が空気抜け流路内に入ってしまい、ＰＣＲチャンバー１２内には決められた量の生体サンプルが入らなかった。これはサンプル注入口よりも空気抜け流路の接続場所がプレート外周側にあるため、生体サンプルが空気抜け流路に入ってしまったためである。図６（ｃ）のサンプルでは、空気抜け流路の接続場所がサンプル注入口よりもプレート回転中心側にあったため、図６（ｂ）で生じた空気抜け流路内に生体サンプルが流れ込むことは無く、全ての生体サンプルがＰＣＲチャンバーに入った。従って、空気抜け流路の配置は注入口よりも回転中心方向にしなければならない。

以上のように、実施の形態１においてプレートの流路ユニット２に空気抜け流路を形成することにより、両面フィルム接着の際に、微細流路やチャンバーにフィルムが入り込むことがないため、送液が確実に行うことができ、ＰＣＲの増幅から電気泳動による測定までの一連の工程をおこなうことができる。

本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、プレートが複雑な構造を有し、かつ両面をフィルムで熱圧着する構造において、フィルムがチャンバー内に入り込まないため、送液が確実におこなうことができるものとして有用である。

本発明の実施の形態１にかかる生体サンプル判別プレートの平面図本発明の実施の形態１にかかる生体サンプル判別プレートの要部拡大平面図本発明の実施の形態１にかかる生体サンプル判別プレートの断面図本発明の実施の形態１にかかる生体サンプル判別プレートの製造工程を示すフローチャート本発明の実施の形態１にかかる生体サンプル判別プレートの熱圧着工程を示す図本発明の実施の形態１にかかる生体サンプル判別プレートの空気抜け流路の配置場所の違いによる流路パターンを示す図従来例の流体チップの平面図

符号の説明

１生体サンプル判別プレート
２流路ユニット
３位置決め穴
４ベースプレート
５フィルム
６フィルム
７軸心
８回転部固定用穴
９サンプル注入口
１０サンプルチャンバー
１１空気抜け流路
１２ＰＣＲチャンバー
１３流路
１４緩衝液注入口
１５緩衝液チャンバー
１６定量部
１７廃棄チャンバー
１８流路
１９プラス極
２０マイナス極
２１電圧印加部
２２電気泳動流路
２３ホットプレート
２４ベルトコンベア
２５ローラー
２６加熱ヒーター

Claims

軸心を持ち複数の流路と複数のチャンバーとから形成された流路ユニットを一つ以上備えたプレートと前記プレートの両面を覆うように形成されたフィルムとからなる生体サンプル分析用プレートにおいて、
一端が前記流路ユニットの任意のチャンバーと接続し他端が前記プレートの壁面で開口されている空気抜き流路を備えた生体サンプル分析用プレート。
前記任意のチャンバーは、前記フィルムで覆われた開口部を有する請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
前記空気抜き流路と前記任意のチャンバーとの接続部は、前記開口部よりも前記軸心方向側の位置に形成された請求項２に記載の生体サンプル分析用プレート。
前記プレートは両面に流路が形成されている請求項１記載の生体サンプル分析用プレート。
前記任意のチャンバーは、生体サンプルを保持するために使用される請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
前記任意のチャンバーは、前記生体サンプルを注入するための注入口を持ち、前記注入口は前記生体サンプルを注入する前は前記フィルムによって覆われている請求項５に記載の生体サンプル分析用プレート。
前記空気抜き流路と前記任意のチャンバーとの接続部は、前記注入口よりも前記軸心方向側の位置に形成された請求項５に記載の生体サンプル分析用プレート。