JP5691187B2 - 核酸増幅反応用マイクロチップ及びその製造方法 - Google Patents
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Description
酵素の固着層とオリゴヌクレオチドプライマーの固着層との間には、反応緩衝液溶質の固着層を積層してもよい。
この核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法は、前記第一の工程において、前記ウェル内に、酵素溶液を滴下して乾燥した後、オリゴヌクレオチドプライマー溶液を滴下する前に、反応緩衝液溶質溶液を滴下して乾燥する手順を含むことが好適となる。
また、この核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法は、前記第二の工程において、前記基板層の表面を、酸素プラズマ処理又は真空紫外光処理により活性化する手順を含むことができる。
1.核酸増幅反応用マイクロチップ
2.核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法
(2−1)基板層a1の成形
(2−2)ウェルへの酵素・プライマーの固着化
(2−3)基板層a1,a2の表面活性化と貼り合せ
本発明に係る核酸増幅反応用マイクロチップ(以下、単に「マイクロチップ」とも称する)の上面模式図を図1に、断面模式図を図2に示す。図2は、図1中P−P断面に対応する。
また、これらの試薬を積層する順序は、例えば、「オリゴヌクレオチドプライマー、dNTP、酵素、バッファー溶質」の順や「バッファー溶質、酵素、dNTP、オリゴヌクレオチドプライマー」の順など、任意の順序とできる。
さらに、これらの試薬の一部、例えばプライマーとバッファー溶質や、プライマーとdNTPは混合されて固着化されてもよい。
ウェル内には、増幅核酸鎖を得るために必須ではないが、蛍光試薬(蛍光色素)やリン光試薬(リン光色素)などの増幅核酸鎖の検出及び定量のために必要な試薬を、必要に応じて固着化させておくこともできる。
また、反応に必要な全ての試薬を予めウェル内に固着化しておけば、標的核酸鎖のみを含むサンプル溶液を供給するだけで反応を開始できるため、一層分析が簡便となる。
続いて、図5に示すフローチャートを参照して、本発明に係るマイクロチップの製造方法を説明する。以下、上述のマイクロチップAを例に説明する。
図5中、符号S1は、基板層a1の成形工程である。本工程では、基板層a1に、導入口1、主流路2、分岐流路3、ウェル41,42,43及び排出口5を成形する。基板層a1への導入口1等の成形は、例えば、ガラス製基板層のウェットエッチングやドライエッチングによって、あるいはプラスチック製基板層のナノインプリントや射出成型、切削加工によって行うことができる。
符号S2は、ウェルへの酵素の固着化工程である。また、符号S3は、ウェルへのプライマーの固着化工程である。工程S2,S3は、ウェル内に、反応に必要な複数の試薬を所定の順序で積層して固着化する工程(第一の工程)に相応する。
また、これらの試薬を積層する順序は、例えば、「プライマー、dNTP、酵素、バッファー溶質」の順や「バッファー溶質、酵素、dNTP、プライマー」の順など、任意の順序とできる。
さらに、これらの試薬の一部、例えばプライマーとバッファー溶質や、プライマーとdNTPは混合されて固着化されてもよい。
酵素とプライマーの混合を防止するため、工程S3では、マイクロチップを予め低温(−10℃程度)に保持し、滴下したプライマー溶液が凍結され、凍結乾燥されるようにすることが好ましい。
あるいは、マイクロチップを予め低温に保持し、水を滴下して凍結させた後にプライマー溶液を滴下して凍結乾燥を行い、さらに常温乾燥により氷の中間層を蒸発させる方法を用いてもよい。
さらに、より好適には、マイクロチップを予め低温に保持し、バッファー溶質溶液を滴下して凍結乾燥を行い、酵素Eの固着層の上層にバッファー溶質Bの固着層を積層し、その後、プライマー溶液を滴下して風乾、真空乾燥あるいは凍結乾燥を行ってもよい。これにより、各ウェル内には、酵素固着層とプライマー固着層との間に、バッファー溶質固着層が積層された3層構造が形成される(図6参照)。
なお、これらの方法は、プライマー固着層の上層に酵素固着層を積層する場合にも、プライマーの混合を防止するために採用され得る。
符号S4は、基板層a1,a2表面の活性化工程である。また、符号S5は、基板層a1,a2の貼り合せ工程である。工程S4,S5は、試薬が積層されて固着化された基板層の表面を活性化し、貼り合わせる工程(第二の工程)に相応する。
また、基板層の表面を、酸素プラズマ処理又は真空紫外光処理により活性化して貼り合せる方法も採用できる。ポリジメチルシロキサン等のプラスチックとガラスは親和性が高く、表面を活性化処理して接触させると、ダングリングボンドが反応して強固な共有結合であるSi−O−Siシラノール結合を形成し、十分な強度の接合が得られる。酸素プラズマ処理又は真空紫外光処理は、基板層の材料に応じて適宜な条件を設定して行う。
E 酵素
P1,P2,P3 プライマー
1 導入口
2 主流路
3 分岐流路
41,42,43 ウェル
5 排出口
Claims (5)
- 外部から液体が導入される導入口と、
核酸増幅反応の反応場となる複数のウェルと、
導入口から導入される液体を各ウェル内に供給する流路と、が配設され、
各ウェル内に、反応に必要な複数の試薬が所定の順序で積層されて固着化されており、
オリゴヌクレオチドプライマーの固着層が、酵素の固着層よりも上層に積層された核酸増幅反応用マイクロチップ。 - 酵素の固着層とオリゴヌクレオチドプライマーの固着層との間に、反応緩衝液溶質の固着層が積層された請求項1記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
- 核酸増幅反応の反応場となる複数のウェルが形成された基板層のウェル内に、反応に必要な複数の試薬を所定の順序で積層して固着化する第一の工程と、
前記試薬が積層されて固着化された基板層の表面を活性化し、貼り合わせる第二の工程を含み、
前記第一の工程において、前記ウェル内に、酵素溶液を滴下して乾燥した後、オリゴヌクレオチドプライマー溶液を滴下して乾燥する手順を含む核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。 - 前記第一の工程において、前記ウェル内に、酵素溶液を滴下して乾燥した後、オリゴヌクレオチドプライマー溶液を滴下する前に、反応緩衝液溶質溶液を滴下して乾燥する手順を含む請求項3記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
- 前記第二の工程において、前記基板層の表面を、酸素プラズマ処理又は真空紫外光処理により活性化する手順を含む請求項4記載の核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法。
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