WO2002009877A1 - Dispositif pour l'amplification en châine thermo-dependante de sequences d'acides nucleiques cibles - Google Patents

Dispositif pour l'amplification en châine thermo-dependante de sequences d'acides nucleiques cibles Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to the field of genetics.
  • the present invention relates to a device for the amplification of target nucleic sequences, reaction cartridges usable in this device, and modes of use of this device.
  • the object of the present invention is in particular to allow the detection and, where appropriate, the quantification in real time, of target nucleic acid sequences in one or more samples.
  • Detection of target nucleic acid sequences is a technique that is increasingly used in many fields, and the range of applications of this technique is expected to widen as it becomes more reliable, more economical and more fast.
  • the detection of certain nucleic acid sequences allows in certain cases a reliable and rapid diagnosis of viral or bacterial infections.
  • the detection of certain genetic particularities can make it possible to identify susceptibilities to certain diseases, or to establish an early diagnosis of genetic or neoplastic diseases.
  • the detection of target nucleic sequences is also used in the food industry, in particular to ensure the traceability of products, to detect the presence of genetically modified organisms and identify them, or to carry out sanitary control of food.
  • Detection methods based on nucleic acids almost systematically involve a molecular hybridization reaction between a target nucleic sequence and one or more sequences nucleic acids complementary to said target sequence. These methods have many variants, such as the techniques known to those skilled in the art under the terms “transfer techniques” (blot, dot blot, Southern blot, Restriction Fragment Length Polymorphism, etc.), or even like miniaturized systems on which the sequences complementary to the target sequences are prefixed (“biochips"). In the context of these techniques, the complementary nucleic sequences are generally called probes.
  • Another variant which can constitute in itself the basis of a diagnostic process or be only an additional step in one of the techniques mentioned above (in particular in order to increase the concentration of the target sequence and therefore the sensitivity of the diagnosis), consists in amplifying the targeted nucleic acid sequence.
  • ACP Amplification in Chain by Polymerase
  • PCR PCR Reaction
  • PCR reactions involve a repetition of cycles, the number of which generally varies from 20 to 50, and which are each composed of three successive phases, namely: denaturation, hybridization, elongation.
  • the first phase corresponds to the transformation of double-stranded nucleic acids into single-stranded nucleic acids
  • the second phase to molecular hybridization between the target sequence and the primers complementary to said sequence
  • the third phase to the elongation of the hybridized complementary primers to the target sequence, by DNA polymerase.
  • These phases are carried out at specific temperatures: generally 95 ° C for denaturation, 72 ° C for elongation, and between 30 ° C and 65 ° C for hybridization, depending on the hybridization temperature (Tm) of the primers. used. It is also possible to perform the hybridization and elongation stages at the same temperature (generally 60 ° C).
  • a PCR reaction therefore consists of a series of repetitive thermal cycles during which the number of target DNA molecules serving as template is theoretically doubled at each cycle.
  • the PCR yield is less than 100%, so that the quantity of product X n obtained after n cycles is:
  • X n - ⁇ is the quantity of product obtained in the previous cycle, and r n the yield of the PCR in cycle n (0 ⁇ r n ⁇ 1).
  • the yield r decreases during the PCR reaction, due to several factors, such as a limiting quantity of at least one of the reagents necessary for the amplification, the inactivation of the polymerase by its repeated passages at 95 ° C, or its inhibition by the pyrophosphates produced by the reaction.
  • log (X n ) log (X 0 ) + n log (1 + r)
  • the measurement in real time, of the quantity of product obtained can therefore make it possible to know the initial concentration of matrix, which is particularly useful in a large number of applications, for example for measuring the viral load of a patient, or still to know the variability of a transcriptome.
  • PCRs involve reaction volumes ranging from 2 to 50 ⁇ l and are carried out in tubes, microtubes, capillaries or systems known to those skilled in the art under the term "microplates" (in fact sets of integral micro tubes).
  • microplates in fact sets of integral micro tubes.
  • Random Amplified Polymorphism DNA either by the use of specific primers but in greater number, each pair of primers used allowing the amplification of a target sequence.
  • These multiplex amplifications correspond to special cases and are not the norm. Of moreover, they do not guarantee the absence of interactions from one amplification reaction to another, and for reasons in particular of possible hybridizations between the primers, can only be very limited in the number of target sequences amplified by container.
  • probes that can be used to carry out kinetic PCRs include the TaqMan TM system (ABI ® ), the AmpliSensor TM system (InGen), and the Sunrise TM system (Oncor ® , Appligène ® ).
  • the most commonly used system is the Taq Man TM system.
  • This process combines the DNA polymerase and 5 '- »3' nuclease activities of Taq polymerase during PCR. Its principle is as follows: in addition to the two primers of sequence complementary to that of the target to be quantified, a probe, called reporter probe, is added to the reaction medium. It has the ability to hybridize to the target in the body of the amplified sequence, but cannot be amplified itself. Indeed, a phosphoryl group added to the 3 'end of the probe prevents its extension by Taq polymerase. A fluorescein derivative and a rhodamine derivative are incorporated into the probe, respectively at the 5 'and 3' ends. The probe is small, so the rhodamine derivative, located near the fluorescein, absorbs the energy emitted by the fluorescein subjected to an excitation source (quenching phenomenon).
  • the Taq DNA polymerase attacks the probe by its 5 ′ activity nuclease, releasing the quencher group and thus restoring the fluorescence emission.
  • the intensity of the fluorescence emitted is then proportional to the quantity of PCR products formed, which makes it possible to obtain a quantitative result.
  • the fluorescence emitted is proportional to the number of starting target molecules. The kinetics of fluorescence development can be followed in real time during the amplification reaction.
  • a device for carrying out this technique is sold by the company Perkin-Elmer.
  • This device combines a thermocycler and a fluorimeter. It is capable of detecting the increase in fluorescence generated during a quantification test according to the TaqMan TM process, this thanks to optical fibers located below each tube and connected to a CCD camera which detects, in real time , the signal emitted by the fluorescent groups released during the PCR.
  • the quantitative data are deduced from the determination of the cycle at which the signal of the amplification product reaches a certain threshold determined by the user.
  • the objective of the present invention is to propose such a system which makes it possible to considerably reduce the number of manipulations necessary for the implementation of an amplification method on a plurality of target sequences and, consequently, to reduce the time necessary for this operation.
  • Another objective of the present invention is to propose such a system which minimizes the risks of contamination from one container to another.
  • Another objective of the present invention is to propose such a system which reduces the volumes of reagents involved and therefore the costs.
  • Another objective of the present invention is to propose such a system which optimizes a homogeneous distribution in volume and in concentration of the reagents necessary for the PCR in the containers.
  • Another objective is to provide all potential users, in particular hospitals, medical analysis laboratories, food manufacturers and health control laboratories, with a device for easy use and maintenance, in order to carry out routine quantified nucleic acid amplifications in real time.
  • a "nucleic acid amplification reaction” refers to any method of nucleic acid amplification known to those skilled in the art.
  • ACP Amplification in Chain by Polymerase
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • TMA transcription mediated amplification
  • NASBA nucleic acid sequence based amplification
  • 3SR self sustained sequence replication
  • amplification by strand displacement or SDA (strand displacement amplification) and LCR (ligase chain reaction).
  • the initial amplification template can be any type of nucleic acid, DNA or RNA, genomic, plasmid, recombinant, cDNA, mRNA, ribosomal RNA, viral RNA or the like.
  • a first reverse transcription step is generally carried out to obtain a DNA template. This step will generally not be mentioned in this text, because the person skilled in the art knows exactly when and how to carry it out. It is understood that the devices of the invention can be used to amplify and possibly specifically quantify RNA as well as DNA sequences.
  • PCR will therefore be the generic term used to designate both the PCR proper as well as RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction).
  • One of the objectives of the present invention is to provide a new device for carrying out so-called “quantitative” amplification reactions, that is to say making it possible to determine the concentration of target sequence initially present in the reaction mixture.
  • quantitative amplification reactions Several types of quantitative amplification reactions have been described. We can distinguish quantitative amplifications based on the use of an external standard, competitive amplifications, using an internal standard, and finally kinetic amplifications, the principle of which was mentioned above, and which consist in measuring in real time, increasing the amount of the target sequence.
  • This type of amplification will be designated here indifferently under the terms “kinetic amplification (of nucleic acids)” “kinetic PCR”, “amplification (of nucleic acids) quantified in real time", or even “PCR in real time”. The terms in parentheses are sometimes omitted.
  • the term "reagent must be understood broadly, as designating any element necessary either for the amplification reaction itself, or for its detection.
  • the salts, the dNTPs, the primers or even polymerase are reagents necessary for PCR.
  • a fluorescent intercalator, or a probe are here considered as reagents participating in the detection of amplified products, although they do not react literally.
  • Figure 1 shows a side view of a simplified embodiment of the device according to the present invention
  • Figure 2 shows a top view of the heating plate, in the case where the blocks (21 to 23) are disk sectors ( Figure 2A), and in the case where they consist of crown sectors
  • Figure 3 shows a perspective view of a first embodiment of the cartridge (1), provided with reaction chambers and part of the displacement means; • Figure 4 shows a sectional view of this cartridge along the line AA;
  • Figure 5 shows an upper view of the lower part (base) of a second particular embodiment of the cartridge according to the invention. The ratings are given for information only, and are in no way limiting;
  • Figure 6 shows a sectional view of this lower cartridge, along line AA of Figure 5;
  • Figure 7 shows a top view of the upper part (cover) of the cartridge shown in Figures 5 and 6; • Figure 8 shows a sectional view of this upper cartridge, along line BB of Figure 7;
  • FIG. 11A represents a cartridge (1) comprising 8 sub-tanks (111 to 118) and 40 reaction chambers Only the 5 channels connected to the sub-tank 111 are shown, as well as the corresponding reaction chambers (13).
  • FIG. 11B illustrates a device of the invention comprising a rectangular cartridge (1) and a heating plate (2) made up of three parallel elements (21 to 23). In FIG. 11C, the element (22) is offset relative to the others; the cartridge must therefore move along a triangle to perform the PCR cycles;
  • Figure 12 shows a schematic section of a channel (12) having a "pressure drop” device.
  • the invention relates firstly to any device for carrying out enzymatic and / or molecular biology reactions requiring at least two different incubation temperatures, characterized in that it comprises: at least one plate or cartridge (1) having a plurality reaction chambers (13) and a reservoir (11), said reaction chambers being connected to the reservoir by channels (12); - at least one heating plate (2) having at least two distinct zones which can be brought to at least two different temperatures; means (3) for relative movement between said cartridge and said plate, allowing a cyclic variation of the temperature of the reaction chambers.
  • the temperature of each zone of the plate can be homogeneous or, if necessary, this temperature can vary according to a gradient.
  • Several types of molecular biology reactions require placing the reaction mixture at different temperatures over time. This is the case for example when one wishes to inactivate an enzyme after having used it (for example, a restriction nuclease), or to test the stability of a complex.
  • a complex for example, an antigen / antibody complex, or receptor / ligand
  • the board is then programmed to present several temperatures in ascending order, if necessary in the form of a gradient.
  • the stability of the complex is then tested by moving the cartridge on the stage, so that the temperature of the reaction chamber rises gradually, and by observing the increase in fluorescence, using excitation means. / measurement of the fluorescence placed opposite the reaction chamber.
  • the increase in fluorescence then reflects the dissociation of the complex.
  • the device of the invention is particularly suitable for reactions requiring a cyclic variation of the temperature of the reaction chambers, which is the case for certain nucleic acid amplification reactions, for example for polymerase chain reaction (PCR), or for the chain reaction by ligase (LCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • LCR chain reaction by ligase
  • the invention therefore relates in particular to a device for the amplification in a heat-dependent chain of target nucleic acid sequences, characterized in that it comprises: at least one cartridge (1) having a plurality of reaction chambers (13 ) and a tank (11), said reaction chambers being connected to the tank by channels (12); at least one heating plate (2) having at least two distinct zones which can be brought to at least two different temperatures, corresponding to the phases of the amplification cycles of said target nucleic acids; - means (3) for relative movement between said cartridge and said plate, allowing a cyclic variation of the temperature of the reaction chambers.
  • Such a system according to the invention is less complex than the systems of the prior art, in so far as the temperatures necessary for the cycles of the chain amplification are ensured by distinct zones of constant temperatures and not by a plate whose must vary the temperature.
  • thermo-dependent chains require the passage of the samples at at least two temperatures.
  • LCR requires at each cycle a phase at around 95 ° C to denature the target DNA, then a phase between 55 and 65 ° C (depending on the Tm of the probes), to give rise to hybridization / ligation .
  • each cycle is generally broken down into three phases, namely denaturation at around 95 ° C, hybridization whose temperature depends on the Tm of the probes, and elongation, usually carried out at 72 ° C . It is however possible to carry out PCRs with simplified cycles, in which the hybridization and the elongation are carried out at the same temperature, so that each cycle requires only two different temperatures.
  • the system comprises the following characteristics: primers specific to target sequences to be amplified are pre-distributed in the reaction chambers (13), the reservoir (11) is intended to receive a fluid composed in particular of a sample of nucleic acids to be analyzed and of the reagents necessary for a reaction polymerase chain amplification, with the exception of the primers, the heating plate (2) has three distinct zones which can be brought to three different temperatures, corresponding to the three phases of the polymerase chain amplification cycles.
  • the reaction chambers (13) may contain reagents necessary for a real-time PCR reaction other than the primers mentioned above.
  • the reaction chambers also comprise, in addition to the primers, one or more probe (s) specific for the sequence to be amplified.
  • the distribution of the probes in the reaction chambers can also be such that certain chambers comprise probes specific for the sequences to be amplified and other chambers comprise control probes, not a priori recognizing the sequence to be amplified. These probes can be labeled and, if several probes are present in the same reaction chamber (for example a probe specific for the sequence to be amplified and a control probe), these probes will preferably be labeled with different fluorophores.
  • additional reagents such as dNTPs or salts, are initially deposited in the reaction chambers. These reagents will then be absent, or present in a smaller quantity, in the fluid deposited in the reservoir (11).
  • all the reagents necessary for the PCR reaction with the exception of the matrix, are deposited in the reaction chambers (13), and the fluid deposited in the reservoir (11) will then comprise only the sample d 'DNA (or RNA) to be amplified.
  • the device of the invention is also suitable for this type of manipulation.
  • the samples are deposited in the reaction chambers (13).
  • the primers can be introduced into the fluid deposited in the reservoir (11), with the other reagents necessary for the PCR.
  • this configuration also does not exclude that certain reagents other than the sample to be analyzed is pre-deposited in the reaction chambers (13).
  • each reagent deposited in the reaction chambers (13) can advantageously be deposited therein by a simple liquid deposition, followed by drying.
  • the arrival of the fluid from the reservoir (11) then allows the re-solution of these reagents.
  • the quantity of each reagent deposited is calculated as a function of the volume of fluid which will penetrate into each reaction chamber (13), so that the re-solution of the reagents results in the final concentration desired for each of them.
  • Cartridges as described above, in which at least part of the reaction chambers (13) comprise reagents which have been loaded therein by a liquid deposit, followed by drying, so that these reagents are put back into solution by the arrival of a fluid in these reaction chambers, are also an integral part of the invention.
  • the device described above has the advantage of allowing concomitant filling of all the reaction chambers, which reduces the preparation time and the risks of contamination from one chamber to another.
  • This device also has the advantage of being able to be miniaturized and of involving the use of smaller volumes of reagents than in the prior art.
  • the invention makes it possible to accelerate the PCR cycles, since it is not necessary to carry out the different phases
  • the invention also relates to a device for the amplification in a heat-dependent chain of target nucleic acid sequences, measured in real time, characterized in that it comprises the same elements as any of the devices described above. above, and further comprising optical means (5) for excitation / measurement of fluorescence, arranged so as to excite and measure the fluorescence of the contents of the reaction chambers at each cycle.
  • the element indifferently called plate or reaction cartridge (1) is the element indifferently called plate or reaction cartridge (1).
  • This element can be recyclable or, preferably, consumable, and constitutes in itself an aspect of the present invention.
  • the invention also relates to a reaction cartridge comprising several reaction chambers (13) and at least one reservoir (11) and having the following characteristics: - each reaction chamber is connected to the reservoir by a channel (12) having a cross section included in a circle with a diameter of less than 3 mm, the capacity of the reservoir is less than 10 ml, the arrangement of the reaction chambers and the channels with respect to the reservoir makes it possible to distribute a fluid homogeneously in the reaction chambers, from the reservoir .
  • the diameter of the channels will preferably be chosen small enough not to allow gravity distribution of the fluid present in the tank in the reaction chambers, so as to avoid non-reproducible filling of these chambers. This diameter will thus preferably be less than or equal to about 0.2 mm. Regarding this diameter, it will be noted that the section of the channels will preferably be circular but that it may also be of any other shape and in particular polygonal, the "diameter" of the channels then targeting their greatest width in section.
  • the reservoir intended to receive the sample of nucleic acids and the reagents necessary for the PCR may have a variable capacity, ranging for example between approximately 0.1 ml and approximately . 1 ml.
  • the cartridge preferably comprises between approximately 20 and approximately 500 reaction chambers and, more preferably, between 60 and 100 reaction chambers.
  • these chambers may also vary according to the embodiments.
  • these chambers have a volume of between approximately 0.2 and 50 ⁇ l, preferably between 1 ⁇ l and 10 ⁇ l.
  • the junction between the channels (12) and the reservoir (11) is preferably made at the periphery of the reservoir, and the bottom of said reservoir is inclined and / or convex, so as to ensure distribution. of a fluid contained in the reservoir at the inlet of the channels.
  • a cartridge according to the invention can have multiple shapes.
  • this cartridge has a circular shape, the reservoir then being provided substantially in the center of the cartridge, the reaction chambers being distributed in a circle around the reservoir, and the channels connecting the reservoir to the chambers being provided essentially radially.
  • Such architecture optimizes the filling of the reaction chambers from the central tank.
  • the bottom of the tank (11) is conical.
  • reaction chambers are provided relative to the periphery of said cartridge.
  • said reaction chambers are provided relative to the periphery of said cartridge.
  • such a cartridge comprises as many channels as reaction chambers.
  • provision may be made for sections of channels common to several reaction chambers.
  • the cartridge when it has a geometry of revolution, preferably has a diameter of between approximately 1 and 10 cm.
  • a cartridge according to the invention may have a translation geometry, in which the reservoir (11) is placed on one side of said cartridge, the reaction chambers (13) are aligned on the other side of the cartridge, and the channels (12) connecting the tank to the chambers are essentially parallel to each other.
  • the general shape of such a cartridge is then essentially rectangular, apart from certain protrusions and / or hollows intended to connect the cartridge to means capable of setting it in motion.
  • An example of such a cartridge is shown in FIG. 11 A.
  • the bottom of the tank (11) is preferably an inclined plane, which makes it possible to direct the reaction fluid towards the inlet of the channels (12).
  • a variant of the cartridges of the invention described above consists in dividing the tank (11) into 2 to 20, preferably 2 to 8 sub-tanks, making it possible to analyze several samples simultaneously on a same cartridge.
  • each of the reaction chambers (13) is connected to only one of these sub-tanks by a channel (12).
  • An example of this variant is shown in Figure 11 A.
  • the cartridge shown in this figure has eight sub-tanks numbered 111 to 118, each of these sub-tanks being connected to five reaction chambers (13) via five channels (12) . In this figure, only the channels connected to the sub-tank 111 are shown. It is important to note here that in all of the above and what follows, the "reservoir (11)" denotes both the reservoir (11) as a whole and a sub-reservoir.
  • the depth of the reaction chambers can also vary depending on the embodiments of the invention. According to a preferred variant, these chambers have a depth of between approximately 0.5 mm and 1.5 mm.
  • this cartridge depends on several factors and in particular on the material constituting it.
  • this cartridge is preferably made of plastic, preferably polycarbonate, the physical, optical and thermal properties of which are suitable for carrying out the present invention.
  • the thickness of the cartridges of the invention is preferably between 0.5 and 5 mm.
  • the thickness of the "floor” of these should preferably be as small as possible. This thickness depends on the material used to make the cartridge. Preferably, it is between 0.05 and 0.5 mm, for example around 0.25 mm.
  • the reaction chambers of the cartridges of the invention are preferably closed by a transparent upper wall (17), for example made of transparent plastic, in order to allow the excitation and the measurement of the fluorescence of the reaction fluid, under good conditions.
  • the chambers are provided with vents (open system), allowing the air which they contain to escape when they are filled with the fluid coming from the reservoir.
  • the channels (12) preferably consist of at least two parts of different diameters (121 and 122), the diameter of the second part (122) being lower than that of the first part (121), so as to create a pressure drop in the channel (12).
  • the pressure drop phenomenon makes it possible to stop the progression of the fluid in the channel or channels of which the first part (121) is filled, until all channels are filled in the same way. This makes it possible to “pre-calibrate” the volumes for each channel, in order to ensure a homogeneous filling of the different reaction chambers.
  • the second part of the channel (122) can consist for example of a glass capillary, of much smaller diameter than the first part (121), said capillary being included in a plastic cartridge.
  • the cartridges described above intended either for use in an open system, or for use in a closed system, preferably have an opening adaptable to means (4) for modulating the pressure in the reservoir (11), making it possible to move the fluid present in the tank to the reaction chambers.
  • the invention also relates to a method for filling the reaction chambers (13) in a closed system with a cartridge (1) as described in the preceding paragraph, in the variant where the reaction chambers are closed, which method comprises the following steps: at least partially fill the reservoir (11) with a fluid, connect the cartridge (1) to the means (4) for modulating the pressure, - apply a vacuum to the interior of the cartridge, then restore the pressure.
  • each channel (12) is equipped with an anti-reflux cavity (123) at its junction with the tank (1 1), said anti-reflux cavity consisting of a substantially vertical channel portion, with a diameter greater than or equal to that of the channel (12).
  • This variant has two main advantages. On the one hand, these anti-reflux cavities make it possible to prevent cross contamination in the event of untimely return of fluid to the reservoir (11), or in the event that all of the fluid has not engaged in the channels. On the other hand, these cavities make it possible to provide, in the devices of the invention, a plug whose serrations come to marry these vertical inlets, in order to block the channels after the addressing of the reaction fluid but before the amplification reaction.
  • each of the reaction chambers (13) comprises oligonucleotides. More preferably, each of the reaction chambers (13) comprises two primers specific for a nucleic acid sequence to be amplified and, optionally, one or more labeled probe (s) specific for said sequence.
  • a probe can be labeled so that its signal increases when it hybridizes to its target sequence (Sunrise TM system), or so that the elongation from a strand on which it is hybridized causes the signal to decrease or increase (AmpliSensor TM system or TaqMan TM system, respectively).
  • probes in the reaction chambers makes it possible to carry out quantified amplifications in real time, with a device of the invention having means (5) for excitation / measurement of fluorescence, as described above.
  • Control probes nonspecific of the sequence to be amplified, and labeled differently from the specific probes, can also be used, to detect possible contaminations.
  • these different probes and primers will preferably be chosen so that their melting temperatures (Tm) be close.
  • Tm melting temperatures
  • the Tm of the different primers will preferably be within the same range of approximately 5 ° C.
  • the various probes will preferably have a Tm comprised in the same interval of
  • the probes will be chosen so that their Tm is greater than that of the primers, the difference between Tm of the different categories of oligonucleotides then preferably being of the order of 5 ° C.
  • the hybridization temperature used to carry out the amplification then corresponds to the lowest of the melting temperatures of the primers.
  • the reaction chambers (13) of the cartridges of the invention may also comprise, in addition to the primers and the probes, if any, one or more other reagents necessary for the PCR reaction or for measuring the amplification. They may be, for example, salts, dNTP, or a fluorescent intercalator of double stranded DNA, of the SybrGreen type (registered trademark). As mentioned above, all of these reagents are advantageously deposited at the level of the reaction chambers (13) by the deposition of a liquid solution, followed by drying.
  • the cartridges are intended for the screening of a large number of samples according to a small number of criteria. This implies that the user of these cartridges can easily deposit his samples in each of the reaction chambers (13).
  • the cartridge may for example have a removable cover which, when removed, gives direct access to the reaction chambers.
  • Such cartridges can also be preloaded and include, at the level of the reaction chambers (13), one or more reagents necessary for amplification and / or for its detection.
  • the devices of the invention mentioned above may include one or more cartridges corresponding to any of the cartridges described above.
  • the separate heating zones of the heating plate (2) are preferably distributed according to disc portions
  • thermoblocks are preferably large enough to also heat part of the channels, as shown for example in FIG. 11, within the framework of a rectangular cartridge.
  • the number of separate heating zones can be two, three, or more.
  • the platinum may have a zone at 95 ° C. for the denaturation of double-stranded nucleic acids, and a zone at 60 ° C. for the hybridization of the primers and the elongation. .
  • the platinum may have a zone at 95 ° C. for the denaturation of double-stranded nucleic acids, and a zone at 60 ° C. for the hybridization of the primers and the elongation. .
  • the stage will present a zone at 95 ° C (denaturation), a zone between 40 and 70 ° C (hybridization of the primers), and a zone at 72 ° C (elongation).
  • the plate can have a number of zones greater than three, for example to temporarily block the reaction at some point in each cycle.
  • the stage can also have a number of zones which is a multiple of two or three, so that one revolution of the cartridge corresponds to several PCR cycles.
  • the relative size of the different heating zones is advantageously chosen in proportion to the desired incubation time for the reaction fluid at the temperature of said zone.
  • thermoblock 21 dedicated to the denaturation step, has an area twice as small as that of the thermoblocks intended for the hybridization and elongation steps (blocks 22 and 23, respectively ).
  • the plate (2) is fixed and the cartridge (1) is moved by means of the displacement means (3).
  • the displacement means (3) allow the rotation of said cartridge and / or of said plate.
  • a conductive element can be provided between the cartridge and the heating plate.
  • said cartridge is in direct contact with said heating plate.
  • said plate is advantageously provided with a coating promoting movement between said cartridge and said plate.
  • a coating may for example be constituted, Teflon (registered trademark).
  • the heating plate of the system can have at least two or three zones which can be brought to distinct temperatures.
  • this plate is made up of two or three separate thermal blocks (“thermoblocks”) connected to means for programming their temperature.
  • thermoblocks 21 to 23
  • the first of these thermoblocks (21) is heated to the denaturation temperature, the second (22) to the hybridization temperature, the third (23) to the elongation temperature.
  • the use of such constant temperature thermoblocks simplifies the production of the heating plate.
  • the means for relative displacement of the cartridge relative to the plate can be produced in multiple forms.
  • the cartridge (1) has on the bottom a central projecting part (181) comprising a notch (182), so that the projecting part (181) is embedded in the heating plate (2) and connects the cartridge (1) with the displacement means (3) at the level of a cleat or axis (32) set in motion by a micromotor (31).
  • the projecting part (181) therefore makes it possible, on the one hand, to position the cartridge relative to a plate (2) such as that shown in FIG. 2B, and on the other hand, to ensure its connection with the setting means. in motion (3).
  • the cartridge has at least one ear (183) and the displacement means (3) include at least one axis (32) cooperating with said ear to instill in said cartridge a rotary movement.
  • the relative mode of movement between the plate and the cartridge may vary according to the embodiments. It could be a displacement at continuous speed or in spurts. The speed of movement may be constant or vary over time.
  • the displacement of the cartridge relative to the plate (2) is preferably done by translation, as described in example 3 and illustrated in FIG. 11.
  • the system according to the invention also comprises optical means for excitation / measurement of the fluorescence, provided for example above or on the side of said cartridge.
  • optical means for excitation / measurement of the fluorescence provided for example above or on the side of said cartridge.
  • these means will constitute a single and fixed system.
  • An advantage of a preferred variant of the invention according to which the cartridge is circular and molten according to a rotary movement is to be able to successively bring each reaction chamber under said optical system, thus reducing its complexity.
  • a tracking system for example located on the cartridge (1), makes it possible to determine at all times which reaction chamber is located opposite the optical system.
  • the means for supplying the fluid present in said reservoir to said reaction chambers can be produced in different forms. As described above, we can distinguish two categories of addressing the fluid to the reaction chambers: addressing in an open system, which implies an increase in pressure at the level of the reservoir and the presence of vents
  • the means (4) for supplying the fluid into the reaction chambers differ depending on the embodiment chosen.
  • the fluid contained in the reservoir is distributed under pressure in the reaction chambers so as to allow uniform filling of these chambers.
  • the supply means (4) preferably include a piston device (41) whose speed of penetration into the tank will be calculated to promote proper filling of the reaction chambers.
  • these supply means include a pump connected so as to increase the pressure in the tank (11).
  • Another preferred variant of the invention involves working in a closed system.
  • the fluid contained in the reservoir is then distributed in the reaction chambers as follows: firstly, a vacuum is created inside the cartridge, if necessary by a piston device or a pump (42), connected this time to reduce the pressure in the cartridge
  • the invention also relates to any method of amplifying nucleic acid using a system as described above, characterized in that it comprises the steps consisting in: at least partially filling the reservoir (11) with a fluid containing a sample of nucleic acids to be analyzed as well as everything necessary for an amplification reaction, except the primers, and optionally, a fluorescent intercalator of the nucleic acids;
  • reagents necessary for the amplification reaction and / or for the detection of the amplification products, and distinct from the primers and probes are pre-distributed in the reaction chambers (13) of the cartridge (1).
  • the fluid introduced into the reservoir (11) then does not contain these reagents.
  • (13) is carried out either by applying a vacuum to the interior of the cartridge, then restoring the pressure (closed system), or by increasing the pressure at the reservoir (11), provided that the reaction chambers are provided with '' vents (open system).
  • Example 1 simplified embodiment of the device of the invention.
  • the system for detecting and quantifying target nucleic acid sequences represented in FIG. 1 comprises a circular cartridge made of plastic material 2 mm thick with a diameter of 5 cm.
  • This cartridge (1) is provided with a central reservoir (11) and will be described in more detail with reference below to FIGS. 3 and 4.
  • the capacity of the reservoir is, in the context of this embodiment, 400 ⁇ l .
  • Its floor is flat but it will be noted that in other embodiments it may be curved to facilitate the passage of the fluid towards the chambers without the formation of air bubbles, in particular at the end of addressing when the tank is almost empty.
  • the system also comprises a heating plate (2) in direct contact with the underside of the cartridge (1) and means (3) for moving the cartridge (1) relative to the heating plate (2).
  • These displacement means include a micromotor (31) connected to two axes (32) which cooperate with two ears (183) of the cartridge (1) to instill in the latter a rotary movement on the heating plate (2), the latter it remains fixed.
  • the system described also includes a piston (41) intended to cooperate with said reservoir (11) as well as an optical device (5) for excitation / fluorescence measurement (emitting source allowing excitation at a given and programmable wavelength and receiver of the emitted fluorescence) fixed and placed above the cartridge (1) and the heating plate (2).
  • a piston (41) intended to cooperate with said reservoir (11) as well as an optical device (5) for excitation / fluorescence measurement (emitting source allowing excitation at a given and programmable wavelength and receiver of the emitted fluorescence) fixed and placed above the cartridge (1) and the heating plate (2).
  • the heating plate (2) consists of three metal blocks (21, 22 and 23) (hereinafter called thermoblocks) in the form of disc portions. It will be noted that in this embodiment, these thermoblocks have substantially the same size but that, in other embodiments, they may have a different size, the size being understood as the angular surface occupied when viewed from above.
  • Each thermoblock (21, 22 and 23) is designed to be able to be brought to a constant and programmable temperature, corresponding to one of the phases (denaturation, hybridization or elongation) of the amplification cycles (PCR), ie generally 94 ° respectively. C for denaturation, 72 ° C for elongation, and between 30-40 and 65-70 ° C for hybridization according to the Tm (hybridization temperature) of the primers used.
  • thermoblocks can be controlled by any means known to those skilled in the art.
  • the cartridge (1) is provided with a central reservoir (11) with a capacity of 400 ⁇ l connected to 36 reaction chambers (13) by as many channels (12), distributed uniformly over the entire periphery of the cartridge (in FIG. 3, we have not shown all of the channels and chambers but only some of them).
  • These reaction chambers (13) are moreover provided with vents (14) opening onto the edge of the cartridge (1).
  • the channels have a diameter of 0.2 mm and the volume of the reaction chambers is 2.5 microliters. In other embodiments, this diameter and this volume may of course be different.
  • this cartridge (1) is also provided with two ears (183) each pierced with an orifice to allow an axis to pass
  • the reaction chambers have a depth of 1 mm. Their floor has a thickness of about 0.2 mm. This thickness is sufficiently small to facilitate good heat exchanges between the chambers (13) and the thermoblocks (21, 22 and
  • reaction chambers (13) are closed in their upper part by a transparent wall (17), also forming the wall of the reservoir (11).
  • the central reservoir (11) is intended to receive the sample of nucleic acids to be analyzed as well as everything necessary for an amplification reaction, and optionally a fluorescent intercalator of the nucleic acids (the assembly is hereinafter referred to as fluid) , with the exception of the primers pre-distributed in each peripheral reaction chamber 10.
  • the user places in the central reservoir 90 ⁇ l (that is to say 36 times 2.5 ⁇ l) of fluid, of which 75 ng of nucleic acids.
  • the reagent concentrations of said fluid are as follows: dNTP: 200 ⁇ M Taq buffer: 1 x MgCI 2 : 1.5 mM Taq: 4U SybrGreen (registered trademark): 1 x
  • Each chamber 10 except a few for negative control purposes, contains two primers specific for a target sequence to be amplified, and optionally one or more labeled probes, allowing a specific subsequent measurement of fluorescence.
  • 10 ng of each primer were distributed in each chamber except in those serving as a negative control.
  • the piston (41) After having partially filled the reservoir (11) with the fluid whose volume is equal to the sum of the volumes of the chambers (the volume of a chamber is defined as being the product of its "floor" surface and its depth), the piston (41) is actuated to distribute this fluid in the plurality of reaction chambers (13).
  • This piston increases the pressure within the reservoir (11) and allows the passage of the fluid in the channels to the chambers.
  • the speed of movement of the piston in the reservoir is approximately 1 mm per second and said movement is stopped at a level which depends on the volume of fluid to be addressed in the chambers.
  • the small diameter of the channels (12) makes it possible to prevent the diffusion of the fluid from the reservoir (11) to the channels (12) and the chambers (13) under the effect of gravity (on this scale, the processes usually negligible as the capillary forces become significant, and in this case sufficient to maintain the fluid in the reservoir). Thanks to the vents (14), the air present in the chambers (13) is evacuated, which ensures filling thereof.
  • thermoblocks (21, 22, 23) are brought to the three temperatures corresponding to the three temperatures of the phases of the PCR (or to slightly higher temperatures taking into account any heat losses between the heating plate (2) and the cartridge 1) and the displacement means (3) are implemented so as to animate with a gyratory movement the cartridge (1) for passing successively and as many times as desired each reaction chamber above the three thermoblocks.
  • the block (21) is brought to the temperature corresponding to the denaturation phase (94 ° C)
  • the thermoblock (22) is brought to the temperature corresponding to the hybridization phase (36 ° C)
  • the thermoblock (23) is brought to the temperature corresponding to the elongation phase (72 ⁇ C).
  • the micromotor (31) of the displacement means (3) is designed to instill a rotation of 10 degrees every 2.5 seconds in the cartridge (1) (i.e. a PCR cycle in 1.5 min).
  • this movement may have a different speed and be continuous instead of being jerky.
  • the optical device (5) is provided above the corresponding block 23 brought to a temperature corresponding to the elongation temperature, and more particularly to a location which corresponds to the end of the elongation phase.
  • the optical device (5) can be placed in a different location, chosen in particular according to the chemistry used. For example, using TaqMan TM chemistry or non-specific fluorescence, it makes sense to perform the measurement at the end of the elongation phase, as described above.
  • the use of Molecular Beacons TM type chemistry implies that the measurement is made rather at the time of hybridization. The system presented makes it possible to rapidly and reproducibly fill a large quantity of reaction chambers and to carry out a PCR and fluorescence measurements on the content thereof at each cycle of the PCR.
  • FIGS. 5 to 10 show an example of a circular cartridge presenting certain modifications compared to the cartridge of example 1.
  • This cartridge is intended for use in a closed system, that is to say that the reaction chambers (13) have no other opening than the arrival of the channel (12).
  • the cartridge consists of two elements which fit into each other: the lower part, or base, is shown in Figures 5 and 6, and the upper part, or cover, is shown in Figures 7 and 8. The assembly of the two is illustrated in Figures 9 and 10.
  • the loading of this cartridge is carried out as follows:
  • the fluid is no longer addressed by an increase in pressure but by vacuum, which presents the advantage of not requiring a vent and therefore working in a closed system.
  • the bottom of the tank has a conical shape allowing the fluid to be distributed around its periphery, that is to say near the entry of the channels.
  • an anti-reflux system consisting of a vertical channel portion (123), which, on the one hand, prevents cross contamination in the event of untimely return of fluid to the central part or in case all the fluid is not engaged in the channel and, on the other hand, once the addressing has been carried out but before the PCR, to plug the channels by means of a stopper including the serrations come to marry these vertical entries, in order to work in a closed system (no contamination, no evaporation).
  • the cartridge is made of plastic, preferably polycarbonate because this polymer has interesting physical, optical and thermal behavior characteristics.
  • the size of the channels is for example 0.4 x 0.2 mm (half moon) in section.
  • the size of the consumable is for example 100 mm (diameter), the number of chambers is 80, the number of sub-tanks is between 1 and 8.
  • the cartridge (1) has a central protruding part (181) on the underside having a notch (182), so that the protruding part (181) is embedded in the heating plate (2) and connects the cartridge (1) with the displacement means (3) at a cleat or axis (32) set in motion by a micromotor (31).
  • the projecting part (181) therefore makes it possible, on the one hand, to position the cartridge relative to a plate (2) such as that shown in FIG. 2B, and on the other hand, to ensure its connection with the setting means. in motion (3).
  • the reaction chambers are loaded with primers specific for target sequences and, where appropriate, with probes of the TaqMan TM type or other specific for said targets.
  • the targets will be viral or bacterial genes, junctions between a transgene and the genome of a plant to detect and / or identify certain GMOs, etc.
  • SybrGreen (registered trademark): 0.1 x
  • the reservoir is no longer central but "on the side", and the movement of the cartridge is no longer necessarily rotary, but can be translational.
  • the addressing and closing mode can be completely the same as in the case of the circular mode described in example 2.
  • the fluids are addressed by increasing the pressure. They enter the first part of the channel (121), the sum of the volumes of which is intended to be slightly less than the volume of sample to be analyzed (of nucleic acid extract).
  • the second part of the channel (122) consists of a glass capillary, of much smaller diameter, included in the plastic system, as illustrated in FIG. 12. Its advantage is to create a phenomenon called pressure drop, allowing a homogeneous filling of the first part of the channels (if one channel fills faster than another when the pressure increases, this phenomenon makes it possible to stop the progression of the fluid in the filled channel (s) until others are in turn).
  • vents themselves opening into enclosures (15) with holes on the top, the interest of which is, on the one hand, to recover without pollution any surplus fluid which would come out through said vents and, on the other hand, to be able to close with an adhesive strip in order to prevent evaporation.
  • the volume (and shape) of the chambers is equal to that of the first part of the channels.
  • the size of the channels is 0.4 mm in diameter, i.e. 1 channel per mm if the space between two channels is 0.6 mm.
  • an 8 cm long cartridge has 80 chambers. Two possibilities can be envisaged to close the channel at the level of the reservoir:
  • the first possibility consists in using, as in Example 2, a serrated plug.
  • the piston which increases the pressure and said plug are then combined.
  • an opening of the piston must be provided
  • the second possibility is to have the oil (in excess) above the fluids. So once the chambers are filled, the canals
  • (121) are at least partially filled with oil, preventing contamination and evaporation.

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Abstract

La présente invention concerne un dispositif pour l'amplification de séquences nucléiques cibles, des cartouches réactionnelles utilisables dans ce dispositif, et des modes d'utilisation de ce dispositif.

Description

Dispositif pour l'amplification en chaîne thermo-dépendante de séquences d'acides nucléiques cibles, mesurée en temps réel.
La présente invention concerne le domaine de la génétique.
Plus précisément, la présente invention concerne un dispositif pour l'amplification de séquences nucléiques cibles, des cartouches réactionnelles utilisables dans ce dispositif, et des modes d'utilisation de ce dispositif.
La présente invention a notamment pour objectif de permettre la détection et, le cas échéant, la quantification en temps réel, de séquences d'acide nucléique cibles dans un ou plusieurs échantillons.
La détection de séquences nucléiques cibles est une technique de plus en plus utilisée dans de nombreux domaines, et l'éventail des applications de cette technique est appelé à s'étendre au fur et à mesure qu'elle deviendra plus fiable, plus économique et plus rapide. Ainsi, en santé humaine, la détection de certaines séquences d'acide nucléique permet dans certains cas un diagnostic fiable et rapide d'infections virales ou bactériennes. De même, la détection de certaines particularités génétiques peut permettre d'identifier des susceptibilités à certaines maladies, ou d'établir un diagnostic précoce de maladies génétiques ou néoplasiques. La détection de séquences nucléiques cibles est aussi utilisée dans l'industrie agroalimentaire, notamment pour assurer la traçabilité des produits, pour détecter la présence d'organismes génétiquement modifiés et les identifier, ou pour effectuer un contrôle sanitaire des aliments.
Les procédés de détection basés sur les acides nucléiques font quasi systématiquement intervenir une réaction d'hybridation moléculaire entre une séquence nucléique cible et une ou plusieurs séquences nucléiques complémentaires de ladite séquence cible. Ces procédés présentent de nombreuses variantes comme les techniques connues de l'homme de métier sous les expressions "techniques de transfert" (blot, dot blot, Southern blot, Restriction Fragment Length Polymorphism, etc.), ou encore comme les systèmes miniaturisés sur lesquels sont préfixées les séquences complémentaires des séquences cibles ("biopuces"). Dans le cadre de ces techniques, les séquences nucléiques complémentaires sont généralement appelées sondes. Une autre variante, qui peut constituer en soi la base d'un procédé de diagnostic ou n'être qu'une étape supplémentaire dans une des techniques mentionnées ci-dessus (afin notamment d'augmenter la concentration de la séquence cible et donc la sensibilité du diagnostic), consiste à amplifier la séquence d'acide nucléique ciblée. Plusieurs techniques permettant l'amplification spécifique d'une séquence d'acide nucléique ont été décrites, dont la plus utilisée est l'Amplification en Chaîne par Polymérase (ACP), ou Polymerase Chain
Reaction (PCR). Dans le cadre de cette dernière technique, des séquences nucléiques complémentaires des séquences cibles, appelées amorces, sont utilisées pour amplifier lesdites séquences cibles.
Les réactions de PCR impliquent une répétition de cycles, dont le nombre varie généralement de 20 à 50, et qui sont composés chacun de trois phases successives, à savoir : dénaturation, hybridation, élongation.
Respectivement, la première phase correspond à la transformation des acides nucléiques bicaténaires en acides nucléiques monocaténaires, la seconde phase à l'hybridation moléculaire entre la séquence cible et les amorces complémentaires de ladite séquence, et la troisième phase à l'élongation des amorces complémentaires hybridées à la séquence cible, par une ADN polymérase. Ces phases sont menées à des températures spécifiques : généralement 95°C pour la dénaturation, 72°C pour l'élongation, et entre 30°C et 65°C pour l'hybridation, selon la température d'hybridation (Tm) des amorces utilisées. Il est aussi possible d'effectuer les étapes d'hybridation et d'élongation à la même température (généralement 60 °C).
Une réaction de PCR consiste donc en un enchaînement de cycles thermiques répétitifs au cours duquel le nombre de molécules d'ADN cible servant de matrice est théoriquement doublé à chaque cycle. En réalité, le rendement de la PCR est inférieur à 100%, si bien que la quantité de produit Xn obtenu après n cycles est :
Xn = X„_ι (1 + r„), où
Xn-ι est la quantité de produit obtenu au cycle précédent, et rn le rendement de la PCR au cycle n (0 < rn < 1).
En considérant le rendement constant, c'est-à-dire identique pour chaque cycle, la quantité de produit Xn obtenu après n cycles à partir d'une quantité initiale X0 est alors :
Xn = Xo (1 + r)n (A)
En réalité, le rendement r diminue au cours de la réaction de PCR, du fait de plusieurs facteurs, tel qu'une quantité limitante d'au moins un des réactifs nécessaires à l'amplification, l'inactivation de la polymérase par ses passages répétés à 95°C, ou son inhibition par les pyrophosphates produits par la réaction.
Du fait de cette diminution du rendement, la cinétique d'une réaction de PCR présente d'abord une phase exponentielle (tant que r est constant), qui évolue ensuite vers une phase de plateau lorsque r diminue.
Au cours de la phase exponentielle, l'équation (A) ci-dessus est valable, et peut aussi s'écrire : log (Xn) = log (X0) + n log (1 + r) Ainsi, dans la phase exponentielle de la PCR, la courbe présentant la quantité de produit, en échelle logarithmique, en fonction du nombre de cycles, et une droite de pente (1 + r) et qui coupe l'axe des ordonnées à une valeur égale au logarithme de la concentration initiale.
La mesure en temps réel, de la quantité de produit obtenu, peut donc permettre de connaître la concentration initiale de matrice, ce qui est particulièrement utile dans un grand nombre d'applications, par exemple pour mesurer la charge virale d'un malade, ou encore pour connaître la variabilité d'un transcriptome.
Généralement, les PCR impliquent des volumes réactionnels allant de 2 à 50 μl et sont effectuées dans des tubes, des microtubes, des capillaires ou des systèmes connus de l'homme de l'art sous le terme "microplaques" (en fait des ensembles de micro tubes solidarisés). Chaque lot de tubes ou de contenants équivalents doit donc être successivement porté aux trois températures correspondant aux différentes phases de la
PCR, et ce autant de fois que de cycles désirés.
L'utilisation de tubes ou de systèmes s'y approchant oblige l'utilisateur à effectuer de multiples manipulations pour préparer autant de tubes et de solutions (connues de l'homme de l'art sous l'expression "mix PCR") que de séquences cibles qu'il souhaite amplifier même à partir d'un échantillon unique d'acides nucléiques, à l'exception , des procédés d'amplification "multiplex", qui permettent l'amplification de plusieurs séquences cibles simultanément dans le même contenant, soit par l'utilisation d'amorces dites peu spécifiques qui peuvent s'hybrider avec plusieurs séquences cibles comme par exemple la technique RAPD -
Random Amplified Polymorphism DNA, soit par l'utilisation d'amorces spécifiques mais en nombre plus important, chaque couple d'amorces utilisé permettant l'amplification d'une séquence cible. Ces amplifications multiplex correspondent à des cas particuliers et ne sont pas la norme. De surcroît, elles ne garantissent pas l'absence d'interactions d'une réaction d'amplification sur une autre, et pour des raisons notamment de possibles hybridations entre les amorces, ne peuvent qu'être très limitées dans le nombre de séquences cibles amplifiées par contenant.
Ces différentes manipulations impliquent de nombreux inconvénients.
En premier lieu, elles sont consommatrices de temps. En second lieu, elles ne sont pas sans risques du point de vue des éventuelles contaminations d'un tube à l'autre ou depuis l'environnement extérieur (poussière, bactérie, aérosol ou tout autre contaminant susceptible de contenir des molécules d'acides nucléiques ou des molécules susceptibles d'influer sur l'efficacité de la réaction d'amplification). De plus, elles n'assurent pas une homogénéité de volume et de concentration en réactifs d'un tube à l'autre. Enfin, elles imposent l'utilisation de volumes manipulables manuellement, généralement supérieurs à 1 μl, ce qui a une incidence sur les coûts liés à la réalisation des PCR, les réactifs utilisés étant chers.
L'utilisation de dispositifs conçus pour automatiser au moins partiellement de telles manipulations permet de pallier certains de ces inconvénients. Toutefois, de tels automates sont relativement chers et leur utilisation ne se trouve donc généralement économiquement justifiée que dans le cas des PCR en grandes séries, par exemple pour le séquençage des génomes.
Il existe aussi certains automates permettant de réaliser des réactions de PCR cinétiques. Comme il a été vu plus haut, la réalisation d'une PCR cinétique nécessite de quantifier en temps réel, et de façon spécifique, la séquence cible amplifiée. L'utilisation d'un intercalant fluorescent dans le mélange réactionnel permet de mesurer l'augmentation de la quantité totale d'ADN double brin dans ledit mélange. Toutefois, cette méthode ne permet pas de discriminer l'amplification de la séquence cible par rapport au bruit de fond ou à une éventuelle amplification non spécifique. Plusieurs systèmes de sondes ont été décrits récemment pour permettre de mesurer spécifiquement l'amplification d'une séquence cible déterminée. Ils sont basés sur des oligonucléotides complémentaires de ladite séquence, et liés à des couples de groupements de fluorophores ou fluorophores/qrueπc/iers, de telle sorte que l'hybridation de la sonde à sa cible et les cycles d'amplification successifs entraînent, suivant les cas, une augmentation ou une diminution de la fluorescence totale du mélange, proportionnellement à l'amplification de la séquence cible.
A titre d'exemples de sondes utilisables pour réaliser des PCR cinétiques, on peut citer le système TaqMan™ (ABI®), le système AmpliSensor™ (InGen), et le système Sunrise™ (Oncor®, Appligène® ).
Le système le plus utilisé actuellement est le système Taq Man™.
Ce procédé associe les activités ADN polymérase et 5'-»3' nucléase de la Taq polymérase au cours de la PCR. Son principe en est le suivant : en sus des deux amorces de séquence complémentaire de celle de la cible à quantifier, une sonde, appelée sonde reporter, est ajoutée dans le milieu réactionnel. Elle a la capacité de s'hybrider à la cible dans le corps de la séquence amplifiée, mais ne peut être amplifiée elle-même. En effet, un groupe phosphoryle ajouté à l'extrémité 3' de la sonde empêche son extension par la Taq polymérase. Un dérivé de la fluorescéine et un dérivé de la rhodamine sont incorporés dans la sonde, respectivement aux extrémités 5' et 3'. La sonde est de petite taille, aussi le dérivé de la rhodamine, situé à proximité de la fluorescéine, absorbe-t-il l'énergie émise par la fluorescéine soumise à une source d'excitation (phénomène de quenching).
Une fois les amorces hybridées à la cible, au cours de la réaction d'extension, la Taq ADN polymérase attaque la sonde par son activité 5' nucléase, libérant le groupement quencher et rétablissant ainsi l'émission de fluorescence. L'intensité de la fluorescence émise est alors proportionnelle à la quantité de produits de PCR formés, ce qui permet d'obtenir un résultat quantitatif. La fluorescence émise est proportionnelle au nombre de molécules cibles de départ. La cinétique de développement de la fluorescence peut être suivie en temps réel au cours de la réaction d'amplification.
Cette technique présente l'avantage d'être facilement automatisable. Un appareil permettant de réaliser cette technique, l'ABI Prism 7700™, est commercialisé par la société Perkin-Elmer. Cet appareil combine un thermocycleur et un fluorimètre. Il est capable de détecter l'augmentation de fluorescence générée au cours d'un test de quantification selon le procédé TaqMan™, ceci grâce à des fibres optiques situées au- dessous de chaque tube et reliées à une caméra CCD qui détecte, en temps réel, le signal émis par les groupes fluorescents libérés au cours de la PCR. Les données quantitatives sont déduites à partir de la détermination du cycle auquel le signal du produit d'amplification atteint un certain seuil déterminé par l'utilisateur. Plusieurs études ont en effet montré que ce nombre de cycles était proportionnel à la quantité de matériel initial (Gibson, Heid et al. 1996; Heid, Stevens et al. 1996; Williams, Giles et al.
1998).
Le nombre d'applications potentielles d'un tel appareil est considérable, tant en santé humaine qu'en agroalimentaire et en contrôle qualité. Malheureusement, l'ABI Prism 7700™ et les quelques autres appareils concurrents commercialisés actuellement sont extrêmement chers. De plus, ils ne peuvent être utilisés que par un manipulateur qualifié. En pratique, de tels appareils ne sont donc utilisés que dans certaines structures très spécialisées. Il existe donc aujourd'hui un réel besoin pour un système d'amplification d'acides nucléiques, le cas échéant mesurée en temps réel, et qui ne présente pas les inconvénients cités ci-dessus de l'état de la technique.
L'objectif de la présente invention est de proposer un tel système qui permette de diminuer considérablement le nombre de manipulations nécessaires à la mise en œuvre d'une méthode d'amplification sur une pluralité de séquences cibles et, en conséquence, de diminuer le temps nécessaire à cette opération.
Un autre objectif de la présente invention est de proposer un tel système qui minimise les risques de contamination d'un contenant à l'autre.
Un autre objectif de la présente invention est de proposer un tel système qui réduise les volumes de réactifs mis en jeu et donc les coûts.
Un autre objectif de la présente invention est de proposer un tel système qui optimise une répartition homogène en volume et en concentration des réactifs nécessaires à la PCR dans les contenants.
Un autre objectif est de fournir à tous les utilisateurs potentiels, notamment aux centres hospitaliers, aux laboratoires d'analyses médicales, aux industriels de l'agroalimentaire et aux laboratoires de contrôle sanitaire, un appareil d'utilisation et de maintenance aisées, pour effectuer en routine des amplifications d'acides nucléiques quantifiées en temps réel.
Dans cette demande, plusieurs termes sont employés, dont la signification est la suivante :
• Une "réaction d'amplification d'acides nucléiques" fait référence à n'importe quelle méthode d'amplification d'acides nucléiques connue de l'homme du métier. On peut citer, à titre d'exemples et de façon non restrictive, l'Amplification en Chaîne par Polymérase (ACP), plus souvent désignée par l'homme du métier sous son acronyme anglophone, PCR (Polymérase Chain Reaction), la TMA (transcription mediated amplification), la NASBA (nucleic acid séquence based amplification), la 3SR (self sustained séquence replication), l'amplification par déplacement de brin, ou SDA (strand displacement amplification) et la LCR (ligase chain reaction).
La matrice initiale de l'amplification peut être n'importe quel type d'acide nucléique, ADN ou ARN, génomique, plasmidique, recombinant, ADNc, ARNm, ARN ribosomal, ARN viral ou autre. Lorsque la matrice initiale est un ARN, une première étape de transcription réverse est en général réalisée pour obtenir une matrice ADN. Cette étape ne sera en général pas mentionnée dans ce texte, car l'homme du métier sait exactement quand et comment la réaliser. Il est bien entendu que les dispositifs de l'invention sont utilisables pour amplifier et éventuellement quantifier spécifiquement des séquences d'ARN aussi bien que d'ADN.
Dans la suite du texte, le terme "PCR" sera donc le terme générique utilisé pour désigner aussi bien la PCR proprement dite que la RT-PCR (Reverse Ttranscription - Polymérase Chain Reaction).
• Parmi les réactions d'amplification citées ci-dessus, certaines sont isothermes. D'autres, notamment la PCR et la LCR, impliquent de porter le mélange réactionnel à différentes températures au cours du temps, de façon cyclique. De telles réactions sont appelées ici "réactions d'amplification d'acides nucléiques thermo-dépendantes". Dans la suite de ce texte, le dispositif de l'invention sera principalement décrit dans son application à la PCR. Toutefois, il est bien évident que ce dispositif n'est pas limité à cette technique, et qu'il peut être utilisé aussi pour n'importe quelle réaction d'amplification d'acides nucléiques, voire pour d'autres réactions enzymatiques et/ou de biologie moléculaire. Ce dispositif est particulièrement adapté aux réactions qui nécessitent des volumes faibles et le passage cyclique du mélange réactionnel à plusieurs températures, comme cela apparaîtra clairement dans la suite.
• Un des objectifs de la présente invention est de fournir un nouveau dispositif pour effectuer des réactions d'amplification dites "quantitatives", c'est-à-dire permettant de déterminer la concentration de séquence cible initialement présente dans le mélange réactionnel. Plusieurs types de réactions d'amplification quantitatives ont été décrits. On peut distinguer les amplifications quantitatives basées sur l'emploi d'un standard externe, les amplifications compétitives, utilisant un standard interne, et enfin les amplifications cinétiques, dont le principe a été évoqué plus haut, et qui consistent à mesurer en temps réel, l'augmentation de la quantité de la séquence cible. Ce type d'amplification sera désigné ici indifféremment sous les termes "amplification cinétique (d'acides nucléiques)" "PCR cinétique", "amplification (d'acides nucléiques) quantifiée en temps réel", ou encore "PCR en temps réel". Les termes entre parenthèses sont parfois omis.
• Dans cette demande, le terme "réactif doit être compris au sens large, comme désignant n'importe quel élément nécessaire soit à la réaction d'amplification proprement dite, soit à sa détection. Suivant cette définition, les sels, les dNTP, les amorces ou encore la polymérase, sont des réactifs nécessaires à la PCR. De même, un intercalant fluorescent, ou une sonde, sont ici considérés comme des réactifs participant à la détection des produits amplifiés, bien qu'ils ne réagissent pas au sens littéral.
D'autres termes désignant certains éléments du dispositif de l'invention seront définis plus loin dans la description détaillée de l'invention.
Certains éléments du dispositif sont numérotés en référence aux dessins, qui illustrent quelques modes et variantes non limitatifs de réalisation l'invention, et dans lesquels : • la figure 1 représente une vue latérale d'une réalisation simplifiée du dispositif selon la présente invention ;
• la figure 2 représente une vue supérieure de la platine chauffante, dans le cas où les blocs (21 à 23) sont des secteurs de disque (figure 2A), et dans le cas où ils sont constitués de secteurs de couronne
(figure 2B);
• la figure 3 représente une vue en perspective d'un premier exemple de réalisation de la cartouche (1), pourvue des chambres réactionnelles et d'une partie des moyens de déplacement ; • la figure 4 représente une vue en coupe de cette cartouche selon la ligne AA ;
• la figure 5 représente une vue supérieure de la partie inférieure (socle) d'un deuxième mode de réalisation particulier de la cartouche selon l'invention. Les cotes sont données à titre purement indicatif, et ne sont en aucun cas limitatives ;
• la figure 6 représente une vue en coupe de cette cartouche inférieure, selon la ligne AA de la figure 5 ;
• la figure 7 représente une vue supérieure de la partie supérieure (couvercle) de la cartouche représentée aux figures 5 et 6 ; • la figure 8 représente une vue en coupe de cette cartouche supérieure, suivant la ligne BB de la figure 7 ;
• la figure 9 représente une cartouche complète, constituée du socle représenté aux figures 5 et 6 (traits pleins), et du couvercle représenté aux figures 7 et 8 (traits discontinus) ; • la figure 10 montre trois modélisations de la cartouche de la figure 9, au-dessus de laquelle se trouvent les moyens d'excitation/mesure de la fluorescence (5) ; • la figure 11 illustre une cartouche rectangulaire et deux modes d'utilisation d'une telle cartouche. La figure 11A représente une cartouche (1) comportant 8 sous-réservoirs (111 à 118) et 40 chambres réactionnelles Seuls les 5 canaux reliés au sous-réservoir 111 sont représentés, ainsi que les chambres réactionnelles (13) correspondantes. La figure 11 B illustre un dispositif de l'invention comportant une cartouche (1) rectangulaire et une platine chauffante (2) constituée de trois éléments parallèles (21 à 23). Dans la figure 11C, l'élément (22) est décalé par rapport aux autres ; la cartouche doit donc se déplacer suivant un triangle pour effectuer les cycles de PCR ;
• la figure 12 montre une coupe schématique d'un canal (12) possédant un dispositif de "perte de charge".
L'invention concerne en premier lieu tout dispositif pour effectuer des réactions enzymatiques et/ou de biologie moléculaire nécessitant au moins deux températures d'incubation différentes, caractérisé en ce qu'il comprend : au moins une plaque ou cartouche (1) présentant une pluralité de chambres réactionnelles (13) et un réservoir (11), lesdites chambres réactionnelles étant reliées au réservoir par des canaux (12) ; - au moins une platine de chauffage (2) présentant au moins deux zones distinctes pouvant être portées à au moins deux températures différentes; des moyens (3) de déplacement relatif entre ladite cartouche et ladite platine, permettant une variation cyclique de la température des chambres réactionnelles.
La température de chaque zone de la platine peut être homogène ou, le cas échéant, cette température peut varier suivant un gradient. Plusieurs types de réactions de biologie moléculaire nécessitent de placer le mélange réactionnel à différentes températures en fonction du temps. Ceci est le cas par exemple lorsqu'on souhaite inactiver une enzyme après l'avoir utilisée (par exemple, une nucléase de restriction), ou pour tester la stabilité d'un complexe. Dans ce dernier cas, on peut envisager de placer un complexe (par exemple, un complexe antigène/anticorps, ou récepteur/ligand), dont l'un des éléments est couplé à un fluorophore et l'autre à un quencher de fluorescence, dans une des chambres réactionnelles du dispositif. La platine est alors programmée pour présenter plusieurs températures dans un ordre croissant, le cas échéant sous forme d'un gradient. La stabilité du complexe est alors testée en déplaçant la cartouche sur la platine, de façon à ce que la température de la chambre réactionnelle s'élève progressivement, et en observant l'augmentation de la fluorescence, à l'aide de moyens d'excitation / mesure de la fluorescence placés en regard de la chambre réactionnelle.
L'augmentation de la fluorescence traduit alors la dissociation du complexe.
Le dispositif de l'invention est particulièrement adapté à des réactions nécessitant une variation cyclique de la température des chambres réactionnelles, ce qui est le cas pour certaines réactions d'amplifications d'acides nucléiques, par exemple pour l'amplification en chaîne par polymérase (PCR), ou pour la réaction en chaîne par ligase (LCR).
L'invention porte donc en particulier sur un dispositif pour l'amplification en chaîne thermo-dépendante de séquences d'acides nucléiques cibles, caractérisé en ce qu'il comprend : au moins une cartouche (1) présentant une pluralité de chambres réactionnelles (13) et un réservoir (11), lesdites chambres réactionnelles étant reliées au réservoir par des canaux (12) ; au moins une platine de chauffage (2) présentant au moins deux zones distinctes pouvant être portées à au moins deux températures différentes, correspondant aux phases des cycles d'amplification desdits acides nucléiques cibles ; - des moyens (3) de déplacement relatif entre ladite cartouche et ladite platine, permettant une variation cyclique de la température des chambres réactionnelles.
Un tel système selon l'invention est moins complexe que les systèmes de l'art antérieur, dans la mesure où les températures nécessaires aux cycles de l'amplification en chaîne sont assurées par des zones distinctes de températures constantes et non par une platine dont on doit faire varier la température.
Il est important de noter que les réactions d'amplification en chaîne thermo-dépendantes nécessitent le passage des échantillons à au moins deux températures. Par exemple, la LCR nécessite à chaque cycle une phase à environ 95°C pour dénaturer l'ADN cible, puis une phase entre 55 et 65°C (en fonction du Tm des sondes), pour donner lieu à l'hybridation / ligation. En ce qui concerne la PCR, chaque cycle se décompose en général en trois phases, à savoir la dénaturation à environ 95°C, l'hybridation dont la température dépend du Tm des sondes, et l'élongation, habituellement réalisée à 72°C. Il est cependant possible de réaliser des PCR ayant des cycles simplifiés, dans lesquels l'hybridation et l'élongation se font à la même température, si bien que chaque cycle nécessite seulement deux températures différentes.
II pourra être envisagé différentes variantes du dispositif décrit ci- dessus. Selon une variante préférentielle de l'invention, le système comprend les caractéristiques suivantes : des amorces spécifiques de séquences cibles à amplifier sont pré-réparties dans les chambres réactionnelles (13), le réservoir (11) est destiné à recevoir un fluide composé notamment d'un échantillon d'acides nucléiques à analyser et des réactifs nécessaires à une réaction d'amplification en chaîne par polymérase, à l'exception des amorces, la platine de chauffage (2) présente trois zones distinctes pouvant être portées à trois températures différentes, correspondant aux trois phases des cycles d'amplification en chaîne par polymérase.
Selon cette variante préférentielle, il est possible de distribuer, à partir d'un réservoir, un fluide contenant un échantillon d'acides nucléiques à analyser et les réactifs nécessaires à la PCR dans une pluralité de chambres réactionnelles contenant des amorces spécifiques de séquences cibles d'acides nucléiques à amplifier, et d'autoriser le processus d'amplification en soumettant le contenu des chambres successivement à différentes températures (à savoir celles nécessaires à la dénaturation, l'hybridation et l'élongation) une multitude de fois grâce à un mouvement relatif entre la cartouche incluant lesdites chambres réactionnelles et ladite platine de chauffage présentant deux ou trois zones distinctes pouvant être portées à des températures différentes.
Le cas échéant, les chambres réactionnelles (13) peuvent contenir des réactifs nécessaires à une réaction de PCR en temps réel autres que les amorces mentionnées ci-dessus. Dans une réalisation préférée du dispositif de l'invention, les chambres réactionnelles comportent également, en plus des amorces, une ou plusieurs sonde(s) spécifique(s) de la séquence à amplifier. La distribution des sondes dans les chambres réactionnelles peut aussi être telle que certaines chambres comportent des sondes spécifiques des séquences à amplifier et d'autres chambres comportent des sondes contrôles, ne reconnaissant pas a priori la séquence à amplifier. Ces sondes peuvent être marquées et, si plusieurs sondes sont présentes dans une même chambre réactionnelle (par exemple une sonde spécifique de la séquence à amplifier et une sonde contrôle), ces sondes seront de préférence marquées par des fluorophores différents.
Dans une autre variante du dispositif, des réactifs supplémentaires, tels que les dNTP ou des sels, sont initialement déposés dans les chambres réactionnelles. Ces réactifs seront alors absents, ou présents en moindre quantité, dans le fluide déposé dans le réservoir (11). Dans le cas extrême, tous les réactifs nécessaires à la réaction de PCR, à l'exception de la matrice, sont déposés dans les chambres réactionnelles (13), et le fluide déposé dans le réservoir (11) comprendra alors uniquement l'échantillon d'ADN (ou d'ARN) à amplifier.
Les variantes décrites ci-dessus supposent que plusieurs réactions soient réalisées en parallèle, avec des amorces et/ou des sondes différentes, sur un même échantillon. Il s'agit donc de la caractérisation d'un échantillon unique (ou dé quelques échantillons si le réservoir est divisé en quelques sous-réservoirs) suivant plusieurs critères. Dans certaines applications, on souhaite au contraire caractériser une multitude d'échantillons suivant un critère unique ou un faible nombre de critères.
Ceci est le cas par exemple en recherche, lorsqu'on souhaite cribler une banque de phages ou de bactéries pour la présence d'un gène donné. Il est dans ce cas nécessaire d'effectuer une PCR sur un grand nombre d'échantillons, à partir d'un couple d'amorces donné. Le dispositif de l'invention est adapté aussi à ce type de manipulations. Pour cela, les échantillons sont déposés dans les chambres réactionnelles (13). Les amorces peuvent être introduites dans le fluide déposé dans le réservoir (11), avec les autres réactifs nécessaires à la PCR. Bien entendu, cette configuration n'exclut pas non plus que certains réactifs autres que l'échantillon à analyser soient pré-déposés dans les chambres réactionnelles (13).
Quelle que soit la variante du dispositif choisie, et quels que soient les réactifs déposés dans les chambres réactionnelles (13), ils peuvent y être déposés avantageusement par un simple dépôt liquide, suivi d'un séchage. L'arrivée du fluide en provenance du réservoir (11) permet ensuite la remise en solution de ces réactifs. La quantité de chaque réactif déposée est calculée en fonction du volume de fluide qui pénétrera dans chaque chambre réactionnelle (13), de telle sorte que la remise en solution des réactifs aboutisse à la concentration finale souhaitée pour chacun d'entre eux. Des cartouches telles que décrites ci-dessus, dans lesquelles au moins une partie des chambres réactionnelles (13) comportent des réactifs qui y ont été chargés par un dépôt liquide, suivi d'un séchage, de telle sorte que ces réactifs soient remis en solution par l'arrivée d'un fluide dans ces chambres réactionnelles, sont également partie intégrante de l'invention.
Le dispositif décrit ci-dessus présente l'avantage d'autoriser un remplissage concomitant de toutes les chambres réactionnelles, ce qui diminue le temps de préparation et les risques de contamination d'une chambre à l'autre. Ce dispositif présente également l'avantage de pouvoir être miniaturisé et d'impliquer l'utilisation de volumes de réactifs plus faibles que dans l'état de la technique.
Enfin on notera aussi que, grâce à la platine de chauffage spécifique qu'elle préconise, l'invention permet d'accélérer les cycles de PCR, puisqu'il n'est pas nécessaire pour effectuer les différentes phases
(dénaturation, hybridation, élongation) de faire varier la température de la platine chauffante ou de l'atmosphère comme dans l'état de la technique, le mouvement relatif entre la cartouche et la platine permettant de soumettre rapidement et successivement le contenu de chacune des chambres réactionnelles à trois températures distinctes dédiées à chacune de ces phases. L'utilisation de faibles volumes réactionnels, et d'un plancher de faible épaisseur pour la cartouche (1), permettent aussi de limiter l'inertie thermique au niveau des chambres réactionnelles, et contribuent donc à la rapidité de la réaction.
L'invention porte également sur un dispositif pour l'amplification en chaîne thermo-dépendante de séquences d'acides nucléiques cibles, mesurée en temps réel, caractérisé en ce qu'il comprend les mêmes éléments que l'un quelconque des dispositifs décrits ci-dessus, et comportant en outre des moyens optiques (5) d'excitation / mesure de la fluorescence, disposés de manière à exciter et mesurer à chaque cycle la fluorescence du contenu des chambres réactionnelles.
Un des éléments particulièrement originaux des dispositifs décrits ci- dessus est l'élément appelé indifféremment plaque ou cartouche réactionnelle (1). Cet élément peut être recyclable ou, de façon préférée, consommable, et constitue en soi un aspect de la présente invention. Ainsi, l'invention porte également sur une cartouche réactionnelle comportant plusieurs chambres réactionnelles (13) et au moins un réservoir (11) et présentant les caractéristiques suivantes : - chaque chambre réactionnelle est reliée au réservoir par un canal (12) ayant une section droite comprise dans un cercle de diamètre inférieur à 3 mm, la capacité du réservoir est inférieure à 10 ml, la disposition des chambres réactionnelles et des canaux par rapport au réservoir permet de répartir un fluide de façon homogène dans les chambres réactionnelles, à partir du réservoir.
Le diamètre des canaux sera préférentiellement choisi suffisamment faible pour ne pas autoriser une distribution par gravité du fluide présent dans le réservoir dans les chambres réactionnelles, ceci de façon à éviter un remplissage non reproductible de ces chambres. Ce diamètre sera ainsi préférentiellement inférieur ou égal à environ 0,2 mm. Au sujet de ce diamètre, on notera que la section des canaux sera préférentiellement circulaire mais qu'elle pourra être également de toute autre forme et notamment polygonale, le "diamètre" des canaux visant alors leur plus grande largeur en section.
Le réservoir destiné à recevoir l'échantillon d'acides nucléiques et les réactifs nécessaires à la PCR pourra présenter une capacité variable, comprise par exemple entre environ 0,1 ml et environ .1 ml.
La cartouche comprend de préférence entre environ 20 et environ 500 chambres réactionnelles et, de manière encore préférée, entre 60 et 100 chambres réactionnelles.
Le volume de ces chambres pourra également varier selon les modes de réalisation. Avantageusement, ces chambres présentent un volume compris entre environ 0,2 et 50 μl, de préférence entre 1 μl et 10 μl.
Dans les cartouches de l'invention, la jonction entre les canaux (12) et le réservoir (11) se fait de préférence à la périphérie du réservoir, et le fond dudit réservoir est incliné et/ou convexe, de façon à assurer la répartition d'un fluide contenu dans le réservoir au niveau de l'entrée des canaux.
On notera qu'une cartouche selon l'invention peut présenter de multiples formes. Toutefois, selon une variante préférentielle de l'invention, cette cartouche présente une forme circulaire, le réservoir étant alors prévu sensiblement au centre de la cartouche, les chambres réactionnelles étant réparties en cercle autour du réservoir, et les canaux reliant le réservoir aux chambres étant prévus essentiellement radialement. Une telle architecture permet d'optimiser le remplissage des chambres réactionnelles à partir du réservoir central.
Dans une réalisation particulière des cartouches circulaires de l'invention, le fond du réservoir (11) est conique.
Egalement préférentiellement, lesdites chambres réactionnelles sont prévues relativement à la périphérie de ladite cartouche. Ainsi, il est possible d'optimiser le nombre de chambres réactionnelles pouvant être prévues sur la cartouche et remplies à partir du réservoir central.
Selon une variante de l'invention, une telle cartouche comprend autant de canaux que de chambres réactionnelles. Toutefois, dans certains modes de réalisation, on pourra prévoir des tronçons de canaux communs à plusieurs chambres réactionnelles.
L'un des avantages de la présente invention est d'autoriser une miniaturisation du dispositif qu'elle propose. Ainsi, avantageusement, la cartouche, lorsqu'elle a une géométrie de révolution, présente de préférence un diamètre compris entre environ 1 et 10 cm.
Alternativement, une cartouche selon l'invention peut posséder une géométrie de translation, dans laquelle le réservoir (11) est placé sur un côté de ladite cartouche, les chambres réactionnelles (13) sont alignées de l'autre côté de la cartouche, et les canaux (12) reliant leréservoir aux chambres sont essentiellement parallèles les uns aux autres. La forme générale d'une telle cartouche est alors essentiellement rectangulaire, mis à part certaines protubérances et/ou creux destinés à relier la cartouche à des moyens capables de la mettre en mouvement. Un exemple d'une telle cartouche est représenté à la figure 11 A. Dans le cas d'une telle cartouche, le fond du réservoir (11) est de préférence un plan incliné, qui permet de diriger le fluide réactionnel vers l'entrée des canaux (12). Une variante des cartouches de l'invention décrites ci-dessus, quelle que soit leur géométrie, consiste à diviser le réservoir (11) en 2 à 20, de préférence 2 à 8 sous-réservoirs, permettant d'analyser simultanément plusieurs échantillons sur une même cartouche. Dans ce cas, chacune des chambres réactionnelles (13) est reliée à un seul de ces sous-réservoirs par un canal (12). Un exemple de cette variante est représenté à la figure 11 A. La cartouche représentée sur cette figure comporte huit sous- réservoirs numérotés 111 à 118, chacun de ces sous-réservoirs étant relié à cinq chambres réactionnelles (13) via cinq canaux (12). Dans cette figure, seuls les canaux reliés au sous-réservoir 111 sont représentés. Il est important de noter ici que dans tout ce qui précède et ce qui suit, le "réservoir (11)" désigne aussi bien le réservoir (11) dans sa globalité qu'un sous-réservoir.
La profondeur des chambres réactionnelles (par rapport aux canaux) peut aussi varier en fonction des modes de réalisation de l'invention. Selon une variante préférentielle, ces chambres présentent une profondeur comprise entre environ 0,5 mm et 1,5 mm.
On notera par ailleurs que l'épaisseur de la cartouche dépend de plusieurs facteurs et notamment du matériau la constituant. En pratique, cette cartouche est préférentiellement constituée en matière plastique, de préférence en polycarbonate, dont les propriétés physiques, optiques et thermiques, sont appropriées pour la réalisation de la présente invention. L'épaisseur des cartouches de l'invention est de préférence comprise entre 0,5 et 5 mm.
Afin de faciliter les échanges thermiques entre le contenu des chambres réactionnelles et la platine, l'épaisseur du "plancher" de celles-ci devra être préférentiellement aussi faible que possible. Cette épaisseur dépend du matériau utilisé pour réaliser la cartouche. Préférentiellement, elle est comprise entre 0,05 et 0,5 mm, par exemple environ 0,25 mm. Les chambres réactionnelles des cartouches de l'invention sont de préférence fermées par une paroi supérieure transparente (17), par exemple en plastique transparent, afin de permettre l'excitation et la mesure de la fluorescence du fluide réactionnel, dans des bonnes conditions.
Dans une réalisation particulière de l'invention, les chambres sont pourvues d'évents (système ouvert), permettant à l'air qu'elles contiennent de s'échapper lors de leur remplissage par le fluide provenant du réservoir.
Dans le cas ci-dessus, où les chambres (13) sont pourvues d'évents (14), les canaux (12) sont préférentiellement constitués d'au moins deux parties de diamètres différents (121 et 122), le diamètre de la deuxième partie (122) étant inférieur à celui de la première partie (121), de façon à créer une perte de charge dans le canal (12). Ainsi, si un canal se remplit plus vite qu'un autre sous l'effet de la pression, le phénomène de perte de charge permet d'arrêter la progression du fluide dans le ou les canaux dont la première partie (121) est remplie, jusqu'à ce que tous les canaux soient remplis de la même façon. Ceci permet de « pré-calibrer » les volumes pour chaque canal, afin d'assurer un remplissage homogène des différentes chambres réactionnelles. La deuxième partie du canal (122) peut être constituée par exemple d'un capillaire de verre, de diamètre beaucoup plus faible que la première partie (121), ledit capillaire étant inclus dans une cartouche en plastique.
Il est aussi possible de prévoir des enceintes (15) dans lesquelles débouchent les évents (14) des chambres réactionnelles. Ces enceintes possèdent une ouverture (16) vers l'extérieur de la cartouche (système ouvert), et présentent l'intérêt, d'une part, de récupérer sans pollution les éventuels surplus de fluide qui sortiraient des chambres réactionnelles par les évents (14) et, d'autre part, de pouvoir se fermer après le remplissage des chambres réactionnelles. Cette fermeture peut se faire par exemple en utilisant une bande adhésive, et permet de passer en système clos pour effectuer l'amplification proprement dite. Ceci permet d'éviter ou au moins limiter l'évaporation du fluide contenu dans la cartouche (1). Cette réalisation de l'invention est détaillée dans l'exemple 3 et illustrée aux figures 11A et 12.
Alternativement, il est possible de travailler en système clos dès le remplissage des chambres réactionnelles, en provoquant dans la cartouche une dépression suivie d'un rétablissement de la pression, comme cela sera détaillé plus loin. Des cartouches dans lesquelles les chambres réactionnelles ne possèdent pas d'autre ouverture que l'arrivée du canal
(12) (chambres réactionnelles dites "closes") font donc également partie de l'invention.
Les cartouches décrites ci-dessus, prévues soit pour un usage en système ouvert, soit pour un usage en système fermé, comportent de préférence une ouverture adaptable à des moyens (4) de modulation de la pression dans le réservoir (11), permettant de déplacer le fluide présent dans le réservoir vers les chambres réactionnelles.
L'invention porte également sur un procédé de remplissage en système clos des chambres réactionnelles (13) d'une cartouche (1) telle que décrite au paragraphe précédent, dans la variante où les chambres réactionnelles sont closes, lequel procédé comporte les étapes suivantes : remplir au moins partiellement le réservoir (11) avec un fluide, connecter la cartouche (1) aux moyens (4) de modulation de la pression, - appliquer une dépression à l'intérieur de la cartouche, puis rétablir la pression.
Dans une variante des cartouches de l'invention, chaque canal (12) est équipé d'une cavité anti-reflux (123) au niveau de sa jonction avec le réservoir (1 1), ladite cavité anti-reflux étant constituée d'une portion de canal sensiblement verticale, d'un diamètre supérieur ou égal à celui du canal (12). Cette variante présente deux principaux avantages. D'une part, ces cavités anti-reflux permettent de prévenir les contaminations croisées en cas de retour intempestif de fluide vers le réservoir (11), ou au cas où tout le fluide ne se serait pas engagé dans les canaux. D'autre part, ces cavités permettent de prévoir, dans les dispositifs de l'invention, un bouchon dont les dentelures viennent épouser ces entrées verticales, afin de boucher les canaux après l'adressage du fluide réactionnel mais avant la réaction d'amplification. Ceci permet de travailler en système parfaitement clos, et donc d'éviter tout risque de contamination et d'évaporation. Toutefois, il est important de noter que les cavités anti-reflux, et l'utilisation d'un bouchon au niveau du réservoir pour boucher l'entrée des canaux du côté du réservoir, peuvent être employées aussi dans le cas de systèmes ouverts tels que décrits ci-dessus, où les chambres réactionnelles sont pourvues d'évents.
Dans une réalisation préférée des cartouches de l'invention, une partie au moins des chambres réactionnelles (13) comporte des oligonucléotides. De façon encore préférée, chacune des chambres réactionnelles (13) comporte deux amorces spécifiques d'une séquence d'acide nucléique à amplifier et, facultativement, une ou plusieurs sonde(s) marquée(s) spécifique(s) de ladite séquence. Une telle sonde peut être marquée de façon à ce que sont signal augmente lorsqu'elle s'hybride à sa séquence cible (système Sunrise™), ou de façon à ce que l'élongation à partir d'un brin sur laquelle elle est hybridée entraîne une diminution ou une augmentation du signal (système AmpliSensor™ ou système TaqMan™ , respectivement). La présence de telles sondes dans les chambres réactionnelles permet de réaliser des amplifications quantifiées en temps réel, avec un dispositif de l'invention disposant de moyens (5) d'excitation / mesure de la fluorescence, tel que décrit plus haut. Des sondes contrôles, non spécifiques de la séquence à amplifier, et marquées d'une façon différente des sondes spécifiques, peuvent aussi être utilisées, pour détecter d'éventuelles contaminations.
Dans la réalisation de l'invention décrite ci-dessus, où les chambres réactionnelles comportent des amorces et, facultativement une ou plusieurs sonde(s), ces différentes sondes et amorces seront choisies de préférence de telle sorte que leurs températures de fusion (Tm) respectives soient proches. En particulier, le Tm des différentes amorces sera de préférence compris dans un même intervalle d'environ 5°C. De même, les différentes sondes auront de préférence un Tm compris dans un même intervalle de
5°C, qui peut être différent de l'intervalle des Tm des amorces. Dans ce cas, les sondes seront choisies de telle sorte que leur Tm soit supérieur à celui des amorces, la différence entre de Tm des différentes catégories d'oligonucléotides étant alors de préférence de l'ordre de 5°C. La température d'hybridation retenue pour effectuer l'amplification correspond alors à la plus basse des températures de fusion des amorces.
Les chambres réactionnelles (13) des cartouches de l'invention peuvent aussi comporter, outre les amorces et les sondes éventuelles, un ou plusieurs autres réactifs nécessaires à la réaction de PCR ou à la mesure de l'amplification. Il peut s'agir, par exemple, de sels, de dNTP, ou d'un intercalant fluorescent de l'ADN double brin, de type SybrGreen (marque déposée). Comme mentionné plus haut, tous ces réactifs sont avantageusement déposés au niveau des chambres réactionnelles (13) par le dépôt d'une solution liquide, suivi d'un séchage.
Selon un mode de réalisation alternatif des cartouches de l'invention, les cartouches sont prévues pour le criblage d'un grand nombre d'échantillons suivant un faible nombre de critères. Ceci implique que l'utilisateur de ces cartouches puisse facilement déposer ses échantillons dans chacune des chambres réactionnelles (13). Pour cela, la cartouche peut par exemple posséder un couvercle amovible qui, lorsqu'il est enlevé, donne accès directement aux chambres réactionnelles. De telles cartouches peuvent aussi être pré-chargées et comporter, au niveau des chambres réactionnelles (13), un ou plusieurs réactifs nécessaire(s) à l'amplification et / ou à sa détection.
Bien entendu, les dispositifs de l'invention mentionnés plus haut peuvent comprendre une ou plusieurs cartouches correspondant à n'importe laquelle des cartouches décrites ci-dessus.
Dans la réalisation particulière du dispositif de l'invention, où la cartouche est circulaire, les zones distinctes de chauffage de la platine de chauffage (2) sont préférentiellement réparties selon des portions de disque
(figure 2A) ou de couronne (figure 2B). Chaque portion peut être chauffée à une température distincte pour porter successivement le contenu des chambres réactionnelles aux températures distinctes souhaitées, grâce aux moyens de déplacement (3) relatifs entre la cartouche (1) et la platine chauffante (2). Afin de limiter les problèmes d'évaporation et de condensation dans la cartouche (1), les thermoblocs sont de préférence suffisamment larges pour chauffer aussi une partie des canaux, comme cela est représenté par exemple à la figure 11, dans le cadre d'une cartouche rectangulaire.
Il est important de noter que le nombre de zones de chauffage distinctes peut être égal à deux, trois, ou davantage. Par exemple, dans le cas d'une PCR à deux températures, la platine pourra présenter une zone à 95°C pour la dénaturation des acides nucléiques double brin, et une zone à 60°C pour l'hybridation des amorces et l'élongation. Dans le cas d'une
PCR à trois températures, la platine présentera une zone à 95°C (dénaturation), une zone entre 40 et 70°C (hybridation des amorces), et une zone à 72°C (élongation). Enfin, la platine peut présenter un nombre de zones supérieur à trois, par exemple pour bloquer provisoirement la réaction à un moment donné de chaque cycle. La platine peut aussi présenter un nombre de zones qui soit un multiple de deux ou trois, de telle façon qu'un tour de la cartouche corresponde à plusieurs cycles PCR. Enfin, il est important de noter que la taille relative des différentes zones de chauffage est avantageusement choisie proportionnellement à la durée d'incubation désirée pour le fluide réactionnel à la température de ladite zone. Ainsi, dans la platine représentée à a figure 2B, le thermobloc 21 , dédié à l'étape de dénaturation, a une surface deux fois moindre que celle des thermoblocs destinés au étapes d'hybridation et d'élongation (blocs 22 et 23, respectivement). En choisissant une vitesse de rotation relative de la cartouche sur la platine telle qu'une rotation de 360° est effectuée en 150 secondes, on obtient donc des cycles dans lesquels la dénaturation dure 30 secondes, l'hybridation 1 minute et l'élongation 1 minute.
Au sujet des moyens de déplacement on notera que, selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, la platine (2) est fixe et la cartouche (1) est mue grâce aux moyens de déplacement (3).
Toutefois, dans d'autres modes de réalisation, on pourra également prévoir une cartouche fixe et une platine de chauffage mise en mouvement grâce audits moyens de déplacement.
Dans le mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, selon lequel la cartouche est circulaire, les moyens de déplacement (3) autorisent la mise en rotation de ladite cartouche et/ou de ladite platine.
On peut prévoir un élément conducteur entre la cartouche et la platine chauffante. Toutefois, selon une variante préférentielle de l'invention, ladite cartouche est en contact direct avec ladite platine chauffante. Dans ce cas, ladite platine est avantageusement pourvue d'un revêtement favorisant le déplacement entre ladite cartouche et ladite platine. Un tel revêtement peut par exemple être constitué, en Téflon (marque déposée). Comme indiqué ci-dessus, la platine de chauffage du système peut présenter au moins deux ou trois zones pouvant être portées à des températures distinctes. Préférentiellement, cette platine est constituée de deux ou trois blocs thermiques indépendants ("thermoblocs") distincts reliés à des moyens de programmation de leur température. Dans le cas où la platine comporte trois thermoblocs (21 à 23), le premier de ces thermoblocs (21) est chauffé à la température de dénaturation, le deuxième (22) à la température d'hybridation, le troisième (23) à la température d'élongation. L'utilisation de tels thermoblocs de température constante simplifie la réalisation de la platine chauffante.
Les moyens de déplacement relatif de la cartouche par rapport à la platine pourront être réalisés sous de multiples formes. Selon un mode de réalisation préféré, illustré à la figure 10, la cartouche (1) présente sur le dessous une partie saillante centrale (181) comportant une encoche (182), de telle sorte que la partie saillante (181) s'encastre dans la platine chauffante (2) et relie la cartouche (1) avec les moyens de déplacement (3) au niveau d'un taquet ou axe (32) mis en mouvement par un micromoteur (31). La partie saillante (181) permet donc d'une part, de positionner la cartouche par rapport à une platine (2) telle que celle représentée à la figure 2B, et d'autre part, d'assurer sa liaison avec les moyens de mise en mouvement (3).
Selon un mode de réalisation alternatif, représenté aux figures 1 et 3, la cartouche présente au moins une oreille (183) et les moyens de déplacement (3) incluent au moins un axe (32) coopérant avec ladite oreille pour inculquer à ladite cartouche un mouvement rotatif.
Le mode de déplacement relatif entre la platine et la cartouche pourra varier selon les modes de réalisation. Il pourra s'agir d'un déplacement à vitesse continu ou par à-coups. La vitesse de déplacement pourra être constante ou varier dans le temps. Dans le cas d'une cartouche rectangulaire, le déplacement de la cartouche par rapport à la platine (2) se fait de préférence par translation, comme cela est décrit à l'exemple 3 et illustré à la figure 11.
Avantageusement, le système selon l'invention comprend également des moyens optiques d'excitation/mesure de la fluorescence, prévus par exemple au-dessus ou sur le côté de ladite cartouche. Selon une variante préférentielle de l'invention, ces moyens constitueront un système unique et fixe. Un avantage d'une variante préférentielle de l'invention selon laquelle la cartouche est circulaire et mue selon un déplacement rotatif est de pouvoir amener successivement chaque chambre réactionnelle sous ledit système optique, réduisant ainsi sa complexité. Un système de repérage, situé par exemple sur la cartouche (1), permet de déterminer à chaque instant quelle chambre réactionnelle est située en regard du système optique.
Les moyens d'amenée du fluide présent dans ledit réservoir vers lesdites chambres réactionnelles peuvent être réalisés sous différentes formes. Comme cela a été décrit plus haut, on peut distinguer deux catégories de modes d'adressage du fluide vers les chambres réactionnelles : l'adressage en système ouvert, qui suppose une augmentation de pression au niveau du réservoir et la présence d'évents
(14) au niveau des chambres réactionnelles, et l'adressage en système clos, qui débute au contraire par l'établissement d'une dépression dans la cartouche (1), suivi d'un rétablissement de cette pression.
Les moyens (4) d'amenée du fluide dans les chambre réactionnelles diffèrent suivant le mode de réalisation choisi. Ainsi, en système ouvert, le fluide contenu dans le réservoir est distribué sous pression dans les chambres réactionnelles de façon à permettre un remplissage uniforme de ces chambres. Dans ce cas, les moyens d'amenée (4) incluent préférentiellement un dispositif à piston (41) dont la vitesse de pénétration dans le réservoir sera calculée pour favoriser le bon remplissage des chambres réactionnelles. Alternativement, ces moyens d'amenée incluent une pompe branchée de façon à augmenter la pression dans le réservoir (11).
Comme il a été vu plus haut, une autre variante préférée de l'invention implique de travailler en système clos. Le fluide contenu dans le réservoir est alors distribué dans les chambres réactionnelles de la façon suivante : dans un premier temps, une dépression est créée à l'intérieur de la cartouche, le cas échéant par un dispositif à piston ou une pompe (42), branchée cette fois de manière à diminuer la pression dans la cartouche
(1). La pression est ensuite rétablie, ce qui permet au fluide de s'engager dans les canaux et de remplir les chambres réactionnelles périphériques.
L'invention concerne également tout procédé d'amplification d'acide nucléique grâce à un système tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : remplir au moins partiellement le réservoir (11) avec un fluide contenant un échantillon d'acides nucléiques à analyser ainsi que tout le nécessaire à une réaction d'amplification, à l'exception des amorces, et facultativement, un intercalant fluorescent des acides nucléiques ;
- répartir ledit fluide dans les chambres réactionnelles (13) prévues dans la cartouche (1), dans lesquelles sont pré-réparties des amorces et, facultativement, une ou plusieurs sondes marquées spécifiques de la séquence nucléique cible ;
mettre en œuvre les moyens de déplacement relatif entre la cartouche, et Ja_pJatine chauffante pour amener successivement, et autant de fois que désiré, le contenu de chaque chambre aux températures définies par les deux, trois ou davantage zones de ladite platine de chauffage. Dans une variante du procédé ci-dessus, des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification et/ou à la détection des produits de l'amplification, et distincts des amorces et des sondes, sont pré-répartis dans les chambres réactionnelles (13) de la cartouche (1). Le fluide introduit dans le réservoir (11) ne contient alors pas ces réactifs.
L'étape de répartition du fluide dans les chambres réactionnelles
(13) est effectuée soit en appliquant une dépression à l'intérieur de la cartouche, puis en rétablissant la pression (système clos), soit en augmentant la pression au niveau du réservoir (11), à condition que les chambres réactionnelles soient pourvues d'évents (système ouvert).
L'invention, ainsi que les différents avantages qu'elle présente, seront mieux compris grâce à la description qui va suivre de quelques modes non limitatifs de réalisation de celle-ci, illustrés dans les figures.
Exemple 1 : mode de réalisation simplifié du dispositif de l'invention.
Le système de détection et de quantification de séquences nucléiques cibles représentés à la figure 1 comprend une cartouche circulaire en matière plastique de 2 mm d'épaisseur présentant un diamètre de 5 cm. Cette cartouche (1) est pourvue d'un réservoir central (11) et sera décrite plus en détails en référence ci-après aux figures 3 et 4. La capacité du réservoir est, dans le cadre du présent mode de réalisation, de 400 μl. Son plancher est plat mais on notera que dans d'autres modes de réalisation il pourra être bombé pour faciliter le passage du fluide vers les chambres sans formation de bulles d'air, notamment en fin d'adressage lorsque le réservoir est quasiment vide. Le système comprend par ailleurs une platine chauffante (2) en contact direct avec la face inférieure de la cartouche (1) et des moyens de déplacement (3) de la cartouche (1) par rapport à la platine chauffante (2). Ces moyens de déplacement incluent un micromoteur (31) relié à deux axes (32) qui coopèrent avec deux oreilles (183) de la cartouche (1) pour inculquer à celle-ci un mouvement rotatif sur la platine chauffante (2), celle- ci restant quant à elle fixe.
Le système décrit comprend également un piston (41) destiné à coopérer avec ledit réservoir (11) ainsi qu'un dispositif optique (5) d'excitation/mesure de fluorescence (source émettrice permettant une excitation à une longueur d'onde donnée et programmable et récepteur de la fluorescence émise) fixe et placé au dessus de la cartouche (1) et de la platine chauffante (2).
Comme on peut le voir sur la figure 2A, la platine chauffante (2) est constituée de trois blocs métalliques (21 , 22 et 23) (ci-après dénommés thermoblocs) en forme de portions de disques. On notera que dans ce mode de réalisation, ces thermoblocs présentent sensiblement la même taille mais que, dans d'autres modes de réalisation, ils pourront présenter une taille différente, la taille étant entendue comme la surface angulaire occupée en vue de dessus. Chaque thermobloc (21, 22 et 23) est conçu pour pouvoir être amené à une température constante et programmable, correspondant à l'une des phases (dénaturation, hybridation ou élongation) des cycles d'amplification (PCR), soit généralement respectivement 94°C pour la dénaturation, 72°C pour l'élongation, et entre 30-40 et 65-70°C pour l'hybridation selon le Tm (température d'hybridation) des amorces utilisées.
Les températures des thermoblocs pourront être contrôlées par tous moyens connus de l'homme de l'art.
En référence à la figure 3, la cartouche (1) est pourvue d'un réservoir central (11) de capacité 400 μl relié à 36 chambres réactionnelles (13) par autant de canaux (12), réparties uniformément sur toute la périphérie de la cartouche (sur la figure 3, on n'a pas représenté l'ensemble des canaux et des chambres mais seulement certains d'entre eux). Ces chambres réactionnelles (13) sont par ailleurs pourvues d'évents (14) abouchant sur le bord de la cartouche (1). Dans le présent mode de réalisation, les canaux présentent un diamètre de 0,2 mm et le volume des chambres réactionnelles est de 2,5 microlitres. Dans d'autres modes de réalisation, ce diamètre et ce volume pourront bien sûr être différents.
Comme déjà précisé, cette cartouche (1) est également pourvue de deux oreilles (183) percées chacune d'un orifice pour laisser passer un axe
(32) relié au micromoteur (31).
Selon la figure 4, les chambres réactionnelles présentent une profondeur de 1 mm. Leur plancher présente une épaisseur de 0,2 mm environ. Cette épaisseur est suffisamment faible pour faciliter de bons échanges thermiques entre les chambres (13) et les thermoblocs (21 , 22 et
23). Les chambres réactionnelles (13) sont fermées dans leur partie supérieure par une paroi (17) transparente, formant également la paroi du réservoir (11).
L'utilisation du dispositif représenté est la suivante :
Le réservoir central (11) est destiné à recevoir l'échantillon d'acides nucléiques à analyser ainsi que tout le nécessaire à une réaction d'amplification, et facultativement un intercalant fluorescent des acides nucléiques (l'ensemble est ci-après dénommé fluide), à l'exception des amorces préréparties dans chaque chambre réactionnelle périphérique 10.
Dans le cadre du présent mode de réalisation, l'utilisateur place dans le réservoir central 90 μl (c'est-à-dire 36 fois 2,5 μl) de fluide, dont 75 ng d'acides nucléiques. Les concentrations en réactifs dudit fluide sont les suivantes : dNTP : 200 μM Tampon Taq : 1 x MgCI2 : 1 ,5 mM Taq : 4U SybrGreen (marque déposée) : 1 x
H2O : qsp
Chaque chambre 10, sauf quelques-unes à des fins de témoins négatifs, contient deux amorces spécifiques d'une séquence cible à amplifier, et facultativement une ou plusieurs sondes marquées, permettant une mesure spécifique ultérieure de fluorescence. Dans le présent mode de réalisation, ont été répartis 10 ng de chaque amorce dans chaque chambre sauf dans celles servant de témoin négatif.
Après avoir rempli partiellement le réservoir (11) avec le fluide dont le volume est égal à la somme des volumes des chambres (le volume d'une chambre est défini comme étant le produit de sa surface de "plancher" par sa profondeur), le piston (41) est actionné pour distribuer ce fluide dans la pluralité de chambres réactionnelles (13). Ce piston permet d'augmenter la pression au sein du réservoir (11) et permet le passage du fluide dans les canaux vers les chambres. La vitesse de déplacement du piston dans le réservoir est d'environ 1 mm par seconde et ledit déplacement est stoppé à un niveau qui dépend du volume de fluide à adresser dans les chambres.
Le faible diamètre des canaux (12) permet d'empêcher la diffusion du fluide depuis le réservoir (11) vers les canaux (12) et les chambres (13) sous l'effet de la gravité (à cette échelle, les processus habituellement négligeables comme les forces de capillarité deviennent prégnants, et dans le cas présent suffisent à maintenir le fluide dans le réservoir). Grâce aux évents (14), l'air présent dans les chambres (13) est évacué, ce qui assure le remplissage de celles-ci. Les thermoblocs (21 , 22, 23) sont portés aux trois températures correspondant aux trois températures des phases de la PCR (ou à des températures légèrement supérieures compte tenu des éventuelles déperditions thermiques entre la platine chauffante (2) et la cartouche 1) et les moyens de déplacement (3) sont mis en œuvre de façon à animer d'un mouvement giratoire la cartouche (1) pour faire passer successivement et autant de fois que désiré chaque chambre réactionnelle au-dessus des trois thermoblocs.
Plus précisément, le bloc (21) est porté à la température correspondant à la phase de dénaturation (94°C), le thermobloc (22) est porté à la température correspondant à la phase d'hybridation (36°C) et le thermobloc (23) est porté à la température correspondant à la phase d'élongation (72σC).
Dans le présent mode de réalisation, le micromoteur (31) des moyens de déplacement (3) est conçu pour inculquer une rotation de 10 degrés toutes les 2,5 secondes à la cartouche (1) (soit un cycle de PCR en 1 ,5 mn). Toutefois, dans d'autres modes de réalisation, ce mouvement pourra présenter une vitesse différente et être continu au lieu d'être saccadé.
On notera que le dispositif optique (5) est prévu au dessus du bloc correspondant 23 porté à une température correspondant à la température d'élongation, et plus particulièrement à un emplacement qui correspond à la fin de la phase d'élongation. Bien entendu, le dispositif optique (5) peut être placé à un emplacement différent, choisi notamment en fonction de la chimie utilisée. Par exemple, en utilisant la chimie TaqMan™ ou de la fluorescence non spécifique, il est logique d'effectuer la mesure à la fin de la phase d'élongation, comme décrit ci-dessus. En revanche, l'utilisation d'une chimie du type Molecular Beacons™ implique que la mesure se fasse plutôt au moment de l'hybridation. Le système présenté permet de remplir rapidement et de façon reproductible une grande quantité de chambres réactionnelles et d'effectuer sur le contenu de celles-ci une PCR et des mesures de fluorescence à chaque cycle de la PCR.
Le mode de réalisation ici décrit n'a pas pour objet de réduire la portée de l'invention. Il pourra donc y être apporté de nombreuses modifications sans sortir du cadre de celle-ci.
Exemple 2 : Cartouche circulaire améliorée
Les figures 5 à 10 représentent un exemple de cartouche circulaire présentant certaines modifications par rapport à la cartouche de l'exemple 1.
Cette cartouche est prévue pour une utilisation en système clos, c'est-à-dire que les chambres réactionnelles (13) n'ont pas d'autre ouverture que l'arrivée du canal (12). La cartouche est constituée de deux éléments qui s'emboîtent l'un dans l'autre : la partie inférieure, ou socle, est représentée aux figures 5 et 6, et la partie supérieure, ou couvercle, est représentée aux figures 7 et 8. L'assemblage des deux est illustré aux figures 9 et 10.
Le chargement de cette cartouche s'effectue de la façon suivante :
L'utilisateur place dans le réservoir central l'extrait d'acides nucléiques à analyser. Il place le consommable dans l'automate. Ce dernier crée une dépression à l'intérieur de la cartouche (P = 0,05 bar approximativement), par exemple par l'utilisation d'une pompe (42). La pression est ensuite rétablie , ce qui permet aux fluides de s'engager dans les canaux et de remplir les chambres réactionnelles périphériques. Ainsi, par rapport au dispositif de l'exemple 1 , le fluide n'est plus adressé par une augmentation de la pression mais par dépression, ce qui présente l'avantage de ne pas nécessiter d'évent et donc de travailler en système clos.
Le cas échéant, on peut prévoir plusieurs sous-réservoirs et non plus un réservoir unique, ce qui présente l'avantage de traiter simultanément plusieurs échantillons.
Le fond du réservoir a une forme conique permettant au fluide de se répartir à sa périphérie, c'est-à-dire près de l'entrée des canaux.
A la jonction entre les canaux et le réservoir, se trouve un système anti-reflux, constitué par une portion de canal vertical (123), ce qui, d'une part, prévient les contaminations croisées en cas de retour intempestif de fluide vers la partie centrale ou au cas où tout le fluide ne se serait pas engagé dans le canal et, d'autre part, permet une fois l'adressage effectué mais avant la PCR, de venir boucher les canaux au moyen d'un bouchon dont les dentelures viennent épouser ces entrées verticales, afin de travailler en système clos (pas de contamination, pas d'évaporation).
La cartouche est en plastique, préférentiellement en polycarbonate car ce polymère présente des caractéristiques physiques, optiques et de comportement thermique intéressantes.
La taille des canaux est par exemple de 0,4 x 0,2 mm (demi-lune) en section.
La taille du consommable est par exemple de 100 mm (diamètre), le nombre de chambres est de 80, le nombre de sous-réservoirs est compris entre 1 et 8.
Comme illustré à la figure 10, la cartouche (1) présente sur le dessous une partie saillante centrale (181) comportant une encoche (182), de telle sorte que la partie saillante (181) s'encastre dans la platine chauffante (2) et relie la cartouche (1) avec les moyens de déplacement (3) au niveau d'un taquet ou axe (32) mis en mouvement par un micromoteur (31). La partie saillante (181) permet donc d'une part, de positionner la cartouche par rapport à une platine (2) telle que celle représentée à la figure 2B, et d'autre part, d'assurer sa liaison avec les moyens de mise en mouvement (3).
Les chambres réactionnelles sont chargées avec des amorces spécifiques de séquences cibles et, le cas échéant, avec des sondes de type TaqMan™ ou autre spécifiques desdites cibles. Suivant les applications, les cibles seront des gènes viraux ou bactériens, des jonctions entre un transgène et le génome d'une plante pour détecter et/ou identifier certains OGM, etc.
Une variante de la cartouche décrite ci-dessus, comportant 36 chambres réactionnelles d'un volume de 8 μl et des canaux d'un diamètre de 0,3 mm, a été utilisée pour effectuer un test de détection de bactéries Salmonelles. 288 μl (soit 36 fois 8 μl) de la solution suivante ont été placés dans le réservoir central :
DUTP 400 μM dNTP : 200 μM
Tampon Taq : 1 x MgCI2 : 3 mM
Taq : 15 U
TWEEN (marque déposée) : 0,007 %
SybrGreen (marque déposée) : 0,1 x
ADN génomique de Salmonella enteritidis : 1 ng H2O : qsp
1,6 picomole des amorces FinA1 et FinA2 décrites dans Cohen, Mechanda et al. 1996 ont été déposées dans les chambres réactionnelles.
Cette expérience a donné des résultats positifs, comme attendu. Exemple 3 : Cartouche rectangulaire
Dans cet exemple, illustré à la figure 11 , le réservoir n'est plus central mais "sur le côté", et le mouvement de la cartouche n'est plus nécessairement rotatif, mais peut être translationnel.
Le mode d'adressage et de fermeture peut être tout à fait le même que dans le cas du mode circulaire décrit à l'exemple 2.
Alternativement, les fluides sont adressés par augmentation de la pression. Ils entrent dans la première partie du canal (121) dont la somme des volumes est prévue pour être légèrement inférieure au volume d'échantillon à analyser (d'extrait d'acides nucléiques). La deuxième partie du canal (122) est constituée par un capillaire de verre, de diamètre beaucoup plus faible, inclus dans le système plastique, comme illustré à la figure 12. Son intérêt est de créer un phénomène dit de perte de charge, permettant un remplissage homogène de la première partie des canaux (si un canal se remplit plus vite qu'un autre lors de l'augmentation de la pression, ce phénomène permet d'arrêter la progression du fluide dans le ou les canaux remplis jusqu'à ce que les autres le soient à leur tour). Ceci permet de "précalibrer" les volumes pour chaque canal et donc d'assurer un remplissage homogène des différentes chambres (13) plus en aval. A l'extrémité des chambres se trouvent des évents, débouchant eux-mêmes dans des enceintes (15) trouées sur le dessus dont l'intérêt est, d'une part, de récupérer sans pollution les éventuels surplus de fluide qui sortiraient par lesdits évents et, d'autre part, de pouvoir se fermer par une bande adhésive afin d'empêcher l'évaporation. Le volume (et la forme) des chambres est égal à celui de la première partie des canaux.
La taille des canaux est de 0,4 mm de diamètre, soit 1 canal par mm si l'espace entre deux canaux est de 0,6 mm. Ainsi, une cartouche de longueur 8 cm comporte 80 chambres. Deux possibilités peuvent être envisagées pour fermer le canal au niveau du réservoir :
La première possibilité consiste à utiliser, comme à l'exemple 2, un bouchon dentelé. Le piston qui augmente la pression et ledit bouchon sont alors confondus. Dans ce cas, il faut prévoir une ouverture du piston
(creux) entre l'étape d'adressage des fluides par pression et cette étape de fermeture, afin que la fermeture n'engendre pas une nouvelle augmentation de la pression qui amènerait le fluide au-delà des chambres).
La deuxième possibilité consiste à disposer de l'huile (en excès) au-dessus des fluides. Ainsi, une fois les chambres remplies, les canaux
(121) sont remplis au moins partiellement d'huile, empêchant contamination et évaporation.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Cartouche réactionnelle comportant plusieurs chambres réactionnelles (13) et au moins un réservoir (11) et présentant les caractéristiques suivantes : - chaque chambre réactionnelle est reliée au réservoir par un canal (12) ayant une section droite comprise dans un cercle de diamètre inférieur à 3 mm, la capacité du réservoir est inférieure à 10 ml, la disposition des chambres réactionnelles et des canaux par rapport au réservoir permet de répartir un fluide de façon homogène dans les chambres réactionnelles, à partir du réservoir.
2. Cartouche selon la revendication 1 , dans laquelle le diamètre des canaux (12) est inférieur ou égal à 0,2 mm.
3. Cartouche selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la capacité du réservoir (11) est comprise entre 0,1 ml et 1 ml.
4. Cartouche selon les revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 20 et 500 chambres réactionnelles.
5. Cartouche selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le volume des chambres réactionnelles est compris entre 0,2 et 50 μl, de préférence entre 1 et 10 μl.
6. Cartouche selon les revendications 1 à 5, dans laquelle la jonction entre les canaux (12) et le réservoir (11) se fait à la périphérie du réservoir, et le fond dudit réservoir est incliné et/ou convexe, de façon à assurer la répartition d'un fluide contenu dans le réservoir au niveau de l'entrée des canaux.
7. Cartouche selon les revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle possède une géométrie de révolution, dans laquelle le réservoir (11) est placé sensiblement au centre de ladite cartouche, les chambres réactionnelles (13) sont réparties en cercle autour dudit réservoir, et les canaux (12) reliant ledit réservoir aux dites chambres sont essentiellement radiaux.
8. Cartouche selon la revendication 7, dans laquelle le fond du réservoir (11) est conique.
9. Cartouche selon la revendication 7 ou 8, dans laquelle les chambres réactionnelles (13) sont placées à la périphérie de ladite cartouche.
10. Cartouche selon les revendications 7 à 9, présentant un diamètre compris entre 1 et 10 cm.
11. Cartouche selon les revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle possède une géométrie de translation, dans laquelle le réservoir (11) est placé sur un côté de ladite cartouche, les chambres réactionnelles (13) sont alignées de l'autre côté de la cartouche, et les canaux (12) reliant ledit réservoir aux dites chambres sont essentiellement parallèles les uns aux autres.
12. Cartouche selon la revendication 11 , dans laquelle le fond du réservoir (11) est un plan incliné.
13. Cartouche selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans laquelle le réservoir (11) est divisé en 2 à 8 sous-réservoirs (111 à 118), et chacune des chambres réactionnelles (13) est reliée à un seul de ces sous-réservoirs par un canal (12).
14. Cartouche selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans laquelle les chambres réactionnelles présentent une profondeur comprise entre 0,5 et 1 ,5 mm.
15. Cartouche selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce qu'elle est en matière plastique, et de préférence en polycarbonate.
16. Cartouche selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, dont l'épaisseur est comprise entre 0,5 et 5 mm.
17. Cartouche selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans laquelle le plancher des chambres réactionnelles (13) présente une épaisseur comprise entre 0,05 et 0,5 mm, de préférence environ 0,25 mm.
18. Cartouche selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, dans laquelle les chambres réactionnelles (13) sont fermées par une paroi supérieure transparente (17).
19. Cartouche selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans laquelle les chambres réactionnelles (13) sont pourvues d'évents (14).
20. Cartouche selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans laquelle les chambres réactionnelles (13) sont closes.
21. Cartouche selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle le réservoir (11) comporte une ouverture adaptable à des moyens (4) de modulation de la pression dans ledit réservoir.
22. Cartouche selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 , dans laquelle chaque canal (12) est constitué d'au moins deux parties de diamètres différents (121 et 122), le diamètre de la deuxième partie (122) étant inférieur à celui de la première partie (121), de façon à créer une perte de charge dans le canal (12).
23. Cartouche selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisée en ce que chaque canal (12) est équipé d'une cavité anti-reflux (123) au niveau de . sa jonction avec le réservoir (11), ladite cavité anti-reflux étant constituée d'une portion de canal sensiblement verticale, d'un diamètre supérieur ou égal à celui du canal (12).
24. Cartouche selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, dans laquelle une partie au moins des chambres réactionnelles (13) comporte des oligonucléotides.
25. Cartouche selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, dans laquelle chacune des chambres réactionnelles (13) comporte deux amorces spécifiques d'une séquence d'acide nucléique à amplifier et, facultativement, une sonde marquée spécifique de ladite séquence.
26. Cartouche selon l'une quelconque des revendications 1 à 25, dans laquelle au moins une partie des chambres réactionnelles (13) comportent des réactifs qui y ont été chargés par dépôt liquide suivi d'un séchage, de telle sorte que l'arrivée d'un fluide dans lesdites chambres réactionnelles remette lesdits réactifs en solution.
27. Dispositif pour effectuer des réactions enzymatiques et/ou de biologie moléculaire nécessitant au moins deux températures d'incubation différentes, caractérisé en ce qu'il comprend : au moins une cartouche (1) présentant une pluralité de chambres réactionnelles (13) et un réservoir (11), lesdites chambres réactionnelles étant reliées au réservoir par des canaux (12) ; au moins une platine de chauffage (2) présentant au moins deux zones distinctes pouvant être portées à au moins deux températures différentes; des moyens (3) de déplacement relatif entre ladite cartouche et ladite platine, permettant une variation cyclique de la température des chambres réactionnelles.
28. Dispositif selon la revendication 27, dans lequel la réaction enzymatique est une amplification en chaîne thermo-dépendante de séquences d'acides nucléiques, et dans lequel les zones de la platine de chauffage (2) peuvent être portées à au moins deux températures différentes, correspondant aux phases des cycles d'amplification desdits acides nucléiques.
29. Dispositif selon la revendication 28, caractérisé en ce que : des amorces spécifiques de séquences cibles à amplifier sont pré-réparties dans les chambres réactionnelles (13), le réservoir (11) est destiné à recevoir un fluide composé notamment d'un échantillon d'acides nucléiques à analyser et des réactifs nécessaires à une réaction d'amplification en chaîne par polymérase, à l'exception des amorces, la platine de chauffage (2) présente trois zones distinctes pouvant être portées à trois températures différentes, correspondant aux trois phases des cycles d'amplification en chaîne par polymérase.
30. Dispositif selon la revendication 28 ou 29, pour l'amplification en chaîne thermo-dépendante de séquences d'acides nucléiques mesurée en temps réel, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens optiques (5) d'excitation / mesure de la fluorescence, disposés de manière à exciter et mesurer à chaque cycle la fluorescence du contenu des chambres réactionnelles.
31. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 27 à 30, dans lequel la cartouche (1) est une cartouche selon l'une quelconque des revendications 1 à 26.
32. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 27 à 31 , dans lequel les zones distinctes de chauffage de la platine (2) sont réparties selon au moins deux ou trois portions de disque.
33. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 27 à 32, dans lequel ladite platine de chauffage (2) est fixe et ladite cartouche (1) est mue grâce aux dits moyens de déplacement (3).
34. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 27 à 32, dans lequel ladite cartouche (1) est fixe et ladite platine de chauffage (2) est mue grâce aux dits moyens de déplacement (3).
35. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 27 à 34, dans lequel lesdits moyens de déplacement (3) autorisent la mise en rotation de ladite cartouche (1) et/ou de ladite platine de chauffage
(2).
36. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 27 à 35, dans lequel la cartouche (1) est en contact direct avec la platine chauffante (2).
37. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 27 à 36, dans lequel la platine (2) est pourvue d'un revêtement favorisant le déplacement relatif entre ladite cartouche (1) et ladite platine (2).
38. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 27 à 37, dans lequel la platine chauffante (2) comporte deux ou trois thermoblocs distincts (21, 22 et le cas échéant, 23) reliés à des moyens de programmation de leur température.
39. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 27 à 38, dans lequel la cartouche (1) présente sur le dessous une partie saillante centrale (181) comportant une encoche (182), et les moyens de déplacement (3) incluent au moins un taquet (32) coopérant avec ladite encoche (182) pour inculquer à ladite cartouche (1) un mouvement rotatif.
40. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 27 à 39, comportant des moyens optiques (5) d'excitation / mesure de la fluorescence disposés au-dessus ou sur le côté de la cartouche.
41. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 27 à 40, comportant en outre des moyens (4) permettant d'amener le fluide présent dans le réservoir (11) dans les chambres réactionnelles (13).
42. Dispositif selon la revendication 41 , dans lequel lesdits moyens d'amenée (4) incluent un dispositif à piston (41), et le fluide est amené dans les chambres réactionnelles par une augmentation de pression.
43. Dispositif selon la revendication 41 , dans lequel lesdits moyens d'amenée (4) incluent une pompe (41), et le fluide est amené dans les chambres réactionnelles par un rétablissement de la pression après l'établissement d'une dépression.
44. Dispositif selon la revendication 43, dans lequel les chambres réactionnelles (13) de la cartouche (1) sont closes.
45. Procédé d'amplification d'acide nucléique grâce à un dispositif selon l'une quelconque des revendications 27 à 44, comportant les étapes suivantes : - remplir au moins partiellement le réservoir (11) avec un fluide contenant un échantillon d'acides nucléiques à analyser, ainsi que tout le nécessaire à une réaction d'amplification à l'exception des amorces et, le cas échéant, un intercalant fluorescent des acides nucléiques ; - répartir ledit fluide dans les chambres réactionnelles (13) de la cartouche (1), dans lesquelles sont prédéposées des amorces et, le cas échéant, une ou plusieurs sondes marquées ; mettre en œuvre les moyens (3) de déplacement relatif entre la cartouche et la platine chauffante pour amener successivement et autant de fois que désiré le contenu de chaque chambre réactionnelle aux deux, trois ou davantage températures définies par les deux, trois ou davantage zones de ladite platine de chauffage (2).
46.— Procédé d'amplification selon la revendication 45, dans lequel l'étape de répartition du fluide dans les chambres réactionnelles (13) est effectuée en appliquant une dépression à l'intérieur de la cartouche, puis en rétablissant la pression.
7. Procédé de remplissage en système clos des chambres réactionnelles (13) d'une cartouche (1) selon la revendication 21, comportant les étapes suivantes : remplir au moins partiellement le réservoir (11) avec un fluide, connecter la cartouche (1) aux moyens (4) de modulation de la pression, appliquer une dépression à l'intérieur de la cartouche, puis rétablir la pression.
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