WO2002079508A1 - Dispositif integre et miniaturise de sequencage d'acides nucleiques - Google Patents

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WO2002079508A1
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    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid sequencing methods, as well as to nucleic acid sequencing devices and to disposable cassettes for use in these devices.
  • the invention is based on the measurement of the elongation of a double-stranded nucleic acid, from a single-stranded nucleic acid matrix to be sequenced, hybridized to a primer fixed on a support, by bringing the matrix to be sequenced successively with reaction fluids comprising a given nucleotide.
  • Nucleic acid sequencing is an essential tool, of growing importance, in several fields of biological research and its applications. This is the case, for example, in research in molecular biology, virology, phylogenetics or epidemiology, or even in research for the improvement of plant species.
  • DNA sequencing is already used as a means of diagnosing a genetic disorder or anomaly. It is likely that this diagnostic tool will be used more and more in the future, making it possible, for example, to determine an individual's susceptibility to a given drug, or to diagnose a predisposition to a pathology.
  • the majority of the sequencing methods currently used are derived from the Sanger method, or from a chemical method comprising a moderate chemical processing step which selectively destroys one of the four bases of DNA.
  • Sanger's method the DNA to be sequenced is used as a template for the synthesis in in vitro, by DNA polymerase, of a series of partial replicas of the DNA chain, all starting at the same level, but ending at different points.
  • the key to this method is the use of dideoxyribonucleosides triphosphates, in which the 3'-OH group of deoxyribose, present in normal nucleotides, is absent.
  • the present invention relates to methods and devices for high throughput sequencing, which are easy and economical to implement.
  • the present invention makes it possible in particular to overcome the particularly heavy step of electrophoresis on a polyacrylamide gel, by proposing to carry out the elongation of a strand of nucleic acid, from a simple DNA template. strand or RNA to be sequenced, hybridized in 3 ′ to a primer, by the sequential supply of several elongation solutions each containing a given nucleotide. The elongation of the complementary strand to the matrix whose sequence is sought to be determined is measured after the passage of each of the nucleotides, which makes it possible to determine the sequence in question.
  • the invention therefore relates firstly to a method of nucleic acid sequencing, comprising the following steps:
  • the setting in motion of the fluid in the tube is for example carried out by pneumatic means, and the movement of the fluid in the tube is preferably a cyclic movement , for example a back and forth movement on either side of the reaction zone, of the part of the fluid comprising the reaction fluids.
  • each of the reaction fluids is separated from the other fluids by a gaseous or liquid separating fluid, immiscible with the reaction fluids.
  • the invention also relates to a nucleic acid sequencing method, which comprises the following steps: 1) hybridization of the nucleic acid to be sequenced, in single-stranded form, to a polynucleotide primer fixed in a capillary tube, at the level d '' a reaction zone,
  • reaction fluids each containing a single nucleotide (A, T, C, or G, respectively) and the reagents necessary for elongation , from the primer, the complementary strand of the nucleic acid to be sequenced, with the exception of the other nucleotides, said fluids passing cyclically one after the other through the capillary tube at a speed greater than the diffusion rate of the nucleotides in the reaction fluids (defined by a constant),
  • a variant of this method designated hereinafter by the term "open system method" consists in passing continuously at a given speed, greater or not greater than the diffusion rate of the fluids, a fluid carrier, into which the reaction fluids are injected at given intervals, for example using a piezoelectric distributor.
  • the intervals between injections of fluids are determined as a function of the speed of passage of the fluid and the speed of diffusion of the nucleotides, so that there is no possible mixing between the nucleotides.
  • the carrier fluid is preferably an aqueous fluid, and may or may not contain a number of reagents other than the nucleotides. These reagents can then, if necessary, be absent from the reaction fluids.
  • each reaction fluid contains a single type of nucleotide, which will only be incorporated into the strand being extended from the primer if it is complementary to the base located on the acid. nucleic acid to be sequenced, at the level immediately following the part already sequenced.
  • the detection of the elongation of the complementary strand of the nucleic acid to be sequenced, after the passage of each reaction fluid containing a given type of nucleotide makes it possible to deduce the sequence of the matrix: for example, the incorporation of A , followed by the incorporation of two Cs and one G, indicates the presence of the sequence 5'-CGGT-3 '.
  • the type of nucleotide incorporated is identified either by a specific marker detectable by a measuring device, or by an identification of the reaction fluid containing them.
  • the identification means can be physical, as described in the description of the device, or colorimetric, each reaction fluid then containing a dye which is specific to it. In the latter case, the dye identifies the reaction fluid present in the reaction zone and therefore, indirectly. type of nucleotide possibly incorporated.
  • the order in which the nucleotides are placed in the reaction fluids is arbitrary. It only matters that it be known.
  • equivalents of nucleotides A, C, T, or G also comes within the scope of the methods of the invention.
  • equivalent is meant here any type of molecule capable of forming a chain complementary to the nucleic acid to be sequenced.
  • uracije (U) is an equivalent of thymidine (T).
  • nucleotide equivalents mention may in particular be made of nucleotide analogs blocking the 3 'extension in a reversible manner.
  • the use of such analogs allows incorporation of only one nucleotide at a time when passing a nucleotide, even when the template has a repeat of the complementary nucleotide.
  • the elimination of the blocking group, for example by photocleavage, allows the elongation to continue in the next step.
  • the use of such equivalents therefore makes it possible to control the speed of extension of the primer even in the presence of repeated nucleotides.
  • the unblocking of the 3 ′ -terminal nucleotide then occurs preferably after rinsing and / or destruction of the non-incorporated nucleotides.
  • DNA polymerase has a sufficiently high affinity constant for its substrate so that it does not drop out immediately when a fluid does not contain this enzyme.
  • the closed system method it may therefore be present only in a fluid, whether or not containing nucleotides.
  • DNA polymerase can be introduced only at the start, with, if necessary, one or more new passages of fluid containing it, during the sequencing reaction. Such sparse use of DNA polymerase makes it possible to lower the cost of sequencing, without however reducing its quality.
  • the first step of the methods described above can be replaced by an equivalent step, that is to say a step at the end of which the nucleic acid to be sequenced is hybridized to a localized primer and maintained at the level of the reaction zone.
  • the nucleic acid to be sequenced can be hybridized, in single-stranded form, to primers fixed on magnetic beads, which are then introduced into the tube and maintained at the level of the reaction zone using a magnet. .
  • the measurement of the elongation of the complementary strand of the nucleic acid to be sequenced can be carried out in several ways. It can be direct, for example by using nucleotides coupled to a fluorescent label and by measuring the increase in the fluorescence of the reaction zone, or indirect, for example by measuring the departure of the pyrophosphate molecules, the incorporation of a nucleotide causing the release of a pyrophosphate molecule.
  • Another type of indirect measurement of elongation consists in measuring a quantity of fluorescent intercalator in a reaction fluid before and after its passage at the site of the nucleic synthesis. The difference in fluorescence will then reflect the incorporation of nucleotides into the molecule during elongation.
  • a third type of indirect measurement consists in using nucleotides coupled to a marker (fluorescent for example), so that the marker is photocleavable and blocks the elongation of the 3 'chain.
  • a light pulse is sent to the reaction zone, and the fluorescent markers possibly released are detected downstream of this zone.
  • the measurement of the elongation of the complementary strand of the nucleic acid to be sequenced is carried out by a measurement device placed opposite the reaction zone, for example an optical device such as an excitation and luminescence, fluorescence, or chemiluminescence measurement device.
  • a measurement device placed opposite the reaction zone, for example an optical device such as an excitation and luminescence, fluorescence, or chemiluminescence measurement device.
  • the measurement device is an excitation and fluorescence measurement device capable of measuring an increase in fluorescence of 1% and, preferably, of 0.1%.
  • This allows, for example, to use as a marker for the elongation of the double-stranded nucleic acid, a fluorescent interlayer of the ethydium bromide or SybrGREEN (registered trademark) type.
  • SybrGREEN registered trademark
  • the incorporation of x nucleotides will then result in an increase in the fluorescence of x / n%, n denoting here the number of bases of the complementary strand of the matrix to be sequenced, including the primer.
  • the passage of the reaction fluid comprising nucleotide C will cause an increase in fluorescence by 3%.
  • the increase in fluorescence after incorporation of a nucleotide will therefore represent an increasingly small proportion of the total fluorescence.
  • the sensitivity of the detector used therefore determines the maximum size of the fragments that can be sequenced.
  • the invention also relates to methods for sequencing large fragments with a sensor of reduced sensitivity, using labile or ephemeral labeling of the molecule being elongated.
  • Examples of photo-cleavable conjugates, allowing the release of a marker coupled to a biomolecule by an electromagnetic discharge are given in US Pat. No. 5,986,076.
  • the use of such compounds therefore makes it possible to periodically suppress the labeling of molecules in the process of elongation, by an electromagnetic discharge, while maintaining the integrity of these molecules, and therefore to continue sequencing without risking exceeding the sensitivity limits of the sensor.
  • the fluorescent labeling of the molecules can also be removed by photobleaching (photobleaching), that is to say by destroying the fluorophores by an electromagnetic pulse.
  • the reaction fluids therefore contain an elongation marker for a double-stranded nucleic acid molecule, such as a fluorescent interlayer or an interlayer coupled to a labeled molecule , if necessary by a photo-cleavable link.
  • an elongation marker for a double-stranded nucleic acid molecule such as a fluorescent interlayer or an interlayer coupled to a labeled molecule , if necessary by a photo-cleavable link.
  • the nucleotides contained in each of the reaction fluids are labeled or coupled to a labeled molecule, where appropriate by a photo-cleavable bond.
  • a step of rinsing the reaction zone with a rinsing solution is introduced after the passage of each of the reaction fluids, said rinsing solution containing, where appropriate, a or several enzymes capable of degrading the nucleotide triphosphates.
  • a or several enzymes capable of degrading the nucleotide triphosphates.
  • an enzyme can be, for example, an apyrase.
  • the rinsing fluid can be located on either side of each of the reaction fluids, or brought to the level of the reaction site from a branch of the capillary tube, as described in Figures 2 and 3, respectively, as well as in Example 3.
  • each of the reaction fluids is left in contact with the reaction zone for a duration preferably between 10 and 200 ms, for example from 50 to 100 ms.
  • the elongation step 2) is carried out between 65 and 75 ° C, preferably between 71, 5 and 72.5 ° C.
  • the invention also relates to a sequencing method such as those described above, in which several capillary tubes are used to carry out several sequencing in parallel.
  • FIG. 1 Another aspect of the invention, illustrated in FIG. 1, relates to a nucleic acid sequencing device comprising at least one tube (1) comprising a reaction zone (2), where there are polynucleotide primers (3), said tube (1) containing a multiphase fluid (5) containing the reaction fluids (6-9), so that the reaction fluids carry out successive passages at the level of the reaction zone (2).
  • the fluids (6-9) are defined as follows: they each contain a single nucleotide (A, T, C, or G, respectively) and the reagents necessary for elongation, starting from the primer, the complementary strand of the nucleic acid to be sequenced, with the exception of the other nucleotides.
  • nucleotide order given here is arbitrary, and can of course be changed. Furthermore, they can contain an equivalent of nucleotides A, C, T or G, as defined above. Other elements can, if necessary, be added to these fluids, as was mentioned above and will be recalled below.
  • each of the reaction fluids (6-9) is in the form of an independent phase, separated from the other fluids by a gaseous or liquid separating fluid (10), immiscible with the reaction fluids (6 -9).
  • a device for sequencing nucleic acids comprising at least the following elements:
  • a tube (1) comprising a reaction zone (2) to which are fixed polynucleotide primers (3), - means (4) for setting in motion a fluid (5), comprising the reaction fluids (6-9 ), in the tube (1), allowing at least part of the fluid (5) to make several passages at the level of the reaction zone (2),
  • reaction fluids (6-9) into the tube (1), in the form of separate phases
  • the tube (1) can be either circular or linear.
  • the tube (1) forms a loop, and the means (4) for setting in motion the fluid (5) ensure for example the continuous circulation of the fluid (5) along this loop; in the second case, they allow the fluid (5) to go back and forth along a portion of the tube (1), so that the reaction fluids (6-9) pass successively and cyclically to the level of the reaction zone (2).
  • the nucleic acid sequencing device can be an open system, in which reaction fluids (6-9) as defined above are introduced one after the other, so that a continuous circulation is ensured in the tube (1), between the part of the tube into which the fluids are introduced and a device for collecting the fluids when they exit the tube, after they have passed through the reaction zone (2).
  • the fluids preferentially circulate at a speed greater than the speed of diffusion of the nucleotides in the reaction solutions, in order to avoid artefacts.
  • a rinsing fluid (11) can be introduced into the tube between each reaction fluid containing nucleotides.
  • the device of the invention therefore comprises at least: - a tube (1) comprising a reaction zone (2) to which are fixed polynucleotide primers (3),
  • the tube (1) can be of circular section or the like. In all cases, the diameter of the circle in which the section of the tube is inscribed will be designated by the term "tube diameter (1)".
  • the tube (1) has a length between 0.2 and 20 cm and a diameter between 1 and 3000 ⁇ m, preferably between 1 and 1000 ⁇ m. In what follows, the tube (1) will therefore sometimes be called a “capillary”, given its dimensions. Due to the reduced diameter of the tube (1), the volumes of reagents involved in the methods and devices of the invention are very small, of the order of a few tens or hundreds of nanoliters, which makes it possible to obtain reduced sequencing costs.
  • the tube (1) comprises, at the level of the reaction zone (2), a chamber whose diameter is greater than that of the rest of the tube.
  • the "diameter" of the chamber is defined, as for the tube (1), as being the diameter of the circle in which the section of the chamber is inscribed, perpendicular to the passage of the fluid.
  • the reaction chamber can be a tube of non-circular section, for example having radial folds, so that the diameter of the chamber is greater than that of the tube (1), but that the surface of the section of the chamber is substantially equal to that of the tube (1).
  • the reaction zone (2) can have a particular geometry increasing the reaction surface, for example villi, to obtain a higher density of polynucleotide primers (3).
  • the polynucleotide primers (3) can be composed of a single type of nucleotides, but are preferably composed of a non-monotonic sequence of nucleotides, so that the hybridization of the target sequence on the primer determines exactly the position of said target sequence relative to the primer.
  • the examples below are presented with polythymine primers in order to simplify the description.
  • the length of these primers is for example between 15 and 100 nucleotides, preferably between 40 and 60 nucleotides, and the number of polynucleotide primers (3) fixed at the level of the reaction zone (2) can be between 10 and
  • these devices comprise several tubes (1), which allow several sequencing operations to be carried out in parallel.
  • all or part of the means for setting in motion (4) of the fluid may be common to several tubes (1), as well as all or part of the means for supplying the reaction fluids (6-9 ) in the tubes (1).
  • the means for setting in motion (4) of the fluid are pneumatic means.
  • other means for setting fluids in motion can be envisaged, such as the use of flexible tubes on which rollers are supported which push the fluid by crushing a variable part of the tube, or even by arranging the tubes. radially and using centrifugal force.
  • the means for supplying the reaction fluids (6-9) comprise at least one zone (15) for depositing the reactants.
  • This zone can consist of a funnel connected to the tube (1), in which the reaction fluids can be deposited manually or automatically.
  • this zone can be an adapter between one end of the tube (1) and one or more channels connected to reagent reservoirs.
  • the measurement device In the sequencing devices of the invention, the measurement device
  • the measuring device (14) is preferably an optical device for excitation and measurement of luminescence, fluorescence, or chemiluminescence. More preferably, the measuring device (14) is an excitation device and fluorescence measurement capable of measuring an increase in fluorescence of 1% and, preferably, 0.1% or even lower.
  • the measurement device (14) is connected to a computer system (16), programmed to translate the measured results into a genetic sequence.
  • the computer system (16) can also be connected to the means (4) for setting in motion the fluid (5) contained in the tube (1) and / or to the means for bringing the reaction fluids (6-9) into the tube. (1).
  • connection piston (4) to the computer (16) connects the information collected by the sensor (14) to the position of the piston (4).
  • the possible elongation observed is therefore linked to the position of the fluid (5) in the tube, and thereby to the reaction fluid which has just passed through the reaction zone (2), which makes it possible to deduce the nature of the incorporated nucleotide.
  • the computer system can be connected to the means of supply •> reaction fluids.
  • the information collected by the sensor (14) will be linked to the nature of the nucleotide which has just passed through the reaction zone (2).
  • the computer system (16) is not necessarily connected to the means (4) for setting in motion the fluid (5) contained in the tube (1) nor to the means for supplying the reaction fluids (6-9) in the tube (1).
  • the correlation between the measurement carried out by the device (14) and the reaction fluid (6, 7, 8, or 9) which has just passed at the level of the reaction zone can be made for example by a clock system, the passage of fluids then being programmed precisely.
  • the nucleotides can each be labeled in a different way, for example by being coupled to fluorophores of different fluorescence wavelengths. The nature of the incorporated nucleotide is then determined directly from the information collected by the sensor (14).
  • the sequencing device further comprises an electromagnetic radiation emission device, intended to release a marker from a photocleavable compound.
  • an electromagnetic radiation emission device intended to release a marker from a photocleavable compound.
  • the sensitivity of the device for measuring the elongation of the double-stranded nucleic acid conditions the maximum size of the fragments which can be sequenced.
  • the use of labile labeling, for example photo-cleavable, linked either to the nucleotides or to an intercalant, or to any molecule capable of binding to the double-stranded nucleic acid molecule being extended therefore allows to periodically suppress the marking of molecules during elongation, by an electromagnetic discharge, while maintaining the integrity of these molecules, and therefore to continue sequencing without risk exceeding the sensitivity limits of the sensor.
  • the device for emitting electromagnetic radiation and the measuring device (14) can be combined in the same device.
  • the tube (s) (1) are arranged in a disposable cassette (17), optionally recyclable by the manufacturer. This makes it possible in particular to ensure good calibration of the number and quality of the polynucleotide primers fixed at the level of the reaction zone (2), and to facilitate the use of the devices and methods of the invention.
  • the invention also relates to sequencing cassettes (17), comprising at least
  • a tube (1) comprising a reaction zone (2) to which are fixed polynucleotide primers (3), and - an opening (18) adaptable to means for setting in motion (4) of a fluid (5) in the tube (1), allowing at least part of the fluid (5) to make several passages at the level of the reaction zone (2).
  • the cassettes of the invention can be recycled after use, for example by the method described in Example 2.
  • the tube (1) can have a circular section, and preferably has a length between 0.2 and 20 cm and a diameter between 1 and 3000 ⁇ m.
  • the tube (1) may comprise, at the level of the reaction zone (2), a chamber whose diameter is greater than that of the rest of the tube.
  • the reaction zone (2) can have a particular geometry increasing the reaction surface, for example to obtain greater density of polynucleotide primers (3).
  • the polynucleotide primers (3) fixed at the level of the reaction zone (2) are composed of a determined sequence of nucleotides, for example of a single type of nucleotides, preferably thymine. Their length is preferably between 15 and 100 nucleotides, for example between 40 and 60 nucleotides.
  • the number of polynucleotide primers (3) fixed at the level of the reaction zone (2) is between 10 3 and 10 9 , preferably between 10 6 and 10 8 .
  • Those skilled in the art can use any means available to fix the primers at the level of the reaction zone (2), such as for example a covalent chemical grafting or an affine bond of avidin / biotin type. This grafting can be carried out directly on the walls of the tube (1), or on mobile elements such as beads, possibly magnetic, which will then be "trapped" in the reaction zone (2).
  • the cassettes of the invention comprise several tubes (1). This allows in particular to perform several sequencing in parallel.
  • all the tubes (1) can be connected to the same opening (18) adaptable to means for setting in motion (4) a fluid (5) in the tube (1).
  • the tube (s) (1) each comprise a zone for depositing the reagents (15).
  • this reagent deposition zone (15) can be common to several tubes, or even to all the tubes.
  • the reagent deposition zone (15) can for example be an opening adaptable to means for supplying the reaction fluids.
  • the sequencing cassette (17) is already loaded with the reaction fluids (6-9).
  • Such a cassette has the advantage of being ready to use, and its use only requires hybridizing the nucleic acid to be sequenced in the reaction zone (2).
  • the supply of the nucleic acid to be sequenced can be carried out, for example, by tapping a syringe through a membrane or septum (21) situated near or at the level of the reaction zone (2), as shown in the Figure 4 and specified in Example 4.
  • the cassette may include a zone for depositing the nucleic acid to be sequenced, located between the reaction zone and the reaction fluids, or downstream of the reaction zone, said deposition zone being adaptable to the device, in such a way that the device itself brings the fluid into the cassette, for example by pneumatic means.
  • the present invention therefore relates to a sequencing cassette (17), comprising at least
  • a tube (1) comprising a reaction zone (2) to which are fixed polynucleotide primers (3), and
  • each tube (1) additionally contains the reaction fluids (6) to (9), containing respectively the nucleotide A, T, C, or G, and the reagents necessary for the elongation, starting from the primer, the complementary strand of the nucleic acid to be sequenced, with the exception of the other nucleotides, each of the reaction fluids (6-9) being in the form of a phase independent, separated from the other fluids by a gaseous or liquid separating fluid (10), immiscible with the reaction fluids (6-9).
  • all of the reaction fluids (6-9) are initially located on the same side of the tube (1) relative to the reaction zone (2).
  • the reaction fluids (6-9) can additionally contain an elongation marker for a double-stranded nucleic acid molecule, such as a fluorescent intercalator or an intercalator coupled to a labeled molecule, where appropriate by a photo-cleavable bond.
  • an elongation marker for a double-stranded nucleic acid molecule such as a fluorescent intercalator or an intercalator coupled to a labeled molecule, where appropriate by a photo-cleavable bond.
  • the nucleotides contained in each of the reaction fluids (6-9) of the cassettes (17) ready for use can be labeled or coupled to a labeled molecule, if necessary by a photo-cleavable bond.
  • reaction fluids can contain a specific dye which makes it possible to visually distinguish the different reaction fluids, and therefore, indirectly, to determine the nucleotide present in each fluid.
  • the invention also relates to a sequencing cassette (17) such as those described above, in which the tube (1) also contains a rinsing solution (1 1), containing, if necessary, one or more enzymes. capable (s) of degrading nucleotide triphosphates.
  • the rinsing solution can be placed in the tube (s) (1), between each reaction fluid (6-9) and on either side of the fluids (6-9), as shown in Figure 2.
  • the rinsing fluid (11) and the separating fluid (10) can be combined.
  • the rinsing fluid (1 1) can be located in a branch of the tube (1), provided with own means for setting in motion said fluid or adaptable to such means.
  • the means for setting in motion (14) of the reaction fluids (6-9) and those of the rinsing fluid (11) will have to operate in a perfectly coordinated manner, as shown in FIG. 3 and explained in example 3.
  • the invention also relates to a sequencing device usable with the cassettes of the invention or with equivalent cassettes.
  • equivalent cassette is meant here a cassette allowing the elongation of a strand of nucleic acid from a single-stranded nucleic acid matrix and a primer, by successive passage of reaction fluids each containing a given nucleotide.
  • the invention therefore relates to a device comprising means for setting in motion (4) a fluid (5), the means for regulating (13) the temperature of the fluid.
  • each cassette comprising one or more tube (s) (1).
  • FIG. 1 illustrates the process implemented by a sequencing device according to the invention, known as “in a closed system”, as well as the first steps of sequencing.
  • Figures 1A to 1 D are discussed in Example 1 below.
  • FIG. 2 illustrates an example of arrangement of the fluids (6-11) in a tube (1), in which the rinsing fluid (11) is placed on either side of each of the reaction fluids (6-9), separated from them by the separating fluid (10).
  • FIG. 3 illustrates a variant of the device, in which the rinsing fluid (11) is set in motion by pneumatic means (20) distinct from the means (4) ensuring the circulation of the reaction fluids (6-9) in the tube ( 1), and as described in Example 3.
  • FIG. 4 illustrates the use of a “ready to use” cassette, as described in example 4.
  • Example 1 Loading the device and initiating sequencing
  • This example illustrated in FIG. 1, describes the first stages of sequencing, with a device provided with an excitation and fluorescence measurement device (14), using a fluorescent interlayer of the SybrGREEN type (registered trademark) for measure the elongation of the double-stranded DNA molecule.
  • a fluorescent interlayer of the SybrGREEN type registered trademark
  • Figure 1A shows the device before the introduction of fluid into the tube (1).
  • the piston (4) is connected to a computer (16) which receives the data measured by the sensor (14), which makes it possible to correlate the measurements to the position of the fluids in the tube (1), and therefore to associate an increase in fluorescence with the integration of a given nucleotide.
  • Figure 1 D The activation of the piston (4) then makes it possible to pass the reaction fluids (6) to (9) at the level of the reaction zone (2), the temperature of which will have been brought either to the temperature d hybridization, but at the elongation temperature of the primer, which results in the elongation of the primer (3).
  • a nucleotide G has been incorporated, reflecting the presence of a nucleotide C in the nucleic acid to be sequenced.
  • Example 2 Solutions for sequencing beyond 1000 bp, with an apparatus for excitation and measurement of fluorescence and permanent fluorophores
  • Permanent fluorophores designate here either a fluorescent intercalator, of the SybrGREEN type (registered trademark), or nucleotides stably coupled to a fluorescent marker, in contrast to molecules labilely coupled (for example, photo-cleavable), to a fluorescent marker.
  • the use of permanent fluorophores poses the following problem: during the elongation of the complementary strand of the nucleic acid to be sequenced, the increase in fluorescence, corresponding to the incorporation of a nucleotide, represents a proportion of more in addition to the total fluorescence.
  • polynucleotide primers will here be poly-thymines.
  • reaction zone (2) is then brought to a temperature sufficient to denature the DNA (approximately 95 ° C.), so that the fragment of interest, initially hybrid to the primers, is no longer hybrid to the neosynthesized strand, but in solution.
  • c) The user recovers this fragment.
  • the rinsing solution is brought back to the deposition zone (15) by pneumatic means, where it is collected by the user.
  • primer 1 is identical to one of those which served to amplify the sequence of interest prior to the use of the system. Its sequence is that of the 5 'end of the fragment used in the previous sequencing cycle, where primer 2 has a sequence identical to that of the neosynthesized strand, at its 3' end.
  • This PCR makes it possible to obtain fragments shorter than those obtained at the end of the initial amplification (they are amputated from the sequence just decrypted in the previous step) and to repeat the process and therefore to sequence fragments of size greater than 1000 bp.
  • the number of PCR cycles to be carried out is determined so that the sequence obtained is in excess relative to the primers (3) fixed, and represents a large fraction of the total DNA, so that the proportion of the initial sequence is very low relatively to the shorter news.
  • Ten to 15 PCR amplification cycles are generally sufficient to meet these requirements.
  • the user will fix at 3 ′ of the PCR product a fragment of equal size and of sequence complementary to the primers (3) fixed.
  • Steps a) and b) mentioned above are identical.
  • the primers are manufactured in situ, that is to say that the device is equipped to carry out synthesis of oligonucleotides, from instructions given to it by the system, namely the sequences corresponding to the primers desired: o primer 1: sequence supplied by the user to the computer system (1b) when launching the sequencing (sequence which served to amplify the sequence of interest), o primer 2: sequence supplied by the computer system (1b ) who obtained it due to sequencing.
  • the device is equipped with oligonucleotide synthesis stations and dilution means, and with means for bringing the oligonucleotides to the correct concentration in the aforementioned basin (and also with reservoirs, means for washing and elimination of reagents in order to restart the operation).
  • nucleic acid fragments thus obtained are then brought into (2), in a new capillary, which has been changed by the user, or which was already incorporated in the system but which has not yet been used.
  • a fragment of equal size and sequence complementary to the primer (3) previously fixed in (2) is provided at the level of the reaction zone (2).
  • the zone (2) is brought to the right temperature to allow hybridization of this fragment with the primer (3).
  • An exonuclease is then supplied to the reaction zone (2), for example using pneumatic means (4), which allows the polishing of the protruding 3 ′ ends, by digestion of the elongated part of the primer polyT.
  • reaction zone (2) is then heated to bring it to the DNA denaturation temperature (approximately 95 ° C.), in order to release in solution the complementary sequence (polyA sequence), then washed.
  • the reaction zone (2) is found in its initial state, with a population of primers (3) polyT.
  • This arrangement is shown in Figure 2. It consists of alternating the aqueous phases and the separating fluid (10) (for example, oil), the sequence of the aqueous phases itself being alternating reaction fluid and solution rinsing (11);
  • FIGS. 3A to 3D illustrate the rinsing of the reaction zone (2) between the passage of the reaction fluids (6) and (7).
  • reaction fluid (6) has just passed at the level of the reaction zone, and the rinsing fluid (11) is in the branch of the tube (1) which opens near the reaction zone (2) .
  • the rinsing solution preferably has a high volume compared to that of the reaction fluids, in order to dilute as much as possible the potential reagents that it will potentially entail each time it passes through the reaction zone, and therefore to keep as much as possible its function of rinsing solution, unpolluted.
  • nucleic acid solution to be sequenced (12).
  • the fragments to be sequenced were of course prepared by adding a 3 ′ end complementary to the primers (3) fixed at the level of the reaction zone (2).
  • the cassette illustrated in Figure 4, has an elastomeric membrane (21), allowing the introduction of the tip of a needle at a point in the tube (1), located between the piston (14) and the reaction zone (2) ( Figure 4A).
  • the introduction of the fluid containing the fragments to be sequenced (2) causes a displacement of the reaction fluids (6-9) (from ⁇ to ⁇ , see FIG. 4B).
  • the piston (4) is then actuated to bring the solution (12) to the level of the reaction zone (2) (FIG. 4C).
  • the reaction zone (2) is brought to a temperature allowing the hybridization of the fragments to be sequenced with the primers (3) fixed in (2).
  • the sequencing proper can then begin, by back and forth movements allowing the successive passage of fluids (6-9) at the level of the reaction zone (2) ( Figures 4D and 4E).

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Abstract

La présente invention porte sur des méthodes de séquençage d'acides nucléiques, ainsi que sur des dispositifs de séquençage d'acides nucléiques et sur des cassettes jetables utilisables dans ces dispositifs. L'invention est basée sur la mesure de l'élongation d'un acide nucléique double brin, à partir d'une matrice d'acide nucléique simple brin à séquencer, hybridée à une amorce fixée sur un support, par mise en contact de la matrice à séquencer successivement avec des fluides réactionnels comportant un nucléotide donné.

Description

DISPOSITIF INTEGRE ET MINIATURISE DE SEQUENÇAGE D'ACIDES NUCLEIQUES
La présente invention porte sur des méthodes de séquençage d'acides nucléiques, ainsi que sur des dispositifs de séquençage d'acides nucléiques et sur des cassettes jetables utilisables dans ces dispositifs.
L'invention est basée sur la mesure de l'élongation d'un acide nucléique double brin, à partir d'une matrice d'acide nucléique simple brin à séquencer, hybridée à une amorce fixée sur un support, par mise en contact de la matrice à séquencer successivement avec des fluides réactionnels comportant un nucleotide donné.
Le séquençage d'acides nucléiques est un outil essentiel, d'importance grandissante, dans plusieurs domaines de la recherche en biologie et de ses applications. Ceci est le cas, par exemple, en recherche en biologie moléculaire, en virologie, en phylogénétique ou en épidémiologie, ou encore dans la recherche pour l'amélioration des espèces végétales.
Dans tous ces domaines, le séquençage de génomes viraux, bactériens, végétaux ou animaux, trouve de nombreuses applications. Par ailleurs, le séquençage d'ADN est déjà utilisé comme moyen de diagnostic d'un désordre ou d'une anomalie génétique. Il est probable que ce moyen de diagnostic sera de plus en plus utilisé à l'avenir, permettant, par exemple, de déterminer la susceptibilité d'un individu à un médicament donné, ou de diagnostiquer une prédisposition à une pathologie.
La majorité des méthodes de séquençage utilisées actuellement sont dérivées de la méthode de Sanger, ou d'une méthode chimique comportant une étape de traitement chimique modéré qui détruit sélectivement l'une des quatre bases de l'ADN. Dans la méthode de Sanger, l'ADN à séquencer est utilisé comme matrice pour la synthèse in vitro, par l'ADN polymérase, d'une série de répliques partielles de la chaîne d'ADN, commençant toutes au même niveau, mais se terminant en différents points. La clé de cette méthode est l'utilisation de didésoxyribonucléosides triphosphates, dans lesquels le groupement 3'- OH du désoxyribose, présent dans les nucléotides normaux, est absent.
Lorsqu'un tel nucleotide modifié est incorporé à la chaîne d'ADN, il bloque l'addition du nucleotide suivant. Cette réaction, tout comme la réaction d'hydrolyse chimique ménagée, donne un ensemble de fragments d'ADN de tailles différentes, qui sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel de poiyacrylamide. La préparation et le chargement des gels, ainsi que l'analyse suivant l' électrophorèse, sont lourds à mettre en. œuvre, et des efforts importants ont été réalisés pour automatiser ces étapes. En dépit de la mise au point de séquenceurs automatisés, utilisés notamment dans les projets à grande échelle de séquençage des génomes humain ou autres, ces méthodes de séquençage restent très onéreuses et difficiles à mettre en œuvre dans un laboratoire d'analyse médicale. Il existe donc une demande importante pour des dispositifs de séquençage d'ADN à plus grand débit, tant pour le séquençage de génomes que pour les applications cliniques de routine.
La présente invention a pour objet des méthodes et dispositifs de séquençage à haut débit, qui sont de mise en œuvre aisée et économique. La présente invention permet notamment de s'affranchir de l'étape particulièrement lourde d' électrophorèse sur gel de poiyacrylamide, en proposant d'effectuer l'élongation d'un brin d'acide nucléique, à partir d'une matrice d'ADN simple brin ou d'ARN à séquencer, hybridée en 3' à une amorce, par l'apport séquentiel de plusieurs solutions d'élongation contenant chacune un nucleotide donné. L'élongation du brin complémentaire à la matrice dont on cherche à déterminer la séquence est mesurée après le passage de chacun des nucléotides, ce qui permet de déterminer la séquence en question. Le concept de séquençage par incorporation de nucléotides a déjà été suggéré, notamment dans la demande de brevet WO 00/50642. Toutefois, les méthodes et dispositifs de l'art antérieur ne proposent pas de système permettant à la fois d'éviter le mélange des nucléotides au niveau du site réactionnel (ce qui conduirait à des erreurs de séquençage), et une rapidité satisfaisante.
L'invention porte donc en premier lieu sur une méthode de séquençage d'acide nucléique, comportant les étapes suivantes :
1 ) hybridation de l'acide nucléique à séquencer, sous forme simple brin, à une amorce polynucléotidique fixée dans un tube capillaire, au niveau d'une zone réactionnelle,
2) élongation du brin complémentaire dudit acide nucléique à séquencer, par la mise en mouvement d'un fluide contenu dans le tube capillaire, ledit fluide comportant, dans des phases distinctes, des fluides réactionnels contenant chacun un seul nucleotide (A, T,
C, ou G, respectivement) et les réactifs nécessaires à l'élongation, à partir de l'amorce, du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer, à l'exception des autres nucléotides, de telle façon que la mise en mouvement du fluide dans le tube capillaire permette le passage, au niveau de la zone réactionnelle, des fluides réactionnels contenant chacun un nucleotide donné,
3) mesure de l'élongation du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer, après le passage de chacun des fluides réactionnels au niveau de la zone réactionnelle.
Dans cette méthode, désignée ci-après par le terme "méthode en système fermé", la mise en mouvement du fluide dans le tube est par exemple effectuée par des moyens pneumatiques, et le mouvement du fluide dans le tube est de préférence un mouvement cyclique, par exemple un mouvement de va-et-vient de part et d'autre de la zone réactionnelle, de la partie du fluide comportant les fluides réactionnels.
Dans une réalisation préférée de la méthode décrite ci-dessus, chacun des fluides réactionnels est séparé des autres fluides par un fluide séparateur gazeux ou liquide, non miscible avec les fluides réactionnels.
Un exemple de mise en œuvre des premières étapes de cette méthode est décrit à l'exemple 1 ci-dessous, et illustré à la figure 1.
L'invention porte aussi sur une méthode de séquençage d'acide nucléique, qui comporte les étapes suivantes : 1 ) hybridation de l'acide nucléique à séquencer, sous forme simple brin, à une amorce polynucléotidique fixée dans un tube capillaire, au niveau d'une zone réactionnelle,
2) élongation du brin complémentaire dudit acide nucléique à séquencer, par le passage en continu, dans le tube, de fluides réactionnels contenant chacun un seul nucleotide (A, T, C, ou G, respectivement) et les réactifs nécessaires à l'élongation, à partir de l'amorce, du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer, à l'exception des autres nucléotides, lesdits fluides traversant l'un après l'autre, de façon cyclique, le tube capillaire à une vitesse supérieure à la vitesse de diffusion des nucléotides dans les fluides réactionnels (définie par une constante),
3) mesure de l'élongation du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer, après le passage de chacun des fluides réactionnels au niveau de la zone réactionnelle.
Une variante de cette méthode, désignée ci-après par le terme "méthode en système ouvert", consiste à faire passer en continu à une vitesse donnée, supérieure ou non à la vitesse de diffusion des fluides, un fluide porteur, dans lequel on injecte les fluides réactionnels à intervalles donnés, par exemple à l'aide d'un distributeur piezzo-électrique. Les intervalles entre les injections de fluides sont déterminés en fonction de la vitesse de passage du fluide et de la vitesse de diffusion des nucléotides, de telle sorte qu'il n'y ait pas de mélange possible entre les nucléotides.
Le fluide porteur est de préférence un fluide aqueux, et peut contenir ou non up certain nombre de réactifs autres que les nucléotides. Ces réactifs peuvent alors, le cas échéant, être absents des fluides réactionnels.
Dans les méthodes décrites ci-dessus, chaque fluide réactionnel contient un seul type de nucleotide, qui ne sera incorporé dans le brin en cours d'élongation à partir de l'amorce que s'il est complémentaire de la base située sur l'acide nucléique à séquencer, au niveau suivant immédiatement la partie déjà séquencée. Ainsi, la détection de l'élongation du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer, après le passage de chaque fluide réactionnel contenant un type de nucléotides donné, permet de déduire la séquence de la matrice : par exemple, l'incorporation de A, suivie de l'incorporation de deux C et d'un G, indique la présence de la séquence 5'-CGGT-3'.
Le type de nucleotide incorporé est identifié soit par un marqueur spécifique détectable par un dispositif de mesure, soit par une identification du fluide réactionnel les contenant. Les moyens d'identification peuvent être physiques, comme cela est décrit dans la description du dispositif, ou colorimétriques, chaque fluide réactionnel contenant alors un colorant qui lui est spécifique. Dans ce dernier cas, le colorant permet d'identifier le fluide réactionnel présent au niveau de la zone réactionnelle et donc, indirectement, le . type de nucleotide éventuellement incorporé. Bien entendu, l'ordre dans lequel les nucléotides sont placés dans les fluides réactionnels est quelconque. Il importe seulement qu'il soit connu. Par ailleurs, l'utilisation d'équivalents des nucléotides A, C, T, ou G entre également dans le cadre des méthodes de l'invention. Par « équivalent », on entend ici n'importe quel type de molécule capable de former une chaîne complémentaire de l'acide nucléique à séquencer. Par exemple, l'uracije (U) est un équivalent de la thymidine (T).
Parmi les équivalents des nucléotides, on peut citer notamment les analogues de nucléotides bloquant l'extension en 3' de façon réversible. L'utilisation de tels analogues permet l'incorporation d'un seul nucleotide à la fois lors du passage d'une nucleotide, même lorsque la matrice présente une répétition du nucleotide complémentaire. L'élimination du groupement bloquant, par exemple par photoclivage, permet la poursuite de l'élongation à l'étape suivante. L'utilisation de tels équivalents permet donc de contrôler la vitesse d'extension de l'amorce même en présence de nucléotides répétés. Le déblocage du nucleotide 3' -terminal intervient alors de préférence après rinçage et/ou destruction des nucléotides non incorporés.
Dans les méthodes décrites ci-dessus, il n'est pas indispensable que chaque fluide réactionnel contienne l'ensemble des réactifs habituellement nécessaires à une réaction d'élongation. En particulier, l'ADN polymérase possède une constante d'affinité pour son substrat suffisamment élevée pour qu'elle ne s'en décroche pas immédiatement lors du passage d'un fluide ne contenant pas cette enzyme. Dans le cas de la méthode en système fermé, elle peut donc n'être présente que dans un fluide, contenant ou non des nucléotides. Dans la méthode en système ouvert, l'ADN polymérase peut être introduite seulement au départ, avec, le cas échéant, un ou plusieurs nouveaux passages de fluide la contenant, au cours de la réaction de séquençage. Une telle utilisation parcimonieuse de l'ADN polymérase permet d'abaisser le coût du séquençage, sans toutefois en diminuer la qualité.
La première étape des méthodes décrites ci-dessus peut être remplacée par une étape équivalente, c'est-à-dire une étape à l'issue de laquelle l'acide nucléique à séquencer est hybride à une amorce localisée et maintenue au niveau de la zone réactionnelle. Par exemple, l'acide nucléique à séquencer peut être hybride, sous forme simple brin, à des amorces fixées sur des billes magnétiques, qui sont ensuite introduites dans le tube et maintenues au niveau de la zone réactionnelle à l'aide d'un aimant.
La mesure de l'élongation du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer peut être effectuée de plusieurs façons. Elle peut être directe, par exemple en utilisant des nucléotides couplés à un marqueur fluorescent et en mesurant l'augmentation de la fluorescence de la zone réactionnelle, ou indirecte, par exemple en mesurant le départ des molécules de pyrophosphate, l'incorporation d'un nucleotide entraînant la libération d'une molécule de pyrophosphate.
Un autre type de mesure indirecte de l'élongation consiste à mesurer une quantité d'intercalant fluorescent dans un fluide réactionnel avant et après son passage au niveau du site de la synthèse nucléique. La différence de fluorescence traduira alors l'incorporation de nucléotides dans la molécule en cours d'élongation.
Un troisième type de mesure indirecte consiste à utiliser des nucléotides couplés à un marqueur (fluorescent par exemple), de telle sorte que le marqueur soit photoclivable et bloque l'élongation de la chaîne en 3'.
Après passage du fluide réactionnel comportant le nucleotide couplé, et élimination des nucléotides non incorporés, une impulsion lumineuse est envoyée au niveau de la zone réactionnelle, et les marqueurs fluorescents éventuellement libérés sont détectés en aval de cette zone.
Dans une mise en œuvre préférée des méthodes de l'invention, la mesure de l'élongation du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer est effectuée par un dispositif de mesure placé en regard de la zone réactionnelle, par exemple un dispositif optique tel qu'un appareil d'excitation et de mesure de luminescence, fluorescence, ou chemiluminescence.
De manière encore préférée, le dispositif de mesure est un appareil d'excitation et de mesure de fluorescence capable de mesurer une augmentation de fluorescence de 1% et, préférentiellement, de 0,1%. Ceci permet, par exemple, d'utiliser comme marqueur de l'élongation de l'acide nucléique double brin, un intercalant fluorescent du type bromure d'ethydium ou SybrGREEN (marque déposée). L'incorporation de x nucléotides se traduira alors par une augmentation de la fluorescence de x/n %, n désignant ici le nombre de bases du brin complémentaire de la matrice à séquencer, amorce comprise. Par exemple, si ce brin atteint 100 nucléotides et que la séquence de la matrice comporte 3 Guanines successives au niveau suivant immédiatement la partie déjà séquencée, le passage du fluide réactionnel comportant le nucleotide C, entraînera une augmentation de la fluorescence de 3%. Au fur et à mesure de l'élongation de la sonde, l'augmentation de la fluorescence après l'incorporation d'un nucleotide représentera donc une proportion de plus en plus faible de la fluorescence totale. La sensibilité du détecteur utilisé détermine donc la taille maximale des fragments qu'il est possible de séquencer. Ainsi, un appareil d'excitation et de mesure de fluorescence capable de mesurer une augmentation de fluorescence de 0,1 % permet de séquencer des fragments de 1000 bases. L'invention porte également sur des méthodes permettant de séquencer des fragments de grande taille avec un capteur de sensibilité réduite, en utilisant un marquage labile ou éphémère de la molécule en cours d'élongation. Par exemple, il peut être avantageux d'utiliser, pour l'élongation du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer, des nucléotides couplés à des molécules fluorescentes par une liaison clivable. Des exemples de conjugués photo-clivables, permettant la libération d'un marqueur couplé à une biomolécule par une décharge électromagnétique, sont donnés dans le brevet US 5986076. L'utilisation de tels composés permet donc de supprimer périodiquement le marquage des molécules en cours d'élongation, par une décharge électromagnétique, tout en maintenant l'intégrité de ces molécules, et donc de poursuivre le séquençage sans risquer de dépasser les limites de sensibilité du capteur.
Le marquage fluorescent des molécules peut également être supprimé par photoblanchiment (photobleaching), c'est-à-dire en détruisant les fluorophores par une impulsion électromagnétique.
D'autres méthodes permettant de poursuivre le séquençage d'une molécule d'acide nucléique au-delà de la limite fixée par la sensibilité du capteur, font également partie de l'invention. Ces méthodes consistent, pour l'essentiel, à effectuer une « marche par étapes » le long de la molécule à séquencer, en utilisant l'information issue d'une première étape de séquençage, pour synthétiser une nouvelle amorce située en limite de la zone séquencée, permettant ensuite l'amplification sélective de la séquence non encore connue. Une nouvelle étape de séquençage commence alors, en utilisant comme matrice le produit de cette amplification sélective. Bien entendu, l'amorce séquencée à partir des informations issues de la première étape de séquençage peut être située à un niveau quelconque de la séquence déjà connue, ce qui permet, le cas échéant, de séquencer plusieurs fois certaines zones de la molécule, et d'augmenter ainsi le niveau de fiabilité de la méthode. Des exemples de méthodes pour séquencer des acides nucléiques de grande taille sont décrits plus en détail dans l'exemple 2 ci-après.
Dans une mise en œuvre préférée des méthodes de séquençage de l'invention, les fluides réactionnels contiennent donc un marqueur d'élongation d'une molécule d'acide nucléique double brin, tel qu'un intercalant fluorescent ou un intercalant couplé à une molécule marquée, le cas échéant par une liaison photo-clivable. Dans une mise en œuvre alternative des méthodes de l'invention, les nucléotides contenus dans chacun des fluides réactionnels sont marqués ou couplés à une molécule marquée, le cas échéant par une liaison photo-clivable.
Dans une mise en œuvre particulière des méthodes de séquençage de l'invention, une étape de rinçage de la zone réactionnelle par une solution de rinçage est introduite après le passage de chacun des fluides réactionnels, ladite solution de rinçage contenant, le cas échéant, une ou plusieurs enzymes capable(s) de dégrader les nucléotides triphosphates. Une telle enzyme peut être, par exemple, une apyrase. Dans cette mise en œuvre des méthodes de l'invention, le fluide de rinçage peut être situé de part et d'autre de chacun des fluides réactionnels, ou amené au niveau du site réactionnel à partir d'un embranchement du tube capillaire, comme décrit dans les figures 2 et 3, respectivement, ainsi que dans l'exemple 3.
Dans les méthodes de l'invention, chacun des fluides réactionnels est laissé au contact de la zone réactionnelle pendant une durée comprise de préférence entre 10 et 200 ms, par exemple de 50 à 100 ms. Dans une mise en œuvre préférée des méthodes de séquençage de l'invention, l'étape d'élongation 2) est effectuée entre 65 et 75 °C, préférentiellement entre 71 ,5 et 72,5 °C.
L'invention porte également sur une méthode de séquençage telle que celles décrites ci-dessus, dans laquelle plusieurs tubes capillaires sont utilisés pour réaliser plusieurs séquençages en parallèle.
Un autre aspect de l'invention, illustré à la figure 1, concerne un dispositif de séquençage d'acide nucléique comportant au moins un tube (1 ) comportant une zone réactionnelle (2), où se trouvent des amorces polynucléotidiques (3), ledit tube (1) contenant un fluide (5) polyphasique contenant les fluides réactionnels (6-9), de telle sorte que les fluides réactionnels effectuent des passages successifs au niveau de la zone réactionnelle (2). Dans l'ensemble du texte, les fluides (6-9) sont définis de la façon suivante : ils contiennent chacun un seul nucleotide (A, T, C, ou G, respectivement) et les réactifs nécessaires à l'élongation, à partir de l'amorce, du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer, à l'exception des autres nucléotides. Comme mentionné plus haut, l'ordre des nucléotides donné ici est arbitraire, et peut bien évidemment être modifié. Par ailleurs, ils peuvent contenir un équivalent des nucléotides A, C, T ou G, comme défini ci-dessus. D'autres éléments peuvent, le cas échéant, être rajoutés dans ces fluides, comme cela a été mentionné plus haut et sera rappelé plus loin.
Dans cette réalisation de l'invention, chacun des fluides réactionnels (6-9) est sous la forme d'une phase indépendante, séparée des autres fluides par un fluide séparateur (10) gazeux ou liquide, non miscible avec les fluides réactionnels (6-9). Ainsi, l'invention porte en premier lieu sur un dispositif de séquençage d'acides nucléiques, comportant au moins les éléments suivants :
- un tube (1) comportant une zone réactionnelle (2) à laquelle sont fixées des amorces polynucléotidiques (3), - des moyens (4) de mise en mouvement d'un fluide (5), comportant les fluides réactionnels (6-9), dans le tube (1 ), permettant à une partie au moins du fluide (5) d'effectuer plusieurs passages au niveau de la zone réactionnelle (2),
- des moyens d'amenée des fluides réactionnels (6-9) dans le tube (1 ), sous forme de phases distinctes,
- des moyens (13) de régulation de la température des fluides réactionnels (6-9), au moins au niveau de la zone réactionnelle (2), et
- un dispositif de mesure (14) placé en regard de la zone réactionnelle (2), destiné à mesurer l'incorporation d'un marqueur dans une molécule d'acide nucléique en cours d'extension.
Dans cette réalisation de l'invention, le tube (1) peut être soit circulaire, soit linéaire. Dans le premier cas, le tube (1) forme une boucle, et les moyens (4) de mise en mouvement du fluide (5) assurent par exemple la circulation continue du fluide (5) dans le long de cette boucle ; dans le deuxième cas, ils permettent au fluide (5) d'effectuer des va-et-vient le long d'une portion du tube (1), de telle sorte que les fluides réactionnels (6-9) passent successivement et cycliquement au niveau de la zone réactionnelle (2).
Alternativement, le dispositif de séquençage d'acide nucléique peut être un système ouvert, dans lequel des fluides réactionnels (6-9) tels que définis ci-dessus sont introduits les uns après les autres, de telle sorte qu'une circulation continue soit assurée dans le tube (1), entre la partie du tube où sont introduits les fluides et un dispositif de collection des fluides à leur sortie du tube, après leur passage au niveau de la zone réactionnelle (2). Dans un tel dispositif, les fluides circulent préférentiellement à une vitesse supérieure à la vitesse de diffusion des nucléotides dans les solutions réactionnelles, afin d'éviter des artefacts. Le cas échéant, un fluide de rinçage (11 ) peut être introduit dans le tube entre chaque fluide réactionnel contenant des nucléotides.
Dans cette deuxième réalisation, le dispositif de l'invention comporte donc au moins : - un tube (1 ) comportant une zone réactionnelle (2) à laquelle sont fixées des amorces polynucléotidiques (3),
- des moyens d'amenée des fluides réactionnels (6-9) dans le tube (1).
- des moyens (4) de mise en mouvement des fluides réactionnels (6- 9) dans le tube (1), permettant le passage continu desdits fluides dans le tube (1), à une vitesse supérieure à la vitesse de diffusion des réactifs contenus dans lesdits fluides réactionnels,
- un dispositif de collection des fluides à leur sortie du tube (1 ),
- des moyens (13) de régulation de la température des fluides réactionnels (6-9), et
- un dispositif de mesure (14) placé en regard de la zone réactionnelle (2), destiné à mesurer l'incorporation d'un marqueur dans une molécule d'acide nucléique en cours d'extension.
Dans les dispositifs de l'invention décrits ci-dessus, le tube (1) peut être de section circulaire ou autre. Dans tous les cas, on désignera sous le terme « diamètre du tube (1) » le diamètre du cercle dans lequel s'inscrit la section du tube. Dans une réalisation préférée des dispositifs de l'invention, le tube (1) a une longueur comprise entre 0,2 et 20 cm et un diamètre compris entre 1 et 3000 μm, de préférence entre 1 et 1000 μm. Dans ce qui suit, le tube (1) sera donc parfois appelé « capillaire », compte-tenu de ses dimensions. Du fait du diamètre réduit du tube (1 ), les volumes de réactifs mis en jeu dans les méthodes et dispositifs de l'invention sont très faibles, de l'ordre de quelques dizaines ou centaines de nanolitres, ce qui permet d'obtenir des coûts de séquençage réduits.
Dans une réalisation particulière de l'invention, le tube (1 ) comporte, au niveau de la zone réactionnelle (2), une chambre dont le diamètre est supérieur à celui du reste du tube. Le "diamètre" de la chambre est défini, comme pour le tube (1), comme étant le diamètre du cercle dans lequel s'inscrit la section de la chambre, perpendiculairement au passage du fluide. Ainsi, la chambre réactionnelle peut être un tube de section non circulaire, présentant par exemple des plis radiaux, de telle sorte que le diamètre de la chambre soit supérieur à celui du tube (1), mais que la surface de la section de la chambre soit sensiblement égale à celle du tube (1 ). Alternativement ou de façon complémentaire, la zone réactionnelle (2) peut avoir une géométrie particulière augmentant la surface de réaction, par exemple des villosités, pour obtenir une plus grande densité d'amorces polynucléotidiques (3).
Dans les dispositifs de l'invention, les amorces polynucléotidiques (3) peuvent être composées d'un seul type de nucléotides, mais sont préférentiellement composées d'une séquence non monotone de nucléotides, afin que l'hybridation de la séquence cible sur l'amorce détermine exactement la position de ladite séquence cible par rapport à l'amorce. Les exemples ci-après sont présentés avec des amorces poly- thymine dans le but d'en simplifier l'exposé. La longueur de ces amorces est par exemple comprise entre 15 et 100 nucléotides, préférentiellement entre 40 et 60 nucléotides, et le nombre d'amorces polynucléotidiques (3) fixées au niveau de la zone réactionnelle (2) peut être compris entre 10 et
Dans une réalisation particulière des dispositifs de l'invention, ces dispositifs comportent plusieurs tubes (1), qui permettent de réaliser plusieurs séquençages en parallèle. Dans cette réalisation particulière de l'invention, tout ou partie des moyens de mise en mouvement (4) du fluide peuvent être communs à plusieurs tubes (1), ainsi que tout ou partie des moyens d'amenée des fluides réactionnels (6-9) dans les tubes (1).
Dans une autre réalisation particulière de l'invention, les moyens de mise en mouvement (4) du fluide sont des moyens pneumatiques. Bien entendu, d'autres moyens de mise en mouvement des fluides peuvent être envisagés, tels que l'utilisation de tubes souples sur lesquels s'appuient des galets qui poussent le fluide en écrasant une partie variable du tube, ou encore en disposant les tubes de façon radiale et en utilisant la force centrifuge.
Dans une réalisation supplémentaire des dispositifs de l'invention, les moyens d'amenée des fluides réactionnels (6-9) comportent au moins une zone (15) de dépôt des réactifs. Cette zone peut être constituée d'un entonnoir relié au tube (1 ), dans lequel les fluides réactionnels peuvent être déposés manuellement ou de façon automatisée. Alternativement, cette zone peut être un adaptateur entre une extrémité du tube (1) et un ou plusieurs canaux reliés à des réservoirs de réactifs.
Dans les dispositifs de séquençage de l'invention, le dispositif de mesure
(14) est préférentiellement un appareil optique d'excitation et de mesure de luminescence, fluorescence, ou chemiluminescence. De manière encore préférée, le dispositif de mesure (14) est un appareil d'excitation et de mesure de fluorescence capable de mesurer une augmentation de fluorescence de 1% et, préférentiellement, de 0,1 %, voire plus faible.
D'autres moyens alternatifs de mesure de l'élongation de l'amorce (3) sont néanmoins envisageables et dépendent bien évidemment du type de marquage utilisé. Par exemple, il est possible d'utiliser des nucléotides radioactifs et un compteur de radioactivité comme dispositif de mesure .
Dans une réalisation préférée des dispositifs de l'invention, le dispositif de mesure (14) est relié à un système informatique (16), programmé pour traduire les résultats mesurés en une séquence génétique. Le système informatique (16) peut être relié aussi aux moyens (4) de mise en mouvement du fluide (5) contenu dans le tube (1) et/ou aux moyens d'amenée des fluides réactionnels (6-9) dans le tube (1 ). Ceci permet d'assurer la cohérence de la lecture de la séquence, c'est-à-dire de faire une corrélation exacte entre la mesure de l'élongation du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer et le passage d'un nucleotide donné.
Ainsi, dans un système fermé tel que décrit à la Figure 1 , où le fluide (5) contient les fluides réactionnels (6-9), sous forme de phases distinctes deplaçables dans le tube par des moyens pneumatiques symbolisés par un piston, la liaison du piston (4) à l'ordinateur (16) permet de relier l'information recueillie par le capteur (14) à la position du piston (4). L'élongation éventuelle observée est donc reliée à la position du fluide (5) dans le tube, et par là même, au fluide réactionnel qui vient de passer au niveau de la zone réactionnelle (2), ce qui permet de déduire la nature du nucleotide incorporé.
Par ailleurs, dans un système ouvert tel que décrit plus haut, dans lequel les fluides (6-9) sont amenés les uns après les autres, et parcourent le tube (1) pour être ensuite collectés dans une « poubelle », le système informatique peut être relié aux moyens d'amenée •> des fluides réactionnels. Ainsi, l'information recueillie par le capteur (14) sera reliée à la nature du nucleotide qui vient de passer au niveau de la zone réactionnelle (2).
Toutefois, le système informatique (16) n'est pas obligatoirement relié aux moyens (4) de mise en mouvement du fluide (5) contenu dans le tube (1) ni aux moyens d'amenée des fluides réactionnels (6-9) dans le tube (1). En absence d'une telle liaison, la corrélation entre la mesure effectuée par le dispositif (14) et le fluide réactionnel (6, 7, 8, ou 9) qui vient de passer au niveau de la zone réactionnelle peut être faite par exemple par un système d'horloge, le passage des fluides étant alors programmé de façon précise. Alternativement, les nucléotides peuvent être marqués chacun d'une façon différente, par exemple en étant couplés à des fluorophores de longueur d'onde de fluorescence différentes. La détermination de la nature du nucleotide incorporé se fait alors directement à partir de l'information recueillie par le capteur (14).
Dans une réalisation particulière de l'invention, le dispositif de séquençage comporte en outre un dispositif d'émission de radiations électromagnétiques, destiné à libérer un marqueur d'un composé photo- clivable. En effet, comme mentionné plus haut, la sensibilité du dispositif de mesure de l'élongation de l'acide nucléique double brin conditionne la taille maximale des fragments qui peuvent être séquences. L'utilisation d'un marquage labile, par exemple photo-clivable, lié soit aux nucléotides, soit à un intercalant, ou à toute molécule susceptible de se lier à la molécule d'acide nucléique double brin en cours d'extension, permet donc de supprimer périodiquement le marquage des molécules en cours d'élongation, par une décharge électromagnétique, tout en maintenant l'intégrité de ces molécules, et donc de poursuivre le séquençage sans risquer de dépasser les limites de sensibilité du capteur. Bien entendu, dans cette réalisation de l'invention, le dispositif d'émission de radiations électromagnétiques et le dispositif de mesure (14) peuvent être associés dans le même dispositif.
Dans une réalisation particulièrement préférée des dispositifs de l'invention, le ou les tube(s) (1) sont agencés dans une cassette (17) jetable, le cas échéant recyclable par le fabricant. Ceci permet notamment d'assurer un bon calibrage du nombre et de la qualité des amorces polynucléotidiques fixées au niveau de la zone réactionnelle (2), et de faciliter l'utilisation des dispositifs et méthodes de l'invention.
L'invention porte aussi sur des cassettes de séquençage (17), comportant au moins
- un tube (1) comportant une zone réactionnelle (2) à laquelle sont fixées des amorces polynucléotidiques (3), et - une ouverture (18) adaptable à des moyens de mise en mouvement (4) d'un fluide (5) dans le tube (1), permettant à une partie au moins du fluide (5) d'effectuer plusieurs passages au niveau de la zone réactionnelle (2).
Les cassettes de l'invention peuvent être recyclées après usage, par exemple par la méthode décrite dans l'exemple 2.
Dans les cassettes de l'invention, le tube (1 ) peut avoir une section circulaire, et a préférentiellement une longueur comprise entre 0,2 et 20 cm et un diamètre compris entre 1 et 3000 μm. Le cas échéant, le tube (1) peut comporter, au niveau de la zone réactionnelle (2), une chambre dont le diamètre est supérieur à celui du reste du tube. Alternativement ou de façon complémentaire, la zone réactionnelle (2) peut avoir une géométrie particulière augmentant la surface de réaction, par exemple pour obtenir une plus grande densité d'amorces polynucléotidiques (3). Les amorces polynucléotidiques (3) fixées au niveau de la zone réactionnelle (2) sont composées d'une séquence déterminée de nucléotides, par exemple d'un seul type de nucléotides, préférentiellement de thymine. Leur longueur est de préférence comprise entre 15 et 100 nucléotides, par exemple entre 40 et 60 nucléotides.
Dans une réalisation préférée des cassettes de l'invention, le nombre d'amorces polynucléotidiques (3) fixées au niveau de la zone réactionnelle (2) est compris entre 103 et 109, préférentiellement entre 106 et 108. L'homme du métier pourra utiliser n'importe quel moyen disponible pour fixer les amorces au niveau de la zone réactionnelle (2), comme par exemple un greffage chimique covalent ou une liaison affine de type avidine/biotine. Ce greffage peut être réalisé directement sur les parois du tube (1 ), ou sur des éléments mobiles tels que des billes, éventuellement magnétiques, qui seront ensuite « piégés » au niveau de la zone réactionnelle (2).
Dans une réalisation particulière, les cassettes de l'invention comportent plusieurs tubes (1 ). Ceci permet notamment d'effectuer plusieurs séquençages en parallèle. Dans une telle cassette, tous les tubes (1 ) peuvent être reliés à une même ouverture (18) adaptable à des moyens de mise en mouvement (4) d'un fluide (5) dans le tube (1 ).
Dans une réalisation particulière des dispositifs de l'invention, le ou les tube(s) (1 ) comportent chacun une zone de dépôt des réactifs (15). Dans le cas où la cassette comporte plusieurs tubes, cette zone de dépôt des réactifs (15) peut être commune à plusieurs tubes, voire à tous les tubes.
La zone de dépôt des réactifs (15) peut par exemple être une ouverture adaptable à des moyens d'amenée des fluides réactionnels. Dans une autre réalisation particulière des cassettes de l'invention, utilisable dans un système fermé tel que décrit plus haut, la cassette de séquençage (17) est déjà chargée avec les fluides réactionnels (6-9). Une telle cassette présente l'avantage d'être prête à l'emploi, et son utilisation nécessite seulement d'hybrider l'acide nucléique à séquencer au niveau de la zone réactionnelle (2). L'apport de l'acide nucléique à séquencer peut être réalisé par exemple en piquant une seringue au travers d'une membrane ou septum (21 ) situé à proximité ou au niveau de la zone réactionnelle (2), comme cela est représenté à la figure 4 et précisé dans l'exemple 4. Alternativement et afin d'éviter des problèmes de pression suite au perçage du septum par la seringue, la cassette peut comporter une zone de dépôt de l'acide nucléique à séquencer, située entre la zone réactionnelle et les fluides réactionnels, ou en aval de la zone réactionnelle, ladite zone de dépôt étant adaptable au dispositif, de telle façon que le dispositif amène lui-même le fluide dans la cassette, par exemple par des moyens pneumatiques.
La présente invention porte donc sur une cassette de séquençage (17), comportant au moins
- un tube (1 ) comportant une zone réactionnelle (2) à laquelle sont fixées des amorces polynucléotidiques (3), et
- une ouverture (18) adaptable à des moyens de mise en mouvement (4) d'un fluide (5) dans le tube (1 ), permettant à une partie au moins du fluide (5) d'effectuer plusieurs passages au niveau de la zone réactionnelle (2), dans laquelle chaque tube (1 ) contient en outre les fluides réactionnels (6) à (9), contenant respectivement le nucleotide A, T, C, ou G, et les réactifs nécessaires à l'élongation, à partir de l'amorce, du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer, à l'exception des autres nucléotides, chacun des fluides réactionnels (6-9) étant sous la forme d'une phase indépendante, séparée des autres fluides par un fluide séparateur (10) gazeux ou liquide, non miscible avec les fluides réactionnels (6-9).
De manière préférée, l'ensemble des fluides réactionnels (6-9) est initialement situé du même côté du tube (1 ) par rapport à la zone réactionnelle (2).
Dans les cassettes de séquençage (17) prêtes à l'emploi décrites ci- dessus, les fluides réactionnels (6-9) peuvent contenir en outre un marqueur d'élongation d'une molécule d'acide nucléique double brin, tel qu'un intercalant fluorescent ou un intercalant couplé à une molécule marquée, le cas échéant par une liaison photo-clivable. Alternativement ou de façon complémentaire, les nucléotides contenus dans chacun des fluides réactionnels (6-9) des cassettes (17) prêtes à l'emploi peuvent être marqués ou couplés à une molécule marquée, le cas échéant par une liaison photo-clivable.
De plus, les fluides réactionnels peuvent contenir un colorant spécifique qui permet de distinguer visuellement les différents fluides réactionnels, et donc, indirectement, de déterminer le nucleotide présent dans chaque fluide.
L'invention porte aussi sur une cassette de séquençage (17) telle que celles décrites ci-dessus, dans laquelle le tube (1) contient en outre une solution de rinçage (1 1 ), contenant, le cas échéant, une ou plusieurs enzymes capable(s) de dégrader les nucléotides triphosphates. Dans le cas où la cassette est prête à l'emploi, la solution de rinçage peut être placée dans le(s) tube(s) (1), entre chaque fluide réactionnel (6-9) et de part et d'autre des fluides (6-9), comme cela est représenté à la figure 2.
Le cas échéant, le fluide de rinçage (11 ) et le fluide séparateur (10) peuvent être confondus. Alternativement, que la cassette soit prête à l'emploi ou non chargée avec les fluides réactionnels, le fluide de rinçage (1 1 ) peut être situé dans un embranchement du tube (1 ), doté de moyens propres de mise en mouvement dudit fluide ou adaptable à de tels moyens. Dans ce cas, les moyens de mise en mouvement (14) des fluides réactionnels (6-9) et ceux du fluide de rinçage (11 ) devront fonctionner de façon parfaitement coordonnée, comme cela est représenté à la figure 3 et expliqué à l'exemple 3.
L'invention porte également sur un dispositif de séquençage utilisable avec les cassettes de l'invention ou avec des cassettes équivalentes. Par « cassette équivalente », on entend ici une cassette permettant l'élongation d'un brin d'acide nucléique à partir d'une matrice d'acide nucléique simple brin et d'une amorce, par passage successif de fluides réactionnels contenant chacun un nucleotide donné. L'invention porte donc sur un dispositif comportant des moyens de mise en mouvement (4) d'un fluide (5), les moyens de régulation (13) de la température du fluide
(5), et un dispositif de mesure (14), agencés dans un séquenceur dans lequel on peut placer une ou plusieurs cassettes (17) à usage unique, chaque cassette comportant un ou plusieurs tube(s) (1 ).
Les exemples et figures ci-après, illustrent certains aspects de la mise en œuvre et de l'intérêt de la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.
Légende des figures :
La figure 1 illustre le procédé mis en œuvre par un dispositif de séquençage suivant l'invention, dit « en système fermé », ainsi que les premières étapes du séquençage. Les figures 1A à 1 D sont commentées dans l'exemple 1 ci-après. La figure 2 illustre un exemple de disposition des fluides (6-11) dans un tube (1), dans lequel le fluide de rinçage (11) est placé de part et d'autre de chacun des fluides réactionnels (6-9), séparé de ceux-ci par le fluide séparateur (10).
La figure 3 illustre une variante du dispositif, dans laquelle le fluide de rinçage (11 ) est mis en mouvement par des moyens pneumatiques (20) distincts des moyens (4) assurant la circulation des fluides réactionnels (6- 9) dans le tube (1 ), et tel que décrit dans l'exemple 3.
La figure 4 illustre l'utilisation d'une cassette « prête à l'emploi », telle que décrite dans l'exemple 4.
Exemple 1 : Chargement du dispositif et initiation du séquençage
Cet exemple, illustré à la figure 1 , décrit les premières étapes du séquençage, avec un dispositif muni d'un appareil d'excitation et de mesure de la fluorescence (14), en utilisant un intercalant fluorescent du type SybrGREEN (marque déposée) pour mesurer l'élongation de la molécule d'ADN double brin.
• La figure 1A représente le dispositif avant l'introduction de fluide dans le tube (1 ). Dans cet exemple, le piston (4) est relié à un ordinateur (16) qui reçoit les données mesurées par le capteur (14), ce qui permet de corréler les mesures à la position des fluides dans le tube (1), et donc d'associer une augmentation de la fluorescence à l'intégration d'un nucleotide donné.
• Dans l'illustration de la figure 1 B, le fragment à séquencer (12) a été introduit au niveau de la zone de dépôt (15), puis le piston (4) a été actionné pour amener le fluide (12) au niveau de la zone réactionnelle (2), portée à une température permettant l'hybridation du fragment à séquencer avec les amorces (3) fixées au niveau de la zone réactionnelle (2). Un fluide séparateur (10), non miscible avec (12), a été introduit immédiatement après la solution contenant le fragment d'intérêt (12).
• Figure 1C : Après l'hybridation du fragment à séquencer au niveau de la zone réactionnelle (2), les fluides réactionnels (6) à (9) sont introduits dans le tube (1), séparés les uns des autres par le fluide séparateur (10). L'ordre d'introduction des nucléotides présenté ici (A, T, C, G) est arbitraire, et tout autre ordre peut être envisagé. De même, on peut envisager introduire dans le tube (1) plusieurs fois chaque fluide réactionnel.
• Figure 1 D : L'activation du piston (4) permet ensuite de faire passer les fluides réactionnels (6) à (9) au niveau de la zone réactionnelle (2), dont la température aura été portée non plus à la température d'hybridation, mais à la température d'élongation de l'amorce, ce qui entraîne l'élongation de l'amorce (3). Ainsi, dans l'illustration de la figure 1D, un nucleotide G a été incorporé, reflétant la présence d'un nucleotide C dans l'acide nucléique à séquencer.
Exemple 2 : Solutions pour séquencer au-delà de 1000 bp, avec un appareil d'excitation et de mesure de fluorescence et des fluorophores permanents
Les fluorophores permanents désignent ici, soit un intercalant fluorescent, du type SybrGREEN (marque déposée), soit des nucléotides couplés de façon stable à un marqueur fluorescent, par opposition à des molécules couplées de façon labile (par exemple, photo-clivable), à un marqueur fluorescent. L'utilisation de fluorophores permanents pose le problème suivant : au cours de l'élongation du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer, l'augmentation de la fluorescence, correspondant à l'incorporation d'un nucleotide, représene une proportion de plus en plus faible de la fluorescence totale.
Pour poursuivre le séquençage au-delà d'une certaine longueur séquencée, il est donc nécessaire de s'affranchir de la fluorescence correspondant à la région déjà séquencée.
Deux options peuvent être envisagées pour cela. Afin de simplifier les explications, les amorces polynucléotidiques seront ici des poly-thymines.
Bien entendu, ce qui suit est transposable à n'importe quelle séquence d'amorces.
1 ) Option manuelle
Au-delà de 1000 bp, l'utilisateur recommence toute l'opération en injectant dans un nouveau capillaire le reste de la séquence d'intérêt, en procédant de la façon suivante :
a) Une fois arrivé à 1000 bp d'allongement du brin complémentaire de la matrice à séquencer, on effectue un lavage, puis une solution de rinçage aqueuse (H2O ou solution tamponnée) est déposée au niveau de la zone de dépôt (15), puis amenée au niveau de la zone réactionnelle (2) par les moyens de mise en mouvement (4).
b) La zone réactionnelle (2) est ensuite portée à une température suffisante pour dénaturer l'ADN (environ 95° C), afin que le fragment d'intérêt, initialement hybride aux amorces, ne soit plus hybride au brin néosynthétisé, mais en solution. c) L'utilisateur récupère ce fragment. Par exemple, la solution de rinçage est ramenée au niveau de la zone de dépôt (15) par les moyens pneumatiques, où elle est collectée par l'utilisateur.
d) Il procède ensuite à une nouvelle PCR, à partir du fragment initial, à l'aide des amorces suivantes :
• o l'amorce 1 est identique à l'une de celles qui avaient servi à amplifier la séquence d'intérêt préalablement à l'utilisation du système. Sa séquence est celle de l'extrémité 5' du fragment utilisé au cycle de séquençage précédent, o l'amorce 2 a une séquence identique à celle du brin néosynthétisé, en son extrémité 3'.
Cette PCR permet d'obtenir des fragments plus courts que ceux obtenus à l'issue de l'amplification initiale (ils sont amputés de la séquence juste décryptée dans l'étape précédente) et de réitérer le processus et donc de séquencer des fragments de taille supérieure à 1000 bp. Le nombre de cycles PCR à effectuer est déterminé pour que la séquence obtenue soit en excès par rapport aux amorces (3) fixées, et représente une grande fraction de l'ADN total, de telle sorte que la proportion de la séquence initiale soit très faible relativement à la nouvelle plus courte. Dix à 15 cycles d'amplification par PCR suffisent généralement à atteindre ces exigences. Bien entendu et comme précédemment, l'utilisateur fixera en 3' du produit de la PCR un fragment de taille égale et de séquence complémentaire aux amorces (3) fixées.
e) Ces opérations seront effectuées autant de fois que nécessaire, en fonction de la taille du fragment à séquencer.
2) Option automatisée Au-delà de 1000 bp, l'automate continue seul le reste des opérations.
Les étapes a) et b) mentionnées ci-dessus sont identiques.
f) La solution contenant le fragment d'ADN dont on recherche la séquence est amenée par des moyens pneumatiques dans un bassin contenant tous les réactifs nécessaires à une PCR. Les amorces sont telles qu'indiquées ci-dessus. Ce bassin peut être porté successivement aux températures correspondant aux cycles PCR, par des résistances ou par tout autre moyen.
g) Les amorces sont fabriquées in situ, c'est-à-dire que le dispositif est équipé pour procéder à de la synthèse d'oligonucléotides, à partir d'instructions que lui aura données le système, à savoir les séquences correspondantes aux amorces souhaitées : o amorce 1 : séquence fournie par l'utilisateur au système informatique (1b) lors du lancement du séquençage (séquence qui lui a servi pour amplifier la séquence d'intérêt), o amorce 2 : séquence fournie par le système informatique (1b) qui l'a obtenue du fait du séquençage.
Ainsi, le dispositif est équipé de stations de synthèse d'oligonucléotides et de moyens de dilution, et de moyens d'amenée des oligonucléotides à la bonne concentration dans le bassin susmentionné (et également de réservoirs, de moyens de lavage et d'élimination des réactifs afin de recommencer l'opération).
h) Dans le même bassin ou dans un autre bassin, un fragment complémentaire de l'amorce (3) placée en (2) est fixé à l'extrémité
3' du fragment amplifié (ici, une queue polyA). i) Les fragments d'acide nucléique ainsi obtenus sont ensuite amenés en (2), dans un nouveau capillaire, qui aura été changé par l'utilisateur, ou bien qui était déjà incorporé dans le système mais qui n'a pas encore servi.
3) Autre variante automatisée avec recyclage du ou des capillaire(s)
En parallèle de la PCR, les étapes suivantes peuvent se dérouler dans le capillaire utilisé dans l'étape de séquençage :
j) Un fragment de taille égale et de séquence complémentaire à l'amorce (3) préalablement fixée en (2), est apporté au niveau de la zone réactionnelle (2). La zone (2) est portée à la bonne température pour permettre l'hybridation de ce fragment avec l'amorce (3).
k) Une exonucléase est ensuite apportée au niveau de la zone réactionnelle (2), par exemple en utilisant les moyens pneumatiques (4), ce qui permet le polissage des extrémités 3' protubérantes, par la digestion de la partie allongée de l'amorce polyT.
I) La zone réactionnelle (2) est ensuite chauffée pour la porter à la température de dénaturation de l'ADN (environ 95°C), afin de libérer en solution la séquence complémentaire (séquence polyA), puis lavée. Ainsi, la zone réactionnelle (2) se retrouve dans son état initial, avec une population d'amorces (3) polyT.
Ceci permet d'injecter le produit de la nouvelle PCR dans le même capillaire, autant de fois que cela sera nécessaire (par exemple, 1 fois toutes les 1000 bp). Exemple 3 : Utilisation d'un fluide de rinçage (11)
Deux façons d'utiliser un fluide de rinçage aqueux (11), miscible avec les fluides réactionnels (6-9), sont présentées ici :
1) disposition du fluide de rinçage (11) de part et d'autre de chacun des fluides réactionnels (6-9) :
Cette disposition est représentée à la figure 2. Elle consiste à alterner les phases aqueuses et le fluide séparateur (10) (par exemple, de l'huile), la séquence des phases aqueuses étant elle- même une alternance de fluide réactionnel et de solution de rinçage (11) ;
2) apport du fluide de rinçage (11) à partir d'un embranchement du tube (1), grâce à des moyens de mise en mouvement (20) distincts des moyens de mise en mouvement (4) des fluides réactionnels (6- 9) : Cette disposition, illustrée à la figure 3, nécessite une coordination parfaite entre les pistons (4) et (20). Les figures 3A à 3D illustrent le rinçage de la zone réactionnelle (2) entre le passage des fluides réactionnels (6) et (7).
A la figure 3A, le fluide réactionnel (6) vient de passer au niveau de la zone réactionnelle, et le fluide de rinçage (11) est dans l'embranchement du tube (1) qui débouche à proximité de la zone réactionnelle (2).
Le mouvement simultané du piston (4) (vers le haut) et du piston (20) (vers le bas), permet d'apporter le fluide de rinçage (11) au niveau de la zone réactionnelle (2) (figure 3B).
Le mouvement inverse permet de remonter le fluide de rinçage dans l'embranchement (figure 3C). Le rinçage de la zone (2) ayant été effectué, le mouvement du piston (4) seul permet ensuite d'apporter le fluide réactionnel (7) au niveau de la zone réactionnelle (2) (figure 3D).
La solution de rinçage a de préférence un volume élevé par rapport à celui des fluides réactionnels, afin de diluer au maximum les réactifs potentiels qu'elle entraînera potentiellement à chacun de ses passages au niveau de la zone réactionnelle, et donc de conserver le plus possible sa fonction de solution de rinçage, non polluée.
Exemple 4 : Hybridation de l'acide nucléique à séquencer, dans des cassettes prêtes à l'emploi
On considère ici une cassette prête à l'emploi, c'est-à-dire déjà chargée avec les fluides réactionnels (6-9), séparés les uns des autres par le fluide séparateur (10).
Avant d'initier le séquençage, l'opérateur doit introduire dans cette cassette, au niveau de la zone réactionnelle (2), une solution d'acide nucléique à séquencer (12). Les fragments à séquencer ont bien entendu été préparés, par l'ajout d'une extrémité 3' complémentaire des amorces (3) fixées au niveau de la zone réactionnelle (2).
La cassette, illustrée à la figure 4, dispose d'une membrane élastomère (21), permettant l'introduction de la pointe d'une aiguille en un point du tube (1), situé entre le piston (14) et la zone réactionnelle (2) (figure 4A).
L'introduction du fluide contenant les fragments à séquencer (2) entraîne un déplacement des fluides réactionnels (6-9) (de α vers ε, voir la figure 4B). Le piston (4) est ensuite actionné pour apporter la solution (12) au niveau de la zone réactionnelle (2) (figure 4C). La zone réactionnelle (2) est portée à une température permettant l'hybridation des fragments à séquencer aux amorces (3) fixées en (2).
Le séquençage proprement dit peut alors commencer, par des mouvements de va-et-vient permettant le passage successif des fluides (6-9) au niveau de la zone réactionnelle (2) (Figures 4D et 4E).

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de séquençage d'acide nucléique, comportant les étapes suivantes :
1) hybridation de l'acide nucléique à séquencer, sous forme simple brin, à une amorce polynucléotidique fixée dans un tube capillaire, au niveau d'une zone réactionnelle,
2) élongation du brin complémentaire dudit acide nucléique à séquencer, par la mise en mouvement d'un fluide contenu dans le tube, ledit fluide comportant, dans des phases distinctes, des fluides réactionnels contenant respectivement le nucleotide A, T,
C, ou G, et les réactifs nécessaires à l'élongation, à partir de l'amorce, du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer, à l'exception des autres nucléotides, de telle façon que la mise en mouvement du fluide dans le tube permette le passage successif de chacun des fluides réactionnels au niveau de la zone réactionnelle,
3) mesure de l'élongation du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer, après le passage de chacun des fluides réactionnels au niveau de la zone réactionnelle.
2. Méthode de séquençage selon la revendication 1 , dans laquelle la mise en mouvement du fluide dans le tube est effectuée par des moyens pneumatiques.
3. Méthode de séquençage selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le mouvement du fluide dans le tube est un mouvement cyclique, préférentiellement un mouvement de va-et-vient de part et d'autre de la zone réactionnelle, de la partie du fluide comportant les fluides réactionnels.
4. Méthode de séquençage selon les revendications 1 à 3, dans laquelle chacun des fluides réactionnels est séparé des autres fluides par un fluide séparateur gazeux ou liquide, non miscible avec les fluides réactionnels.
5. Méthode de séquençage d'acide nucléique, comportant les étapes suivantes :
1) hybridation de l'acide nucléique à séquencer, sous forme simple brin, à une amorce polynucléotidique fixée dans un tube capillaire, au niveau d'une zone réactionnelle, 2) élongation du brin complémentaire dudit acide nucléique à séquencer, par le passage en continu, dans le tube, de fluides réactionnels contenant respectivement le nucleotide A, T, C, ou G, et les réactifs nécessaires à l'élongation, à partir de l'amorce, du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer, à l'exception des autres nucléotides, lesdits fluides réactionnels traversant le tube l'un après l'autre, de façon cyclique, à une vitesse supérieure à la vitesse de diffusion des nucléotides dans les fluides réactionnels,
3) mesure de l'élongation du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer, après le passage de chacun des fluides réactionnels au niveau de la zone réactionnelle.
6. Méthode de séquençage selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comportant en outre une étape de rinçage de la zone réactionnelle par une solution de rinçage après le passage de chacun des fluides réactionnels, ladite solution de rinçage contenant, le cas échéant, une ou plusieurs enzymes capable(s) de dégrader les nucléotides triphosphates.
7. Méthode de séquençage selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle les fluides réactionnels contiennent en outre un marqueur d'élongation d'une molécule d'acide nucléique double brin, tel qu'un intercalant fluorescent ou un intercalant couplé à une molécule marquée, le cas échéant par une liaison photo-clivable.
8. Méthode de séquençage selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle les nucléotides contenus dans chacun des fluides réactionnels sont marqués ou couplés à une molécule marquée, le cas échéant par une liaison photo-clivable.
9. Méthode de séquençage selon l'une quelconque des revendications
1 à 8, dans laquelle la mesure de l'élongation du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer est effectuée par un dispositif de mesure placé en regard de la zone réactionnelle, tel qu'un appareil d'excitation et de mesure de luminescence, fluorescence, ou chemiluminescence .
10. Dispositif de séquençage d'acide nucléique comportant au moins
- un ou plusieurs tube(s) (1 ) comportant chacun une zone réactionnelle (2) à laquelle sont fixées des amorces polynucléotidiques (3), - des moyens (4) de mise en mouvement d'un fluide (5) dans chaque tube (1), permettant à une partie au moins du fluide (5) d'effectuer plusieurs passages au niveau de la zone réactionnelle (2),
- des moyens d'amenée des fluides réactionnels (6-9) dans chaque tube (1 ), sous forme de phases distinctes,
- des moyens (13) de régulation de la température des fluides réactionnels (6-9), et - un dispositif de mesure (14) placé en regard de la zone réactionnelle (2), destiné à mesurer l'incorporation d'un marqueur dans une molécule d'acide nucléique en cours d'extension.
11. Dispositif de séquençage d'acide nucléique comportant au moins - un ou plusieurs tube(s) (1) comportant une zone réactionnelle (2)
• à laquelle sont fixées des amorces polynucléotidiques (3),
- des moyens d'amenée des fluides réactionnels (6-9) dans chaque tube (1 ),
- des moyens (4) de mise en mouvement des fluides réactionnels (6-9) dans chaque tube (1), permettant le passage en continu desdits fluides dans chaque tube (1 ), à une vitesse supérieure à la vitesse de diffusion des réactifs contenus dans lesdits fluides réactionnels,
- un dispositif de collection des fluides à leur sortie du ou des tube(s) (1),
- des moyens (13) de régulation de la température des fluides réactionnels (6-9), et
- un dispositif de mesure (14) placé en regard de la zone réactionnelle (2), destiné à mesurer l'incorporation d'un marqueur dans une molécule d'acide nucléique en cours d'extension.
12. Dispositif selon la revendication 10 ou 11 , dans lequel chaque tube (1 ) a une longueur comprise entre 0,2 et 20 cm et un diamètre compris entre 1 et 3000 μm.
13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, dans lequel chaque tube (1) comporte, au niveau de la zone réactionnelle
(2), une chambre dont le diamètre est supérieur à celui du reste du tube.
14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, dans lequel les amorces polynucléotidiques (3) ont une longueur comprise entre 15 et 100 nucléotides, préférentiellement entre 40 et 60 nucléotides.
15. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, dans lequel le nombre d'amorces polynucléotidiques (3) fixées au niveau de la zone réactionnelle (2) est compris entre 103 et 109, préférentiellement entre 106 et 108.
16. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, dans lequel tout ou partie des moyens de mise en mouvement (4) du fluide, et/ou tout ou partie des moyens d'amenée de fluides réactionnels (6-9), sont communs à plusieurs tubes (1).
17. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 16, dans lequel les moyens de mise en mouvement (4) du fluide sont des moyens pneumatiques.
18. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 17, dans lequel les moyens d'amenée de fluides réactionnels (6-9) comportent au moins une zone (15) de dépôt des réactifs.
19. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 18, dans lequel le dispositif de mesure (14) est un appareil d'excitation et de mesure de luminescence, fluorescence, ou chemiluminescence .
20. Dispositif selon la revendication 19, dans lequel le dispositif de mesure (14) est un appareil d'excitation et de mesure de fluorescence capable de mesurer une augmentation de fluorescence de 1 % et, préférentiellement, de 0,1 %.
21. Dispositif selon la revendication 19, dans lequel le dispositif de mesure (14) est relié à un système informatique (16) programmé pour traduire les résultats mesurés en une séquence génétique.
22. Dispositif selon la revendication 21 , dans lequel le système informatique (16) est aussi relié aux moyens (4) de mise en mouvement du fluide (5) contenu dans le ou les tube(s) (1) et/ou aux moyens d'amenée des fluides réactionnels (6-9) dans le ou les tube(s) (1).
23. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 22, comportant en outre un dispositif d'émission de radiations électromagnétiques, destiné à libérer un marqueur d'un composé photo-clivable.
24. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 23, dans lequel le ou les tube(s) (1 ) sont agencés dans une cassette (17) à usage unique.
25. Cassette de séquençage (17), comportant au moins
- un ou plusieurs tube(s) (1) comportant une zone réactionnelle (2) aux parois de laquelle sont fixées des amorces polynucléotidiques (3), et - une ouverture (18) adaptable à des moyens de mise en mouvement (4) d'un fluide (5) dans le ou les tube(s) (1), permettant à une partie au moins du fluide (5) d'effectuer plusieurs passages au niveau de la zone réactionnelle (2).
26. Cassette de séquençage (17) selon la revendication 25, dans laquelle tous les tubes (1) sont reliés à la même ouverture (18).
27. Cassette de séquençage (17) selon la revendication 25 ou 26, dans laquelle chaque tube (1 ) a une section circulaire.
28. Cassette de séquençage (17) selon les revendications 25 à 27, dans laquelle chaque tube (1 ) a une longueur comprise entre 0,2 et 20 cm et un diamètre compris entre 1 et 3000 μm.
29. Cassette de séquençage (17) selon les revendications 25 à 28, dans laquelle chaque tube (1 ) comporte, au niveau de la zone réactionnelle (2), une chambre dont le diamètre est supérieur à celui du reste du tube.
30. Cassette de séquençage (17) selon les revendications 25 à 29, dans laquelle les amorces polynucléotidiques (3) ont une longueur comprise entre 15 et 100 nucléotides, préférentiellement entre 40 et 60 nucléotides.
31. Cassette de séquençage (17) selon les revendications 25 à 30, dans laquelle le nombre d'amorces polynucléotidiques (3) fixées au niveau de la zone réactionnelle (2) est compris entre 103 et 109, préférentiellement entre 106 et 108.
32. Cassette de séquençage (17) selon l'une quelconque des revendications 25 à 31 , dans laquelle chaque tube (1 ) comporte en outre une zone de dépôt des réactifs (15).
33. Cassette de séquençage (17) selon la revendication 32, dans laquelle tous les tubes (1) sont reliés à une même zone de dépôt des réactifs (15).
34. Cassette de séquençage (17) selon la revendication 32 ou 33, dans laquelle la zone de dépôt des réactifs (15) est une ouverture adaptable à des moyens d'amenée des fluides réactionnels.
35. Cassette de séquençage (17) selon l'une quelconque des revendications 25 à 34, dans laquelle chaque tube (1 ) contient en outre :
- les fluides réactionnels (6) à (9), contenant respectivement le nucleotide A, T, C, ou G, et les réactifs nécessaires à l'élongation, à partir de l'amorce, du brin complémentaire de l'acide nucléique à séquencer, à l'exception des autres nucléotides, chacun des fluides réactionnels (6-9) étant sous la forme d'une phase indépendante, séparée des autres fluides par un fluide séparateur (10) gazeux ou liquide non miscible avec les fluides réactionnels (6-9), lesdits fluides réactionnels comportant le cas échéant un marqueur d'élongation d'une molécule d'acide nucléique double brin, tel qu'un intercalant fluorescent ou un intercalant couplé à une molécule marquée, et les nucléotides contenus dans chacun des fluides réactionnels (6-9) étant le cas échéant marqués ou couplés à une molécule marquée, et/ou - une solution de rinçage (11 ), contenant, le cas échéant, une ou plusieurs enzymes capable(s) de dégrader les nucléotides triphosphates.
36. Dispositif de séquençage utilisable avec des cassettes (17) selon les revendications 25 à 35, comportant des moyens de mise en mouvement (4) d'un fluide (5) dans chaque tube (1 ), des moyens de régulation (13) de la température du fluide (5), et un dispositif de mesure (14), agencés dans un séquenceur dans lequel on peut placer une ou plusieurs cassettes (17) jetables, chaque cassette comportant un ou plusieurs tube(s) (1 ).
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