CN107208147A - 用于核酸扩增的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于包括引物延伸、核酸扩增、单核苷酸多态性检测和RT‑PCR在内的各种生物测定的寡核苷酸。所述寡核苷酸包含互补于靶序列的5’区以及处于或靠近该寡核苷酸的3’端的阻断基团。引物延伸仅在酶去除该阻断基团之后发生。
Description
交叉引用
本申请要求2014年11月20日提交的第62/082,534号美国临时专利申请、2014年11月20日提交的第62/082,538号美国临时专利申请和2014年11月20日提交的第62/082,541号美国临时专利申请的优先权，这些申请均通过引用以其全文并入本文以用于所有目的。
背景技术
核酸扩增方法允许扩增样品如生物样品中的核酸分子。核酸分子可以经由例如基于热循环的方法(例如，聚合酶链反应(PCR))或经由等温方法来扩增。核酸扩增还可以用于制备核酸分子以供与核酸分析相关的许多应用中的后续分析，这些应用例如是检测靶核酸序列、检测样品中的罕见核酸分子/序列和/或制备用于测序反应的核酸分子。然而，核酸扩增反应可以生成可降低核酸扩增反应的效率和/或特异性的非特异性扩增产物，如引物二聚体副产物。因此，由于核酸扩增对于广泛应用的适用性，对于可用于扩增帮助使核酸扩增过程中非特异性扩增产物生成最小化的核酸分子的组合物和方法存在需要。
发明内容
本公开内容提供了用于核酸扩增和分析的组合物和方法。
本公开内容的一方面提供了具有约6至60个核苷酸长度的引物。该引物从5’端到3’端可包含基本上互补于靶核酸分子的核苷酸序列A以及相对于该靶核酸分子的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的分子部分。该3’端可适合于仅在去除分子部分时在引物延伸反应中延伸以形成靶核酸分子的互补核酸链。
在一些实施方案中，所述引物可以是发夹环形引物，其特征在于核苷酸序列A显示出与自身和/或分子部分的序列互补性。在一些实施方案中，该引物可以是分离且纯化的核酸链。在一些实施方案中，3’端可以是可被具有3’到5’外切核酸酶活性的酶切割的。在一些实施方案中，该引物可适用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
在一些实施方案中，所述分子部分可包含具有相对于靶核酸分子的1-10个相应核苷酸非互补的1-10个连续核苷酸的核苷酸序列B。在一些实施方案中，核苷酸序列A可具有一定的长度，该长度提供相对于靶核酸分子的充分互补性。
在一些实施方案中，所述分子部分可以为至少一个核苷酸、核苷酸类似物或非核苷酸物质。在一些实施方案中，该分子部分可包含磷酸二酯键或可以为n-磷酸酯部分，其中‘n’大于或等于1。在一些实施方案中，该分子部分可适合于防止包含该引物的引物二聚体分子复合体的形成。在一些实施方案中，该引物可具有6至20个核苷酸的长度。在一些实施方案中，该分子部分可具有1至10个单独物质的长度。在一些实施方案中，该分子部分可包含具有非天然碱基或无碱基的核苷酸类似物。在一些实施方案中，该引物可适用于单核苷酸多态性检测。
在一些实施方案中，所述引物被包含在引物组中，该引物组包含与靶核酸分子的互补核酸链显示出序列互补性的至少一个附加引物。在一些实施方案中，当在具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶的存在下在扩增反应中使用时，该引物组可产生基本上不含引物二聚体副产物的扩增靶核酸。在一些实施方案中，引物二聚体副产物可以以一定的浓度存在，如根据扩增靶核酸的解链曲线所测，该浓度小于扩增靶核酸的约10％。在一些实施方案中，该引物可被包含在溶液中。在一些实施方案中，该引物可包含至少一个终止子核苷酸，该终止子核苷酸可以是例如核酸酶抗性的。
本公开内容的附加方面提供了包含正向引物和反向引物的引物组。该正向和反向引物中的每一种从5’端到3’端可包含基本上互补于靶核酸分子或其互补体的核苷酸序列A以及相对于该靶核酸分子或互补体的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的分子部分。该正向引物的分子部分和该反向引物的分子部分可彼此不互补。而且，该正向引物和反向引物仅在去除分子部分时可以以模板指导的方式可延伸。
在一些实施方案中，所述正向引物和/或反向引物可以是发夹环形引物，其特征在于序列A显示出与自身和/或各自的分子部分的序列互补性。在一些实施方案中，该正向和反向引物可以是分离且纯化的核酸链。在一些实施方案中，3’端可以是可被具有3’到5’外切核酸酶活性的酶切割的。在一些实施方案中，该正向引物和/或反向引物可适用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
在一些实施方案中，所述分子部分可包含具有相对于靶核酸分子或互补体的1-10个相应核苷酸非互补的1-10个连续核苷酸的核苷酸序列B。在一些实施方案中，核苷酸序列A可具有一定的长度，该长度提供相对于靶核酸分子或互补体的充分互补性。
在一些实施方案中，所述分子部分可以为至少一个核苷酸、核苷酸类似物或非核苷酸物质。在一些实施方案中，该分子部分可包含磷酸二酯键或为n-磷酸酯部分，其中‘n’大于或等于1。在一些实施方案中，该分子部分可适合于防止包含该正向引物和/或该反向引物的引物二聚体分子复合体的形成。在一些实施方案中，该正向引物和/或反向引物可具有6至20个核苷酸的长度。在一些实施方案中，该分子部分可具有1至10个单独物质的长度。在一些实施方案中，该分子部分可包含具有非天然碱基或无碱基的核苷酸类似物。在一些实施方案中，该正向引物和/或反向引物可适用于单核苷酸多态性检测。在一些实施方案中，该引物组被包含在溶液中。在一些实施方案中，该正向和/或该反向引物可包含至少一个终止子核苷酸，该终止子核苷酸可以是例如核酸酶抗性的。
本公开内容的附加方面提供了用于核酸扩增的方法。该方法可包括使正向引物与单链靶核酸分子退火，以及使反向引物与该单链靶核酸分子的互补体退火。该正向和反向引物中的每一种从5’端到3’端可包含相对于该单链靶核酸分子或互补体的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的分子部分。而且，该正向引物的分子部分和该反向引物的分子部分可彼此不互补。该方法进一步包括以模板指导的方式延伸该正向引物和该反向引物以产生双链靶核酸分子。该方法进一步包括使该双链靶核酸分子变性，以生成单链靶核酸分子。该正向和反向引物的退火、该正向和反向引物的延伸以及得到的双链靶核酸分子的变性可重复至少一个循环，以产生扩增的双链靶核酸分子。
在一些实施方案中，在所述至少一个循环之后，包含正向引物和/或反向引物的引物二聚体副产物可以以一定的浓度存在，如根据扩增的双链靶核酸分子的解链曲线分析所测，该浓度小于扩增的双链靶核酸分子的约10％。
在一些实施方案中，所述方法可以在分区如孔或小滴中进行。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测扩增的双链靶核酸分子的至少一个亚组。所述检测可以包括例如光学检测、静电检测或电化学检测。在一些实施方案中，该方法进一步包括在延伸该正向和反向引物之前去除该正向引物的分子部分和该反向引物的分子部分。在一些实施方案中，该正向引物和/或反向引物可包含至少一个终止子核苷酸，该终止子核苷酸可以是例如核酸酶抗性的。
本公开内容的附加方面提供了用于核酸扩增的方法。该方法可包括使含有具有单链靶核酸分子的核酸样品的反应混合物在产生该核酸样品的扩增产物的条件下经历核酸扩增反应。该反应混合物可包含正向引物，该正向引物互补于该单链靶核酸分子且包含相对于该单链靶核酸分子的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的第一分子部分。该反应混合物还可以包含反向引物，该反向引物互补于该单链靶核酸分子的互补体且包含相对于该互补体的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的第二分子部分。该第一分子部分和该第二分子部分可彼此不互补。
在一些实施方案中，所述经历核酸扩增反应可包括以模板指导的方式延伸该正向引物和该反向引物以产生双链靶核酸分子。在一些实施方案中，所述经历核酸扩增反应可包括在延伸该正向引物和该反向引物之前去除第一和第二分子部分。在一些实施方案中，该第一和/或第二分子部分可以是借助于反应混合物中聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性可去除的。
在一些实施方案中，所述正向和/或反向引物可以是分离且纯化的核酸链。在一些实施方案中，该正向引物和/或反向引物可以是发夹环形引物，其特征在于序列A显示出与自身和/或第一和/或第二分子部分的序列互补性。在一些实施方案中，该正向引物和/或反向引物可适用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
在一些实施方案中，所述正向和反向引物中的每一种从5’端到3’端可包含基本上互补于单链靶核酸分子或互补体的核苷酸序列A。在一些实施方案中，第一或第二分子部分可包含具有相对于靶核酸分子或互补体的1-10个相应核苷酸非互补的1-10个连续核苷酸的核苷酸序列B。在一些实施方案中，核苷酸序列A可具有一定的长度，该长度提供相对于靶核酸分子或互补体的充分互补性。
在一些实施方案中，第一和/或第二分子部分可以为至少一个核苷酸、核苷酸类似物或非核苷酸物质。在一些实施方案中，第一和/或第二分子部分可包含磷酸二酯键或为n-磷酸酯部分，其中‘n’大于或等于1。在一些实施方案中，第一和/或第二分子部分可适合于防止包含该正向引物和/或该反向引物的引物二聚体分子复合体的形成。
在一些实施方案中，所述正向引物和/或反向引物可具有6至60个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述分子部分可具有1至10个单独物质的长度。在一些实施方案中，第一和/或第二分子部分可包含具有非天然碱基或无碱基的核苷酸类似物。在一些实施方案中，该正向引物和/或反向引物可适用于单核苷酸多态性检测。在一些实施方案中，该反应混合物的温度可借助于热梯度来控制。在一些实施方案中，该正向引物和/或反向引物可包含至少一个终止子核苷酸，该终止子核苷酸可以是例如核酸酶抗性的。
本公开内容的附加方面提供了用于核酸扩增的方法。该方法可包括提供包含正向引物、反向引物和靶核酸分子的反应混合物，其中该正向引物互补于该靶核酸分子，并且该反向引物互补于该靶核酸分子的互补体。该方法可进一步包括使用该正向引物和该反向引物进行多个扩增循环，以在溶液中生成该靶核酸分子的扩增产物。在20个或更多个扩增循环之后，如通过扩增产物的解链曲线分析所测，反应混合物中包含该正向引物的序列和/或该反向引物的序列的引物二聚体分子复合体的浓度可小于扩增产物的约10％。
在一些实施方案中，所述多个扩增循环借助于热梯度来进行。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括检测扩增产物。在一些实施方案中，用于检测扩增产物的循环阈值(Ct)可小于60。在一些实施方案中，所述正向引物可包含相对于靶核酸分子非互补的在3’端的分子部分。在一些实施方案中，所述反向引物可包含相对于靶核酸分子的互补体非互补的在3’端的分子部分。在一些实施方案中，所述引物二聚体分子复合体可能是不可检测的。在一些实施方案中，该正向引物和/或该反向引物可包含至少一个终止子核苷酸，该终止子核苷酸可以是例如核酸酶抗性的。
本公开内容的附加方面提供了包含约6至60个核苷酸的寡核苷酸。该寡核苷酸的3’端可具有分子部分，该分子部分在靶核酸分子的扩增期间相对于靶核酸分子为非结合的，可被具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶识别，并且可被该聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性切割。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸可包含约10至60个核苷酸。在一些实施方案中，该寡核苷酸可包含显示出与自身和/或该分子部分的序列互补性的核苷酸序列A。在一些实施方案中，核苷酸序列A可具有一定的长度，该长度提供相对于靶核酸分子的充分互补性。在一些实施方案中，该分子部分可包含具有相对于靶核酸分子的1-10个相应核苷酸非互补的1-10个连续核苷酸的核苷酸序列B。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸可以是分离且纯化的核酸链。在一些实施方案中，该寡核苷酸可适用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。在一些实施方案中，所述分子部分可以为至少一个核苷酸、核苷酸类似物或非核苷酸物质。在一些实施方案中，该分子部分可包含磷酸二酯键或可以为n-磷酸酯部分，其中‘n’大于或等于1。在一些实施方案中，该分子部分可适合于防止包含该寡核苷酸的寡核苷酸二聚体副产物的形成。在一些实施方案中，该寡核苷酸可具有6至20个核苷酸的长度。在一些实施方案中，该分子部分可具有1至10个单独物质的长度。在一些实施方案中，该分子部分可包含具有非天然碱基或无碱基的核苷酸类似物。在一些实施方案中，该寡核苷酸可适用于单核苷酸多态性检测。在一些实施方案中，该寡核苷酸可被包含在溶液中。在一些实施方案中，该寡核苷酸可包含至少一个终止子核苷酸，该终止子核苷酸可以是例如核酸酶抗性的。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸可被包含在寡核苷酸组中，该寡核苷酸组包含与靶核酸分子的互补核酸链显示出序列互补性的至少一个附加寡核苷酸。在一些实施方案中，当在具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶的存在下在扩增反应中使用时，该寡核苷酸组可产生基本上不含寡核苷酸二聚体副产物的扩增靶核酸。在一些实施方案中，当所述寡核苷酸组用于扩增反应时，如根据扩增靶核酸的解链曲线所测，寡核苷酸二聚体副产物可以以小于约10％的浓度存在。
通过以下仅示出并描述了本公开内容的说明性实施方案的详细描述，本公开内容的附加方面和优势对于本领域技术人员是显而易见的。应当认识到，本公开内容能够具有其他且不同的实施方案，并且在均不脱离本公开内容的情况下其若干细节能够在各个明显方面进行修改。因此，附图和说明书在本质上应被视为说明性的，而非限制性的。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体地且单独地指出每一个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体地描述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图(本文也称为“图”)将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：
图1是描绘用于核酸扩增的示例方法的示意图；
图2是描绘用于核酸扩增的示例方法的示意图；
图3A是描绘核酸分子中的示例单核苷酸多态性(SNP)的示意图；图3B和图3C是描绘用于检测图3A所描绘的示例SNP的示例方法的示意图；
图4A是如实施例1所述的示例靶核酸序列；图4B提供了如实施例1所述的正向和反向引物；图4C是描述如实施例1所述的不同测试反应混合物的表格；图4D是如实施例1所述的示例凝胶电泳分析的照片；
图5A提供了如实施例2所述的正向和反向引物；图5B是描述如实施例2所述的不同测试反应混合物的表格；图5C是如实施例2所述的示例凝胶电泳分析的照片；
图6A提供了如实施例3所述的正向和反向引物；图6B是描述如实施例3所述的不同测试反应混合物的表格；图6C是如实施例3所述的示例凝胶电泳分析的照片；
图7A是如实施例4所述的示例靶核酸序列；图7B提供了如实施例4所述的正向和反向引物；图7C是如实施例4所述的示例凝胶电泳分析的照片；
图8A提供了描述如实施例5所述的不同测试反应混合物的表格；图8B是如实施例5所述的示例凝胶电泳分析的照片；
图9A提供了如实施例6所述的示例靶核酸序列和相应的示例正向、反向和逆转录引物；图9B是如实施例6所述的发夹环形逆转录引物的示意性描绘；图9C是如实施例6所述的示例凝胶电泳分析的照片；
图10A提供了具有示例SNP位点的示例靶核酸序列以及如实施例7所述的用来探询示例SNP位点的相关正向引物和反向引物；图10B提供了如实施例7所述的示例正向和反向引物；图10C和图10D提供了各种反应混合物的示例解链曲线分析的图形描绘和总结如实施例7所述的各种反应混合物的内含物的表格。
图11A是描绘包含终止子或阻断子区域的示例引物的示意图；图11B是描绘使用包含终止子或阻断子区域的示例引物进行核酸扩增的示例方法的示意图；以及
图12A和图12B描绘了适用于检测单核苷酸多态性(SNP)的示例正向引物。
具体实施方式
虽然本文已示出并描述了本发明的各种实施方案，但此类实施方案仅通过实例的方式予以提供对于本领域技术人员是显而易见的。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案。
除非上下文另有明确规定，如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。例如，术语“一个核酸分子”包括多个核酸分子，包括其混合物。
如本文所用，术语“扩增(amplify)”和“扩增(amplication)”可互换使用且通常是指产生核酸的一个或多个拷贝。“扩增反应”通常是指发生核酸扩增的反应。
如本文所用，术语“退火”通常是指一个核酸分子(例如，引物)经由核酸分子之间的互补性与另一个核酸分子(例如，模板核酸分子)的结合。
“互补性”、“互补的”和“序列互补性”通常是指核酸通过Watson-Crick或其他类型的碱基配对与另一个核酸形成氢键的能力。序列互补性可经由碱基堆积帮助维持碱基配对的核酸分子的结构稳定性。核酸链的“互补体”通常是指与该核酸链互补的核酸的另一条链。在一些情况下，核酸序列可与自身互补，因为该核酸的一个序列区互补于该核酸的另一个序列区。“部分互补的”通常意指第一核酸序列的一部分将与第二核酸序列的一部分形成氢键。“基本上互补的”或“基本互补性”通常是指在3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补性的程度。“充分互补性”通常是指两个核酸分子(或单核酸分子的两个互补区)之间的互补性的程度，使得当该两个核酸分子(或该单核酸分子的两个互补区)经由互补性杂交时生成稳定的复合体。在一些情况下，这样的稳定复合体可具有约为环境温度的解链温度。
如本文所用，术语“循环阈值”或“Ct”通常是指在扩增反应期间的循环，其中由扩增的产物或扩增的核酸分子引起的可检测信号的增加达到背景信号以上的统计显著性水平。
如本文所用，术语“变性(denaturing)”和“变性(denaturation)”可互换使用且通常是指双链核酸的螺旋结构的全部或部分解旋，并且在一些实施方案中是指单链核酸的二级结构的解旋。
如本文所用，“可检测物质”通常是指产生可检测信号的组合物，其存在或不存在可用来检测核酸和/或核酸的拷贝的存在与否。在一些实施方案中，可检测物质可以是光学响应性物质。如本文所用，术语“光学响应性物质”通常是指在存在(或不存在)电磁辐射例如光的情况下产生可检测信号的可检测物质。
如本文所用，术语“解链温度”(Tm)通常是指杂交并形成双链分子的两个单链核酸分子彼此解离时的温度。在一些实施方案中，解链温度可指一群相同的双链核酸分子的约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多的相同核酸链与它们相应的互补链解离时的温度。例如，引物或分子部分的解链温度可指与核酸分子杂交的一群相同引物或分子部分中大约一半的引物或分子部分分子与它们相应的核酸分子上的互补序列解离时的温度。核酸分子的解链温度可以经由任何合适的计算方法基于核酸分子的序列来计算。
在一些实施方案中，引物或分子部分的解链温度可以为约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃或更高。
如本文所用，术语“分子复合体”通常是指包含复合在一起的多个核酸分子的复合体。分子复合体的核酸分子可经由核酸分子之间的结合相互作用(例如，非特异性结合、杂交)复合在一起，或可经由使用例如另一个作为模板来延伸或扩增(例如，经由酶)核酸分子中的一个或两个而复合在一起。分子复合体的一个实例是包含复合在一起的至少两个或更多个引物(或一个引物以及另一个引物的一个或多个拷贝)的“引物二聚体副产物”。在另一个实例中，引物二聚体副产物可以是由一个或多个引物的酶促延伸产生的扩增产物。例如，引物二聚体副产物可包含与反向引物结合的正向引物。在另一个实例中，引物二聚体副产物可包含已延伸为包含第二引物的互补序列的第一引物。在一些情况下，这样的引物二聚体副产物还可包含已延伸为包含第一引物的互补序列的第二引物。当扩增反应混合物中的一个或多个引物与另一个引物结合时和/或使用另一个引物作为模板而非靶核酸分子进行延伸时，可在核酸扩增反应期间生成引物二聚体副产物。
分子复合体的另一个实例是包含复合在一起的至少两个或更多个寡核苷酸(或一个寡核苷酸以及另一个寡核苷酸的一个或多个拷贝)的“寡核苷酸二聚体副产物”。例如，寡核苷酸二聚体副产物可包含结合在一起的两个或更多个寡核苷酸。在另一个实例中，寡核苷酸二聚体副产物可以是由一个或多个寡核苷酸物质的酶促延伸产生的扩增产物。在另一个实例中，寡核苷酸二聚体副产物可包含已延伸为包含第二寡核苷酸的互补序列的第一寡核苷酸。在一些情况下，这样的寡核苷酸二聚体副产物还可包含已延伸为包含第一寡核苷酸的互补序列的第二寡核苷酸。当扩增反应混合物中的一个或多个寡核苷酸与另一个寡核苷酸结合时和/或使用另一个寡核苷酸作为模板而非靶核酸分子进行延伸时，可在核酸扩增反应期间生成寡核苷酸二聚体副产物。通常，如例如经由凝胶电泳所测，引物二聚体副产物或寡核苷酸副产物可以为小于约100个碱基对的长度。
如本文所用，术语“核酸”和“核酸分子”可互换使用且通常是指任何长度的聚合物形式的核苷酸，其可以是脱氧核糖核苷酸(dNTP)、核糖核苷酸(rNTP)、其类似物和/或其组合。核酸可具有任何三维结构，并且可行使任何已知或未知的功能。核酸的非限制性实例包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、氟化核酸(FNA)、桥连核酸(BNA)、基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析定义的基因座(多个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组核酸、支链核酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。核酸可以包含一个或多个修饰的核苷酸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可在核酸的组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核酸的核苷酸的序列可被非核苷酸组分例如连接体或间隔区物质中断。在一些实施方案中，核苷酸的序列可以被人工非配对核苷酸类似物中断。核酸可以在聚合反应之后例如通过与可检测物质的缀合或结合进一步修饰。在一些实施方案中，核酸可以为在一些实施方案中可用来扩增另一个核酸分子的引物。
在一些实施方案中，核酸分子，包括待扩增的核酸分子，如靶核酸分子，可以由生物样品提供给反应混合物并在未经纯化的情况下进行扩增。生物样品的非限制性实例包括全血、干血(例如，干血斑)、血清、唾液、精液、痰、脑脊液、尿、粪便、培养的细胞、动物组织、植物组织、体液或被怀疑具有靶核酸分子的其他生物液体和固体。
如本文所用，术语“引物”通常是指能够与模板核酸分子杂交且能够经由该模板核酸分子以模板指导的方式延伸的核酸分子。
“引物延伸反应”通常是指引物与核酸链的结合(例如，“退火”)，然后使用核酸链作为模板将核苷酸随该引物掺入(例如，该引物的“延伸”或“延伸”该引物)，通常在其3’端。引物延伸反应可借助于例如聚合酶的酶来完成。
如本文所用，术语“反应混合物”或“扩增反应混合物”通常是指包含完成引物延伸反应和/或核酸扩增所需的一种或多种试剂的组合物，此类试剂的非限制性实例包括对于靶核酸具有特异性的一种或多种引物、聚合酶、合适的缓冲液、辅因子(例如，二价和单价阳离子)、核苷酸(例如，脱氧核糖核苷酸(dNTP))以及任何其他的酶。在一些实施方案中，反应混合物还可以包含一种或多种可检测物质。
如本文所用，术语“靶核酸”或“靶核酸分子”可互换使用且通常是指具有靶序列的核酸分子的起始群体中的核酸分子，需要确定该核酸分子的存在、量和/或核苷酸序列或其中一项或多项的变化。在一些实施方案中，靶核酸分子可以是双链的。在一些实施方案中，靶核酸分子可以是单链的。靶核酸分子可以是基因、调节序列、基因组DNA、cDNA、包括mRNA、miRNA、rRNA在内的RNA，或其他的一部分。靶核酸分子可以是来自样品的靶核酸分子或二级靶标如扩增反应的产物。
本公开内容的各个方面提供了可用于进行核酸扩增反应的引物、寡核苷酸、引物组和寡核苷酸组。引物或引物组的引物和/或寡核苷酸或寡核苷酸组的寡核苷酸可包含可去除的在其3’端的分子部分，使得该引物或寡核苷酸可以参与核酸扩增反应。而且，分子部分可用于防止在核酸扩增反应期间引物二聚体副产物或寡核苷酸副产物的形成。
本公开内容的一方面提供了可具有约6至60个核苷酸长度的引物。该引物从5’端到3’端可包含基本上互补于靶核酸分子的核苷酸序列A；和在其3’端的分子部分。该分子部分可相对于该靶核酸分子的一个或多个相应核苷酸是非互补的。而且，该3’端可适合于仅在去除分子部分时在引物延伸反应中延伸以形成靶核酸分子的互补核酸链。
本公开内容的另一方面提供了包含约6至60个核苷酸的寡核苷酸。该寡核苷酸的3’端可具有分子部分，该分子部分在靶核酸分子的扩增期间相对于靶核酸分子为非结合的，可被具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶识别；并且可被该聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性切割。
本公开内容的附加方面提供了可包含正向引物和反向引物的引物组。该正向和反向引物中的每一种从5’端到3’端可包含基本上互补于靶核酸分子或其互补体的核苷酸序列A；以及相对于该靶核酸分子或其互补体的一个或多个相应核苷酸非互补的在其3’端的分子部分。而且，该正向引物的分子部分和该反向引物的分子部分可彼此不互补，并且该正向和反向引物可以仅在去除该分子部分时以模板指导的方式可延伸。
在一些方面，本文所述的引物或寡核苷酸可被包含在引物或寡核苷酸组中。该引物或寡核苷酸组可包含与靶核酸分子的互补核酸链显示出序列互补性的至少一个附加引物或寡核苷酸。在一些实施方案中，当在具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶和/或具有内切核酸酶活性的酶的存在下在扩增反应中使用时，本文所述的引物组或寡核苷酸组可产生基本上不含引物二聚体副产物或寡核苷酸二聚体副产物的扩增靶核酸。如本文所用，“基本上不含引物二聚体副产物或寡核苷酸二聚体副产物”通常是指，如通过扩增的核酸产物的解链曲线分析(或其他合适的分析，例如，凝胶电泳)所测，引物二聚体副产物或寡核苷酸副产物的浓度小于扩增的核酸产物的约30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.01％、0.001％或更低。
此外，本文所述的引物、寡核苷酸、引物组或寡核苷酸组可被包含在溶液中。这样的溶液可以是例如包含核酸分子扩增所需的一种或多种试剂的扩增反应混合物(如本文别处所述)。在一些实施方案中，该溶液可包含核酸分子扩增所需的一种或多种试剂，使得当该溶液与一种或多种附加溶液混合时，得到扩增反应混合物。可包含引物、寡核苷酸、引物组或寡核苷酸组的溶液的其他实例包括水、缓冲液、溶剂、生物流体(例如，血液)、含固体生物样品(例如，动物组织、植物样品等)的流体。
而且，本文所述的引物(包括引物组的引物)或寡核苷酸(包括寡核苷酸组的寡核苷酸)可以是分离且纯化的核酸链。分离且纯化的核酸链通常是指不含或基本上不含其他物质(包括其他核酸)的核酸链。在一些实施方案中，引物(包括引物组的引物)或寡核苷酸(包括寡核苷酸组的寡核苷酸)可以是合成的。此外，在一些实施方案中，本文所述的引物(包括引物组的引物)或寡核苷酸(包括寡核苷酸组的寡核苷酸)的3’端可以是可被具有3’到5’外切核酸酶活性的酶(例如，聚合酶)识别和/或切割的。在一些实施方案中，本文所述的引物(包括引物组的引物)或寡核苷酸(或寡核苷酸组)的3’端可以是可被具有内切核酸酶活性的酶(例如，聚合酶)识别和/或切割的。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的3’端可以是可被具有3’到5’外切核酸酶活性的酶和具有内切核酸酶活性的酶识别和/或切割的。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的3’端可以是可被具有3’到5’外切核酸酶活性和内切核酸酶活性的酶识别和/或切割的。
本文所述的引物(包括引物组的引物)或寡核苷酸(包括寡核苷酸组的寡核苷酸)的长度可根据特定的引物或寡核苷酸和/或使用该引物或寡核苷酸的应用而变化。例如，本文所述的引物或寡核苷酸的长度可以为约3个核苷酸至约70个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的长度可以为约6个核苷酸至约60个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的长度可以为约10个核苷酸至约60个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的长度可以为约6个核苷酸至约50个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的长度可以为约6个核苷酸至约40个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的长度可以为约6个核苷酸至约30个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的长度可以为约6个核苷酸至约20个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的长度可以为约6个核苷酸至约10个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的长度可以为约11个核苷酸至约30个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的长度可以为约10个核苷酸至约20个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的长度可以为约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70个或更多个核苷酸。
此外，本文所述的引物(包括引物组的引物)可包含互补于或基本上互补于靶核酸分子的核苷酸序列A。类似地，本文所述的寡核苷酸(包括寡核苷酸组的寡核苷酸)也可以包含互补于或基本上互补于靶核酸分子的核苷酸序列A。这样的核苷酸序列A可显示出与自身和/或分子部分的序列互补性。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸可以是发夹环形引物，其特征在于其核苷酸序列A显示出与自身和/或分子部分的序列互补性。
本文所述的引物(包括引物组的引物)或寡核苷酸(包括寡核苷酸组的寡核苷酸)的核苷酸序列A的长度可根据特定的引物或寡核苷酸而变化。例如，本文所述的引物或寡核苷酸的核苷酸序列A的长度可以为约6个核苷酸至约60个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的核苷酸序列A的长度可以为约6个核苷酸至约50个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的核苷酸序列A的长度可以为约6个核苷酸至约40个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的核苷酸序列A的长度可以为约6个核苷酸至约30个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的核苷酸序列A的长度可以为约6个核苷酸至约22个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸序列的核苷酸序列A的长度可以为约6个核苷酸至约20个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸序列的核苷酸序列A的长度可以为约6个核苷酸至约10个核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的长度可以为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸，或可以更长或更短。此外，本文所述的引物或寡核苷酸的核苷酸序列A可以具有一定的长度，该长度提供相对于靶核酸分子的充分互补性。核苷酸序列A的充分互补性可以帮助控制该核苷酸序列A的解链温度。
本文所述的引物(包括引物组的引物)或寡核苷酸(包括寡核苷酸组的寡核苷酸)可包含相对于靶核酸分子非互补和/或非结合的在其3’端的分子部分。在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的分子部分可适合于防止包含该引物(例如，正向引物)的引物二聚体副产物或包含该寡核苷酸的寡核苷酸二聚体副产物的形成。例如，本文所述的引物或寡核苷酸中的分子部分的存在可降低该引物或寡核苷酸对于其他引物或寡核苷酸的结合亲和力(或防止其结合)。分子部分的存在还可以降低或消除该引物或寡核苷酸可在扩增反应中使用例如另一引物或寡核苷酸作为模板进行延伸的可能性。在去除该分子部分时，该引物或寡核苷酸可随后延伸。在包含各自含有分子部分的正向引物和反向引物的引物组的情况下，分子部分中的一个或两者可适合于防止包含该正向引物和/或反向引物的引物二聚体分子复合体的形成。
分子部分可以是任何合适的物质。在一些实施方案中，分子部分可包含一个或多个磷酸二酯键。分子部分的非限制性实例包括核苷酸、核酸和非核苷酸物质(例如，氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、烃链(例如，聚乙二醇(PEG))、n-磷酸酯部分(其中“n”大于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)、磷酸二酯键连接的杂缀合物、染料和有机金属络合物)。而且，分子部分还可以包含经由共价键连接在一起(连续地或不连续地)的单独的亚单位或物质。这类单独的物质或亚单位可以为，例如，核酸的一个或多个单独的核苷酸、肽或蛋白质的一个或多个氨基酸或碳水化合物的一个或多个糖。例如，分子部分的长度可以为约1至20、1至15、1至10或1至5个单独的物质或亚单位。在一些实施方案中，分子部分的长度可以为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个单独的物质或亚单位。在一些实施方案中，分子部分的长度可用于调节该分子部分所参与的核酸扩增反应的速率。
在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸的分子部分可包含核酸。包含核酸的本文所述的引物或寡核苷酸的分子部分可降低(或防止)该引物或寡核苷酸与另一引物或寡核苷酸杂交或在扩增反应中延伸的能力。在一些实施方案中，引物组中的正向引物和反向引物的分子部分可彼此不互补，使得分子部分之间序列互补性的缺乏降低(或防止)该正向和反向引物在扩增反应期间彼此杂交的能力。在一些实施方案中，分子部分可经由可被核糖或脱氧核糖隔开的一个或多个磷酸二酯键与引物或寡核苷酸连接，和/或该分子部分可以终止于羟基基团。
此外，可调适本文所述的引物或寡核苷酸的分子部分，使得其解链温度低于该引物或寡核苷酸的核苷酸序列的一部分的解链温度。分子部分的较低解链温度可降低(或防止)在高于该分子部分的解链温度的引物或寡核苷酸退火温度下该分子部分与靶核酸分子结合的可能性。
因此，所述分子部分可包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，分子部分可包含一个或多个具有非天然碱基的核苷酸类似物。具有非天然碱基的核苷酸类似物的非限制性实例包括肌苷(包括次黄嘌呤的碱基)、含尿嘧啶的核苷酸(在核酸为DNA的情况下)、异-DC、异-dG、二氨基嘌呤、2,4-二氟甲苯、4-甲基苯并咪唑、大小扩大的xA、大小扩大的xG、大小扩大的xC、大小扩大的xT、d5SICS和dNaM。在一些实施方案中，分子部分可包含一个或多个无碱基的核苷酸类似物(例如，无碱基核苷酸、无环核苷酸)。在一些实施方案中，分子部分可包含在不去除的情况下不能被聚合酶(例如，经由具有校正活性的酶，如外切核酸酶或内切核酸酶)延伸的终止子核苷酸。
而且，包含核酸的分子部分的长度可以变化。例如，包含核酸的分子部分的长度可以为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸或核苷酸类似物。在本文所述的引物(包括引物组的引物)或寡核苷酸(包括寡核苷酸组的寡核苷酸)包含互补于或基本上互补于靶核酸的核苷酸序列A的实施方案中(包括核苷酸序列A显示出与自身和/或分子部分的序列互补性的情况)，该引物或寡核苷酸的分子部分可包含具有相对于靶核酸分子的1-15、1-10、1-8、1-6或1-4个相应核苷酸非互补的1-15、1-10、1-8、1-6或1-4个连续核苷酸的核苷酸序列B。
而且，引物或寡核苷酸的分子部分可以是外切核酸酶、内切核酸酶或两种类型的酶的底物。本文别处描述了外切核酸酶和内切核酸酶的实例。在这样的情况下，可使用合适的外切核酸酶和/或内切核酸酶去除该分子部分。
此外，在一些实施方案中，本文所述的引物或寡核苷酸可包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个或更多个“终止子”或“阻断子”核苷酸，该核苷酸可以是核酸酶(例如，外切核酸酶、内切核酸酶)抗性的和/或赋予对具有校正活性的酶(例如，具有3’到5’外切核酸酶活性的酶)的抗性。这样的终止子或阻断子核苷酸可位于引物或寡核苷酸的3’端，并且可以减缓或防止核酸酶和/或具有校正活性的酶(例如，具有3’到5’外切核酸酶活性的酶)的进一步作用。在该引物或寡核苷酸还包含分子部分的实施方案中，该终止子或阻断子核苷酸可位于与该分子部分相邻的位置，以便允许去除该分子部分而最小化或防止在该分子部分的5’侧的其他引物核苷酸的进一步去除。在抑制或减缓这类核酸酶和/或具有校正活性的酶的活性时，聚合酶随后可延伸该引物或寡核苷酸的3’区。分子部分中的终止子或阻断子核苷酸和这类核苷酸的数目也可用来控制引物长度、退火时间、变性时间、延伸开始时间、延伸时间以及本文别处所述的核酸扩增所需的循环数。终止子或阻断子可以是核酸酶(例如，外切核酸酶、内切核酸酶)抗性物质。这类物质的非限制性实例包括核酸酶抗性核苷酸、硫代磷酸酯、锁定核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、氟化核酸(FNA)和α-硫代核苷酸。
图11A显示了示例引物1100，其包含引发区1101(例如，包含核苷酸序列A)、包含一个或多个终止子或阻断子核苷酸的终止子或阻断子区域1102以及分子部分1103(例如，包含核苷酸序列B)。引发区1101位于终止子或阻断子区域1102的5’侧，该终止子或阻断子区域1102位于分子部分1103的5’侧。分子部分1103可经由具有3’到5’外切核酸酶活性的酶的作用去除。具有3’到5’外切核酸酶活性的酶与终止子或阻断子区域1102中的终止子或阻断子核苷酸接触，该酶的活性被完全抑制或阻止，使得这种酶的“校正”活性终止或变得更慢。
而且，本文所述的引物(包括引物组的引物)或寡核苷酸(包括寡核苷酸组的寡核苷酸)可适用于任何合适类型的核酸扩增反应，包括本文别处所述的核酸扩增反应和方法的示例类型。例如，如本文别处所述，本文所述的引物或寡核苷酸可适用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
此外，本文所述的引物(包括引物组的引物)或寡核苷酸(包括寡核苷酸组的寡核苷酸)可适用于单核苷酸多态性检测，包括本文别处所述的单核苷酸多态性检测的示例方法。如本文所用，“单核苷酸多态性检测”通常是指检测单核苷酸多态性(SNP)，即活受试者群体中序列水平上的遗传变异的一种类型。在一些实施方案中，引物或寡核苷酸在其分子部分中可包含具有非天然碱基的核苷酸(例如，肌苷的次黄嘌呤、含尿嘧啶的核苷酸)。这类非天然碱基可用来探询如本文别处所述的特定SNP位点。
本文所述的引物(包括引物组的引物)或寡核苷酸(包括寡核苷酸组的寡核苷酸)可能适合的其他应用包括基因分型检测、突变检测、基因表达检测、低量核酸检测、病毒染色/亚型检测、细菌抗药性检测和转基因生物体检测。
本公开内容的附加方面提供了用于核酸扩增的方法。通常，用于本文所述的核酸扩增的方法依赖于在其3’端包含分子部分的引物，该分子部分在核酸扩增反应中引物延伸之前(例如，经由具有校正活性的酶的作用)被去除或切割。图1示意性地描绘了用于核酸扩增的示例方法。如图1所示，正向引物101和反向引物102与双链靶核酸分子105的相相应的链退火。正向引物101和反向引物102在其3’端分别包含分子部分103和104。分子部分103和104(例如，经由包含校正活性的一种或多种酶的作用，如具有3’到5’外切核酸酶活性的酶、具有内切核酸酶活性的酶或兼具两种类型的酶)被切割或去除106，以使正向引物101和反向引物102的3’端在引物延伸反应中可延伸。该引物随后在引物延伸反应中延伸107以生成双链扩增产物108a和108b。
在一方面，本公开内容提供了用于核酸扩增的方法。该方法可包括使正向引物与单链靶核酸分子退火并使反向引物与该单链靶核酸分子的互补体退火；以模板指导的方式延伸该正向和反向引物以产生双链靶核酸分子；使该双链靶核酸分子变性以生成单链靶核酸分子；以及重复该正向和反向引物的退火、延伸和变性至少一个循环，以产生扩增的双链靶核酸分子。该正向和反向引物中的每一种从5’端到3’端可包含相对于该单链靶核酸分子或互补体的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的分子部分。而且，该正向引物和反向引物的分子部分可以彼此互补或可以彼此不互补。
在一些实施方案中，在重复正向和反向引物的退火、延伸和变性至少一个循环之后，包含正向引物和/或反向引物的引物二聚体副产物可以以一定的浓度存在，如通过该扩增的双链靶核酸分子的溶解曲线分析(或其他合适的分析方法，例如凝胶电泳)所测，该浓度小于扩增的双链靶核酸分子的约30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、22％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.01％或更低。在一些实施方案中，该方法可进一步包括在延伸正向和反向引物之前使用任何合适的去除方法，包括本文别处所述的示例去除方法，去除该正向和反向引物的分子部分。
在另一方面，本公开内容提供了用于核酸扩增的方法。该方法可包括使含有具有单链靶核酸分子的核酸样品的反应混合物在产生该核酸样品的扩增产物的条件下经历核酸扩增反应。该反应混合物可包含正向引物，该正向引物互补于该单链靶核酸分子且包含相对于该单链靶核酸分子的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的第一分子部分。该反应混合物还可以包含反向引物，该反向引物互补于该单链靶核酸分子的互补体且包含相对于该互补体的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的第二分子部分。该第一分子部分和第二分子部分可以彼此互补或可以彼此不互补。
在一些实施方案中，使反应混合物经历核酸扩增反应可包括以模板指导的方式延伸正向和反向引物以产生双链靶核酸分子。可在延伸该正向和反向引物之前使用任何合适的去除方法，包括本文别处所述的示例去除方法，分别去除该正向和反向引物的第一和第二分子部分。例如，该第一和第二分子部分可以是借助于反应混合物中聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性可去除的。
在另一方面，本公开内容提供了用于核酸扩增的方法。该方法可包括提供包含互补于靶核酸分子的正向引物、互补于该靶核酸分子的互补体的反向引物以及该靶核酸分子的反应混合物。该方法进一步包括使用该正向引物和该反向引物进行多个扩增循环，以在该反应混合物中生成该靶核酸分子的扩增产物。在20个或更多个扩增循环之后，如通过该靶核酸分子的扩增产物的解链曲线分析(或其他合适的分析方法，例如凝胶电泳)所测，反应混合物中包含该正向引物的序列和/或该反向引物的序列的引物二聚体分子复合体的浓度可小于该靶核酸分子的扩增产物的约10％。
在各个方面，在本文所述的核酸扩增方法中使用的正向和反向引物可具有引物的任何合适的特征或性质，包括任何本文别处所述的引物的各种特征和性质。该正向和反向引物可包括任何合适的引物，其包括任何本文别处所述的各种引物。而且，在本文所述的核酸扩增方法中使用的正向引物的分子部分和反向引物的分子部分可具有分子部分的任何合适的特征或性质，其包括任何本文别处所述的分子部分的各种特征和性质。例如，各自包含分子部分且在本文所述的核酸扩增方法中使用的正向和反向引物可适合于防止包含该正向引物和/或反向引物的引物二聚体分子复合体的形成。在本文所述的核酸扩增方法中使用的正向和反向引物的分子部分可包括任何合适的分子部分，其包括本文别处所述的各种分子部分。此外，在本文所述的核酸扩增方法中使用的正向和反向引物可被包含在引物组中，该引物组包括本文别处所述的任何引物组。
如关于本文别处所述的引物所描述的，在本文所述的核酸扩增方法中使用的正向引物和/或反向引物可包含分子部分。在一些实施方案中，在本文所述的核酸扩增方法中使用的正向引物可包含相对于靶核酸分子非互补的在3’端的分子部分，和/或在本文所述的核酸扩增方法中使用的反向引物可包含相对于靶核酸分子的互补体非互补的在3’端的分子部分。在延伸正向和/或反向引物以产生双链核酸分子(例如，双链靶核酸分子)之前，正向和/或反向引物的分子部分可在进行延伸之前被去除。而且，分子部分可以是可从正向和/或反向引物上切割或去除的。从正向和/或反向引物上去除或切割分子部分可经由任何合适的方法来完成。在一些实施方案中，正向和/或反向引物的分子部分可以化学地和/或物理地去除。在一些实施方案中，分子部分从其引物或寡核苷酸上的去除可在该引物或寡核苷酸与它在靶核酸分子上的互补序列杂交时进行。
在一些实施方案中，分子部分的去除或切割可经由具有3’到5’外切核酸酶活性的酶(例如，聚合酶)的作用来完成。这样的酶可“校正”该分子部分，使得该分子部分的单独物质或亚单位(例如，非互补的核苷酸)通过具有3’到5’外切核酸酶活性的酶从缔合的引物在其3’端以顺序方式逐个去除。具有3’到5’活性的任何合适的酶可用来从正向和/或反向引物去除或切割分子部分。具有3’到5’外切核酸酶活性的酶的非限制性实例包括天然存在的外切核酸酶、工程化的外切核酸酶、Phusion聚合酶、Pfu聚合酶、DEEPVENT聚合酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、外切核酸酶IV、外切核酸酶V、KOD聚合酶、Q5DNA聚合酶、AdvantageHD聚合酶、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、Bst聚合酶和Phi29DNA聚合酶。
在一些实施方案中，分子部分从正向和/或反向引物上的去除可经由具有内切核酸酶活性的酶(例如，聚合酶)的作用来完成。这样的酶可“校正”该分子部分，使得整个分子部分经由例如将该分子部分与引物连接的磷酸二酯键的切割而作为单一物质被去除。具有内切核酸酶活性的任何合适的酶可用来从正向和/或反向引物去除或切割分子部分。具有内切核酸酶活性的酶的非限制性实例包括天然存在的内切核酸酶、工程化的内切核酸酶、脱氧核糖核酸酶I、I型限制性内切核酸酶、II型限制性内切核酸酶、III型限制性内切核酸酶、热稳定的核糖核酸酶HII、热稳定的核糖核酸酶H1和热稳定的尿嘧啶DNA-糖基化酶(UDG)。
如关于本文别处所述的引物所描述的，在本文所述的核酸扩增方法中使用的正向引物和/或反向引物可包含一个或多个终止子或阻断子核苷酸。这类终止子或阻断子核苷酸可具有终止子或阻断子核苷酸的任何合适的特征或性质，包括任何本文别处所述的终止子或阻断子核苷酸的各种特征和性质。而且，在本文所述的核酸扩增方法中使用的正向和/或反向引物的终止子或阻断子核苷酸可被配置为任何合适的构型。例如，在本文所述的核酸扩增方法中使用的正向和/或反向引物可以以类似于图11A所描绘的示例引物的方式配置。
图11B示意性地描绘了使用具有终止子或阻断子区域的正向引物进行核酸扩增的示例方法。如图11B所示，类似于图11A所示的示例引物的正向引物从5’到3’包含引发区1101(例如，核苷酸序列A)、终止子或阻断子区域1102和分子部分1103。分子部分1103可经由具有3’到5’外切核酸酶活性的酶的作用从该正向引物去除。而且，终止子或阻断子区域1102包含一个或多个终止子或阻断子寡核苷酸。该正向引物与其在靶核酸分子1104上的互补序列杂交。在杂交时，具有3’到5’外切核酸酶活性的酶的活性1105从该正向引物去除分子部分1103。一个或多个终止子或阻断子寡核苷酸的存在防止具有3’到5’外切核酸酶活性的酶在它到达终止子或阻断子区域1102时进一步发挥“校正”活性。聚合酶的活性1106随后可在正向引物的3’端(例如，终止子或阻断子区域1102的3’侧)延伸1107该正向引物。延伸生成双链核酸产物，它随后可参与其他轮次的核酸扩增。在一些实施方案中，具有3’到5’外切核酸酶活性1105的酶和具有聚合酶活性1106的酶是不同的酶。在一些实施方案中，具有3’到5’外切核酸酶活性1105的酶和具有聚合酶活性1106的酶是相同的酶。
用于本文所述核酸的方法可用于最小化或防止如本文别处所述的引物二聚体副产物或引物二聚体分子复合体的生成。在本文所述的核酸扩增方法中使用正向引物和/或反向引物，可以在多个扩增循环之后生成靶核酸分子的扩增产物或双链靶核酸分子的扩增产物。在一些实施方案中，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个扩增循环之后，如通过扩增产物的任何合适的分析所测，例如，本文别处所述的扩增产物的解链曲线分析或凝胶电泳所确定的，在扩增反应混合物中包含正向引物的序列和/或反向引物的序列的引物二聚体分子复合体的浓度可小于该靶核酸分子的扩增产物的约30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、22％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.01％或更低。在一些实施方案中，在完成本文所述的核酸扩增方法之后，在反应混合物中用检测方法(例如，解链曲线分析或凝胶电泳)可能检测不到引物二聚体分子复合体或副产物。
通常，核酸扩增可在反应混合物中进行，其中待扩增的核酸分子与扩增核酸分子所需的任何附加试剂(例如，正向引物、反向引物、聚合酶、外切核酸酶、内切核酸酶、dNTP、辅因子、合适的缓冲液等中的一种或多种)一起提供。其他试剂(例如，可检测物质，如探针或染料)也可以包含在可用于检测扩增产物的反应混合物中。该反应混合物随后可经受适合于扩增该核酸分子的条件(例如，合适的温度、热的添加/移除、缓冲液浓度等)。例如，可在反应混合物中提供单链或双链核酸分子，该反应混合物还包含附加试剂(例如，本文别处所述的正向引物和反向引物，聚合酶、外切核酸酶、内切核酸酶、dNTP、辅因子、缓冲液、扩增单链或双链核酸分子所需的其他酶(例如，用于由RNA生成cDNA的逆转录酶、连接酶等)中的一种或多种)。在一些实施方案中，反应混合物的温度可经过变性温度(例如，以使双链核酸分子变性、分离或解链为组分核酸链)、退火温度(例如，以使引物与组分核酸链中的每一个退火或杂交)和延伸温度(例如，以在引物延伸反应中经由聚合酶的作用延伸或将核苷酸添加至退火的引物)重复循环，以便扩增该单链或双链核酸分子。
反应混合物的温度循环可以例如借助于任何合适的热循环仪仪器或其他类型的能够循环加热的装置来实现。如本文别处所述，这样的仪器可以包括或可以耦合至适合于检测反应混合物中的扩增产物的装置。在一些实施方案中，这样的装置可能能够光学检测反应混合物中的光学响应性物质，其中这样的光学检测可用于扩增产物的定量、Ct值的测量和/或解链温度检测。在一些实施方案中，扩增产物的检测可实时(例如，在扩增反应进行时)进行。在一些实施方案中，双链核酸分子的变性可以经由变性剂例如碱剂(例如，氢氧化钠(NaOH))来实现。
在一些情况下，核酸的扩增可以等温地，例如在没有反应混合物的温度变化的情况下实现。在一些实施方案中，本文所述的核酸扩增方法可以无需对扩增反应混合物的温度进行循环而完成。例如，可以进行多个扩增循环而无需对反应混合物的温度进行循环。
在一些实施方案中，反应混合物可经由热梯度的帮助加热至一种或多种反应温度。例如，该热梯度可以通过一种或多种等温热源或一种或多种固定热源来生成。例如，反应混合物可以在基于对流的热梯度仪器中加热，例如经由Rayleigh-Bernard对流。如本文别处所述，这样的仪器可以包括或可以耦合至适合于检测反应混合物中的扩增产物的装置。在一些实施方案中，这样的装置可能能够光学检测反应混合物中的光学响应性物质，其中这样的光学检测可用于扩增产物的定量、Ct值的测量和/或解链温度检测。在一些实施方案中，经由基于对流的策略和/或仪器检测扩增产物可以实时(例如，在扩增反应进行时)进行，所述检测包括经由解链温度检测的检测。
基于对流的策略和系统的实例包括在POCKIT系统中使用的iiPCR方法。这样的系统可包含在经由Rayleigh-Bernard对流驱动扩增反应的一个或多个容器(例如，毛细管)底部的单一热源。当使用Rayleigh-Bernard对流来驱动扩增反应时，反应混合物的不同“部分”的温度变化通常是不同步的。在这种情况下，在反应容器中反应混合物的不同部分可具有不同的温度。这样的温度差异可高达1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃或更高。而且，反应混合物的区域可因不同区域之间与温度相关的密度差异而移动至反应容器的不同区域。
基于Rayleigh-Bernard对流的扩增的另一特征是反应混合物的每一个给定部分可沿着由一个或多个等温热源生成的温度梯度经历连续的温度变化。这样的温度变化可允许使用等温热源进行核酸分子的扩增。
本文所述的核酸扩增方法的任何步骤可以在分区中进行。在一些实施方案中，本文所述的核酸扩增方法的所有步骤可以在分区中进行。在一些实施方案中，发生核酸扩增的反应混合物可以在分区中。在本文所述的核酸扩增方法中使用的分区可以是任何合适类型的分区，分区的非限制性实例包括小滴(例如，乳液中的小滴，例如，油包水乳液或水包油乳液中的小滴)、孔(例如，孔阵列中的孔如微孔板中的孔)、微孔(例如，平坦基底上的微孔)、图案化的孔以及容器(例如，任何合适类型的管、毛细管、离心管、小杯(curvette)、移液管尖端、袋子、盒子、器皿(container))。在分区为孔的实施方案中，孔壁(表面)可由能帮助将水性反应混合物保留在孔内的亲水性物质组成。在一些实施方案中，孔为平坦基底的微孔阵列中的微加工或图案化的微孔。该平坦基底可以涂覆有聚乙二醇(PEG)或疏水性物质，使得油相可施加在微孔内的水性物质(例如，小滴)上(例如，“半乳液”)。而且，在分区为小滴的情况下，可以通过批量(bulk)乳化方法和/或借助于微流体装置生成小滴。批量乳化和/或微流体装置还可以用于将物质分配到小滴中。
核酸扩增反应可以包括聚合酶的使用和作用。在引物延伸反应期间，聚合酶可通常以模板指导的方式将核苷酸添加至与单链核酸分子退火的引物的3’端。任何合适的聚合酶可以用于引物延伸反应，包括商购可得的聚合酶。聚合酶的非限制性实例包括Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、Phusion聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段、Q5DNA聚合酶、Advantage HD聚合酶、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶，及其变体、经修饰的产物和衍生物。
在一些实施方案中，合适的变性温度可以为，例如，约60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃或更高。在一些实施方案中，单个扩增循环的合适的变性时间可以为，例如约0.1秒(“s”)、0.5s、1s、2s、3s、4s、5s、6s、7s、8s、9s、10s、11s、12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s、20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s、40s、41s、42s、43s、44s、45s、46s、47s、48s、49s、50s、51s、52s、53s、54s、55s、56s、57s、58s、59s、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟或更长。
在一些实施方案中，合适的退火温度可以为，例如约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高。在一些实施方案中，单个扩增循环的合适的退火时间可以为，例如约0.1s、0.5s、1s、2s、3s、4s、5s、6s、7s、8s、9s、10s、11s、12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s、20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s、40s、41s、42s、43s、44s、45s、46s、47s、48s、49s、50s、51s、52s、53s、54s、55s、56s、57s、58s、59s、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟或更长。
在一些实施方案中，合适的延伸温度可以为，例如约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高。在一些实施方案中，合适的延伸温度可以与合适的退火温度为相同的温度。在一些实施方案中，单个扩增循环的合适的延伸时间可以为，例如约0.1s、0.5s、1s、2s、3s、4s、5s、6s、7s、8s、9s、10s、11s、12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s、20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s、40s、41s、42s、43s、44s、45s、46s、47s、48s、49s、50s、51s、52s、53s、54s、55s、56s、57s、58s、59s、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟或更长。
任何合适类型的核酸扩增反应可以用来扩增核酸分子。核酸扩增反应的一个实例是聚合酶链反应(PCR)，它依赖于如上所述的引物退火、引物延伸和扩增的核酸分子的变性的重复循环。核酸扩增反应类型的附加非限制性实例包括逆转录、体外转录、连接酶链反应、巢式扩增、多重扩增、解旋酶依赖性扩增、不对称扩增、滚环扩增、多重置换扩增(MDA)；以及PCR的变化形式，其包括实时PCR、热启动PCR、反向PCR、甲基化特异性PCR、等位基因特异性PCR、装配PCR、不对称PCR、微引物PCR、多重PCR、巢式PCR、重叠延伸PCR、数字PCR、乳液PCR、拨出PCR、解旋酶依赖性PCR、巢式PCR、热不对称交错PCR、单管PCR、定量PCR、多重PCR、直接PCR和降落(touchdown)PCR。
本文所述的核酸扩增方法可包括逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。RT-PCR核酸扩增反应可包括使用可由RNA模板生成互补DNA(cDNA)的逆转录酶和逆转录引物。cDNA随后可在PCR核酸扩增反应中采用合适的正向和反向引物以及在聚合酶的作用下进行扩增。因此，发生RT-PCR核酸扩增反应的反应混合物可包含逆转录酶。任何合适的逆转录酶可用于RT-PCR核酸扩增反应，逆转录酶的非限制性实例包括HIV-1逆转录酶、M-MLV逆转录酶、AMV逆转录酶、端粒酶逆转录酶及其变体、经修饰的产物和衍生物。在正向和/或反向引物包含分子部分的情况下，RT-PCR反应混合物还可以包含能够切割该分子部分的酶，例如，如本文别处所述的具有3’到5’外切核酸酶活性的酶。在RT-PCR扩增反应的正向引物、反向引物和/或逆转录引物中分子部分的存在可例如通过抑制逆转录酶的错误引发来提高RT-PCR扩增反应的灵敏度。
在一些实施方案中，RT-PCR核酸扩增反应可以在单一反应混合物(例如，单一容器中的反应混合物)中进行，其中在该反应混合物中提供由RNA模板生成cDNA和进一步扩增该生成的cDNA所需的所有试剂(例如，RNA模板、dNTP、聚合酶、逆转录酶、具有3’到5’外切核酸酶活性的酶、逆转录引物、正向引物、反向引物等)。该反应混合物可经受合适的条件(例如，温度等)来完成RT-PCR扩增反应的各个阶段(例如，RNA模板逆转录生成cDNA，cDNA的扩增等)。在一些实施方案中，整个RT-PCR扩增反应可以在该反应混合物中不去除或添加其他试剂或内含物的情况下进行。
在一些实施方案中，在本文所述的核酸扩增方法中使用的正向引物和/或反向引物可适用于RT-PCR核酸扩增反应。图2示意性地描绘了包含分子部分且适用于RT-PCR核酸扩增反应的正向和反向引物的示例应用。如图2所示，包含分子部分202的正向引物201、包含分子部分204的反向引物203和逆转录引物205与RNA模板206以及适合于进行RT-PCR反应的试剂(例如，聚合酶(例如，具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶、具有内切核酸酶活性的聚合酶)、逆转录酶、dNTP、辅因子等)一起提供于反应混合物中。逆转录引物205被配置为发夹结构。
在将反应混合物的温度升至208高于逆转录引物205的解链温度(例如，逆转录引物205线性化时的温度，例如，高于约30℃的温度)但低于互补于DNA分子的正向和反向引物的退火温度(例如，低于约60℃的温度)的温度时，逆转录引物205与RNA模板206杂交，并且反应混合物中逆转录酶的作用生成了与RNA模板206杂交且至少部分互补于RNA模板206的cDNA分子207。
在将反应混合物的温度升至209合适的变性温度(例如，约90℃或更高)时，RNA模板206和cDNA分子207分离。该反应混合物的温度随后降至210退火温度(例如，约60℃或更高)，在该退火温度下该正向引物与cDNA分子207退火。在合适的延伸温度下，该反应混合物中具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶的作用切割正向引物201的分子部分202，使得其3’端可在引物延伸反应中经由聚合酶的作用延伸以生成双链DNA分子212。
双链DNA分子212可变性为其组成链并经历如上所述的变性、退火和延伸温度的多个循环211(例如，PCR扩增反应的多个循环)，以生成额外的双链DNA分子212。在每个循环期间，正向引物201可与其双链DNA分子212的各自的链杂交，其分子部分经由聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性切割，并且其3’端经由聚合酶的作用延伸。类似地，在每个循环期间，反向引物203可与其双链DNA分子212的相应链杂交，其分子部分(例如，经由聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性)被切割，并且其3’端经由聚合酶的作用延伸。正向引物201和反向引物203的延伸生成额外的双链DNA分子212。
在本文所述的各个方面，方法可包括检测本文所述的一种或多种核酸分子，例如扩增的双链靶核酸分子、核酸样品的扩增产物、靶核酸分子的扩增产物、双链核酸分子、单链核酸分子、靶核酸分子、正向引物、反向引物和/或引物二聚体分子复合体或副产物。在一些实施方案中，本文所述的方法可包括检测扩增的双链靶核酸分子、核酸样品的扩增产物或靶核酸分子的扩增产物的至少一个亚组。本文所述的任何类型的核酸分子的检测可经由任何合适的检测方法或方式来实现。所使用的检测方法或方式的具体类型可依赖于例如被检测的具体物质、检测期间存在的其他物质、可检测的物质是否存在、待使用的可检测物质的具体类型和/或具体应用。
检测方法的非限制性实例包括光学检测、光谱检测、静电检测和电化学检测。因此，可通过检测指示存在或不存在核酸分子的信号(例如，指示核酸分子或相关的可检测物质的光学性质、光谱性质、静电性质或电化学性质的信号)检测本文所述的核酸分子。光学检测方法包括但不限于目视检查(例如，经由眼睛的检测、未借助于光学检测器观察光学性质或光学事件)、荧光测定法、化学发光成像、荧光共振能量转移(FRET)和UV-可见光吸光度。光谱检测方法包括但不限于质谱法、核磁共振(NMR)光谱法、拉曼光谱法和红外光谱法。静电检测方法包括但不限于基于凝胶的技术，例如，凝胶电泳(例如，琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳)。凝胶电泳方法可根据核酸分子的分子大小来分离反应混合物中不同的核酸分子。分离谱(例如，反应混合物中各种核酸的大小)可用来根据其分子大小来鉴定经历凝胶电泳的核酸分子。电化学检测方法包括但不限于安培滴定法。
在一些实施方案中，本文所述的核酸分子的检测可借助于可检测物质来实现。可检测物质可与核酸分子共价地和非共价地连接或偶联(例如，包括双链核酸分子的嵌入)。此外，如本文别处所述，可检测物质可被包含在用于核酸扩增的反应混合物中。在一些实施方案中，本文所述的核酸扩增方法可包括实时核酸扩增反应(例如，实时PCR反应)，借此在核酸分子扩增期间或之后检测扩增产物。可检测物质的非限制性实例包括光学响应性物质(例如，光学响应性染料、光学响应性寡核苷酸探针(例如，TaqMan探针、TaqMan Tamara探针、TaqMan MGB探针、Lion探针、分子信标))和放射性标记(例如，14C、123I、124I、125I、131I、99mTc、35S或3H)。
在一些实施方案中，可检测物质可以是当经受适当条件时生成(或不能生成)信号的光学响应性染料(例如，荧光染料)。染料的非限制性实例包括SYBR绿、SYBR蓝、DAPI、碘化丙锭、Hoeste、SYBR金、EvaGreen、溴化乙锭、吖啶、原黄素、吖啶橙、吖啶黄素、氟香豆素(fluorcoumanin)、玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、乙菲啶、光神霉素、聚吡啶钌、氨茴霉素、菲啶和吖啶、溴化乙锭、碘化丙锭、碘化己锭(hexidium iodide)、二氢乙锭、乙锭同型二聚体-1和-2、单叠氮化乙锭和ACMA、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、DAPI、吖啶橙、7-AAD、放线菌素D、LDS751、羟芪巴脒、SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR金、SYBR绿I、SYBR绿II、SYBR DX、SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45(蓝)、SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(绿)、SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙)、SYTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(红)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-2、Cy-3、Cy-3.5、Cy-5、Cy5.5、Cy-7、德克萨斯红、Phar-Red、别藻蓝蛋白(APC)、SYBR Green、Sybr Green I、Sybr Green II、Sybr Gold、CellTracker绿、7-AAD、乙锭同源二聚体I、乙锭同源二聚体II、乙锭同源二聚体III、溴化乙锭、伞形酮、曙红、绿色荧光蛋白、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、芪、荧光黄、级联蓝、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯、诸如包含铕和铽的那些的荧光镧系元素络合体、羧基四氯荧光素、5和/或6-羧基荧光素(FAM)、5-(或6-)碘乙酰胺荧光素、5-{[2(和3)-5-(乙酰巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素(SAMSA-荧光素)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、5和/或6羧基罗丹明(ROX)、7-氨基-甲基-香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、BODIPY荧光团、8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐、3,6-二磺酸盐-4-氨基-萘酰亚胺、藻胆蛋白、AlexaFluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790染料、DyLight 350、405、488、550、594、633、650、680、755和800染料或其他荧光团。
可用来检测本文所述的核酸分子的另一种检测方法是解链曲线分析。具体地，如本文别处所述，解链曲线分析可用于检测引物二聚体分子复合体或副产物和/或单核苷酸多态性。在解链曲线分析中，可以加热包含双链核酸分子的混合物(例如，扩增反应混合物)，并且可以相对于温度测量该混合物中双链核酸分子的解离(例如，变性)。双链核酸分子的链的温度依赖性解离可利用可嵌入或结合双链核酸分子的可检测物质(例如，荧光团如SYBR绿或EvaGreen、用可检测物质标记的核酸探针)来测量。例如，在当与双链核酸分子结合时发荧光的嵌入剂(例如，SYBR绿)的情况下，在加热期间双链核酸分子的解离可以通过产生的荧光的减少来确定。荧光的减少可能是由于嵌入染料从解离的双链核酸分子上的释放而导致。游离的染料可不发荧光(或可能不在与结合的物质相同的波长下发荧光)，因此荧光的减少可用来表明双链核酸分子的解离。可将解离相对于温度的一阶导数或负一阶导数(例如，荧光的负一阶导数)进行绘图，以经由曲线图中的峰来确定解离温度(例如，50％解离发生时的温度)。核酸分子可以经由获得的解离谱和/或解离温度来鉴定。
而且，在给定数目的扩增循环之后，本文所述的扩增的核酸分子(例如，包括本文别处所述的靶核酸分子的扩增产物、核酸样品的扩增产物、扩增的双链靶核酸分子)可以以相对于其他核酸分子不同的特异性被检测到。例如，特异性可依赖于用于扩增的特定引物、待扩增的核酸分子和/或扩增反应混合物中的其他物质。如本文别处所述，扩增特异性的示例量度是在扩增反应期间扩增产物的循环阈值(Ct)。在一些实施方案中，Ct值可以是给定的扩增反应的总循环数与高于背景水平的任何数字之间的任何数字。在一些实施方案中，Ct值可以与待扩增的核酸分子的初始量成反比。例如，使用本文所述的核酸扩增方法获得的扩增的核酸分子的循环阈值可以被检测为Ct值小于80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5或更小。
核酸扩增方法可适用于单核苷酸多态性(SNP)检测。在一些实施方案中，在本文所述的核酸扩增方法中使用的正向引物和/或反向引物可适用于SNP检测。正向引物和/或反向引物可包含分子部分，该分子部分包含具有非天然碱基(例如，肌苷中的次黄嘌呤、尿嘧啶)的筛选核苷酸，与SNP位点的供选择的互补核苷酸相比，所述筛选核苷酸可与SNP位点上的优选互补核苷酸更好地碱基配对。
在具有校正活性的酶(例如，具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶)的存在下，且当引物的筛选核苷酸与靶核酸分子上所探询的SNP位点处的其优选核苷酸发生碱基配对时，该引物可被聚合酶延伸。引物延伸可以生成含有筛选核苷酸的拷贝，所述拷贝随后可能由于筛选核苷酸中非天然碱基的存在而不在核酸扩增的其他循环中被聚合酶有效地拷贝。这样的情况可导致靶核酸分子的相对较低水平的扩增。
在具有校正活性的酶(例如，具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶)的存在下，且当引物的筛选核苷酸与靶核酸分子上所探询的SNP位点处的其非优选核苷酸发生碱基配对时，该筛选核苷酸可经由聚合酶的3’到5’外切核酸酶从引物去除并被包含对应于SNP位点处靶核酸分子的非优选核苷酸的天然互补的碱基的核苷酸替代。引物延伸可生成含有具有天然互补碱基的核苷酸的拷贝，所述拷贝随后可在附加轮次的核酸扩增中拷贝。这样的情况可导致包含SNP位点处筛选核苷酸的非优选互补核苷酸的靶核酸分子的优先扩增。优先扩增可通过(例如，经由任何合适的检测方法，包括本文所述的示例检测方法)检测扩增产物的水平来检测，所述扩增产物的水平用来确定筛选核苷酸的非优选核苷酸是否是SNP位点处的核苷酸。
为了针对特定SNP探询核酸样品，核酸样品可分成两个反应混合物，其各自包含正向和/或反向引物，所述引物包含用于SNP的特定核苷酸的筛选核苷酸。在具有较高水平的扩增产物的反应混合物中存在的特定筛选核苷酸随后可用来确定该核酸样品的SNP位点处的特定核苷酸。
图3A-3C中示意性地描绘了检测对应于靶核酸分子中的SNP位点的两种基因型的实例。如图3A所示，特定的靶核酸可具有SNP位点320，在第一基因型301中，SNP位点1320包含其有义链303中的含腺嘌呤的核苷酸(“A”)以及其反义链304中的含胸腺嘧啶的核苷酸(“T”)。在第二基因型302中，该靶核酸分子在SNP位点320处包含其有义链305中的含鸟嘌呤的核苷酸(“G”)以及其反义链中的含胞嘧啶的核苷酸(“C”)。
如图3B示意性描绘，为了检测第一基因型301，靶核酸可以与正向引物307、反向引物308、包含3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶(例如，Pfu聚合酶)以及靶核酸分子扩增所需的其他试剂一起提供于反应混合物中。如图3B所示，正向引物307和反向引物308可包含可经由聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性切割的分子部分。正向引物307和反向引物308的分子部分可帮助使靶核酸分子的扩增期间引物二聚体分子复合体或副产物的生成减至最小。在其分子部分中，正向引物307可包含肌苷筛选核苷酸309(“I”)，当与靶核酸分子的反义链304的SNP位点330上的含胸腺嘧啶的核苷酸结合时，该肌苷核苷酸1309可被具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶去除。
肌苷筛选核苷酸309包含次黄嘌呤碱基，与含胸腺嘧啶的核苷酸(肌苷筛选核苷酸309的“非优选”互补核苷酸)相比，该次黄嘌呤碱基在靶核酸分子的反义链304的SNP位点330处通常与含胞嘧啶的核苷酸(肌苷筛选核苷酸309的“优选”互补核苷酸)更好地结合。由于肌苷筛选核苷酸309与靶核酸分子的反义链304的含胸腺嘧啶的核苷酸相对较弱的结合，在正向引物307的分子部分的切割期间，聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性可从正向引物307去除肌苷筛选核苷酸309。在从正向引物307切割分子部分之后，聚合酶随后可延伸正向引物307的3’端，使得反义链304的SNP位点330上的含胸腺嘧啶的核苷酸的天然互补核苷酸(含腺嘌呤的核苷酸“A”)被添加至正向引物307的SNP位点330处。
如本文别处所述，反应混合物的温度从退火到延伸温度进行循环，使得正向引物307与靶核酸分子的反义链304退火，经由聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性去除包含肌苷筛选核苷酸309的分子部分，并延伸正向引物307的3’端。延伸可导致生成扩增的双链核酸分子，其在双链核酸分子的有义链SNP位点处包含含腺嘌呤的核苷酸代替肌苷筛选核苷酸309。因为通过聚合酶去除了肌苷筛选核苷酸309，所以该双链核酸分子随后可使用正向引物307和反向引物308经历扩增340的多个循环，以生成额外的扩增的双链核酸分子350。可检测到扩增的双链核酸分子350，并且根据扩增的双链核酸分子350的存在而将靶核酸分子的基因型确定为基因型301。
如图3C示意性描绘，为了检测第二基因型302，靶核酸可以与正向引物317、反向引物318、包含3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶(例如，Pfu聚合酶)以及靶核酸分子扩增所需的其他试剂一起提供于反应混合物中。如图3C所示，正向引物317和反向引物318均可包含可经由聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性切割的分子部分。正向引物317和反向引物318的分子部分可帮助使靶核酸分子的扩增期间引物二聚体分子复合体或副产物的生成减至最小。在其分子部分中，正向引物317可包含含尿嘧啶的筛选核苷酸319(“U”)，当与靶核酸分子的有义链305的SNP位点360上的含鸟嘌呤的核苷酸结合时，该含尿嘧啶的核苷酸1319可被具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶去除。
含尿嘧啶的筛选核苷酸319包含尿嘧啶碱基，与含鸟嘌呤的核苷酸(含尿嘧啶的筛选核苷酸319的“非优选”互补核苷酸)相比，该尿嘧啶碱基在靶核酸分子的有义链305的SNP位点360处通常与含腺嘌呤的核苷酸(含尿嘧啶的筛选核苷酸319的“优选”互补核苷酸)更好地结合。由于含尿嘧啶的筛选核苷酸319与靶核酸分子的有义链305的含鸟嘌呤的核苷酸相对较弱的结合，在正向引物317的分子部分的切割期间，聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性可从正向引物317去除含尿嘧啶的筛选核苷酸319。在从正向引物317切割分子部分之后，聚合酶随后可延伸正向引物317的3’端，使得有义链305的SNP位点360上的含鸟嘌呤的核苷酸的天然互补核苷酸(含胞嘧啶的核苷酸“C”)被添加至正向引物317的SNP位点360处。
如本文别处所述，反应混合物的温度从退火到延伸温度进行循环，使得正向引物317与靶核酸分子的有义链305退火，经由聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性去除包含含尿嘧啶的筛选核苷酸319的分子部分，并延伸正向引物317的3’端。延伸可导致生成扩增的双链核酸分子，其在双链核酸分子的反义链SNP位点处包含含胞嘧啶的核苷酸代替含尿嘧啶的筛选核苷酸319。因为通过聚合酶去除了含尿嘧啶的筛选核苷酸319，所以该双链核酸分子随后可使用正向引物317和反向引物318经历扩增370的多个循环，以生成额外的扩增的双链核酸分子380。可检测到扩增的双链核酸分子380，并且根据扩增的双链核酸分子380的存在将靶核酸分子的基因型确定为基因型302。
图3A-图3C所示的用于检测基因型301和302的示例方法可同时用来检测核酸样品中的特定基因型。该核酸样品可以分开并提供给两个扩增反应混合物。除了合适的反向引物、具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶以及扩增核酸样品中的靶核酸分子所需的其他试剂以外，每个反应混合物还可包含正向引物307或正向引物317。反应混合物随后可经受适合于扩增核酸样品中的靶核酸分子的条件。在每个反应混合物中的扩增产物(对应于经由正向引物307或正向引物317的扩增)的相对水平可共同用来确定哪一种基因型存在于最初的核酸样品中。如果包含正向引物307的反应混合物与包含正向引物317的反应混合物相比生成更高水平的扩增产物，则通常可以确定该核酸样品包含基因型301。如果包含正向引物317的反应混合物与包含正向引物307的反应混合物相比生成更高水平的扩增产物，则通常可以确定该核酸样品包含基因型302。
此外，本文所述的引物(例如，正向引物、反向引物)可包含可抑制或损害具有3’到5’外切核酸酶活性的酶的活性的一个或多个终止子或阻断子核苷酸。这样的引物可用于例如检测SNP，点突变，来自缺失、插入或易位的特定连接，和/或HLA分型。例如，在扩增反应中用来检测SNP的正向引物和/或反向引物可包含一个或多个终止子或阻断子核苷酸。在一些实施方案中，正向或反向引物的筛选核苷酸还可以是终止子或阻断子核苷酸。图12A(筛选核苷酸，含腺嘌呤的核苷酸“A”)和图12B(筛选核苷酸，含鸟嘌呤的核苷酸“G”)描绘了具有包含分子部分和终止子或阻断子核苷酸的不同筛选核苷酸的示例正向引物。
图12A显示了两种不同的示例正向引物1210和1220。正向引物1210和1220均包含“A”筛选核苷酸(在框中示出)，但它们的分子部分1212和1222分别不同。分子部分1212包含“U”序列而分子部分1222包含“UU”序列。而且，终止子或阻断子核苷酸1211(对于正向引物1210，在1210中所示的序列中的核苷酸之前用“*”示出)和1221(对于正向引物1220，在1220中所示的序列中的核苷酸之前用“*”示出)的定位在两种正向引物1210与1220之间是不同的。在正向引物1210中，终止子或阻断子核苷酸1211包含筛选核苷酸和位于筛选核苷酸的3’侧的附加含腺嘌呤的核苷酸(例如，*A*A)。在正向引物1220中，终止子或阻断子核苷酸1221包含筛选核苷酸和位于筛选核苷酸的5’侧的附加含胞嘧啶的核苷酸(例如，*C*A)。在正向引物1210和1220中，该筛选核苷酸还用作终止子或阻断子核苷酸。
图12B显示了两种不同的示例正向引物1230和1240。正向引物1230和1240均包含“G”筛选核苷酸(在框中示出)但它们的分子部分1232和1242分别不同。分子部分1232包含“U”序列而分子部分1242包含“UU”序列。而且，终止子或阻断子核苷酸1231(对于正向引物1230，在1230中所示的序列中的核苷酸之前用“*”示出)和1241(对于正向引物1240，在1240中所示的序列中的核苷酸之前用“*”示出)的定位在两种正向引物1230与1240之间是不同的。在正向引物1230中，终止子或阻断子核苷酸1231包含筛选核苷酸和位于筛选核苷酸的3’侧的附加含腺嘌呤的核苷酸(例如，*G*A)。在正向引物1240中，终止子或阻断子核苷酸1241包含筛选核苷酸和位于筛选核苷酸的5’侧的附加含胞嘧啶的核苷酸(例如，*C*G)。在正向引物1230和1240中，该筛选核苷酸还用作终止子或阻断子核苷酸。
本文所述的核酸扩增方法(例如，使用具有分子部分的正向和反向引物)可适用的其他应用包括基因分型检测、HLA分型、无纯化的核酸扩增、单容器扩增反应(例如，RT-PCR扩增反应)、突变检测、基因表达检测、低量核酸检测、病毒染色/亚型检测、细菌抗药性检测和转基因生物体检测。
实施例
实施例1：经由具有分子部分的引物进行的核酸扩增
在六种不同的扩增反应混合物(1-6)中，包含人表皮生长因子受体(EGFR)基因的互补序列(互补序列示于图4A)的核酸采用正向引物和反向引物进行扩增。六种反应混合物中的每一种包含图4B所示的四种正向引物之一(“EG5”、“EG5A”、“EG5U”或“EG5T”)和两种反向引物之一(“EG3”或“EG3A”)，其中不同的反应混合物包含正向和反向引物的不同组合。每一种反应混合物中的正向和反向引物的组合示于图4C中，其中每一种反应混合物在其相应的正向和反向引物的交叉处填入表格中。
各种正向和反向引物根据分子部分的存在与否和存在的任何分子部分的组成而彼此不同。关于具体的正向引物，正向引物EG5不具有附接的分子部分；正向引物EG5A具有在其3’端的、序列为“UTT TTT T”的分子部分；正向引物EG5U具有在其3’端的、序列为“UUU”的分子部分；正向引物EG5T具有在其3’端的、序列为“TTT”的分子部分。关于具体的反向引物，反向引物EG3不具有附接的分子部分，而反向引物EG3A具有在其3’端的、序列为“U TTTTTT”的分子部分。
每一种反应混合物具有20微升(“μL”)的总体积。每一种反应混合物包含约1纳克(ng)的互补EGFR DNA，并且还包含1x Phusion快速PCR试剂(由来自New England Biolabs的2x主混合物制成)。每一种反应混合物中各自的正向和反向引物的浓度为0.5微摩尔(“μM”)。为了完成互补EGFR DNA的扩增，每一种反应混合物经历热循环程序，该热循环程序包括98℃下10s的初始变性步骤，然后进行98℃下1s、65℃下5s和72℃下10s的45个循环。在完成热循环程序之后，在溴化乙锭的存在下采用2％琼脂糖凝胶电泳分析各10μL的反应混合物。描绘凝胶电泳分析的照片示于图4D中。
如图4D所示，在所有六种反应混合物中均观察到扩增产物。然而，当正向和反向引物(例如，正向引物EG5和反向引物EG3)不具有缔合的分子部分时(反应混合物1)，观察到引物二聚体分子副产物。在反应混合物2-6中，正向引物或正向和反向引物包含分子部分。在每一种情况下均观察到扩增产物，而没有缔合的引物二聚体副产物。如图4D所示，当使用具有缔合的分子部分的一种或多种引物时，引物二聚体副产物的生成可降至最小。而且，图4D中的结果还表明与正向或反向引物缔合的分子部分可包含至少六个核苷酸。
实施例2：经由具有分子部分(该分子部分具有带有非天然碱基的核苷酸)的引物进行的核酸扩增
在六种不同的扩增反应混合物中，包含人表皮生长因子受体(EGFR)基因的序列的基因组核酸采用正向引物和反向引物进行扩增。十种反应混合物(00、0C、0G、10、1C、1G、20、2C、2G、30)中的每一种包含图5A所示的四种正向引物之一(“EG21e5”、“EG21e5U1”、“EG21e5U2”或“EG21e5U3”)和三种反向引物之一(“EG21e3”、“EG21e3_iso-dC”或“EG21e3_iso-dG”)，其中不同的反应混合物包含正向和反向引物的不同组合。每一种反应混合物中的正向和反向引物的组合示于图5B中，其中每一种反应混合物在其相应的正向和反向引物的交叉处填入表格中。
各种正向和反向引物根据分子部分的存在与否和存在的任何分子部分的组成而彼此不同。在一些情况下，分子部分包含具有非天然碱基的核苷酸如异-dC或异-dG。关于具体的正向引物，正向引物EG21e5不具有附接的分子部分；正向引物EG21e5U1具有在其3’端的、序列为“U”的分子部分；正向引物EG21e5U2具有在其3’端的、序列为“UU”的分子部分；正向引物EG21e5U3具有在其3’端的、序列为“UU U”的分子部分。关于具体的反向引物，反向引物EG21e3不具有附接的分子部分；反向引物EG21e3_isodC具有在其3’端的、序列为“异-dC”的分子部分；以及反向引物EG21e3_isodG具有在其3’端的、序列为“异-dG”的分子部分。
每一种反应混合物具有20μL的总体积。每一种反应混合物包含约1纳克(ng)的互补EGFR DNA，并且还包含1x Phusion快速PCR试剂(由来自New England Biolabs的2x主混合物制成)。每一种反应混合物中各自的正向和反向引物的浓度为0.5μM。为了完成基因组DNA的扩增，每一种反应混合物经历热循环程序，该热循环程序包括98℃下10s的初始变性步骤，然后进行98℃下1s、60℃下10s和72℃下20s的45个循环。在完成热循环程序之后，在溴化乙锭的存在下采用2％琼脂糖凝胶电泳分析各10μL的反应混合物。描绘凝胶电泳分析的照片示于图5C中。
如图5C所示，在所有十种反应混合物中均观察到扩增产物。然而，当正向和反向引物(例如，正向引物EG21e5和反向引物EG21e3)不具有缔合的分子部分时(反应混合物00)，以及当正向引物(例如，正向引物EG21e5U1)具有仅一个碱基的分子部分而反向引物不具有缔合的分子部分时(反应混合物10)，观察到引物二聚体分子副产物。在反应混合物20、30、0C、0G、1C、2C、1G和2G中，正向引物或正向和反向引物包含分子部分。在一些情况下(反应混合物0C、1C、2C、0G、1G和2G)，正向和反向引物中的任一种或两者包含异-dC或异-dG分子部分。无论如何，在这些反应混合物中观察到扩增产物，而没有缔合的引物二聚体副产物。如图5C所示，当使用具有缔合的分子部分的一种或多种引物时，引物二聚体副产物的生成可减至最小。此外，图5C所示的结果还表明，可以调节该分子部分的长度以使引物二聚体副产物的生成减至最小。此外，图5C中的结果还表明，包含具有非天然碱基的核苷酸类似物(例如，异-dC和异-dG)的分子部分还可用于使引物二聚体副产物的生成减至最小。
实施例3：经由具有分子部分的引物进行的核酸扩增和聚合酶类型
在九种不同的扩增反应混合物中，包含人表皮生长因子受体(EGFR)基因的互补序列的核酸采用正向引物和反向引物进行扩增。九种反应混合物(1-9)中的每一种包含在其3’端具有分子部分的正向和反向引物(如图6A所示，正向引物包含序列“U”的分子部分，且反向引物包含序列“异-dG T”的分子部分)以及一种或两种聚合酶(Taq、克隆的Pfu、Deepvent)，其中不同的反应混合物包含不同的聚合酶(或聚合酶的组合)和/或不同的聚合酶浓度。每一种反应混合物中的聚合酶和聚合酶的浓度示于图6B中。所测试的聚合酶包括克隆的Pfu聚合酶对照、Deep vent聚合酶(它可显示出强大的校正活性)和Taq聚合酶(它可显示出强大的持续进行能力)。
每一种反应混合物具有20μL的总体积。每一种反应混合物包含PCR扩增的互补EGFR DNA的约100个拷贝，并且还包含来自New England Biolabs的1x ThermoPol缓冲液(20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，在25℃下pH8.8)、dNTP以及各自的聚合酶。每一种反应混合物中各自的正向和反向引物的浓度为0.5μM，且dNTP的浓度为0.25mM。聚合酶的浓度根据图6B中示出的表格中所示来使用，其中1xTaq对应于0.025个单位/μL，1x克隆的Pfu对应于0.02个单位/μL(因此，2x克隆的Pfu对应于0.04个单位/μL且0.25x克隆的Pfu对应于0.005个单位/μL)，而1x Deep vent对应于0.02个单位/μL(因此，2x Deep vent对应于0.04个单位/μL且0.25x Deep vent对应于0.005个单位/μL)。为了完成互补EGFRDNA的扩增，每一种反应混合物经历热循环程序，该热循环程序包括98℃下10s的初始变性步骤，然后进行98℃下5s、60℃下10s和72℃下10s的45个循环。在完成热循环程序之后，在溴化乙锭的存在下采用2％琼脂糖凝胶电泳分析各10μL的反应混合物。描绘凝胶电泳分析的照片示于图6C中。
如图6C所示，在克隆的Pfu被包含在反应混合物(反应混合物2-5)中、仅Taq被包含在反应混合物(反应混合物1)中或仅Deep vent被包含在反应混合物(反应混合物9)中的情况下，没有观察到扩增产物。然而，在包含Taq和Deep vent的所有三种反应混合物中，观察到扩增产物。图6C中的结果表明，聚合酶的组合可用于采用包含分子部分的正向和反向引物扩增核酸分子。而且，图6C中的结果还表明，具有强大校正活性的聚合酶(例如，Deepvent)和具有强大持续进行能力的聚合酶(例如，Taq)的使用还可以帮助采用包含分子部分的正向和反向引物扩增核酸分子。
实施例4：经由具有分子部分的引物进行的核酸扩增和退火时间
在十种不同的扩增反应混合物中，包含靶序列(如图7A所示)的核酸采用正向引物和反向引物进行扩增。十种反应混合物中的每一种包含三种拷贝数(1、10、100)之一的靶序列、一组在其3’端具有分子部分的正向和反向引物(示于图7B的正向和反向引物——用“U”表示的引物组)或一组不具有分子部分的正向和反向引物(示于图7B的正向和反向引物——用“N”表示的引物组)，并且经历包括63℃下10s或20s的退火条件的热循环程序。正向和反向引物均具有序列为“UU”的分子部分。
每一种反应混合物具有20μL的总体积。每一种反应混合物包含靶序列的1、10或100个拷贝，并且还包含1x Phusion快速PCR试剂(由来自New England Biolabs的2x主混合物制成)。每一种反应混合物中各自的正向和反向引物的浓度为0.5μM。为了完成靶序列的扩增，每一种反应混合物经历热循环程序，该热循环程序包括98℃下10s的初始变性步骤，然后进行98℃下1s、63℃下10s或20s和72℃下15s的50个循环。在完成热循环程序之后，在溴化乙锭的存在下采用2％琼脂糖凝胶电泳分析各10μL的反应混合物。描绘凝胶电泳分析的照片示于图7C中。预期的扩增产物具有约155bp的大小。
如图7C所示，在较长的退火时间下和/或在具有较大初始拷贝数的反应混合物中，采用包含分子部分的正向和反向引物通常观察到扩增产物。而且，当包含分子部分的正向和反向引物用于扩增时，非特异性扩增产物(例如，图7C所示的照片中由箭头所示的除155bp以外的大小的产物)的生成也较少。图7C中的结果表明，包含分子部分的正向和反向引物可使非特异性扩增产物的生成减至最小，并且还表明当使用这类正向和反向引物时，较长的退火时间也可以提高核酸扩增的效率。实施例5：经由具有分子部分的引物进行的基于对流的核酸扩增
在八种不同的扩增反应混合物中，包含靶序列的核酸采用正向引物和反向引物进行扩增。八种反应混合物(1-8)中的每一种包含一组在其3’端具有分子部分的正向和反向引物(如图8A所示的“具有分子部分的引物”)或一组不具有分子部分的正向和反向引物(如图8A所示的“对照”)；可检测物质(SYBR绿(如图8A所示的“SYBR-G”)或DNA探针)或没有可检测物质，以及三种拷贝数(0、2或20)之一的靶序列。具有分子部分的正向和反向引物均具有在其3’端的、序列为“UU”的分子部分。图8A描绘了每一种反应混合物的内含物。
每一种反应混合物具有50μL的总体积。每一种反应混合物包含靶序列的0、2或20个拷贝，并且还包含1x Phusion快速PCR试剂(由来自New England Biolabs的2x主混合物制成)。每一种反应混合物中各自的正向和反向引物的浓度为0.4μM。为了完成靶序列的扩增，每一种反应混合物经历基于对流的核酸扩增。在完成基于对流的核酸扩增之后，在溴化乙锭的存在下采用4％琼脂糖凝胶电泳分析各10μL的反应混合物。描绘凝胶电泳分析的照片示于图8B中。
如图8B所示，对于含有靶序列的所有反应混合物(反应混合物2、3和5-8)均观察到扩增产物。而且，当不包含分子部分的正向和反向引物用于扩增时，非特异性扩增产物的生成也较大。图8B中的结果表明，包含分子部分的正向和反向引物可使非特异性扩增产物的生成减至最小，并提高核酸扩增的效率。
实施例6：单容器逆转录扩增
两种靶RNA序列在平行的逆转录扩增混合物中进行扩增。每一种靶RNA序列(“靶标A”和“靶标B”)的序列示于图9A中。图9A还显示了各自的正向引物(“A正向引物”表示针对靶RNA序列A的正向引物；“B正向引物”表示针对靶RNA序列B的正向引物)、各自的反向引物(“A反向引物”表示针对靶RNA序列A的反向引物；“B反向引物”表示针对靶RNA序列B的反向引物)以及适合于在逆转录酶的存在下由每一种靶RNA序列生成cDNA的逆转录引物(“RT引物”)的序列。
每一种正向和反向引物在其3’端包含具有序列“UU”的分子部分。逆转录引物包含21个碱基，具有24％的GC含量，经由4个与发夹环形引物的3’区杂交的5’碱基被配置为发夹环形引物。发夹环形RT引物的示意性描绘示于图9B中。发夹环形RT引物的茎区具有30℃的解链温度，且在低于该解链温度的温度下防止该发夹环形RT引物的延伸。
每一种靶RNA序列在单一反应容器中扩增。两种反应容器中的每一种包含合适的靶RNA序列的约100个拷贝、合适的正向和反向引物(均为0.25μM)、1.25μM的发夹环形RT引物(对照实验改为包含随机引物)、1x ThermoPol缓冲液、1.25个单位/μL的MMLV转录酶、0.02个单位/μL的Phusion DNA聚合酶以及2mM DTT。为了完成靶RNA序列的扩增，每一种反应混合物经历热循环程序，该热循环程序包括37℃下10min、42℃下10min、98℃下5min，然后进行98℃下2s、60℃下30s和72℃下10s的45个循环。在溴化乙锭的存在下采用凝胶电泳分析每一种反应混合物。描绘凝胶电泳分析的照片示于图9C中。两种靶RNA序列的预期的扩增产物具有约132bp的大小。
如图9C所示，对于两种靶RNA序列均观察到预期大小的扩增产物。没有观察到反应副产物(例如，引物二聚体副产物)。图9C中的结果表明，包含分子部分的正向和反向引物可以在逆转录引物和逆转录酶的存在下扩增靶RNA序列。
实施例7：用来检测单核苷酸多态性(SNP)的核酸扩增
研究了使用在其3’端具有分子部分的正向和反向引物进行核酸扩增反应以检测靶序列中的单核苷酸多态性(SNP)的能力。研究的靶序列示于图10A中，该靶序列具有以图10A中所示的框中的“N”核苷酸表示的SNP位点。如图10B所示，在其3’端处包含序列“IUU”的分子部分的正向引物(“A-正向”)用来检测SNP位点N处的“A/T”SNP。A-正向引物的分子部分中的肌苷核苷酸充当针对SNP位点上的含胸腺嘧啶的核苷酸的筛选核苷酸。图10B还显示了用来检测SNP位点处的A/T SNP且在其3’端处包含序列“UU”的分子部分的相应反向引物(“A-反向”)。
而且，如图10B所示，在其3’端包含序列“UUU”的分子部分的反向引物(“G-反向”)用来检测SNP位点N处的“C/G”SNP。G-反向引物的分子部分中3个U核苷酸的最5’侧充当针对SNP位点上的含鸟嘌呤的核苷酸的筛选核苷酸。图10B还显示了用来检测SNP位点处的C/GSNP且在其3’端包含序列“UU”的分子部分的相应正向引物(“G-正向”)。
在一系列六种反应混合物(A-F)中，每一个引物组(A-正向/A-反向或G-正向/G-反向)在识别其靶SNP(A/T与C/G)方面进行评估。六种反应混合物中的两种包含图10A中的靶序列的100或1000个拷贝，其中在SNP位点上测试引物组的靶SNP(例如，对于A-正向/A-反向引物组，在SNP位点上“A”替换N，对于G-正向/G-反向引物组，在SNP位点上“G”替换N)。每一组的其他四种反应混合物包含图10A中的靶序列的1000、10000、100000或1000000个拷贝，其中在SNP位点上测试引物组的非靶SNP(例如，对于A-正向/A-反向引物组，在SNP位点上“G”替换N，对于G-正向/G-反向引物组，在SNP位点上“A”替换N)。
每一种反应混合物均为20μL的总体积。每一种反应混合物包含合适的模板(SNP位点上的A或SNP位点上的G)的合适数目的拷贝、0.25μM的各自的正向和反向引物、200μMdNTP、0.02个单位/μL的Phusion DNA聚合酶和来自New England Biolabs的缓冲液，以及从Life Technologies获得的SYBR绿(浓度为0.3x)和ROX(浓度为1x)荧光染料。为了完成靶序列的扩增，每一种反应混合物经历热循环程序，该热循环程序包括98℃下10s的初始变性步骤，然后是98℃下1s、60℃下30s和72℃下10s的45个循环。
在完成该热循环程序之后，完成每一种反应混合物的解链曲线分析。描绘每一组反应混合物的解链曲线分析的结果的曲线图示于图10C(对于评估A-正向/A-反向的反应混合物)和图10D(对于评估G-正向/G-反向的反应混合物)。在图10C和图10D的每一幅图中均显示了表格，该表格指出哪一个靶核苷酸在靶序列的SNP位点上，以及每一种反应混合物(A-F)中合适的靶序列的拷贝数。在图10C和图10D中，每一种反应混合物的解链曲线分析示于曲线图中，其中每一个标记的曲线的字母对应于该表格中合适的反应混合物。
如图10C所示，当正向-A和反向-A引物用于扩增时，在SNP位点上包含A的靶序列的解链曲线分析期间，在靶序列的基本上较低的拷贝数下观察到类似的荧光变化。例如，对于包含在SNP位点上具有A的靶序列的100个拷贝的反应混合物(A)观察到的荧光变化类似于对于包含在SNP位点上具有G的靶序列的100000个拷贝的反应混合物(E)观察到的荧光变化。此外，对于包含在SNP位点上具有A的靶序列的1000个拷贝的反应混合物(B)观察到的荧光变化类似于对于包含在SNP位点上具有G的靶序列的1000000个拷贝的反应混合物(F)观察到的荧光变化。在两个比较中，根据两种反应混合物中每一个靶序列的拷贝数，观察到在检测靶SNP时约1000倍的区别。
类似地，如图10D所示，当正向-G和反向-G引物用于扩增时，在SNP位点上包含G的靶序列的解链曲线分析期间，在靶序列的基本上较低的拷贝数下观察到类似的荧光变化。例如，对于包含在SNP位点上具有G的靶序列的100个拷贝的反应混合物(A)观察到的荧光变化高于对于包含在SNP位点上具有A的靶序列的100000个拷贝的反应混合物(E)观察到的荧光变化。此外，对于包含在SNP位点上具有G的靶序列的1000个拷贝的反应混合物(B)观察到的荧光变化类似于对于包含在SNP位点上具有A的靶序列的1000000个拷贝的反应混合物(F)观察到的荧光变化。在两个比较中，根据两种反应混合物中每一个靶序列的拷贝数，观察到在检测靶SNP时至少1000倍的区别。因此，图10C和图10D中的数据表明，包含具有合适筛选核苷酸的分子部分的正向和反向引物可用于SNP检测。
虽然本文已显示并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅通过举例的方式来提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。旨在由以下权利要求来限定本发明的范围，以及旨在由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
Claims (92)
1.一种具有约6至60个核苷酸长度的引物，所述引物从5’端到3’端包含(a)基本上互补于靶核酸分子的核苷酸序列A，和(b)相对于所述靶核酸分子的一个或多个相应核苷酸非互补的在所述3’端的分子部分，并且其中所述3’端适合于仅在去除所述分子部分时在引物延伸反应中延伸以形成所述靶核酸分子的互补核酸链。
2.根据权利要求1所述的引物，其中所述引物是发夹环形引物，其特征在于所述核苷酸序列A显示出与(1)自身和/或(2)所述分子部分的序列互补性。
3.根据权利要求1所述的引物，其中所述引物是分离且纯化的核酸链。
4.根据权利要求1所述的引物，其中所述3’端可被具有3’到5’外切核酸酶活性的酶切割。
5.根据权利要求1所述的引物，其中所述引物适用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
6.根据权利要求1所述的引物，其中所述分子部分包含具有相对于所述靶核酸分子的1-10个相应核苷酸非互补的1-10个连续核苷酸的核苷酸序列B。
7.根据权利要求1所述的引物，其中所述核苷酸序列A具有一定的长度，该长度提供相对于所述靶核酸分子的充分互补性。
8.根据权利要求1所述的引物，其中所述分子部分为至少一个核苷酸、核苷酸类似物或非核苷酸物质。
9.根据权利要求1所述的引物，其中所述分子部分包含磷酸二酯键或为n-磷酸酯部分，其中‘n’大于或等于1。
10.根据权利要求1所述的引物，其中所述分子部分适合于防止包含所述引物的引物二聚体分子复合体的形成。
11.根据权利要求1所述的引物，其中所述引物具有6至20个核苷酸的长度。
12.根据权利要求1所述的引物，其中所述分子部分具有1至10个单独物质的长度。
13.根据权利要求1所述的引物，其中所述分子部分包含具有非天然碱基或无碱基的核苷酸类似物。
14.根据权利要求1所述的引物，其中所述引物适用于单核苷酸多态性检测。
15.一种引物组，其包含如权利要求1所述的引物和与所述靶核酸分子的互补核酸链显示出序列互补性的至少一种附加引物。
16.根据权利要求15所述的引物组，其中当在具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶的存在下在扩增反应中使用时，所述引物组产生基本上不含引物二聚体副产物的扩增靶核酸。
17.根据权利要求16所述的引物组，其中引物二聚体副产物以一定的浓度存在，如通过所述扩增靶核酸的解链曲线所测，该浓度小于所述扩增靶核酸的约10％。
18.一种包含如权利要求1所述的引物的溶液。
19.一种包含正向引物和反向引物的引物组，其中所述正向和反向引物中的每一种从5’端到3’端包含(a)基本上互补于靶核酸分子或其互补体的核苷酸序列A，和(b)相对于所述靶核酸分子或所述互补体的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的分子部分，其中所述正向引物的分子部分和所述反向引物的分子部分彼此不互补，并且其中所述正向引物和反向引物仅在去除所述分子部分时以模板指导的方式可延伸。
20.根据权利要求19所述的引物组，其中所述正向引物和/或反向引物是发夹环形引物，其特征在于所述序列A显示出与(1)自身和/或(2)所述分子部分的序列互补性。
21.根据权利要求19所述的引物组，其中所述正向和反向引物是分离且纯化的核酸链。
22.根据权利要求19所述的引物组，其中所述3’端可被具有3’到5’外切核酸酶活性的酶切割。
23.根据权利要求19所述的引物组，其中所述正向引物和/或反向引物适用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
24.根据权利要求19所述的引物组，其中所述分子部分包含具有相对于所述靶核酸分子或所述互补体的1-10个相应核苷酸非互补的1-10个连续核苷酸的核苷酸序列B。
25.根据权利要求19所述的引物组，其中所述核苷酸序列A具有一定的长度，该长度提供相对于所述靶核酸分子或所述互补体的充分互补性。
26.根据权利要求19所述的引物组，其中所述分子部分为至少一个核苷酸、核苷酸类似物或非核苷酸物质。
27.根据权利要求19所述的引物组，其中所述分子部分包含磷酸二酯键或为n-磷酸酯部分，其中‘n’大于或等于1。
28.根据权利要求19所述的引物组，其中所述分子部分适合于防止包含所述正向引物和/或所述反向引物的引物二聚体分子复合体的形成。
29.根据权利要求19所述的引物组，其中所述正向引物和/或反向引物具有6至20个核苷酸的长度。
30.根据权利要求19所述的引物组，其中所述分子部分具有1至10个单独物质的长度。
31.根据权利要求19所述的引物组，其中所述分子部分包含具有非天然碱基或无碱基的核苷酸类似物。
32.根据权利要求19所述的引物组，其中所述正向引物和/或反向引物适用于单核苷酸多态性检测。
33.一种包含如权利要求19所述的引物组的溶液。
34.一种用于核酸扩增的方法，其包括：
a)使(1)正向引物与单链靶核酸分子退火以及使(2)反向引物与所述单链靶核酸分子的互补体退火，其中所述正向和反向引物中的每一种从5’端到3’端包含相对于所述单链靶核酸分子或所述互补体的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的分子部分，并且其中所述正向引物的分子部分和所述反向引物的分子部分彼此不互补；
b)以模板指导的方式延伸所述正向引物和所述反向引物以产生双链靶核酸分子；
c)使所述双链靶核酸分子变性，以生成单链靶核酸分子；以及
d)重复(a)-(c)至少一个循环以产生扩增的双链靶核酸分子。
35.根据权利要求34所述的方法，其中在所述至少一个循环之后，包含所述正向引物和/或所述反向引物的引物二聚体副产物以一定的浓度存在，如通过所述扩增的双链靶核酸分子的解链曲线分析所测，该浓度小于所述扩增的双链靶核酸分子的约10％。
36.根据权利要求34所述的方法，其中(a)-(d)在分区中进行。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述分区为孔。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述分区为小滴。
39.根据权利要求34所述的方法，其进一步包括检测所述扩增的双链靶核酸分子的至少一个亚组。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述检测为光学检测、静电检测或电化学检测。
41.根据权利要求34所述的方法，其进一步包括在(b)之前去除所述正向引物的所述分子部分和所述反向引物的所述分子部分。
42.一种用于核酸扩增的方法，其包括：
使含有具有单链靶核酸分子的核酸样品的反应混合物在产生所述核酸样品的扩增产物的条件下经历核酸扩增反应，
其中所述反应混合物包含：
(a)正向引物，其互补于所述单链靶核酸分子且包含相对于所述单链靶核酸分子的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的第一分子部分；和
(b)反向引物，其互补于所述单链靶核酸分子的互补体且包含相对于所述互补体的一个或多个相应核苷酸非互补的在3’端的第二分子部分，
其中所述第一分子部分和所述第二分子部分彼此不互补。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述经历核酸扩增反应包括以模板指导的方式延伸所述正向引物和所述反向引物以产生双链靶核酸分子。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述经历核酸扩增反应包括在延伸所述正向引物和所述反向引物之前去除所述第一和第二分子部分。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述第一和/或第二分子部分借助于所述反应混合物中聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性是可去除的。
46.根据权利要求42所述的方法，其中所述正向和/或反向引物是分离且纯化的核酸链。
47.根据权利要求42所述的方法，其中所述正向引物和/或反向引物是发夹环形引物，其特征在于所述序列A显示出与(1)自身和/或(2)所述第一和/或第二分子部分的序列互补性。
48.根据权利要求42所述的方法，其中所述正向引物和/或反向引物适用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
49.根据权利要求42所述的方法，其中所述正向和反向引物中的每一种从5’端到3’端包含基本上互补于所述单链靶核酸分子或所述互补体的核苷酸序列A。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述第一或第二分子部分包含具有相对于所述靶核酸分子或所述互补体的1-10个相应核苷酸非互补的1-10个连续核苷酸的核苷酸序列B。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述核苷酸序列A具有一定的长度，该长度提供相对于所述靶核酸分子或所述互补体的充分互补性。
52.根据权利要求42所述的方法，其中所述第一和/或第二分子部分为至少一个核苷酸、核苷酸类似物或非核苷酸物质。
53.根据权利要求42所述的方法，其中所述第一和/或第二分子部分包含磷酸二酯键或为n-磷酸酯部分，其中‘n’大于或等于1。
54.根据权利要求42所述的方法，其中所述第一和/或第二分子部分适合于防止包含所述正向引物和/或所述反向引物的引物二聚体分子复合体的形成。
55.根据权利要求42所述的方法，其中所述正向引物和/或反向引物具有6至60个核苷酸的长度。
56.根据权利要求42所述的方法，其中所述分子部分具有1至10个单独物质的长度。
57.根据权利要求42所述的方法，其中所述第一和/或第二分子部分包含具有非天然碱基或无碱基的核苷酸类似物。
58.根据权利要求42所述的方法，其中所述正向引物和/或反向引物适用于单核苷酸多态性检测。
59.根据权利要求42所述的方法，其中所述反应混合物的温度借助于热梯度来控制。
60.一种用于核酸扩增的方法，其包括：
(a)提供包含正向引物、反向引物和靶核酸分子的反应混合物，其中所述正向引物互补于所述靶核酸分子，并且所述反向引物互补于所述靶核酸分子的互补体；以及
(b)使用所述正向引物和所述反向引物进行多个扩增循环，以在溶液中生成所述靶核酸分子的扩增产物，
其中在20个或更多个扩增循环之后，如根据所述扩增产物的解链曲线分析所测，所述反应混合物中包含所述正向引物的序列和/或所述反向引物的序列的引物二聚体分子复合体的浓度小于所述扩增产物的约10％。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述多个扩增循环借助于热梯度进行。
62.根据权利要求60所述的方法，其进一步包括检测所述扩增产物。
63.根据权利要求60所述的方法，其中用于检测所述扩增产物的循环阈值(Ct)小于60。
64.根据权利要求60所述的方法，其中所述正向引物包含相对于所述靶核酸分子非互补的在3’端的分子部分。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述反向引物包含相对于所述靶核酸分子的互补体非互补的在3’端的分子部分。
66.根据权利要求60所述的方法，其中所述引物二聚体分子复合体是不可检测的。
67.一种包含约6至60个核苷酸的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3’端具有分子部分，该分子部分在所述靶核酸分子的扩增期间i)相对于靶核酸分子为非结合的，ii)可被具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶识别，以及iii)可被所述聚合酶的所述3’到5’外切核酸酶活性切割。
68.根据权利要求67所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含约10至60个核苷酸。
69.根据权利要求67所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含显示出与(1)自身和/或(2)所述分子部分的序列互补性的核苷酸序列A。
70.根据权利要求69所述的寡核苷酸，其中所述核苷酸序列A具有一定的长度，该长度提供相对于所述靶核酸分子的充分互补性。
71.根据权利要求69所述的寡核苷酸，其中所述分子部分包含具有相对于所述靶核酸分子的1-10个相应核苷酸非互补的1-10个连续核苷酸的核苷酸序列B。
72.根据权利要求67所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是分离且纯化的核酸链。
73.根据权利要求67所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸适用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
74.根据权利要求67所述的寡核苷酸，其中所述分子部分为至少一个核苷酸、核苷酸类似物或非核苷酸物质。
75.根据权利要求67所述的寡核苷酸，其中所述分子部分包含磷酸二酯键或为n-磷酸酯部分，其中‘n’大于或等于1。
76.根据权利要求67所述的寡核苷酸，其中所述分子部分适合于防止包含所述寡核苷酸的寡核苷酸二聚体副产物的形成。
77.根据权利要求67所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有6至20个核苷酸的长度。
78.根据权利要求67所述的寡核苷酸，其中所述分子部分具有1至10个单独物质的长度。
79.根据权利要求67所述的寡核苷酸，其中所述分子部分包含具有非天然碱基或无碱基的核苷酸类似物。
80.根据权利要求67所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸适用于单核苷酸多态性检测。
81.一种寡核苷酸组，其包含如权利要求67所述的寡核苷酸和与所述靶核酸分子的互补核酸链显示出序列互补性的至少一个附加寡核苷酸。
82.根据权利要求81所述的寡核苷酸组，其中当在具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶的存在下在扩增反应中使用时，所述寡核苷酸组产生基本上不含寡核苷酸二聚体副产物的扩增靶核酸。
83.根据权利要求82所述的寡核苷酸组，其中如根据所述扩增靶核酸的解链曲线所测，寡核苷酸二聚体副产物以小于约10％的浓度存在。
84.一种包含如权利要求67所述的寡核苷酸的溶液。
85.根据权利要求1所述的引物，其中所述引物包含至少一个终止子核苷酸。
86.根据权利要求85所述的引物，其中所述至少一个终止子核苷酸是核酸酶抗性的。
87.根据权利要求19所述的引物组，其中所述正向引物和/或所述反向引物包含至少一个终止子核苷酸。
88.根据权利要求87所述的引物组，其中所述至少一个终止子核苷酸是核酸酶抗性的。
89.根据权利要求34、42或60所述的方法，其中所述正向引物和/或所述反向引物包含至少一个终止子核苷酸。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述至少一个终止子核苷酸是核酸酶抗性的。
91.根据权利要求67所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个终止子核苷酸。
92.根据权利要求91所述的寡核苷酸，其中所述至少一个终止子核苷酸是核酸酶抗性的。
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