CN109266725A - 一种利用rna位点特异性核酸酶的基因克隆方法 - Google Patents

一种利用rna位点特异性核酸酶的基因克隆方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109266725A
CN109266725A CN201811129780.4A CN201811129780A CN109266725A CN 109266725 A CN109266725 A CN 109266725A CN 201811129780 A CN201811129780 A CN 201811129780A CN 109266725 A CN109266725 A CN 109266725A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
target gene
nuclease
carrier
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811129780.4A
Other languages
English (en)
Inventor
刘喜朋
林振华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Baike Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Suzhou Taikang Ji'an Instrument Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Taikang Ji'an Instrument Technology Co Ltd filed Critical Suzhou Taikang Ji'an Instrument Technology Co Ltd
Priority to CN201811129780.4A priority Critical patent/CN109266725A/zh
Publication of CN109266725A publication Critical patent/CN109266725A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法，利用RNA嵌合引物，扩增载体与目标基因，然后将扩增片段用核酸酶HII与HIII进行消化，生成3’单链DNA，载体与目标基因的3’单链DNA彼此配对，形成带缺口重组质粒，转化大肠杆菌后缺口被修复完整，形成完好的环状重组质粒，进行基因克隆。通过上述方式，本发明不再依赖于限制性内切酶对载体和目标基因进行特异性切割，而且载体和目标基因之间的配对区长达10‑30个碱基，不再需要DNA连接酶对DNA进行连接缝合，可以直接转化大肠杆菌，极大地增加了一次基因克隆操作的目标基因数量，非常适合于高通量基因克隆，能应用于重组DNA的构建(基因克隆)、基因点突变等，也可用于精准医疗等领域的DNA文库构建。

Description

一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法。
背景技术
基因克隆技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术涉及目标基因片段与质粒载体的限制性核酸内切酶消化、连接酶连接环化目标基因与质粒两步必不可少的操作。具体的克隆方法是通过限制性内切酶切割载体和目的片段，然后将载体和目的片段用连接酶连接起来。由于限制性核酸内切酶消化反应与DNA连接酶反应，特别是限制性核酸内切酶消化反应，效率的高低直接决定着目标基因克隆能否成功。虽然利用碱性磷酸单酯酶除去线性化载体的5’磷酸基团，会大大提高阳性克隆百分比，但该操作异常繁琐，手法难于掌握，经常起不到应有作用。该方法操作缺点主要有：1)需要在引物的5’端引入一个限制性内切酶切割位点，如果基因内部具有该位点则导致无法进行该基因的克隆；2)不同基因选择的内切酶不一样，需要不同的限制性内切酶进行处理，因此很难同时克隆多个基因。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种利用含RNA的引物和RNA位点特异性核酸酶进行的基因克隆方法，能解决现有基因克隆技术的不足，简化基因克隆操作，提高克隆效率与操作通量，可用于大规模基因克隆。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法，包括步骤为：(1)利用含有RNA碱基的引物PCR扩增目标基因和载体；(2)利用核酸酶HII或核酸酶HIII对步骤(1)得到的PCR扩增后的目标基因和载体进行消化处理，得到目标基因的单链DNA尾巴和载体的单链DNA尾巴；(3)将步骤(2)得到的目标基因的单链DNA尾巴和载体的单链DNA尾巴配对，形成带缺口的含有目标基因的重组载体；(4)步骤(3)得到的带缺口的含有目标基因的重组载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组载体。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述含有RNA碱基的引物的序列为：5’端第5-30位的碱基含间隔性的RNA碱基；扩增目标基因和载体的正向引物5’端的第1-30位碱基序列是互补配对的，扩增目标基因和载体的反向引物5’端的第1-30位碱基序列是互补配对的；3’端下游碱基序列与所述目标基因和载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因和载体的正向引物、用于扩增目标基因和载体的反向引物、目标核酸模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中还包括用限制性核酸内切酶Dpn I对扩增后的目标基因和载体中的环状模板质粒进行消化去除。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)中所述消化处理的温度根据核酸酶HII或核酸酶HIII的热稳定性确定，所述消化处理时间为0.5-10分钟。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)中常温核酸酶HII或常温核酸酶HIII的消化处理温度为30-40度，热稳定性核酸酶HII或热稳定性核酸酶HIII的消化处理温度50-75度。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)中所述配对过程是室温下放置0.5-15分钟。
在本发明一个较佳实施例中，所述利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法还包括对含目标基因的完整重组载体的鉴定：挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与TaqDNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组载体的阳性克隆，培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组载体。
在本发明一个较佳实施例中，所述利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法用于基因点突变，包括步骤为：(1)利用含有RNA碱基的引物PCR扩增野生型基因的质粒载体；(2)利用核酸酶HII或核酸酶HIII对步骤(1)得到的PCR扩增后的质粒载体进行消化处理，得到两端产生彼此互补配对的单链DNA尾巴的核苷酸突变型基因的质粒载体；(3)将步骤(2)得到的两端带有互补配对单链DNA的质粒载体自我杂交配对，形成带缺口的含突变型目标基因的重组质粒载体；(4)步骤(3)得到的带缺口的含突变型目标基因的重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含突变型目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含突变型目标基因的完整重组质粒载体。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增的正向引物、用于扩增的反向引物、野生型质粒模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸；步骤(1)中还包括用限制性核酸内切酶Dpn I对扩增后的野生型基因的质粒载体的环状质粒模板进行消化去除；步骤(2)中所述消化处理的温度根据核酸酶HII或核酸酶HIII的热稳定性确定，所述消化处理时间为0.5-10分钟；步骤(2)中常温核酸酶HII或常温核酸酶HIII的消化处理温度为30-40度，热稳定性核酸酶HII或热稳定性核酸酶HIII的消化处理温度50-75度；步骤(3)中所述配对过程是室温下放置0.5-15分钟；所述利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法用于基因点突变还包括对含突变型SSB目标基因的完整重组质粒载体的鉴定：挑取单菌落，培养阳性克隆，并抽提含突变型目标基因的完整重组质粒载体进行测序，验证点突变。
本发明的有益效果是：
一、不再依赖于限制性内切酶对载体和目标基因进行特异性切割，而且载体和目标基因之间的配对区长达10-30个碱基，不在需要DNA连接酶对DNA进行连接缝合，可以直接转化大肠杆菌；
二、由于所有操作都是一步核酸酶HII/HII处理，因此可以同时克隆多个基因，极大地增加了一次克隆反应中同时克隆的目标基因数量，非常适合于高通量基因克隆；
三、若使用高温核酸酶HII/HII进行消化处理，可以促进切断的DNA短链的游离释放，后续降温过程便于载体与目标基因之间的杂交配对。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明的利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法一较佳实施例
的流程图；
图2是图1所述利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法的含有目标基
因的阳性克隆的鉴定结果图；
图3是本发明的利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法用于基因点突
变的一较佳实施例的流程图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：枯草芽孢杆菌单链DNA结合蛋白SSB的基因克隆
请参阅图1，提供一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法，包括步骤为：
(1)设计合成含有RNA碱基的引物，其中所述含有RNA碱基的引物的序列要满足的特征为：(a)5’端第5-15位含有间隔性的RNA碱基，相邻RNA碱基间的距离为3-4个碱基；(b)扩增目标基因和质粒载体的正向引物5’端的第1-14位碱基序列是互补配对的，扩增目标基因和质粒载体的反向引物5’端的第1-14位碱基序列是互补配对的；(c)3’端下游碱基序列与所述目标基因和载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对；
扩增SSB的引物序列为：
gene-F：5’CAAAAaAGCAgGCTcCCATATGCTTAACCGAGTTGTATT
gene-R:5’CAAGaAAGCuGGGTcGGATCCTTAGAATGGA AGATCATCAT扩增pDEST17的引物序列为：
pDEST17-F：5’AGCCuGCTTuTTTGuACAAACTTGTT
pDEST17-R:5’ACCCaGCTTuCTTGuACAAAGTG
其中大写字母为DNA碱基，小写字母为RNA碱基。
(2)利用含有RNA碱基的引物采用聚合酶链式反应PCR扩增目标基因SSB和pDEST17质粒载体，其中50微升PCR扩增反应缓冲液中包括有0.2μM用于扩增目标基因和质粒载体的正向引物、0.2μM用于扩增目标基因和质粒载体的反向引物、0.2μM目标核酸模板分子、DNA聚合酶、0.2mM 4种脱氧核苷三磷酸，所述目标核酸模板分子为目标基因模板为50纳克枯草芽孢杆菌基因组DNA，质粒载体模板分子为5纳克pDEST7环状质粒，所述DNA聚合酶是1个单位高忠实度KOD DNA聚合酶，本发明中PCR反应条件为：本发明中pDEST17载体PCR反应条件为：98度3分钟；(95度0.5分钟，52度0.5分钟，72度2.5分钟)×30循环；72度×4分钟；16度3分钟。本发明中目标基因的PCR反应条件为：98度3分钟；(95度0.5分钟，50度0.5分钟，72度0.5分钟)×30循环；72度×6分钟；16度3分钟。
(3)用限制性核酸内切酶Dpn I消化扩增的线性化质粒载体PCR产物中存在的环状质粒模板。直接在20微升PCR产物中加入DpnI为10个单位，37度反应时间为1小时。所述限制性核酸内切酶Dpn I能特异性识别切割模板质粒双链DNA中A甲基化的GmATC序列，Dpn I的处理使得质粒模板变成很多段短的DNA双链，这些短的DNA双链转化大肠杆菌不能够产生克隆，从而消除了野生型质粒模板产生的假阳性克隆。
(4)直接在DpnI处理的pDEST17载体PCR产物、SSB目标基因PCR产物中或在核酸酶HII/HIII的反应缓冲液中加入大肠杆菌核酸酶HII或衣原体核酸酶HIII，在37度消化处理目标基因与线性化质粒载体DNA片断，在RNA碱基处断裂DNA中的磷酸二酯键，断裂的短片段DNA链与互补链分离，从而在双链DNA片段的两端产生长度为14个核苷酸的3’突出端。所述消化处理时间为5分钟。
(5)带有14个核苷酸长度的3’突出端的目标基因与线性化质粒载体DNA片断间进行杂交配对，所述杂交配对是将两种DNA片断混合后，室温放置0.5～15分钟，使二者的3’突出端杂交配对，形成稳定的完全配对双链含目标基因的带缺口重组质粒，不需要进行DNA连接反应。
(6)步骤(5)得到的杂交混合物中包含有带缺口的含有目标基因的重组质粒载体，所述带缺口的含有目标基因的重组质粒载体转化大肠杆菌感受态细胞，在固体培养基上37度培养过夜。在大肠杆菌的繁殖过程中，带缺口重组质粒载体中目标基因与质粒载体间的缺口会被修复，形成含目标基因的完整重组质粒载体。
(7)含目标基因的完整重组质粒载体的鉴定：挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与Taq DNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组质粒的阳性克隆。培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组质粒DNA。10个克隆中阳性克隆数为9个，阳性克隆率达到90％，详见图2。
实施例2：枯草芽孢杆菌单链DNA结合蛋白SSB的基因定点突变体D74A的构建
请参阅图3，提供一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因定点突变方法，包括步骤为：
(1)设计合成含有RNA碱基的引物，其中所述含有RNA碱基的引物的序列要满足的特征为：(a)正向引物D74A-F的5’端第7,12位的碱基为RNA碱基，反向引物D74A-R的5’端第6,12位的碱基为RNA碱基；(b)正向引物与反向引物的5’端的第1-11位碱基序列是互补配对的；(c)3’端下游20个碱基序列与所述野生型SSB目标基因突变位点下游碱基序列配对。
扩增SSB的D74A点突变的引物序列如下：
D74A-F：5’CGTAGCuGGCCgTTTACAAACAAGAA
D74A-R:5’GGCCAgCTACGcCTGCAAGGCTTCCT
其中大写字母为DNA碱基，小写字母为RNA碱基。
(2)利用含有RNA碱基的引物采用聚合酶链式反应PCR扩增野生型SSB基因的质粒载体。其中50微升PCR扩增反应缓冲液中包括有0.2μM用于扩增的正向引物、0.2μM反向引物、5纳克野生型质粒模板分子、DNA聚合酶、0.2mM4种脱氧核苷三磷酸，所述野生型质粒模板分子为含野生型目标基因SSB的环状质粒分子，所述DNA聚合酶为1个单位KOD DNA聚合酶，本发明中PCR反应条件为：98度3分钟；(95度0.5分钟，52度0.5分钟，72度3分钟)×30循环；72度×6分钟；16度3分钟。
(3)用限制性核酸内切酶Dpn I消化扩增的线性化质粒载体PCR产物中存在的环状质粒模板。直接在20微升PCR产物中加入DpnI为10个单位，37度反应时间为5分钟至2小时。所述限制性核酸内切酶Dpn I能特异性识别切割模板质粒双链DNA中A甲基化的GmATC序列，Dpn I的处理使得质粒模板变成很多段短的DNA双链，这些短的DNA双链转化大肠杆菌不能够产生克隆，从而消除了野生型质粒模板产生的假阳性突变体。
(4)直接在DpnI处理的PCR产物中加入大肠杆菌核酸酶HII或衣原体核酸酶HIII，在37度消化处理5-30分钟，消化处理线性化质粒载体DNA片断，在RNA碱基处断裂DNA中的磷酸二酯键，断裂的短片段DNA链与互补链分离，从而在双链DNA片段的两端产生长度为11个核苷酸的3’突出端。
(5)突变型SSB基因的线性化质粒的11个核苷酸长度的3’突出端单链自我杂交配对，室温放置3分钟，使二者的3’突出端杂交配对，形成稳定的完全配对双链含突变型目标基因的带缺口重组质粒。
(6)步骤(5)得到的带缺口的含有突变型目标基因的重组质粒载体，转化大肠杆菌感受态细胞，在固体培养基上37度培养过夜。在大肠杆菌的繁殖过程中，带缺口重组质粒载体的缺口会被修复，形成含突变型SSB目标基因的完整重组质粒载体。
(7)含突变型目标基因SSB的完整重组质粒载体的鉴定：挑取单菌落，培养克隆，并抽提质粒进行测序，验证突变型SSB的D74A点突变。
本发明的有益效果是：本发明的利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法，不再依赖于限制性内切酶对载体和目标基因进行特异性切割，而且载体和目标基因之间的配对区长达10-30个碱基，不再需要DNA连接酶对DNA进行连接缝合，可以直接转化大肠杆菌，极大地增加了一次克隆反应中可以同时的目标基因数量，非常适合于高通量基因克隆，能应用于重组DNA的构建(基因克隆)、基因定点突变等，也可用于需要进行DNA文库构建的精准医疗等领域。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：(1)利用含有RNA碱基的引物PCR扩增目标基因和载体；(2)利用核酸酶HII或核酸酶HIII对步骤(1)得到的PCR扩增后的目标基因和载体进行消化处理，得到目标基因的单链DNA尾巴和载体的单链DNA尾巴；(3)将步骤(2)得到的目标基因的单链DNA尾巴和载体的单链DNA尾巴配对，形成带缺口的含有目标基因的重组载体；(4)步骤(3)得到的带缺口的含有目标基因的重组载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组载体。
2.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤(1)中所述含有RNA碱基的引物的序列为：5’端第5-30位的碱基含间隔性的RNA碱基；扩增目标基因和载体的正向引物5’端的第1-30位碱基序列是互补配对的，扩增目标基因和载体的反向引物5’端的第1-30位碱基序列是互补配对的；3’端下游碱基序列与所述目标基因和载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对。
3.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤(1)中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因和载体的正向引物、用于扩增目标基因和载体的反向引物、目标核酸模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。
4.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤(1)中还包括用限制性核酸内切酶DpnI对扩增后的目标基因和载体中的环状模板质粒进行消化去除。
5.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤(2)中所述消化处理的温度根据核酸酶HII或核酸酶HIII的热稳定性确定，所述消化处理时间为0.5-10分钟。
6.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤(2)中常温核酸酶HII或常温核酸酶HIII的消化处理温度为30-40度，热稳定性核酸酶HII或热稳定性核酸酶HIII的消化处理温度50-75度。
7.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤(3)中所述配对过程是室温下放置0.5-15分钟。
8.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，所述利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法还包括对含目标基因的完整重组载体的鉴定：挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与Taq DNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组载体的阳性克隆，培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组载体。
9.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，所述利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法用于基因点突变，包括步骤为：(1)利用含有RNA碱基的引物PCR扩增野生型基因的质粒载体，得到核苷酸突变型基因的质粒载体；(2)利用核酸酶HII或核酸酶HIII对步骤(1)得到的PCR扩增后的质粒载体进行消化处理，得到两端产生了彼此互补的单链尾巴的核苷酸突变型基因的质粒载体；(3)将步骤(2)得到的互补单链尾巴进行自我杂交配对，形成带缺口的含突变型目标基因的重组质粒载体；(4)步骤(3)得到的带缺口的含突变型目标基因的重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含突变型目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含突变型目标基因的完整重组质粒载体。
10.根据权利要求9所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤(1)中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增的正向引物、用于扩增的反向引物、野生型质粒模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸；步骤(1)中还包括用限制性核酸内切酶DpnI对扩增后的野生型基因的环状质粒模板进行消化去除；步骤(2)中所述消化处理的温度根据核酸酶HII或核酸酶HIII的热稳定性确定，所述消化处理时间为0.5-10分钟；步骤(2)中常温核酸酶HII或常温核酸酶HIII的消化处理温度为30-40度，热稳定性核酸酶HII或热稳定性核酸酶HIII的消化处理温度50-75度；步骤(3)中所述配对过程是室温下放置0.5-15分钟；所述利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法用于基因点突变还包括对含突变型目标基因的完整重组质粒载体的鉴定：挑取单菌落，培养阳性克隆，并抽提含突变型目标基因的完整重组质粒载体进行测序，验证点突变。
CN201811129780.4A 2018-09-27 2018-09-27 一种利用rna位点特异性核酸酶的基因克隆方法 Pending CN109266725A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811129780.4A CN109266725A (zh) 2018-09-27 2018-09-27 一种利用rna位点特异性核酸酶的基因克隆方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811129780.4A CN109266725A (zh) 2018-09-27 2018-09-27 一种利用rna位点特异性核酸酶的基因克隆方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109266725A true CN109266725A (zh) 2019-01-25

Family

ID=65198989

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811129780.4A Pending CN109266725A (zh) 2018-09-27 2018-09-27 一种利用rna位点特异性核酸酶的基因克隆方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109266725A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110129347A (zh) * 2019-06-01 2019-08-16 苏州博睐恒生物科技有限公司 一种化学裂解法制备t载体的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107058361A (zh) * 2016-12-28 2017-08-18 苏州旷世骏弛生物科技有限公司 基于核糖核苷酸修饰引物的连接酶非依赖性基因克隆方法
CN107208146A (zh) * 2014-11-20 2017-09-26 安普里怀斯公司 用于核酸扩增的组合物和方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107208146A (zh) * 2014-11-20 2017-09-26 安普里怀斯公司 用于核酸扩增的组合物和方法
CN107058361A (zh) * 2016-12-28 2017-08-18 苏州旷世骏弛生物科技有限公司 基于核糖核苷酸修饰引物的连接酶非依赖性基因克隆方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110129347A (zh) * 2019-06-01 2019-08-16 苏州博睐恒生物科技有限公司 一种化学裂解法制备t载体的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11692213B2 (en) Compositions and methods for targeted depletion, enrichment, and partitioning of nucleic acids using CRISPR/Cas system proteins
CN105112435B (zh) 植物多基因敲除载体的构建及应用
JP6745599B2 (ja) 分子の作製
CN101310024B (zh) 高通量筛选转座子标记群体和大量平行的插入位点的序列鉴定方法
CN101067133B (zh) 基于硫代修饰的连接酶非依赖性基因克隆方法
CN106661631A (zh) 使用组合的核酸酶、连接酶、聚合酶和测序反应识别和枚举核酸序列、表达、拷贝或dna甲基化变化的方法
CN107058361A (zh) 基于核糖核苷酸修饰引物的连接酶非依赖性基因克隆方法
EP1012264A1 (en) Method for assembly of multiple dna fragments
US20230051396A1 (en) Class ii, type ii crispr systems
CN105420225A (zh) 基于硫代修饰的碘酒裂解型基因克隆方法
CN107904667A (zh) 一种新型甲基化建库试剂盒及其应用
CN109266725A (zh) 一种利用rna位点特异性核酸酶的基因克隆方法
WO2017215517A1 (zh) 测序文库构建中5'和3'接头连接副产物的去除方法
WO1991004340A1 (en) In vitro, isothermal nucleic acid amplification
CN109266671A (zh) 利用dU与endoQ进行基因克隆与点突变的方法
CN110499310A (zh) 一种不依赖于酶的新型基因克隆方法
CN109266670A (zh) 利用dI碱基进行基因克隆与点突变的方法
CN109266644A (zh) 一种利用dI引物进行基因定点饱和突变的方法
CN109804083A (zh) 单引物至双引物扩增子转换
CN109439682A (zh) 利用dU和古菌DNA聚合酶的基因克隆的方法
CN100383248C (zh) 用于t-a克隆的t载体制备方法
CN109750032A (zh) 一种构建基因多点突变和进化的方法
CN109234296A (zh) 一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法
CN111876472B (zh) 多种混合核酸中检测痕量核酸的方法
CN116135982A (zh) 用于基因片段连接的应用方法和试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200420

Address after: 215000 room 705, No. 2, xugongqiao Road, Huaqiao Town, Kunshan City, Suzhou City, Jiangsu Province

Applicant after: SUHOU BOLAIHENG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: 215000 room 402, building C, Cao Hu science and Technology Park, 1 West Kwun Tong, Xiangcheng economic and Technological Development Zone, Suzhou, Jiangsu

Applicant before: SUZHOU TAIKANG JI'AN INSTRUMENT TECHNOLOGY Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20230918

Address after: Room 320, Zone E, Zhongyin Square, No. 2, Xugongqiao Road, Huaqiao Town, Kunshan City, Suzhou City, Jiangsu Province, 215000

Applicant after: Suzhou Baike Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 215000 room 705, No.2, xugongqiao Road, Huaqiao Town, Kunshan City, Suzhou City, Jiangsu Province

Applicant before: SUHOU BOLAIHENG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right