CN109266670A - 利用dI碱基进行基因克隆与点突变的方法 - Google Patents

利用dI碱基进行基因克隆与点突变的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用dI碱基进行基因克隆与点突变的方法，利用dI修饰引物，扩增载体与目标基因，然后将载体与目标基因片段用内切核酸酶V或DNA糖苷酶AlkA进行消化处理，在dI碱基处断裂DNA链，使载体与目标基因的末端分别形成带单链DNA尾巴的结构，二者的单链DNA彼此配对形成带缺口的环状重组DNA分子，载体和目标基因之间的配对区长达10‑15个碱基，不再需要DNA连接酶对DNA进行连接缝合，极大地增加了一次克隆反应中可以同时的目标基因数量，非常适合于高通量基因克隆。

Description

利用dI碱基进行基因克隆与点突变的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种利用dI碱基进行基因克隆与点突变的方法。
背景技术
传统基因克隆技术涉及目标基因片段与质粒载体的限制性核酸内切酶消化、连接酶连接环化目标基因与质粒这两步必不可少的操作。基因克隆技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术缺点主要有：1）恰当的限制性酶切位选择繁琐；2）限制性酶位点的兼容性差导致克隆通量低；3）限制性内切酶消化不彻底或DNA连接反应效率低都会产生大量的阴性克隆，而且单一限制性酶消化法克隆还会因载体自连接生成大量空载体阴性克隆，这两方面都会导致阳性克隆率极低。虽然利用碱性磷酸单酯酶除去线性化载体的5’磷酸基团，会大大提高阳性克隆百分比，但该操作异常繁琐，手法难于掌握，经常起不到应有作用。
为了克服常规基因克隆方法的缺陷，开发了不依赖于连接酶的克隆方法。其基本原理是通过外切酶消化目标基因与线性化载体DNA片段，生成3’或5’单链DNA，目标基因与线性化载体的单链DNA彼此互补配对，形成带DNA缺口的环状重组质粒，转化大肠杆菌后带缺口重组质粒被修复成环状闭合质粒。然而这种基于外切酶的重组克隆技术的外切酶消化程度难于控制，造成DNA消化过头，使得有效的DNA单链尾巴含量过低，造成只有少数目标基因与线性化载体能够杂交配对形成带DNA缺口的环状重组质粒，大大降低了重组反应效率，最终导致基因克隆失败。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种利用dI碱基进行基因克隆与点突变的方法，能解决现有基因克隆技术的不足，可以同时克隆多个基因，极大地增加了一次克隆操作中同时克隆的目标基因数量，非常适合于高通量基因克隆。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种利用dI碱基进行基因克隆的方法，包括步骤为：（1）利用含有dI碱基的引物扩增目标基因和质粒载体；（2）利用内切核酸酶V或DNA糖苷酶AlkA对步骤（1）得到的PCR扩增后的目标基因和质粒载体在dI碱基处切断DNA链，得到目标基因的单链DNA尾巴和质粒载体的单链DNA尾巴；（3）将步骤（2）得到的目标基因的单链DNA尾巴和质粒载体的单链DNA尾巴彼此杂交配对，形成带缺口的含有目标基因的重组质粒载体；（4）步骤（3）得到的带缺口的含有目标基因的重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述含有dI碱基的引物的序列为：（a）5’端第10-15位含有1个dI碱基；（b）扩增目标基因的正向引物与扩增质粒载体的正向引物5’端的第1-15位碱基序列彼此互补配对，扩增目标基因的反向引物与扩增质粒载体的反向引物5’端的第1-15位碱基序列彼此互补配对；（c）3’端下游碱基序列与所述目标基因和质粒载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因的正向引物、用于扩增质粒载体的正向引物、用于扩增目标基因的反向引物、用于扩增质粒载体的反向引物、目标核酸模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中还包括用限制性核酸内切酶Dpn I对扩增后的质粒载体中的野生型环状质粒模板进行消化处理。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（2）中所述在dI碱基处切断DNA链的温度根据内切核酸酶V或DNA糖苷酶AlkA的热稳定性确定，所述在dI碱基处切断DNA链的时间为1-30分钟。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（2）中常温内切核酸酶V或常温DNA糖苷酶AlkA的处理温度为30-40度，热稳定性内切核酸酶V或热稳定性DNA糖苷酶AlkA的处理温度50-75度。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（3）中所述彼此杂交配对过程是室温下放置1～15分钟。
在本发明一个较佳实施例中，所述利用dI碱基的基因克隆方法还包括对含目标基因的完整重组载体的鉴定：挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与Taq DNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组质粒载体的阳性克隆，培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组质粒载体。
本发明的有益效果是：
一、所述方法在特定位点选择性断裂DNA链，形成长度可控的单链尾巴，避免了外切酶重组克隆中存在的过度消化问题，理论上所有单链DNA尾巴均能够有效配对，极大的提高了重组克隆效率；
二、所述方法采用dI碱基作为兼并碱基，可以与4种正常碱基配对，因此可以引入4种碱基，增加突变率，从而将基因克隆与特定位点的碱基饱和突变结合起来；
三、所述方法中的步骤都是一步内切核酸酶V或DNA糖苷酶AlkA处理，因此可以同时克隆多个基因，极大地增加了一次克隆操作中同时克隆的目标基因数量，非常适合于高通量基因克隆。
四、若使用高温内切核酸酶V或DNA糖苷酶AlkA进行消化处理，可以促进切断的DNA短链的游离释放，后续降温过程便于载体与目标基因之间的杂交配对；
五、所述方法不再依赖于限制性内切酶对载体和目标基因进行特异性切割，而且载体和目标基因之间的配对区长达10-15个碱基，不在需要DNA连接酶对DNA进行连接缝合，可以直接转化大肠杆菌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明利用dI碱基修饰引物进行基因克隆的方法的一较佳实施例的流程图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：枯草芽孢杆菌单链DNA结合蛋白SSB的基因克隆
请参阅图1，提供一种利用dI碱基进行基因克隆的方法，包括步骤为：
（1）设计合成用于扩增目标基因SSB与质粒载体pDEST17的引物，其中所述含有dI碱基的引物的序列要满足的特征为：引物的序列特征是：（a）扩增SSB基因与pDEST17载体的引物的5’端第12位的碱基为dI碱基；（b）扩增目标基因的正向引物与扩增质粒载体的正向引物5’端的第1-11位碱基序列彼此互补配对，扩增目标基因的反向引物与扩增质粒载体的反向引物5’端的第1-11位碱基序列彼此互补配对；（c）3’端下游碱基序列与所述目标基因和质粒载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对。
扩增SSB的引物序列为：
gene-F：5’ CATATAGCGTGXatgcttaaccgagttgtattag
gene-R：5’ GGATATGCCTAXttagaatgga agatcatcatc
扩增pDEST17的引物序列为：
pDEST17-F：5’ CACGCTATATGXgcttttttgtacaaacttgtt
pDEST17-R：5’ TAGGCATATCCXcagctttcttgtacaaagtg
其中大写字母为目标基因与质粒5’端互补配对的序列，小写字母为引物与模板配对的序列，X为dI碱基。（2）利用步骤（1）中含有dI碱基的引物采用聚合酶链式反应PCR扩增目标基因SSB与线性化pDEST17质粒载体的DNA片段。将用于扩增SSB目标基因的正向引物与反向引物、用于扩增pDEST17质粒载体的正向引物与反向引物、PCR模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）加入PCR反应缓冲液，进行PCR反应，其中所述目标基因的PCR模板分子为枯草杆菌基因组DNA，质粒载体模板为pDEST17质粒，所述DNA聚合酶为高忠实度KODDNA聚合酶。本实施例PCR反应条件：pDEST17载体的PCR反应条件为：98度3分钟；（95度0.5分钟，55度0.5分钟，72度2.5分钟）×30循环；72度×4分钟；16度3分钟。目标基因SSB的PCR反应条件为：98度3分钟；（95度0.5分钟，55度0.5分钟，72度0.5分钟）×30循环；72度×6分钟；16度3分钟。。
（3）线性化质粒载体DNA片段的限制性内切酶DpnI消化。对扩增的线性化质粒载体PCR产物，用限制性核酸内切酶Dpn I消化野生型环状质粒模板。直接在20微升PCR产物中加入DpnI为10个单位，37度反应时间为1小时。所述限制性核酸内切酶Dpn I能特异性识别切割模板质粒双链DNA中A甲基化的GmATC序列，Dpn I的处理使得质粒模板变成很多段短的DNA双链，这些短的DNA双链转化大肠杆菌不能够产生克隆，从而消除了野生型质粒模板产生的假阳性克隆。
（4）目标基因的单链DNA尾巴和质粒载体的单链DNA尾巴的生成。直接在DpnI处理的PCR产物中、或在内切核酸酶V的反应缓冲液中或在DNA糖苷酶AlkA的反应缓冲液中，加入热稳定性内切核酸酶V或DNA糖苷酶AlkA对步骤（3）得到的线性化pDEST17质粒PCR产物和步骤（2）得到的目标基因SSB的PCR产物，在55温度温育处理扩增后的目标基因与线性化质粒载体DNA片断，在dI碱基处切断DNA链，断裂的短片段DNA链与互补链分离，从而在双链DNA片段的两端产生长度为13个核苷酸的3’突出端。处理时间为10分钟。
（5）目标基因与线性化质粒载体DNA片断间的杂交配对。由于目标基因与质粒载体的3’ 单链DNA尾巴的碱基序列互补配对，二者形成稳定的完全配对双链，不需要进行DNA连接反应。因此将经过内切核酸酶V或DNA糖苷酶AlkA处理过的目标基因SSB与线性化质粒pDES17载体DNA片断混合后，室温放置5分钟，使二者3’突出端的的单链DNA彼此杂交配对，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体。
（6）含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌。杂交混合物（即含目标基因的带缺口重组质粒、没有发生杂交配对的目标基因与线性化质粒片段）转化大肠杆菌感受态细胞，在固体培养基上37度培养过夜。带缺口重组质粒的缺口会被大肠杆菌修复，形成含目标基因的完整重组质粒载体。
（7）含目标基因SSB的完整重组质粒载体的鉴定。挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与Taq DNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组质粒的阳性克隆。培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组质粒载体DNA。
本发明利用dI修饰引物，扩增载体与目标基因，然后将载体与目标基因片段用内切核酸酶V或DNA糖苷酶AlkA进行消化处理，在dI碱基处断裂DNA链，使载体与目标基因的末端分别形成带单链DNA尾巴的结构，二者的单链DNA彼此配对形成带缺口的环状重组DNA分子，载体和目标基因之间的配对区长达10-15个碱基，不再需要DNA连接酶对DNA进行连接缝合，极大地增加了一次克隆反应中可以同时的目标基因数量，非常适合于高通量基因克隆。
本发明由于是在特定位点选择性断裂DNA链，形成长度可控的单链尾巴，避免了外切酶重组克隆中存在的过度消化问题，理论上所有单链DNA尾巴均能够有效配对，极大的提高了重组克隆效率。
本发明采用的这种基因克隆技术不需要限制性核酸内切酶、DNA连接酶，而是利用含有dI碱基的引物，PCR扩增目标基因和质粒载体，然后利用内切核酸酶V或AlkA等对目标基因和载体PCR片段进行消化处理；产生特定长度的单链DNA尾巴，目标基因与载体的单链DNA尾巴彼此配对，二者形成带缺口的重组载体，转化大肠杆菌后，重组质粒的缺口被修复好，形成完好的重组DNA质粒。同时该方法还能够同时引入特点位点的饱和突变。该方法能简化基因克隆操作、提高克隆效率与操作通量，可用于大规模基因克隆。本发明能应用于重组DNA的构建（基因克隆）、基因定点突变等，也可用于需要进行DNA文库构建的精准医疗等领域。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种利用dI碱基进行基因克隆的方法，其特征在于，包括步骤为：（1）利用含有dI碱基的引物扩增目标基因和质粒载体；（2）利用内切核酸酶V或DNA糖苷酶AlkA对步骤（1）得到的PCR扩增后的目标基因和质粒载体在dI碱基处切断DNA链，得到目标基因的单链DNA尾巴和质粒载体的单链DNA尾巴；（3）将步骤（2）得到的目标基因的单链DNA尾巴和质粒载体的单链DNA尾巴彼此杂交配对，形成带缺口的含有目标基因的重组质粒载体；（4）步骤（3）得到的带缺口的含有目标基因的重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。
2.根据权利要求1所述的利用dI碱基进行基因克隆的方法，其特征在于，步骤（1）中所述含有dI碱基的引物的序列为：（a）5’端第10-15位的碱基为1个dI碱基；（b）扩增目标基因的正向引物与扩增质粒载体的正向引物5’端的第1-15位碱基序列彼此互补配对，扩增目标基因的反向引物与扩增质粒载体的反向引物5’端的第1-15位碱基序列彼此互补配对；（c）3’端下游碱基序列与所述目标基因和质粒载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对。
3.根据权利要求1所述的利用dI碱基进行基因克隆的方法，其特征在于，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因的正向引物、用于扩增质粒载体的正向引物、用于扩增目标基因的反向引物、用于扩增质粒载体的反向引物、目标核酸模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。
4.根据权利要求1所述的利用dI碱基进行基因克隆的方法，其特征在于，步骤（1）中还包括用限制性核酸内切酶Dpn I对扩增后的质粒载体中的野生型环状质粒模板进行消化处理。
5.根据权利要求1所述的利用dI碱基进行基因克隆的方法，其特征在于，步骤（2）中所述在dI碱基处切断DNA链的温度根据内切核酸酶V或DNA糖苷酶AlkA的热稳定性确定，所述在dI碱基处切断DNA链的时间为1-30分钟。
6.根据权利要求5所述的利用dI碱基进行基因克隆的方法，其特征在于，步骤（2）中常温内切核酸酶V或常温DNA糖苷酶AlkA的处理温度为30-40度，热稳定性内切核酸酶V或热稳定性DNA糖苷酶AlkA的处理温度50-75度。
7.根据权利要求1所述的利用dI碱基进行基因克隆的方法，其特征在于，步骤（3）中所述彼此杂交配对过程是室温下放置1～15分钟。
8.根据权利要求1所述的利用dI碱基进行基因克隆的方法，其特征在于，所述利用dI碱基的基因克隆方法还包括对含目标基因的完整重组载体的鉴定：挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与Taq DNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组质粒载体的阳性克隆，培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组质粒载体。
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Address before: 215300 Room 705, Xugongqiao Road, Huaqiao Town, Kunshan City, Jiangsu Province

Applicant before: SUHOU BOLAIHENG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.