CN103114102B - 一种多基因载体组装方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多基因载体组装方法与应用，属于基因工程技术领域。该方法包括如下步骤（1）采用含有酶切位点的重叠引物对三个基因片段进行PCR扩增，通过1.33×连接buffer将三个片段连接成重组质粒；（2）重组质粒含有单一酶切位点，在每个插入基因对应的重叠引物内加上质粒单一酶切位点末端碱基，将重组质粒用相应的酶进行酶切，依次用1.33×连接buffer将重组质粒酶切片段和PCR扩增片段连接成新的重组质粒。（1）中引入的多个酶切位点，可以为后续的多基因酶切连接做基础；（2）不仅可以减少质粒单酶切后自连以及目的基因反向连接，而且只需要一个合适的酶切位点，就可以连接所有的目的基因片段。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种多基因载体组装方法与应用。
背景技术
基因工程技术的迅速发展和广泛应用为菌种的遗传改良开拓了广阔的前景。以前，大多数转化技术只是将单个基因构建在一个质粒上进行转化，然而，由于生物体内的代谢途径常常是多步反应，需要多个酶共同催化，即要求几个甚至是十多个相关基因的协同表达，因此将多个基因转化到同一菌种中进行表达意义重大。目前，部分研究者已经对单基因导入转向多基因导入，发展多基因转化系统，将多个基因串联在同一个表达质粒上导入宿主，遇到的最大困难是受酶切位点的限制，不能把多个基因同时构建在同一个表达质粒上。
多基因聚合主要包括杂交法、多个表达载体多次转化法、多个表达载体的共转化法、多基因单表达载体一次性转化法等，其中多基因单表达载体一次性转化法是目前研究的热点。这些方法都涉及到了载体构建，载体构建最常用的方法就是酶切连接的方法，但是这种方法受到限制性酶切位点的限制，无法满足多基因载体构建的需要，而且通常要构建多个中间载体，需要多次连接、转化，既费时又费力。
申请号为201210179998.7的专利申请“多基因植物表达载体及其构建方法和应用”公开多基因植物表达载体及其构建方法和应用，此方法用同尾酶连接后原有酶切位点消失的特性，使酶切后的载体或片段的两端始终是不同的粘段，解决了以往载体内切酶位点有限的问题，同时也避免了载体连接过程中的自连，无需再进行粘性末端的磷酸化处理，也无需中间载体及特殊的工程菌株，回避了大多数的限制性内切酶位点，只需进行酶切、连接、转化等常规步骤，但由于同尾酶数量有限，在一些多基因载体构建中不能应用。Daniel G Gibson在《NATURE METHODS》杂志第343-347页中发表了多个基因表达载体的构建方法：One-step thermocycled DNA assembly（一步等温法），该方法无需任何酶切位点就可以将3个以内的基因片段重组成环状质粒载体，但是该方法在构建多基因大型载体时中间每步都要全部测序，费用大，而且耗时。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种多基因载体组装方法。
本发明的另一目的在于提供上述方法在多基因载体构建中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种多基因载体组装方法，包括如下步骤：
（1）配制1.33×连接buffer。
（2）利用生物软件分析预重组的各基因片段（分别命名为A、B、C、D、E、F等基因），筛选出这些基因片段都不含有的酶切位点（分别命名为a、b、c、d、e、f等）且该位点对应的内切酶可以在市场中买得到。
（3）从预重组的各基因片段中随机筛选出A、B、C三个基因片段，针对该三个基因片段设计出含有a、b、c、d、e、f等酶切位点的重叠引物。
（4）用步骤（3）设计的重叠引物对A、B、C三个基因片段进行PCR扩增回收。
（5）在冰上取15μL步骤（1）的1.33×连接buffer和步骤（4）中等摩尔数的A、B、C三个基因片段共5μL混合均匀，在30～60℃下热处理2～10min进行连接反应。
（6）将步骤（5）的连接产物转化到感受态细胞，筛选含有A、B、C三个基因片段的重组质粒。该重组质粒含有a、b、c、d、e、f等单一酶切位点。
（7）设计D基因的重叠引物，引物上含有步骤（6）中重组质粒上a酶切位点的末端碱基。
（8）用步骤（7）中的重叠引物PCR扩增D基因片段，用a酶切位点对应的内切酶进行单酶切步骤（6）中的重组质粒，分别回收。
（9）取15μL步骤（1）的1.33×连接buffer和步骤（8）中等摩尔数的各基因片段共5μL混合均匀，进行连接反应。
（10）将步骤（9）的连接产物转化到感受态细胞，筛选重组质粒，该重组质粒仍保存着a酶切位点。
（11）设计E基因的重叠引物，引物上含有a酶切位点末端碱基。
（12）用步骤（11）中的重叠引物PCR扩增E基因片段，用a酶切位点对应的内切酶进行单酶切（10）中的重组质粒，分别回收。
（13）取15μL步骤（1）的1.33×连接buffer和步骤（12）中等摩尔数的各基因片段共5μL混合均匀，进行连接反应。
（14）将步骤（13）的连接产物转化到感受态细胞，筛选重组质粒，该重组质粒仍保存着a酶切位点。
（15）设计F基因的重叠引物，引物上含有a酶切位点末端碱基,后同上。
步骤（1）中所述的1.33×连接buffer的配制参考文献（Daniel G Gibson1,LeiYoung1,Ray-Yuan Chuang.etal.Enzymatic assembly of DNA molecules up to severalhundred kilobases.Nature Methods.2009,6,343-345），首先配制5×等温反应缓冲液：25%（质量体积比）PEG-8000，500mM Tris-HCl pH7.5，50mM MgCl2，50mM DTT，1mM ATP，1mM GTP，1mM CTP，1mM TTP，5mM NAD，ddH2O定容到6mL，-20℃保存；然后配制1.33×连接缓冲液：5×等温反应缓冲液320μL，T5DNA核酸外切酶64U，Phusion DNA聚合酶5U，Taq DNA连接酶640U，ddH2O定容到1.2mL。1.33×连接buffer连接各基因片段的原理图如图1所示。
步骤（3）中所述的A、B、C三个基因片段中的其中一个含有原核生物的复制起始位点。
步骤（3）中所述的重叠引物（如图2所示）包括与目的基因互补的基本引物、重叠区域，重叠区域中含有重叠碱基（与预连接的另一基因片段重叠部分）以及酶切位点；基本引物的长度优选为17～28b，重叠区域的长度优选为15～50b；如果重叠引物上含有多个酶切位点，重叠碱基长度为5～15b。重叠引物中加入的酶切位点的碱基在酶切后既可以是粘性末端也可以是平末端；同一条重叠引物上的酶切位点可以是1～5个。
步骤（5）中所述连接反应体系和程序参考文献（Daniel G Gibson1,Lei Young1,Ray-Yuan Chuang.etal.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundredkilobases.Nature Methods.2009,6,343-345），在冰上，等摩尔数的几个基因片段混合均匀定容到5μL（具体参考6kb载体用100ng，500b插入片段10ng，另外总用量提高数倍之内均可获得理想连接效果），然后加上15μL的1.33×连接buffer混匀。所述的连接反应优选为50℃热处理3～10min，最佳条件是50℃热处理5～6min。
步骤（7）、（11）、（15）中所述的重叠引物（如图3所示）包括与目的基因互补的基本引物、重叠区域（只含有重叠碱基）以及酶切位点末端碱基，基本引物的长度优选为17～28b，重叠区域的长度优选为35～50b。
步骤（7）、（11）、（15）中设计的重叠引物一般比较长，碱基在55～75b，难以基因组为模板进行PCR扩增，所以一般采用质粒DNA做为模板。个别情况质粒DNA也无法PCR扩增，可以把目的基因从质粒DNA中酶切回收出来做为模板，或者采用两步PCR法，即：再次设计一对中间引物（中间引物含有5～20b的重叠碱基），以质粒DNA为模板PCR扩增，回收后做为模板再以重叠引物PCR扩增，两者都可以取得不错的结果，也可以把两者结合在一起，先酶切回收，以其为模板，再用中间引物PCR扩增回收，最后用重叠引物扩增出目的基因。
步骤（7）中所述的a酶切位点可以用b、c、d、e或f等酶切位点替换，其后的步骤做相应的改变。
步骤（9）、（13）中所述的连接反应根据步骤（7）的重叠引物的酶切位点末端碱基的不同，采取不同处理连接。当酶切位点末端碱基为平末端上时，其处理同步骤（5）；当酶切位点末端碱基为粘性末端时，先将酶切后的重组质粒50℃处理2～5min，再与插入的基因片段混合均匀，30～60℃下热处理2～10min。两种处理方法酶切位点在重组质粒中都可以继续保存，为下一步构建提供酶切位点。
上述方法适用各种类型多基因载体构建，以紫杉醇代谢中间产物的相关多基因载体构建为例，采用香菇gpd-Les启动子，以潮霉素抗性基因为筛选标记，以紫杉醇代谢途径中的GGPPS基因（牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因）、TS基因（紫杉烯合酶基因）、TH5αOH基因（基因紫杉烯5α-羟基化酶基因）为目的基因进行多基因载体构建，包括如下步骤：
（1）配制1.33×连接buffer。
（2）利用生物信息软件分析各基因片段都不含有的的酶切位点，且该位点对应的内切酶可以在市场中买得到，从而选出AscⅠ、SnaBⅠ、SgrAⅠ、XmaⅠ、NheⅠ和BsiWⅠ酶切位点。
（3）设计分别扩增gles-TS（含有香菇gpd启动子的TS基因片段）、终止子pecterm、质粒pBgles-hph的重叠引物：
扩增gles-TS的重叠引物如SEQ NO.1和2所示；
扩增终止子pecterm的重叠引物如SEQ NO.3和4所示；
扩增质粒pBgles-hph的重叠引物如SEQ NO.5和6所示。
（4）分别以质粒pLes-TS、质粒pLes-TS、质粒pBgles-hph为模板，PCR扩增gles-TS、终止子pecterm、质粒pBgles-hph，并将PCR产物回收。
（5）取15μL1.33×连接buffer与5μL等摩尔数的步骤（4）的回收产物混合均匀，50℃处理5min30s进行连接反应。
（6）将步骤（5）的连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选含gles-TS、终止子pecterm、质粒pBgles-hph片段的重组质粒，命名为PBgle-hph-gLes-TS。
（7）设计扩增含香菇gpd启动子的GGPPS表达盒的重叠引物，其序列如SEQ NO.7和8所示。
（8）以质粒pLes-GGPPS为模板对含香菇gpd启动子的GGPPS表达盒进行PCR扩增并回收。
（9）用AscⅠ酶切质粒PBgle-hph-gLes-TS，并回收于50℃处理5min，将等摩尔数酶切回收后的PBgle-hph-gLes-TS片段和步骤（8）的回收产物混匀定容到5μL，然后与15μL1.33×连接buffer混合均匀，50℃处理5min30s进行连接反应。
（10）将步骤（9）的连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选鉴定正确的重组质粒，命名为pBgles-hph-g-GGPPS-g-TS。
（11）设计扩增TH5αOH表达盒的重叠引物，其序列如SEQ NO.9和10所示。
（12）以质粒pLes-TH5αOH为模板对TH5αOH表达盒进行PCR扩增并回收。
（13）用SnaBⅠ酶切质粒pBgles-hph-g-GGPPS-g-TS，并回收；在冰上将等摩尔数的pBgles-hph-g-GGPPS-g-TS酶切回收产物和步骤（12）的回收产物混匀定容到5μL，然后与15μL1.33×连接buffer混合均匀，50℃处理5min30s进行连接反应。
（14）将步骤（13）的连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选鉴定正确的重组质粒，得到含多个目的基因的载体，命名为pBgles-hph-g-GGPPS-g-TH5αOH-g-TS。
上述为多个表达盒基因的载体构建，将上述目的基因进行多基因载体构建（GGPPS基因、TS基因、TH5αOH基因共表达盒），还可以通过如下步骤：
（1）设计扩增GGPPS基因的重叠引物，其序列如SEQ NO.11和12所示。
（2）以质粒pLes-GGPPS为模板对GGPPS基因进行PCR扩增并回收。
（3）用SpeⅠ酶切质粒PBgle-hph-gLes-TS，并回收于50℃处理5min，将等摩尔数酶切回收后的PBgle-hph-gLes-TS片段和步骤（2）的回收产物混匀定容到5μL，然后与15μL1.33×连接buffer混合均匀，50℃处理5min30s进行连接反应。
（4）将步骤（3）的连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选鉴定正确的重组质粒，命名为pBgles-hph-g-GGPPS-TS。
（5）设计扩增TH5αOH基因的重叠引物，其序列如SEQ NO.13和14所示。
（6）对TH5αOH基因进行PCR扩增并回收。
（7）用NheⅠ酶切质粒pBgles-hph-g-GGPPS-TS，并回收于50℃处理5min，将等摩尔数酶切回收后的pBgles-hph-g-GGPPS-TS片段和步骤（6）的回收产物混匀定容到5μL，然后与15μL1.33×连接buffer混合均匀，50℃处理5min30s进行连接反应。
（8）将步骤（7）的连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选鉴定正确的重组质粒，得到含多个目的基因的载体，命名为PBgle-hph-g-GGPPS-TS-TH5αOH。
步骤（6）所述的PCR扩增优选为通过用NotⅠ酶把TH5αOH基因从质粒PGEM-T-TH5αOH切下来回收作为模板然后再用重叠引物SEQ NO.13和14进行PCR扩增；或通过先设计中间引物，其序列如SEQ NO.15和16所示，以PGEM-T-TH5αOH为模板，用中间引物扩增出TH5αOH基因1，再以其为模板用重叠引物SEQ NO.13和14进行PCR扩增。
上述多基因载体组装方法在多基因载体构建中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明推广了平末端酶切位点应用的范围。在传统的酶切连接构建载体中，平末端酶切位点因为连接效率低而不被人采用，浪费了载体中的许多平末端酶切位点，在本发明中，正是借鉴平末端酶切位点难以自连，从而与PCR扩增出来的含有重叠区域的基因片段拼接成重组质粒。
（2）本发明解决了质粒在单酶切后容易自连的难题。单酶切包含平末端位点单酶切和粘性末端位点单酶切，平末端位点单酶切上述已说明，粘性末端位点单酶切后常采用磷酸化处理且效果不太好。在本发明中，1.33×连接buffer含有T5DNA exonuclease，该酶具体5’外切酶活性，可以把粘性末端降解掉，从而减少自连，但是含有粘性末端的线状质粒在碱基互补配对作用力下可连成环状（接口处只是碱基作用，磷酸基团之间无作用），使5’外切酶无法发挥作用，所以在1.33×连接buffer加入之前先将粘性末端的质粒50℃处理3～5min，破坏碱基互补配对的作用力，变成线状质粒，进而降解掉粘性末端。
（3）本发明提供了一种商业化快速定向载体构建的方法。本发明中，在重叠引物中引入了多个单一酶切位点，其中一条引物中引入了4个酶切位点，重组后的质粒含有6个单一酶切位点，可以作为商业化定向通用型载体。
（4）本发明解决了以往载体内切酶位点有限的问题，只需要一个单一酶切位点，理论上在构建多基因大型载体时可以无限的插入目的基因片段。
（5）本发明节约成本和时间。在现有技术中，重叠延伸PCR构建载体中虽然可以节省部分酶切位点，但是它仍需要中间载体，而且重组后的质粒要全部测序；一步等温法构建载体不需要酶切位点和中间载体，但是重组后的质粒也要全部测序，尤其是在多基因大型载体构建时，后续每一次插入基因片段，构建好的重组质粒都要全部测序，成本和时间都太浪费，在本发明中多基因大型载体构建中无需中间载体，在后续插入基因片段后，只需要对该基因片段测序，节约了在测序上的成本和时间。
（6）本发明方法简单易行，步骤简单，可以解决载体构建中遇到的各种问题。
附图说明
图1是1.33×连接buffer连接各基因片段的原理图；1.33×连接buffer含有T5DNA exonuclease、Phusion DNA polymerase、Taq DNA ligase；T5DNAexonuclease具有5’外切酶活性，可以降解双链DNA的5’端，3’端重叠区域变成单链，在碱基作用力下互补配对；Phusion DNA polymerase可以把缺口处的碱基补齐；Taq DNA ligase可以把两片段连接在一起。在这些酶的共同作用下把各基因片段连接成环状质粒。
图2是含有酶切位点的重叠引物示意图；图中两条粗线代表目的基因，两条细线代表重叠引物，其中3’端序列是目的基因互补的基本引物，长度在17～28b之间，5’端与目的基因不互补的序列代表重叠区域（只含有重叠碱基），其重叠碱基在15～50b之间，其中上游引物重叠区域上的碱基与连接基因CDNA链末端一致，下游引物重叠区域上的碱基与连接基因CDNA链末端互补；黑色箭头位于重叠引物中重叠区域内（基本引物和重叠碱基之间），代表在构建重组质粒时加入的酶切位点，其数目可以是1～5个（如果一条引物上引入多个酶切位点，重叠碱基5～15b）。
图3是含有酶切位点末端碱基的重叠引物示意图；图中两条粗线代表目的基因，两条细线代表重叠引物，其中3’端序列是目的基因互补的基本引物，长度在17～28b之间；5’端与目的基因不互补的序列代表重叠区域（只含有重叠碱基）和酶切位点末端碱基，其中重叠区域在35～50b之间，上游引物基本引物和重叠碱基之间颜色较浅的部分代表酶切位点末端碱基（也可以放在下游重叠引物中）。
图4是pBgles-hph质粒图，该质粒含有香菇gpd-Les启动子，潮霉素抗性基因hph的表达盒。
图5是pLes-TS质粒图，该质粒含有香菇gpd-Les启动子，紫杉烯合酶TS基因的表达盒。
图6是pLes-GGPPS质粒图，该质粒含有以香菇gpd-Les为启动子，以香草基香草基焦磷酸合成酶GGPPS基因为目的基因的表达盒。
图7是pLes-TH5αOH质粒图，该质粒含有香菇gpd-les启动子的TH5αOH基因表达盒。
图8是含有潮霉素抗性筛选标记的TS基因的双表达盒载体构建技术路线图。
图9是重组质粒pBgles-hph-g-GGPPS-g-TS构建技术路线图；用AscⅠ酶切质粒pBgles-hph-g-TS，酶切位点（GG ↓ CGCGCC）粘性末端上的单链碱基（CGCGCC）被T5DNA exonuclease降解掉；用含有AscⅠ粘性末端碱基（CGCGCC）的重叠引物PCR扩增GGPPS表达盒片段，两片段连接成环后，GG+CGCGCC重新拼接成AscⅠ酶切位点；该质粒为含有以潮霉素抗性筛选标记，以香菇gpd-Les为启动子，GGPPS基因、TS基因为目的基因的三个独表达盒的载体。
图10是重组质粒pBgles-hph-g-GGPPS-g-T5aOH-g-TS构建技术路线图；用SnaB I酶切质粒pBgles-hph-g-GGPPS-g-TS，片段两端留下SnaBⅠ平末端，GGPPS表达盒基因末端的碱基为TAC，用含有SnaBⅠ平末端末端碱基（GTA）的重叠引物PCR扩增TH5αOH表达盒基因片段，两片段连接成环后，TAC+GTA重新拼接成SnaBⅠ酶切位点。
图11是重组质粒pBgles-hph-g-GGPPS-TS的构建技术路线图；该质粒是含有潮霉素筛选标记的GGPPS基因与TS基因共表达盒的双表达盒载体。
图12是两步PCR法示意图；首先减短重叠引物中的重叠区域为中间引物（重叠区域碱基5～20b），用中间引物PCR扩增质粒DNA，以其扩增产物为模板，再用重叠引物PCR扩增，最终得到目的产物。
图13是PBgle-hph-g-GGPPS-TS-TH5αOH质粒图，该质粒是含有潮霉素筛选标记的GGPPS基因、TS基因、TH5αOH基因的三基因共表达盒的双表达盒载体。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
一、实验材料
大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α：购买于大连宝生物工程有限公司。
质粒pBgles-hph（如图4所示）：含有香菇gpd启动子的潮霉素抗性基因表达盒，该质粒以pBlueScript II KS(+)质粒载体为框架，通过EcoRⅠ、SpeⅠ、BsrGⅠ三种酶进行酶切连接把将gpd-les启动子和HPH基因组装在一起，HPH基因来源于质粒pAN7-1（中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心），gpd-les从香菇里面克隆而得（于晓玲，林俊芳，郭丽琼，王树昌.等，香菇ras和gpd启动子的克隆与功能鉴定.食用菌学报，2005，12，15-20）。
质粒pLes-TS（如图5所示）：含有香菇gpd启动子的紫杉烯合酶基因表达盒，该质粒以质粒以pBlueScript II KS(+)质粒载体为框架，通过EcoRⅠ、SpeⅠ、NcoⅠ三种酶进行酶切连接把将gpd-les启动子和TS基因组装在一起，TS基因其从短叶红豆杉克隆而得，GenBank:U48796.1。
质粒PGEM-T-GGPPS：GGPPS基因GenBank:JQ029687.1，GGPPS基因来源于蔓地亚红豆杉，将GGPPS基因克隆并连接到pGEM-Teasy载体中得到。
质粒pLes-GGPPS（如图6所示）：含有香菇gpd启动子的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因表达盒，该质粒以质粒pLes-TS和pGEM-T-GGPPS为材料，通过spe I和BsrG I双酶切，将pGEM-T-GGPPS中的GGPPS基因取代pLes-TS中的TS基因构建成质粒pLes-GGPPS。
质粒PGEM-T-TH5αOH：TH5αOH基因GenBank:JQ029686.1，TH5αOH基因来源于蔓地亚红豆杉，将TH5αOH基因克隆并连接到pGEM-Teasy载体中；
质粒pLes-TH5αOH（如图7所示）：含有香菇gpd启动子的TH5αOH基因表达盒，该质粒以质粒pLes-TS和pGEM-T-TH5αOH为材料，通过spe I和BsrG I双酶切，将pGEM-T-TH5αOH中的TH5αOH基因取代pLes-TS中的TS基因构建成质粒pLes-TH5αOH。
二、本发明实施例中使用到的试剂，但并不因此限定本发明范围，也可以采用本技术领域的同类试剂。
主要试剂：氯化钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；氯化镁（天津市科密欧化学试剂有限公司）；PEG-8000（广州卫佳科技有限公司）；Tris（广州健阳生物科技有限公司）；DTT（Sigama公司）；NAD（Sigama公司）；T5DNAexonuclease（Epicentre公司）；Phusion DNA polymerase（NEB公司）；Taq DNAligase（NEB公司）；dGTP、dATP、dTTP、dCTP（大连宝生物工程有限公司）；PrimeSTAR HS DNA Polymerase（大连宝生物工程有限公司）；胶回收和质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司）；
配制方法：
LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，ddH2O定容到1L。
5×等温反应缓冲液：25%PEG-8000，500mM Tris-HCl pH7.5，50mMMgCl2，50mM DTT，1mMATP，1mM GTP，1mM CTP，1mM TTP，5mM NAD，ddH2O定容到6mL。
1.33×连接buffer：5×等温反应缓冲液320μL，T5DNA exonuclease64U，Phusion DNA polymerase5U，Taq DNA ligase640U，ddH2O定容到1.2mL。
实施例1
要构建一个含有潮霉素抗性筛选标记的TS基因（紫杉烯合酶基因）的双表达盒载体，已有的材料质粒pBgles-hph和质粒pLes-TS中的酶切位点都不能应用，无法酶切连接。其技术路线如图8所示。
设计三对重叠引物，分别对gles-TS（3kb），终止子pecterm（290b）以及质粒pBgles-hph（5kb）扩增，三对引物依次为：
gles-TSF：5’-GACTGGTACC ATTCAAGCAGTCAATGGATTGGAGTG-3’；
gles-TSR：5’-ATATGAATTTACT GAATTCCCATGGTCATAC-3’；
划线部分代表重叠碱基，重叠碱基分别是10b和13b，框内部分GGCGCGCC和TACGTA分别代表AscⅠ和SnaBⅠ酶切位点，CACCGGTG、CCCGGG、GCTAGC和CGTACG分别代表SgrAⅠ、XmaⅠ、NheⅠ和BsiWⅠ酶切位点，剩余部分是gles-TS基因片段的基本引物。
pectermF：5’-AATTC AGTAAATTCATATTCCACGCGG-3’；
pectermR：5’-TGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCAACAGCTATGACCATGATTACGC-3’；
划线部分代表重叠碱基，重叠碱基分别是5b和36b，框内部分CGTACG、GCTAGC、CCCGGG和CACCGGTG分别代表BsiWⅠ、NheⅠ、XmaⅠ和SgrAⅠ酶切位点，剩余部分是pecterm基因片段的基本引物。
pBgles-hphF：5’-GCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTGGATAACGCAGGAAAGAACA-3’；
pBgles-hphR：5’-CCATTGACTGCTTGAAT GGTACCAGTCCACAATGACAG-3’；
划线部分代表重叠碱基，重叠碱基分别是28b和17b，框内部分TACGTA和GGCGCGCC分别代表SnaBⅠ和AscⅠ酶切位点酶切位点，剩余部分是pBgles-hph基因片段的基本引物。
其中质粒pBgles-hph的下游重叠引物pBgles-hphR和gles-TS的上游引物gles-TSF含有Asc I、SnaBⅠ两个酶切位点，gles-TS的下游重叠引物gles-TSR和pecterm的上游重叠引物pectermF含有BsiWⅠ、NheⅠ、XmaⅠ、SgrAⅠ四个酶切位点，相连两片段片段的重叠碱基总数在40～59b之间。PCR扩增模板及条件见表1：
表1：PCR扩增条件
用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR扩增的上述3个基因片段分别回收，测定浓度，取基因片段gles-TS100ng、pBgles-hph200ng、pecterm10ng用ddH2O定容到5μL，混合均匀后放在冰上。
在冰上取15μL1.33×连接buffer加入上述的5μL混合液中，混合均匀后放入PCR仪中50℃处理5min30s，放入冰中。
取上述的5～9μL反应液进行DH5α感受态细胞的转化，挑单菌落鉴定、测序（重组后的质粒通用引物M13F和M13R以内的序列都要测序）。将鉴定正确的重组质粒命名为PBgle-hph-gLes-TS，该质粒含有6个单一酶切位点（AscⅠ、SnaBⅠ、BsiWⅠ、NheⅠ、XmaⅠ和SgrAⅠ），其中SnaBⅠ是平末端酶切位点。
实施例2
在实施例1得到的质粒PBgle-hph-gLes-TS上插入一个含有香菇gpd启动子的GGPPS表达盒（2.2kb）的基因片段构建重组质粒pBgles-hph-g-GGPPS-g-TS，已有材料质粒pLes-GGPPS，通过分析得知预插入位点只有AscⅠ、SnaBⅠ两个酶切位点，其中SnaBⅠ是平末端酶切位点，无法运用酶切连接重组质粒。重组质粒pBgles-hph-g-GGPPS-g-TS构建技术路线如图9所示。
设计扩增香菇gpd启动子的GGPPS表达盒的重叠引物：
GGPP SF：5’-GCGAAACAACTGTGAGAGCTGTCATTGTGGACTGGTACC GGGCGTAATACGACTCACTATAGGG-3’；
GGPPSR：5’-TTCTAAATACACTCCAATCCATTGACTGCTTGAATTACGTA GG TGTGGAATTGTGAGCGGATA-3’；
划线部分代表重叠碱基，重叠碱基分别是41b和43b，框内部分CGCGCC代表AscⅠ粘性末端的碱基，剩余部分是GGPPS表达盒基因的基本引物。以质粒pLes-GGPPS为模板对GGPPS表达盒进行PCR扩增（预变性94℃5min，变性94℃30S，退火和延伸72℃2min30S，33个循环，72℃再延伸10min），用AscⅠ酶切质粒PBgle-hph-gLes-TS，分别回收测定浓度。
①取基因片段GGPPS88ng、PBgle-hph-gLes-TS基因280ng加ddH2O定容5μL混匀放在冰上，在冰上取15μL1.33×连接buffer加入上述的5μL混合液中，混合均匀放入PCR仪中50℃处理5min30s，放入冰中；
②取基因片段PBgle-hph-gLes-TS280ng金属浴50℃处理5min，然后在常温下加入GGPPS表达盒基因88ng以及ddH2O定容到5μL混合均匀，快速从冰上吸取15μL1.33×连接buffer加入上述的5μL混合液中混匀，快速放入PCR仪中50℃处理5min30s，放入冰中。
取上述的5～9μL反应液进行DH5α感受态细胞的转化，挑单菌落鉴定，GGPPS基因片段在经过50℃加热处理后自连现象显著降低，未经加热处理单菌落中有60%自连，而经过加热处理后单菌落中只有10%自连，重组后的质粒只需测定GGPPS基因上下游100b之间的序列即可。
构建得到的重组质粒pBgles-hph-g-GGPPS-g-TS中AscⅠ、SnaBⅠ两个酶切位点保留在GGPPS表达盒和TS表达盒基因之间。
实施例3
在实施例2得到的质粒pBgles-hph-g-GGPPS-g-TS内继续插入含有香菇gpd启动子的TH5αOH表达盒基因构建重组质粒pBgles-hph-g-GGPPS-g-TH5αOH-g-TS，已有材料质粒pLes-TH5αOH，通过分析可知质粒pBgles-hph-g-GGPPS-g-TS可用的酶切位点有Asc I、SnaB I。重组质粒pBgles-hph-g-GGPPS-g-T5aOH-g-TS的构建技术路线如图10所示。
设计扩增TH5αOH表达盒的重叠引物：
TH5αOHBF：5’-CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACCTA C GCGTAATACGACTCACTATAGGG-3’；
TH5αOHBR：5’-CCTTCGATTCTAAATACACTCCAATCCATTGACTGCTTG AATTACAGCTATGACCATGATTACGCC-3’；
划线部分代表重叠碱基，重叠碱基分别是40b和45b，框内部分GTA代表SnaBⅠ粘性末端的碱基，剩余部分是TH5αOH表达盒基因的基本引物。以质粒pLes-TH5αOH为模板对TH5αOH表达盒（2.5kb）进行PCR扩增（预变性94℃5min，变性94℃30S，退火和延伸72℃2min45S，33个循环，72℃再延伸10min），用SnaBⅠ酶切质粒pBgles-hph-g-GGPPS-g-TS，分别回收测定浓度。
取基因片段TH5αOH50ng、pBgles-hph-g-GGPPS-g-TS206ng加ddH2O定容5μL混匀放在冰上，在冰上取15μL1.33×连接buffer加入上述的5μL混合液中，混合均匀后放入PCR仪中50℃处理5min30s，放入冰中。
取上述的5～9μL反应液进行DH5α感受态细胞的转化，挑单菌落鉴定，重组后的质粒只需测定TH5αOH表达盒基因上下游100b之间的序列即可。
构建得到的重组质粒pBgles-hph-g-GGPPS-g-TH5αOH-g-TS中SnaBⅠ继续保留在质粒中，按照上述方法可以继续插入基因片段。
实施例4
在实施例1得到的质粒PBgle-hph-gLes-TS上插入一个GGPPS基因片段构建重组质粒pBgles-hph-g-GGPPS-TS，已有材料质粒PGEM-T-GGPPS，通过分析可知质粒PBgle-hph-gLes-TS可知在插入位点TS基因前面可用的酶切位点有Spe I、Msc I。重组质粒pBgles-hph-g-GGPPS-TS的构建技术路线如图11所示。
设计扩增GGPPS基因的重叠引物：
GGPPSJF：5’-GGCCCGCTCAGATAACCAGCATATGGCCATAGTTA CATGGCTTACACGGC-3’；
GGPP SJR：5’-TTCATCTTCAGCGCTGCATTAAATGAGAGCTGAGCCATG AGTACATCAGTTTTGCCTGAATG-3’；
划线部分代表重叠碱基，重叠碱基分别是35b和40b，剩余部分是GGPPS表达盒基因的基本引物，基本引物中框内部分CTAGT与重叠碱基中的A恰巧组合成speⅠ酶切位点。以质粒pLes-GGPPS为模板对GGPPS基因（1.38kb）进行PCR扩增（预变性94℃5min，变性94℃30S，退火和延伸72℃1min45S，33个循环，72℃再延伸10min），用SpeⅠ酶切质粒PBgle-hph-gLes-TS，分别回收测定浓度。
取基因片段PBgle-hph-gLes-TS120ng金属浴50℃处理5min，然后在常温下加入GGPPS基因56ng以及ddH2O定容到5μL混合均匀，快速从冰上吸取15μL1.33×连接buffer加入上述的5μL混合液中混匀，快速放入PCR仪中50℃处理5min30s，放入冰中。
取上述的5～9μL反应液进行DH5α感受态细胞的转化，挑单菌落鉴定，重组后的质粒只需测定GGPPS基因上下游100b之间的序列即可。
构建得到的重组质粒pBgles-hph-g-GGPPS-TS中SnaBⅠ继续保留在质粒中，按照上述方面可以继续插入基因片段。
实施例5
在实施例4得到的质粒PBgle-hph-g-GGPPS-TS内插入TH5αOH单独基因构建重组质粒PBgle-hph-g-GGPPS-TS-TH5αOH，已有材料质粒PBgle-hph-g-GGPPS-TS和PGEM-T-TH5αOH，通过分析可知在插入位点可用的酶切位点有BsiWⅠ、NheⅠ、XmaⅠ、SgrAⅠ四个酶切位点。
设计扩增TH5αOH单独基因的重叠引物：
TH5αOHF：5’-ATTGATCCAATTCAAGTATGACCATGGGAATTCCGTACGG TATGGACGCCCTGTATAAGA-3’；
TH5αOHR：5’-AAACCGCGTGGAATATGAATTTACTCACCGGTGCCCGGG GTAAGAAACCGCGTCCAATAT-3’；
划线部分代表重叠碱基，重叠碱基都是40b，框内部分CTAGC代表NheⅠ
粘性末端的碱基，剩余部分是T5aOH基因的基本引物，以质粒PGEM-T-TH5αOH为模板对TH5αOH基因进行PCR扩增（预变性94℃5min，变性94℃30S，退火64～72℃15S，延伸72℃1min35S，33个循环，72℃再延伸10min），从引物上可以看出重叠区是基本引物的两倍长，在用重叠引物PCR扩增TH5αOH基因时出现非特性扩增且看不到目的带。这个时候可以采取以下几种方案解决：
a酶切质粒得到TH5αOH基因片段
质粒PGEM-T-TH5αOH中TH5αOH基因上下游各有一个NotⅠ酶切位点，用NotⅠ酶把TH5αOH基因从质粒上切下来回收作为模板，然后再用重叠引物PCR扩增（预变性94℃5min，变性94℃30S，退火70℃15S，延伸72℃1min35S，33个循环，72℃再延伸10min）。
b采用两步PCR法（两步PCR原理图如图12所示）
先设计一对中间引物：
TH5αOHF1：5’-AATTCCGTACGG TATGGACGCCCTGTATAAGA-3’；
TH5αOHR1：5’-ACTCACCGGTGCCCGGGGTAAGAAACCGCG T CCAATAT-3’；
划线部分代表重叠碱基，框内部分CTAGC代表NheⅠ粘性末端的碱基，剩余部分是TH5αOH基因的基本引物。以质粒PGEM-T-TH5αOH为模板，用中间引物扩增出TH5αOH基因1（预变性94℃5min，变性94℃30S，退火63℃15S，延伸72℃1min35S，33个循环，72℃再延伸10min），以其为模板，再用重叠引物TH5αOHF和TH5αOHR进行PCR扩增（预变性94℃5min，变性94℃30S，退火70℃15S，延伸72℃1min35S，33个循环，72℃再延伸10min）。
c把a与b结合一起
将上述重叠引物扩增后的片段和用NheⅠ酶切质粒PBgle-hph-g-GGPPS-TS后的片段分别回收测定浓度，取基因片段PBgle-hph-g-GGPPS-TS240ng金属浴50℃处理5min，然后在常温下加入TH5αOH基因片段45ng、加ddH2O定容5μL，迅速取15μL1.33×连接buffer加入上述的5μL混合液中，混合均匀放入PCR仪中50℃处理5min30s，放入冰中，取上述的5～9μL反应液进行DH5α感受态细胞的转化，挑单菌落鉴定。
构建得到的重组质粒PBgle-hph-g-GGPPS-TS-TH5αOH如图13所示，NheⅠ酶切位点保留在质粒中，可以为后续插入基因提供酶切位点。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种多基因载体组装方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)配制1.33×连接buffer；
(2)利用生物软件分析预重组的各基因片段，分别命名为A、B、C、D、E、F等基因，筛选出这些基因片段都不含有的酶切位点，分别命名为a、b、c、d、e、f等酶切位点；
(3)从预重组的各基因片段中随机筛选出A、B、C三个基因片段，针对该三个基因片段设计出含有a、b、c、d、e、f等酶切位点的重叠引物；
(4)用步骤(3)设计的重叠引物对A、B、C三个基因片段进行PCR扩增回收；
(5)在冰上取15μL步骤(1)的1.33×连接buffer和步骤(4)中等摩尔数的A、B、C三个基因片段共5μL混合均匀，在30～60℃下热处理2～10min进行连接反应；
(6)将步骤(5)的连接产物转化到感受态细胞，筛选含有A、B、C三个基因片段的重组质粒；
(7)设计D基因的重叠引物，引物上含有步骤(6)中重组质粒上a酶切位点的末端碱基；
(8)用步骤(7)中的重叠引物PCR扩增D基因片段，用a酶切位点对应的内切酶进行单酶切步骤(6)中筛选后正确的重组质粒，分别回收；
(9)取15μL步骤(1)的1.33×连接buffer和步骤(8)中等摩尔数的各基因片段共5μL混合均匀，进行连接反应；
(10)将步骤(9)的连接产物转化到感受态细胞，筛选重组质粒，该重组质粒仍保存着a酶切位点；
(11)设计E基因的重叠引物，引物上含有a酶切位点末端碱基；
(12)用步骤(11)中的重叠引物PCR扩增E基因片段，用a酶切位点对应的内切酶进行单酶切(10)中筛选后正确的重组质粒，分别回收；
(13)取15μL步骤(1)的1.33×连接buffer和步骤(12)中等摩尔数的各基因片段共5μL混合均匀，进行连接反应；
(14)将步骤(13)的连接产物转化到感受态细胞，筛选重组质粒，该重组质粒仍保存着a酶切位点；
(15)设计F基因的重叠引物，引物上含有a酶切位点末端碱基,后同上；
步骤(8)和(12)中所述重组质粒酶切回收后如果产生粘性末端，则需进一步50℃处理3～5min以降解掉粘性末端；
所述的1.33×连接缓冲液的组成如下：5×等温反应缓冲液320μL，T5DNA核酸外切酶64U，Phusion DNA聚合酶5U，Taq DNA连接酶640U，ddH2O定容到1.2mL；
所述的5×等温反应缓冲液的组成如下：25％(质量体积比)PEG-8000，500mM Tris-HCl pH7.5，50mM MgCl2，50mM DTT，1mM ATP，1mM GTP，1mMCTP，1mM TTP，5mM NAD，ddH2O定容到6mL；
步骤(3)中所述的A、B、C三个基因片段中的其中一个含有原核生物的复制起始位点；
步骤(3)中所述的重叠引物包括与目的基因互补的基本引物、重叠区域，重叠区域中含有重叠碱基以及酶切位点；基本引物的长度为17～28b，重叠区域的长度为15～50b；同一条重叠引物上的酶切位点为1～5个；
步骤(7)、(11)、(15)中所述的重叠引物包括与目的基因互补的基本引物、重叠区域以及酶切位点末端碱基，基本引物的长度为17～28b，重叠区域的长度为35～50b；
步骤(7)中所述的a酶切位点可以用b、c、d、e、f等酶切位点替换，其后的步骤做相应的改变。
2.根据权利要求1所述的多基因载体组装方法，其特征在于：
若使用步骤(7)、(11)、(15)中所述的重叠引物PCR扩增失败，采用如下方法进行PCR扩增：将目的基因从质粒上酶切并回收出来，然后再进行PCR扩增；或者采用两步PCR法：先设计一对中间引物，以质粒为模板PCR扩增目的基因并回收，再以其为模板用重叠引物再次PCR扩增；或者先将目的基因从质粒上酶切回收出来，以其为模板采用两步PCR法扩增。
3.根据权利要求1所述的多基因载体组装方法，其特征在于：
步骤(9)、(13)中所述的连接反应根据步骤(7)的重叠引物的酶切位点末端碱基的不同，采取不同处理连接；当酶切位点末端碱基为平末端上时，其处理同步骤(5)；当酶切位点末端碱基为粘性末端时，先将酶切后的重组质粒50℃处理2～5min，再与插入的基因片段混合均匀，30～60℃下热处理2～10min。
4.权利要求1～3任一项所述的多基因载体组装方法在多基因载体构建中的应用。
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