CN101517077A

CN101517077A - 多基因表达运载体

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Publication number: CN101517077A
Application number: CNA2007800251239A
Authority: CN
Inventors: M·A·安德森; R·L·希斯
Original assignee: HIRSCHMAN CO Ltd
Current assignee: HIRSCHMAN CO Ltd; Hexima Ltd
Priority date: 2006-05-25
Filing date: 2007-05-24
Publication date: 2009-08-26
Anticipated expiration: 2027-05-24
Also published as: WO2007137329A3; EP2027264B1; CA2653404A1; ZA200809722B; JP2009537155A; NZ572795A; EP2027264A2; AU2007266307C1; SG171689A1; US20070277263A1; WO2007137329A2; BRPI0712168A2; AU2007266307A1; WO2007137329A9; CN101517077B; AU2007266307B2; AR063166A1; EP2027264A4; CA2653404C; US20140259231A1

Abstract

多基因表达运载体(multigene expression vehicle，MGEV)基本上由包含2－8个结构域区段D的多核苷酸组成，每个结构域编码功能蛋白质，每个结构域通过编码连接体肽的连接体(L)区段与线性序列中的下一个结构域连接，所述D和L区段都在同一个读码框中，并且所述结构域中的至少一个不是2型蛋白酶抑制剂。

Description

多基因表达运载体

发明背景

马铃薯2型抑制剂是在许多茄科植物中发现的丝氨酸蛋白酶抑制剂的家族。所述抑制剂如此命名是因为所描述的第一个成员是从马铃薯和番茄植物中分离得到的[Bryant，J.等人(1976)Biochemistry 15：3418-3424；Plunkett，G.等人(1982)Arch.Biochem.Biophys.213：463-472]。所述抑制剂通常由2个重复的结构域组成，每个结构域大约6kDa并且具有关于胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶的反应位点。这些二结构域抑制剂由被称为Pin2基因家族的基因编码，所述基因在机械创伤或昆虫伤害后在番茄果实和马铃薯块茎中以及在这2种植物的叶中表达[Graham，JS等人(1985)J.Biol.Chem.260：6561-6564；Keil，M.等人(1986)Nuc.Acids Res.14：5641-5650；Thornberg，RW等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：744-748]。已从马铃薯和番茄中克隆了这个基因家族的几个成员，并且大多数具有与所描述的原始成员相同的二结构域结构[Sanchez-Serrano，J.等人(1986)Mol.Gen.Genet.203：15-20；Thornberg，同上]。

马铃薯2型抑制剂在本文中简称为“2型”抑制剂。2型抑制剂是由称为Pin2的基因家族编码的结构上相关的蛋白质。已在单子叶和双子叶植物中发现了至少11种同源Pin2基因。Pin2基因可以编码单个6kDa蛋白酶抑制剂(PI)结构域，两个6kDa PI结构域(如在马铃薯和番茄中常见的那些)，或者抑制胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶并且通常环状排列的几个高度同源的重复的6kDa结构域。关于序列以及结构关系讨论的一览表，参见Barta等人，(2002)Trends in Genetics 18：600-603。序列已汇集到可在http://www.ba.itb.cnr.it/Plant-PIs处获得的数据库中(还可参见DeLeo，F.等人，(2002)Nucl.Acid Res.30：347-348)。

除了该二结构域12kDa抑制剂外，马铃薯还包含较低水平的一系列大约6kDa的单结构域抑制剂[Hass，GM等人(1982)Biochemistry 21：752-756]，其在序列方面与所述二结构域蛋白质的中心部分相同，并且可能是蛋白水解产物[Sanchez-Serrano，同上]。已从茄子[Richardson，M.(1979)FEBS.Lett.104：322-326]和烟草[Pearce，G.等人(1993)Plant Physiol.102：639-644]中分离出类似的单结构域蛋白酶抑制剂(PI′s)，尽管不知它们是否衍生自较大的前体分子。番茄和烟草都包含编码三结构域抑制剂的基因[Taylor，BH等人(1993)Plant Mol.Biol.23：1005-1014；Baladin，R.等人(1995)Plant Mol.Biol.27：1197-1204]，并且已从观赏性烟草——花烟草(Nicotiana alata)的生殖组织中分离出编码六结构域抑制剂(NaPI-ii)的基因[Atkinson，AH等人(1993)Plant Cell 5：203-213]。

NaPI-ii(SEQ ID NO：1)编码40.3kDa前体蛋白，其包含6个抑制结构域，其中2个对于胰凝乳蛋白酶具有反应性，和4个对于胰蛋白酶具有反应性[Atkinson，同上]。该前体蛋白的蛋白水解加工在结构域之间的连接体区域中发生，导致释放出6个成熟的、有活性的抑制剂[Heath，RL等人(1995)Eur.J.Biochem.230：250-257；Lee，MCS等人(1999)Nature Struct.Biol.6：526-530]。除了蛋白酶抑制结构域外，该前体还具有推定的N-末端ER信号肽和可能充当液泡分选信号的C-末端非重复结构域[Miller，EA等人(1999)Plant Cell 11：1499-1508；Nielsen，KJ等人(1996)Biochemistry 35：369-378]。先前已显示，未成熟的柱头表达与NaPI-ii cDNA杂交的两种mRNAs[Atkinson，同上]。1.4kb的一种信使相应于六结构域抑制剂，而约1.0kb的第二种信使编码较小的同种型。

已从花烟草柱头中分离出具有4个重复的蛋白酶抑制剂结构域的第二种2型PI蛋白酶前体，标示为NaPI-iv[Miller，EA等人(2000)Plant Mol.Biol.42：329-333](SEQ ID NO：2)。NaPI-ii和NaPI-iv的氨基酸序列比对揭示出这两种蛋白质之间的高水平的同一性(参见图1)。在预测的信号肽内存在单个氨基酸变化。第二个保守氨基酸变化存在于第二个重复内，所述第二个重复在NaPI-ii中被标示为T1(SEQID NO：3)。因此，所述第二个重复NaPI-iv中被标示为T5(SEQ ID NO：4)。NaPI-ii和NaPI-iv的功能结构域之间的关系在图2中进行了图解说明。对于NaPI-iv，发现了在氨基酸序列方面与NaPI-ii的那种相同的C-末端非重复结构域(CTPP)(SEQ ID NO：1，氨基酸374-397，SEQID NO：2，氨基酸268-281)。

编码NaPI-ii的cDNA的核苷酸序列已公开于PCT公开号WO94/138810中(其的SEQ ID NO：1)，整个出版物通过提及而合并入本文，至与本文不相矛盾的程度。NaPI-iv cDNA序列SEQ ID NO：2(GenBank登记号AF105340)基本上是NaPI-ii的cDNA序列，除了导致图1中所显示的两个保守氨基酸变化的两个改变以及对于所翻译出的氨基酸序列无影响的几个沉默变化之外。

NaPI-ii和NaPI-iv的表达导致这样的蛋白质，其进行翻译后加工，从而产生具有指定的胰蛋白酶(T)或胰凝乳蛋白酶(C)抑制活性的独个成熟的6kDa蛋白酶抑制剂(PI)蛋白质。在植物细胞中表达后未观察到翻译后的糖基化。未加工的前体PI′s保留了CTPP，并且位于细胞的液泡外。一旦前体蛋白沉积在液泡中，C-末端结构域就被快速去除，并且发生产生独个6kDa PI′s的加工[Miller(1999)同上]。

NaPI-ii前体PI已显示通过在C2_N结构域(SEQ ID NO：1或2，氨基酸31-53)和C2_C结构域(SEQ ID NO：1，氨基酸344-373，SEQ ID NO：2，氨基酸228-2587)中的cys残基之间二硫键的形成而采用环状结构[Lee(1999)同上]。经过前体环化以及随后的翻译后蛋白水解而得到的产物是具有胰凝乳蛋白酶抑制剂活性(C2)的独特异二聚PI。

如同2型家族的其他成员一样，花烟草PI′s抑制几个昆虫物种的消化蛋白酶[Heath，RL等人(1997)J.Insect Physiol.43：833-842]，并且可能用于限制昆虫害虫对花组织和叶的伤害。当掺入人工饮食中或在转基因烟草的叶中表达时，PI′s显著延迟细点突夜蛾(Helicoverpa punctigera)幼虫的生长和发育[Heath(1997)同上]。

已采用各种策略来在单个转基因植物中表达超过一种转基因。一种技术为各自用单一转基因转化独个亲本植株，然后通过使所述亲本杂交来将所述转基因合并在单个植物中[Zhu，Q.等人(1994)Bio/Technology 12：807-812；Bizily，SP等人(2000)Nat.Biotechnol.18：213-217]。当独个转基因重组在不同基因座处时，育种可能是复杂的。该方法不适用于营养体繁殖的植物。

已进行了顺次的单基因转化，但由于用于每个转化步骤的选择标记的有限的可得性而具有有限的实际价值。

各自分别受其自身拷贝的相同启动子的控制的、连接在同一个载体上的多个转基因的使用已导致预料之外的转录沉默[Matzke，AJM等人(1998)Curr.Opin.Plant Biol.1：142-148]或不均一的表达[Vander Elzen，PJM等人(1993)Phil.Trans.R.Soc.Land.B 342：271-278]。使用驱动多个连接的转基因的不同的独个启动子看起来是可行的，但据推测表达受制于每个启动子的个体特征。

几个研究者已报道了采用病毒系统来表达多蛋白，随后进行顺式特异性蛋白酶切割以释放独个蛋白质(参见，例如Marcos，JF等人(1994)Plant Mol.Biol.24：495-503；Beck von Bodman，S.等人(1995)Bio/technology 13：587-591)。所述系统需要引入病毒蛋白酶来切割多蛋白，这可能导致出现所引入的蛋白酶的不希望的副作用。

Urwin，PE等人(1998)Planta 204：472-479描述了在拟南芥中表达的通过来自豌豆(Pisum sativum)的蛋白酶敏感性前肽进行连接的双重蛋白酶抑制剂构建体。仅报道了所表达的多蛋白的部分切割。通过使用来自口蹄疫病毒的长20氨基酸的连接序列(称为2A)，Halpin，C.等人(1999)Plant J.17：453-459描述了构建多蛋白，所述多蛋白具有在单个开放读码框中通过2A进行连接的两个报道编码区。据报道，2A连接体介导在其自身羧基末端处通过酶不依赖性反应进行的共翻译切割。尽管的确发生了多蛋白的表达和切割，但所得到的蛋白质产物之一保留了2A连接体的19个氨基酸，和第20个氨基酸附着至另一个蛋白质。

Francois，IEJA等人(2002)Plant Physiol.28：1346-1358描述了类似结果，他们通过使用来自凤仙花(Impatiens balsamina)的种子的具有16个氨基酸的前肽来连接两种蛋白质的编码区，所述两种蛋白质为来自光滑大丽花(Dahlia mercki)的种子的植物防卫素DmAMPI和来自萝卜(Raphanus sativus)的防卫素RsAFP2。凤仙花的所述前肽得自由Tailor，RA等人(1997)J.Biol.Chem.272：24480-24487所描述的多蛋白前体IbAMP。所描述的DmAMPI和RsAFP2的多蛋白构建体在拟南芥中进行表达并在翻译后进行切割；然而，发现连接性前肽的一部分附着所连接的蛋白质的C-和N-末端，与它们在多蛋白构建体中相对于连接体的方向无关。

通过使用长度为29个氨基酸的复合连接体，Francois，I.F.I.A.等人(2004)Plant Science 166：113-121报道了DmAMP1和RsAFP2在拟南芥中作为多蛋白前体的表达。所述前体进行加工，以产生主要在细胞内提取物中的DmAMP1交叉反应性蛋白质和主要在细胞外流体中的RsAFP2交叉反应性蛋白质。连接体序列是凤仙花连接体的一部分和口蹄疫病2A连接体序列的一部分的复合物。Chen，Q.-J.等人(2006)PlantMol.Biol.62：927-936已描述了用于将多个基因引入植物细胞中的基于重组的系统。每个基因具有其自身的启动子和终止子。

发明概述

本文描述了用于在单个启动子的控制下，在植物细胞、组织或全植物中同时表达多个基因的多基因表达运载体(multi-geneexpression vehicle，MGEV)。MGEV可以被构建为表达线性多蛋白，所述线性多蛋白缺乏对于导致C-末端和N-末端连接在一起而言所必需的特征。所述MGEV包括单个分离的多核苷酸，其序列包括通过由每个区段所编码的功能来描述的下述区段：2-8个开放读码框(D_2-8)，其中每一个编码功能蛋白质；和多个连接体区段(L_1-7)，每一个位于两个D区段之间。优选地，所述MGEV另外还包括编码内质网信号序列(S)的5′-末端区段和编码C-末端液泡靶向肽(V)的3′-末端区段。线性MGEV的翻译产生线性多蛋白，其通过在连接体(L)区段处的切割来进一步进行加工，以使所述蛋白质结构域彼此分开。任选地，以其环状形式，所述MGEV另外还包括编码在S的C-末端侧上的第一个“抱握(Clasp)”肽(C2_N)和在V的N-末端侧上的第二个“抱握”肽(C2_C)的区段。优选地，C2_N和C2_C蛋白具有允许它们相互作用以形成异二聚体的二级和三级结构，所述异二聚体可以通过二硫键的翻译后形成而共价连接在一起，从而形成“环状”多蛋白(具有环状拓扑学)。在一个实施方案中，交联的C2_N-C2_C二聚体具有作为胰凝乳蛋白酶抑制剂(C2)的活性。环状MGEV可以具有3-8个读码框(D_3-8)，其中在每个结构域和每个“抱握”肽之间具有连接体(L_4-8)。最终，该环状多蛋白也在每个L区段处进行切割。以线性和环状形式，在L位点处进行切割前，信号肽(S)和液泡靶向肽(V)用于控制整个多蛋白的细胞内转运。

附图简述

图1显示了NaPI-ii(SEQ ID NO：1)和NaPI-iv(SEQ ID NO：2)的氨基酸比对。

图2是图示，其显示了NaPI-ii和NaPI-iv的表达如何导致形成前体蛋白，所述前体蛋白进行翻译后加工从而产生独个成熟的6kDa蛋白酶抑制剂蛋白质(箭头所示)。所述蛋白质具有胰蛋白酶(T)或胰凝乳蛋白酶(C)抑制活性。显示了T1(SEQ ID NO：3)和T5(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列。SP，信号肽；CTPP，C-末端前肽；N-ter(C2_N)；和C-ter(C2_C)是抱握肽，其经由二硫键而相互作用从而形成6kDa的两链蛋白酶抑制剂(C2)。

图3是在实施例1中使用的pHEX29的质粒图谱。

下述缩写在本文的所有质粒图谱中使用(图3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33)：

oriV-复制起点

ColE1 ori-来自大肠菌素E1的DNA复制起点

TDNA RB-来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的TDNA的右手边界

Nos启动子-来自根瘤土壤杆菌的TDNA的胭脂碱合酶启动子

NPTII-新霉素磷酸转移酶编码区段

Nos终止子-来自根瘤土壤杆菌的TDNA的胭脂碱合酶终止子

破裂的(disrupted)lacZ-大肠杆菌(Eschericia coli)的β-半乳糖苷酶基因的部分区段

CaMV 35S启动子-编码CaMV 35S蛋白的花椰菜花叶病毒(CaMV)基因的启动子区段

在MGEV中的Pot1A-本文所描述的

CaMV 35S终止子-编码CaMV 35S蛋白的CaMV基因的终止子区段

M13 ori-来自M13噬菌体外壳蛋白的复制起点

TDNA LB-来自根瘤土壤杆菌的TDNA的左手边界。

箭头标明了转录方向。

除非本文详细描述，否则所述经缩写的特征是本领域技术人员众所周知并且在标准教科书中描述的标准组成部分。参见，例如Molecular Cloning(2001)Sambrook J.和Russell，D.W.，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，New York。

图4A-4E提供了来自用于在棉花中表达2个NaPIs和PotIA的4-结构域MGEV的数据，如实施例1中所述。图4A是由MGEV-5编码并在pHEX29中表达的环状蛋白质的图示，其具有内质网信号序列(棒状物)、2个6kDa蛋白酶抑制剂结构域(球形物)、1个PotIA结构域(菱形物)和液泡靶向序列(螺旋)。第3个蛋白酶抑制剂结构域由具有3条水平线的球形物来表示，以图解说明将形成抱握的2个肽[N-ter(C2_N)和C-ter(C2_C)]连接在一起的3个二硫键。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的MGEV-5产物的预测大小为31.4KDa减去信号序列。图4B是在来自实验CT89的原初(primary)转基因棉花品系的叶提取物中NaPIs的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶5,000和1∶20,000稀释。Coker是非转基因对照。图4C是在品系89.5.1的T2植物的叶提取物中NaPIs的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶5,000稀释。Coker是非转基因对照。NaPI标准是从花烟草的花中分离的2、4或6μg纯的6kDa NaPIs。图4D是从来自实验CT89和CT90的原初转基因棉花品系(T1)制备的叶提取物的蛋白质印迹。将叶蛋白质直接提取到NuPAGE LDS样品缓冲液(4x)(NOVEX)中，在4-12％Novex Bis-Tris SDS凝胶上进行分离，并转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。用NaPI抗体探测印迹。前体蛋白和6kDa NaPI肽以箭头指示。泳道1：80ng纯化的NaPI，泳道2：89.5，泳道3：89.20，泳道4：89.60，泳道5：89.111，泳道6：89.120，泳道7：89.122，泳道8：90.131，泳道9：未转化的Coker。图4E是从来自实验CT89和CT90的所选品系的T1和T2植物的棉花叶制备的提取物的免疫印迹。蛋白质在溶解到样品缓冲液中之前用丙酮进行沉淀，在4-12％Novex Bis-Tris SDS凝胶上进行分离，并转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。用NaPI抗体探测印迹。在原初品系(T1)及其子代(T2)中都观察到前体蛋白和6kDa NaPI肽(以箭头指示)。加工的中间产物可以在泳道3和7中观察到。泳道1：150ng纯化的NaPI，泳道2：89.177(T1)，泳道3：89.177(T2)，泳道4：90.73(T1)，泳道5：90.73(T2)，泳道6：89.5(T1)，泳道7：89.5(T2)，泳道8：未转化的Coker。

图5是在实施例2中使用的pHEX56的质粒图谱。

图6A-6D提供了基于使用3-结构域线性MGEV来在棉花子叶中表达NaPI和PotIA的数据，如实施例2中所述。图6A是由MGEV-8编码并在pHEX56中表达的线性蛋白质的图示，其具有内质网信号序列(棒状物)、2个6kDa蛋白酶抑制剂结构域(球形物)、1个PotIA结构域(菱形物)和液泡靶向序列(螺旋)。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的MGEV-8产物的预测大小为25.4kDa减去信号序列。图6B是在用pHEX56或PBIN19空载体瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaPIs的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶1,000稀释，并与各种量的纯化的6kDa NaPIs相比较。图6C是在用pHEX56瞬时表达后在棉花子叶提取物中PotIA的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶20稀释，并与纯化的Pot1A标准相比较。图6D是在用pHEX56瞬时表达后从棉花子叶制备的提取物的蛋白质印迹。蛋白质在溶解到样品缓冲液中之前用丙酮进行沉淀，在4-12％Novex Bis-TrisSDS凝胶上进行分离，并转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。用NaPI抗体探测印迹。泳道1：150ng纯化的NaPI，泳道2：幼苗1，泳道3：幼苗2，泳道4：幼苗3，泳道5：用pBIN19空载体转染的子叶样品。在用包含pHEX56构建体的土壤杆菌渗透的所有3种幼苗中都检测出前体蛋白和6kDa NaPI肽(以箭头指出)。

图7是在实施例3中使用的pHEX31的质粒图谱。

图8A-8G提供了基于使用4-结构域MGEV来在棉花中表达NaPI和成熟的NaD1的数据，如实施例3中所述。图8A是由MGEV-6编码并在pHEX31中表达的环状蛋白质的图示，其具有内质网信号序列(棒状物)、2个6kDa蛋白酶抑制剂结构域(球形物)、1个NaD1结构域(三角形物)和液泡靶向序列(螺旋)。第3个蛋白酶抑制剂结构域由具有3条水平线的球形物来表示，以图解说明将形成抱握的2个肽[N-ter(C2_N)和C-ter(C2_C)]连接在一起的3个二硫键。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的MGEV-6产物的预测大小为28.2KDa减去信号序列。图8B是在品系93.4的T2植物的叶提取物中NaPIs的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶5,000稀释。Coker是非转基因对照。PBS-T是阴性对照。NaPI标准是纯化的6kDa NaPI的阳性对照。图8C是在品系93.4的T2植物的叶提取物中NAD1的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶50稀释。图8D是在品系93.279的T2植物的叶提取物中NaPIs的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶1,000稀释。图8E是在品系93.279的T2植物的叶提取物中NAD1的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶50稀释。图8F是从来自实验CT93的转基因棉花品系(T1和T2)的棉花叶制备的提取物的蛋白质印迹。在4-12％Novex Bis-Tris SDS凝胶上分离蛋白质，并转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。用NaPI抗体探测印迹。泳道1：150ng纯化的NaPI，泳道2：93.4.1T2，泳道3：93.36.2T1，泳道4：93.36.2T2。存在前体蛋白和6kDa NaPI肽(以箭头指示)。图8G是从来自实验CT93的转基因棉花品系(T1和T2)的棉花叶制备的提取物的蛋白质印迹。在4-12％Novex Bis-Tris SDS凝胶上分离蛋白质，并转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。用NaD1抗体探测印迹。泳道1和2：93.4.1，泳道3：50ng成熟的NaD1，泳道4：150ng成熟的NaD1。NaD1以箭头指示。在泳道1和2中都观察到约6kDa的模糊条带，这证实成熟的NaD1存在于转基因品系93.4.1中，并且已正确地进行了加工。

图9是在实施例4中使用的pHEX46的质粒图谱。

图10A-10F提供了基于使用MGEV来在棉花子叶和烟草(Nicotiana tabacum)叶中表达GFP并将其靶向液泡的数据，如实施例4中所述。图10A是由MGEV-7编码并在pHEX46中表达的环状蛋白质的图示，其具有内质网信号序列(棒状物)、3个6kDa蛋白酶抑制剂结构域(球形物)、GFP(圆柱体)和液泡靶向序列(螺旋)。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的MGEV-7产物的预测大小为49.6kDa减去信号序列。图10B是在用pHEX46或BIN19空载体瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaPIs的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶1,000稀释，并与纯化的6kDa标准相比较。图10C是在用pHEX46瞬时表达后从棉花子叶制备的提取物的蛋白质印迹。蛋白质在溶解到样品缓冲液中之前用丙酮进行沉淀，在4-12％NovexBis-Tris SDS凝胶上进行分离，并转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。用NaPI抗体探测印迹。泳道1：用pHEX46转染的子叶样品，泳道2：用pBIN19空载体转染的子叶样品。6kDa NaPI肽(以箭头指出)存在于用pHEX46转染的子叶样品中。图10D显示了在用pHEX46(MGEV-7)瞬时表达后从本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶制备的提取物的蛋白质印迹。图10D-1和图10D-2是相同蛋白质印迹，其包含有在泳道1(NaPI)中的从花烟草花中纯化出的6kD NaPIs和在第2泳道中的在pHEX46(MGEV-7)的瞬时表达后来自本氏烟草叶的提取物。图10D-1，NaPI抗体与泳道1中的6kDa PIs结合，并且与叶提取物中具有关于MGEV-7的预期大小的蛋白质(～50kDa，以箭头指示)结合。图10D-2是在剥离并用GFP抗体再次探测后来自图10D-1的印迹。GFP抗体不与6kDa PIs结合，但与具有MGEV-7的预期大小的蛋白质(～50kDa，以箭头指示)结合。因此，该～50kDa蛋白质(以箭头指示)具有6kDa PI结构域和GFP结构域。图10D-3和图10D-4是第二个蛋白质印迹，其先用GFP抗体进行探测(图10D-3)，然后进行剥离并用NaPI抗体再次探测(图10D-4)。该印迹具有在泳道1中的经细菌表达的GFP和在第2个泳道中的在pHEX46(MGEV-7)的瞬时表达后来自本氏烟草叶的提取物。GFP抗体与经细菌表达的GFP(28kDa，以箭头指示)结合，并且与来自表达MGEV-7的叶的提取物中具有相同大小的蛋白质结合。它还与具有未加工的MGEV-7的预期大小的蛋白质以及约34kDa的可能的加工中间体结合。NaPI抗体(图10D-4)与叶提取物中的～50kDa蛋白质(以箭头指示)结合，这证实这种蛋白质具有如关于未加工的MGEV-7(～50kDa，以箭头指示)所预期的NaPI和GFP结构域。NaPI抗体不与叶提取物中由GFP抗体加亮突出的28kDa蛋白质结合。这与在本氏烟草的叶中从MGEV上释放出游离GFP相一致。图10E是显微照片，其显示了在棉花叶的表皮细胞中从pHEX46中的GFP的瞬时表达。GFP荧光定位于液泡中(以箭头指示)。用Olympus BX50荧光显微镜来检查GFP荧光。图10F是显微照片，其显示了在棉花叶的表皮细胞中从pHEX45中的GFP的瞬时表达。GFP荧光是细胞外的(以箭头指示)。用Olympus BX50荧光显微镜来检查GFP荧光。

图11是在实施例5中使用的pHEX55的质粒图谱。

图12A-12E提供了基于使用6-结构域MGEV来在棉花子叶中表达NaPI、NaD1和Pot 1A的数据，如实施例5中所述。图12A是由MGEV-9编码并在pHEX55中表达的环状蛋白质的图示，其具有内质网信号序列(棒状物)、2个6kDa蛋白酶抑制剂结构域(球形物)、2个Pot1A结构域(菱形物)、1个NaD1结构域(三角形物)和液泡靶向序列(螺旋)。第3个蛋白酶抑制剂结构域由具有3条水平线的球形物来表示，以图解说明将形成抱握的2个肽[N-ter(C2_N)和C-ter(C2_C)]连接在一起的3个二硫键。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的MGEV-9产物的预测大小为46.6KDa减去信号序列。图12B是在用pHEX55或pBIN19空载体瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaPIs的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶1,000稀释。图12C是在用pHEX55或pBIN19空载体瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaD1的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶100稀释。图12D是在用pHEX55或pBIN19空载体瞬时表达后在棉花子叶提取物中Pot 1A的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶20稀释。图12E是在用pHEX55瞬时表达后从棉花子叶制备的提取物的蛋白质印迹。蛋白质在溶解到样品缓冲液中之前用丙酮进行沉淀，在4-12％Novex Bis-Tris SDS凝胶上进行分离，并转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。用NaPI抗体探测印迹。泳道1：400ng纯化的NaPI，泳道2：用pHEX55转染的子叶样品，泳道3：未转化的Coker。6kDa NaPI肽(以箭头指示)存在于用pHEX55转染的子叶样品中。还检测出约17kDa-38kDa的几种加工中间体。

图13是在实施例6中使用的pHEX45的质粒图谱。

图14A-14F提供了基于使用MGEV来在本氏烟草叶中表达GFP并将其靶向细胞外间隙的数据，如实施例6中所述。图14A是由4种构建体编码的蛋白质中每一种的图示。内质网信号序列通过棒状物来表示，6kDa蛋白酶抑制剂结构域(包括抱握结构域)是球形物，GFP是圆柱体，和液泡靶向序列(V)表示为螺旋。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的所编码的蛋白质减去信号序列的预测大小紧靠草图给出。图14B-E是显微照片，其显示了从pHEX45(MGEV10)和C1(图14A)中的GFP的瞬时表达。在不存在V的情况下，来自这两种构建体的GFP被导向细胞外。使用Leica TCS SP2共聚焦激光显微镜来检查GFP荧光。

图14B-pHEX45在表皮细胞中的瞬时表达。

图14C-pHEX45在叶肉细胞中的瞬时表达。

图14D-对照基因构建体C1在表皮细胞中的瞬时表达。

图14E-对照基因构建体C1在叶肉细胞中的瞬时表达。

图14F-在用pHEX45(MGEV-10)、pHEX46(MGEV-7)、C1(S-GFP)和C2(S-GFP-V)瞬时表达后从本氏烟草叶制备的提取物的蛋白质印迹。用GFP抗体探测印迹A和B。泳道1：阳性对照，经细菌表达的GFP。泳道2-5是分别在C1、C2、pHEX 46(MGEV-7)和pHEX45(MGEV-10)的瞬时表达后来自叶的提取物。所有构建体产生结合GFP抗体的28kDa的蛋白质。pHEX 46(MGEV-7)和pHEX45(MGEV-10)还产生约50kDa的蛋白质，这是与GFP-抗体反应的MGEV-7和MGEV-10的预期大小。相应于MGEV-10的～50kDa蛋白质还结合NaPI抗体，印迹C，其显示出这种蛋白质具有NaPI和GFP结构域。

图15是在实施例7中使用的pHEX42的质粒图谱。

图16A-16E提供了基于使用4-结构域MGEV来在棉花子叶中表达NaPI和NaD1(具有CTPP)的数据，如实施例7中所述。图16A是由MGEV-11编码并在pHEX42中表达的环状蛋白质的图示，其具有内质网信号序列(棒状物)、3个6kDa蛋白酶抑制剂结构域(球形物)、1个NaD1结构域(三角形物)+CTPP尾巴(螺旋)和液泡靶向序列(螺旋)。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的MGEV-11产物的预测大小为31.8KDa减去信号序列。图16B是在用pHEX42或空载体瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaPI的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶100稀释。图16C是在用pHEX42瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaD1的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶5,000稀释。图16D是在用pHEX42瞬时表达后从棉花子叶制备的提取物的蛋白质印迹。蛋白质在溶解到样品缓冲液中之前用丙酮进行沉淀，在4-12％Novex Bis-Tris SDS凝胶上进行分离，并转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。用NaPI抗体探测印迹。泳道1：用pHEX42转染的子叶样品，泳道2：用pBIN19空载体转染的子叶样品，泳道3：空白，泳道4：200ng纯化的NaPI。前体蛋白和6kDa NaPI肽(以箭头指示)存在于用pHEX42转染的子叶样品中。图16E是在用pHEX42瞬时表达后从棉花子叶制备的提取物的蛋白质印迹。蛋白质在溶解到样品缓冲液中之前用丙酮进行沉淀，在10-20％Novex Tricine SDS凝胶上进行分离，并转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。用NaD1抗体探测印迹。泳道1：用pHEX42转染的子叶样品，泳道2：用pBIN19空载体转染的子叶样品，泳道3：空白，泳道4：150ng纯化的NaD1。前体蛋白和6kDa NaD1(以箭头指示)存在于用pHEX42转染的子叶样品中。

图17是在实施例8中使用的pHEX33的质粒图谱。

图18A-18C提供了基于使用5-结构域MGEV来在棉花子叶中表达NaPI和PotIA的数据。图18A是由pHEX33编码的环状蛋白质MGEV-12的图示，其具有内质网信号序列(棒状物)、3个6kDa蛋白酶抑制剂结构域(球形物)、2个PotIA结构域(菱形物)和液泡靶向序列(螺旋)。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的MGEV-12产物的预测大小为40.4kDa减去信号序列。图18B是在用pHEX33瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaPIs的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶1,000稀释。图18C是在用pHEX33瞬时表达后在棉花子叶提取物中Pot 1A的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶20稀释。

图19是在实施例9中使用的pHEX39的质粒图谱。

图20A-20C提供了基于使用5-结构域MGEV来在棉花子叶中表达NaPI、成熟的NaD1和NaD2的数据。图20A是由pHEX39编码的环状蛋白质MGEV-13的图示，其具有内质网信号序列(棒状物)、3个6kDa蛋白酶抑制剂结构域(球形物)、1个NaD2结构域(三角形物)、1个NaD1结构域(三角形物)和液泡靶向序列(螺旋)。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的MGEV-13产物的预测大小为34KDa减去信号序列。图20B是在用pHEX39瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaPIs的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶1,000稀释。图20C是在用pHEX39瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaD1的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶100稀释。

图21是在实施例10中使用的pHEX48的质粒图谱。

图22A-22D提供了基于使用4-结构域线性MGEV来在棉花子叶中表达NaPI和PotIA的数据。图22A是由MGEV-14编码并在pHEX48中表达的线性蛋白质的图示，其具有内质网信号序列(棒状物)、2个6kDa蛋白酶抑制剂结构域(球形物)、2个PotIA结构域(菱形物)和液泡靶向序列(螺旋)。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的MGEV-14产物的预测大小为34.5kDa减去信号序列。图22B是在用pHEX48瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaPIs的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶1,000稀释。图22C是在用pHEX48瞬时表达后在棉花子叶提取物中Pot 1A的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶20稀释。图22D是在用pHEX48瞬时表达后从棉花子叶制备的提取物的蛋白质印迹。蛋白质在溶解到样品缓冲液中之前用丙酮进行沉淀，在4-12％Novex Bis-Tris SDS凝胶上进行分离，并转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。用NaPI抗体探测印迹。泳道1：150ng纯化的NaPI，泳道2：用pHEX48转染的子叶样品，泳道3：用pBIN19空载体转染的子叶样品。6kDa NaPI肽以箭头指示。在用pHEX48转染的子叶组织中检测出NaPI肽和几种加工中间体。

图23是在实施例11中使用的pHEX47的质粒图谱。

图24A-24D提供了基于使用3-结构域线性MGEV来在棉花子叶中表达NaPI和成熟的NaD1的数据。图24A是由MGEV-15编码并在pHEX47中表达的线性蛋白质的图示，其具有内质网信号序列(棒状物)、2个6kDa蛋白酶抑制剂结构域(球形物)、1个NaD1结构域(三角形物)和液泡靶向序列(螺旋)。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的MGEV-15产物的预测大小为22.3kDa减去信号序列。图24B是在用pHEX47瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaPIs的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶1,000稀释。图24C是在用pHEX47瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaD1的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶100稀释。图24D是在用pHEX47瞬时表达后从棉花子叶制备的提取物的蛋白质印迹。蛋白质在溶解到样品缓冲液中之前用丙酮进行沉淀，在4-12％Novex Bis-Tris SDS凝胶上进行分离，并转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。用NaPI抗体探测印迹。泳道1：400ng纯化的NaPI，泳道2：用pHEX47转染的子叶样品，泳道3：未转化的Coker。6kDa NaPI肽(以箭头指示)存在于用pHEX47转染的子叶样品中。

图25是在实施例12中使用的pHEX35的质粒图谱。

图26A-26C提供了基于使用2-结构域线性MGEV来在棉花子叶中表达PotIA的数据。图26A是由MGEV-16编码并在pHEX35中表达的线性蛋白质的图示，其具有内质网信号序列(棒状物)、PotIA前结构域(prodomain)(矩形物)和2个PotIA结构域(菱形物)。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的MGEV-16产物的预测大小为19.4kDa减去信号序列。图26B是在用pHEX35和pHEX6瞬时表达后在棉花子叶提取物中Pot1A的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶50稀释。pHEX6与构建体pHEX35相同，除了仅存在一个拷贝的Pot1A基因外。在所评估的3株幼苗中，与单个Pot1A结构域(pHEX6)相比较，当使用Pot1A二聚体(pHEX35)时，Pot1A的表达更高。pHEX6公开于公开的专利申请(WO2004/094630)中。图26C是在用pHEX35瞬时表达后从棉花子叶制备的提取物的蛋白质印迹。蛋白质在溶解到样品缓冲液中之前用丙酮进行沉淀，在4-12％ NovexBis-Tris SDS凝胶上进行分离，并转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。用PotIA抗体探测印迹。泳道1：用pHEX35转染的子叶样品(幼苗2)，泳道2：用pBIN19空载体转染的子叶样品，泳道3：100ng纯化的Pot1A。在用pHEX35转染的子叶幼苗中产生成熟的Pot 1A(以箭头指示)。

图27是在实施例13中使用的pHEX41的质粒图谱。

图28A-28F提供了基于使用2-结构域线性MGEV来在棉花子叶中表达NaD1的数据。图28A是由MGEV-17编码并在pHEX41中表达的线性蛋白质的图示，其具有内质网信号序列(棒状物)、1个6kDa蛋白酶抑制剂结构域(球形物)、1个NaD1结构域(三角形物)和使得能够靶向液泡的CTPP尾巴(螺旋)。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的MGEV-17产物的预测大小为15.8kDa减去信号序列。图28B是在用pHEX41和pHEX3瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaD1的ELISA检测。样品进行1∶500稀释。pHEX3与pHEX41相同，除了它不包含NaPI结构域外。在所评估的2株幼苗中，与单独的NaD1的表达(pHEX6)相比较，当与NaPI结构域一起表达(pHEX35)时，NaD1的表达更高。pHEX3公开于美国专利6,031,087中。图28C是在用pHEX41瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaPI的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶1,000。图28D是在用pHEX41瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaD1的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶500。图28E是在用pHEX41瞬时表达后从棉花子叶制备的提取物的蛋白质印迹。蛋白质在溶解到样品缓冲液中之前用丙酮进行沉淀，在4-12％Novex Bis-Tris SDS凝胶上进行分离，并转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。用NaPI抗体探测印迹。泳道1：用pHEX41转染的子叶样品(幼苗2)，泳道2：用pBIN19空载体转染的子叶样品，泳道3：空白，泳道4：200ng纯化的NaPI。在用pHEX41转染的子叶样品中存在6kDa NaPI肽(以箭头指示)。图28F是在用pHEX41瞬时表达后从棉花子叶制备的提取物的蛋白质印迹。蛋白质在溶解到样品缓冲液中之前用丙酮进行沉淀，在4-12％Novex Bis-Tris SDS凝胶上进行分离，并转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。用NaD1抗体探测印迹。泳道1：用pHEX41转染的子叶样品(幼苗2)，泳道2：用pBIN19空载体转染的子叶样品，泳道3：空白，泳道4：150ng纯化的NaD1。在用pHEX41转染的子叶样品中存在前体和6kDa NaD1(以箭头指示)。

图29是在实施例14中使用的pHEX52的质粒图谱。

图30提供了基于使用2-结构域线性MGEV来在棉花子叶中表达NaD2和NaD1的数据。图30A是由MGEV-18编码并在pHEX52中表达的线性蛋白质的图示，其具有内质网信号序列(棒状物)、1个NaD2结构域(三角形物)、1个NaD1结构域(三角形物)和使得能够靶向液泡的CTPP尾巴(螺旋)。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的MGEV-18产物的预测大小为14.7kDa减去信号序列。图30B是在用pHEX52瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaD1的ELISA检测数据的条形图。

图31是在实施例15中使用的pHEX51的质粒图谱。

图32A-32B提供了基于使用2-结构域线性MGEV来在棉花子叶中表达NaD2和NaD1并将其靶向细胞外间隙的数据。图32A是由MGEV-19编码并在pHEX51中表达的线性蛋白质的图示，其具有内质网信号序列(棒状物)、1个NaD2结构域(三角形物)和1个NaD1结构域(三角形物)。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的MGEV-19产物的预测大小为11.1kDa减去信号序列。图32B是在用pHEX51瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaD1的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶100稀释。

图33是在实施例16中使用的pHEX58的质粒图谱。

图34A-34C提供了基于使用2-结构域线性MGEV来在棉花子叶中表达GUS并将其靶向液泡的数据。图34A是由MGEV-20编码并在pHEX58中表达的线性蛋白质的图示，其具有内质网信号序列(棒状物)、2个6kDa蛋白酶抑制剂结构域(球形物)、1个GUS(正方形物)和液泡靶向序列(螺旋)。连接体肽由连接每个蛋白质结构域的实线示出。未加工的MGEV-20产物的预测大小为84.8kDa减去信号序列。图34B是在用pHEX58瞬时表达后在棉花子叶提取物中NaPI的ELISA检测数据的条形图。样品进行1∶1,000稀释。图34C是在用pHEX58瞬时表达后从棉花子叶制备的提取物的蛋白质印迹。蛋白质在溶解到样品缓冲液中之前用丙酮进行沉淀，在4-12％Novex Bis-Tris SDS凝胶上进行分离，并转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。用NaPI抗体探测印迹。泳道1：用pHEX58转染的子叶样品(幼苗2)，泳道2：用pBIN19空载体转染的子叶样品，泳道3：150ng纯化的NaPI肽。在用pHEX58转染的子叶幼苗中产生NaPI肽(以箭头指示)。

发明详述

在本文和下述实施例中详细描述了各种MGEV构建体。编码环状多蛋白(MGEV-P)的一般MGEV结构如下进行图解说明：

S-C2_N-(L_jD_k)_m-L_jC2_C-V

其中，每个大写字母表示编码根据其功能进行标示的氨基酸区段的多核苷酸，因此：S是具有编码信号肽的开放读码框的多核苷酸区段；D_k是具有编码功能蛋白质(下文称为“结构域”)的开放读码框的多核苷酸区段，其中k表示用于鉴别选自具有3至m个成员的结构域的组的任何单个功能结构域的序数(ordinal number)，和D中至少一个不编码2型蛋白酶抑制剂；L_j是具有编码连接体多肽的开放读码框的多核苷酸区段，其中L_j是用于鉴别选自具有3至m+1个成员的组的每个单个连接体(L)的序数；C2_N是具有编码N-末端抱握肽的开放读码框的多核苷酸区段；C2_C是具有编码C-末端抱握肽的开放读码框的多核苷酸；V是液泡靶向肽；m是3-8的基数(cardinal number)；以及，S、C2_N、L、D、C2_C和V都在彼此相同的同一个读码框中。例如，编码3个功能结构域(D)的MGEV可以如上文所显示地进行图解说明，其中m是3，k是1、2或3，j是1、2、3或4。在下文描述的另一个线性实施方案中，抱握蛋白质被省略或截短。在不存在抱握肽的情况下，不需要任何D来编码2型蛋白酶抑制剂。

L_j编码如本文所描述的连接体氨基酸序列。每个L_j可以具有相同或不同的序列。一般性的连接体氨基酸序列以SEQ ID NO：17给出。

在植物细胞中，由MGEV所编码的蛋白质(MGEV-P)经历几步翻译后加工。这些包括在细胞内转运至内质网，条件是存在前导序列(S)；接着去除S并随后转运至细胞内贮藏液泡，条件是存在液泡靶向序列(V)。V在液泡中被去除。如果存在C2_N和C2_C，那么MGEV-P的末端变得连接在一起从而形成闭合的环，如下图解说明：

其中，C2_N、L_1-4、D_1-3、C2_C和V如上所述。

在每个连接体处以及在C2c和V之间的翻译后蛋白水解切割导致D₁、D₂、D₃，以及在一个实施方案中，导致C2作为分开的蛋白质释放。因而，MGEV的表达导致从单个启动子同时表达至少3种分开的蛋白质，其中至少一种不是2型蛋白酶抑制剂。

环状MGEV可以编码同时表达的3-8个功能结构域(D)。同时表达在本文中定义为意指来自单个转录物的多个功能蛋白质的细胞内合成。同时表达在下述几种情况下是特别有用的：当希望或需要在植物细胞中产生并积聚大量蛋白质时，例如植物保护性蛋白质或经济上重要的蛋白质；或者当控制所表达的蛋白质的相对量是有利的时；或用于表达在植物细胞中通常较差地表达的某些蛋白质，例如富含半胱氨酸的肽。当MGEV包括液泡靶向肽(V)时，同时表达的蛋白质积聚在细胞中的贮藏液泡中，这可以用于两个目的：(1)提供浓缩形式的蛋白质，以在病原体攻击的事件中维持有效剂量的植物保护剂，或易于纯化经济上有价值的蛋白质；和(2)隔离另外有毒的蛋白质，其可以将附加的抗虫性和经济价值赋予表达此类蛋白质的植物。V可以与待表达的任何结构域相组合，最方便地在MGEV的3′-末端处。需要时可以包括超过1个V。在不存在V的情况下，可以从细胞中输出通过蛋白水解而从MGEV-P中释放的蛋白质。

所表达的MGEV的组分在本文中更详细地进行描述。

原则上，由MGEV核苷酸序列的开放读码框编码的蛋白质结构域(D)可以是任何蛋白质。关于可作为MGEV的组分进行表达的蛋白质未知有大小上限。本文例示了这样的数据，其证实了编码约5kDa-超过65kDa的蛋白质的独个结构域的同时表达。当选择适合于使用MGEV来进行表达的蛋白质时，可以考虑本领域技术人员已知的实际考虑。例如，非常大的蛋白质可以单独地更有效地进行表达，而不是作为MGEV的一部分。某些蛋白质在某些情况下可能在空间上干扰环化。每个蛋白质结构域(D)通过在结构域的N-末端和C-末端氨基酸处的肽键与连接体肽(L)进行连接。

目前相信，当每个结构域和连接性连接体的N-和C-末端由于蛋白质构象而暴露于在蛋白质表面上的水性环境，而不是内部隔离在蛋白质内时，从MGEV-P中释放独个蛋白质结构域的翻译后肽切割的效率达到最大。因此，用于作为MGEV-P的一部分进行表达的候选蛋白质优选具有暴露的N-和C-末端氨基酸。

可以使用MGEV来表达的蛋白质的例子包括(但不限于)马铃薯1型PI′s、马铃薯2型PI′s、植物防卫素、动物防卫素、蛋白质性质的毒素、嵌合和融合蛋白、以及指示蛋白质例如绿色荧光蛋白(GFP)(28kDa)和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(68kDa)。可以在MGEV中表达的编码蛋白质的结构域的例子包括植物保护蛋白质，例如马铃薯1型蛋白酶抑制剂(Pot 1A)、植物种子防卫素、植物花防卫素、昆虫毒性肽例如蝎毒素、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒素、热休克蛋白、Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂、以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂和指示剂例如绿色荧光蛋白(GFP)和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)。可以使用MGEV(利用高表达水平)来表达对于除植物保护外的其他用途而言具有经济价值的蛋白质，包括适合于医学用途的抗微生物肽、抗体片段等。当希望同时的且具有正确比例的表达时，大的异二聚或异多聚蛋白质也特别适合于MGEV表达。由MGEV编码的至少一种蛋白质不是2型PI。通过提供向植物细胞内的贮藏液泡的转运以及在其中隔离，MGEV特别可用于表达这样的蛋白质，所述蛋白质对于在其中表达了它们的细胞可能是有毒的。

连接体(L)是位于每个结构域之间的短肽，其使每个邻近的结构域分开并暴露肽酶敏感性位点以用于独个结构域之间的翻译后切割。氨基酸序列——EEKKN(SEQ ID NO：5)——是连接体肽的例子。其他氨基酸序列可以充当连接体，例如其中E和K被类似氨基酸置换的序列，例如D(asp)或R(arg)或N(asn)被Q(gln)置换。共有连接体序列可以表示为X₁X₂X₃X₄X₅，其中X₁是E(glu)或D(asp)，X₂是E(glu)或D(asp)，X₃是K(lys)或R(arg)，X₄是K(lys)或R(arg)，和X₅是N(asn)或Q(gln)(SEQ ID NO：17)。连接体提供了高度亲水性区段，其使蛋白水解切割位点(N-X)暴露于MGEV-P的外表面。任何短的高度亲水性肽都可以充当MGEV-P中的连接体。本文描述的连接体肽是有利的，因为通过连接体进行连接的结构域的翻译后加工可以导致转基因植物中整个连接体的去除。(参见Heath，R.L.等人，(1995)Eur.J.Biochem.230：250-257)。

前导肽也称为信号肽(S)，其是约10-约30个最疏水的氨基酸的序列，其发挥转运功能以用于细胞内转运。许多信号肽是本领域已知的。任何已知的信号肽都可以在MGEV-P以及其中置换了同源氨基酸的其修饰形式之中使用。

液泡靶向肽(V)位于MGEV-P的C-末端处。各种液泡靶向决定子已知存在于植物细胞中，参见，例如Maruyama等人，Plant Cell(2006)18：1253-1273。合适的液泡靶向肽可以从广泛多样的已知候选物中选择出来。此外，合适的V区段无需置于MGEV的C-末端处，而是原则上可以位于序列中的其他地方；例如附着至C2_N的N-末端，在S和C2_N之间。在一个实施方案中，合适的序列可以是与已知的BP-80液泡分选受体结合的序列。结合BP-80或其同系物的任何此类液泡靶向序列都可以用作MGEV-P的组分。合适的液泡靶向序列的另一个例子显示于Miller等人(同上)，图1，NaPI-iv序列(SEQ ID NO：2)的氨基酸258-281。其他例子包括NaD1的C-末端前肽(SEQ ID NO：14，氨基酸27-105，和Pot1A前结构域，SEQ ID NO：20)。

抱握区段C2_N和C2_C在本文中由氨基酸30-48(C2_N)和228-257(C2_C)来表示(SEQ ID NO：6)。肽C2_N和C2_C的折叠构型是这样的，即使得它们容易与彼此结合，并且随后经过结合而形成的异二聚体通过形成肽间二硫化物交联来进行共价稳定化。交联的[C2_N:C2_C]蛋白质具有胰凝乳蛋白酶活性并且在本文中简称为C2。在MGEV-P结构中，C2的形成导致具有C-末端延伸(液泡靶向肽V)的MGEV-P的环化。抱握结构可以使用任何2型抑制剂来形成，与蛋白酶特异性无关，这是因为在它们之中的高度同源性。对于这些抑制剂而言共同的4氨基酸序列PRNP(或在T5的情况下，PKNP)的删除将形成抱握肽的合适的N-末端和C-末端区段。环状结构的形成不是MGEV-P的活性所必需的。MGEV-P的环状结构被视为对于有效的细胞内转运来说是有利的。环状构型的进一步优点是，由此形成的额外的抑制剂是有用的针对昆虫伤害的植物保护剂。

C2_N和C2_C的全部或部分删除可以阻止环状结构的形成并导致线性构型。本发明包括MGEV-P的线性和环状构型。无论何时要表达大蛋白质、大和小蛋白质的混合物、或缺乏紧凑的三级结构的蛋白质，线性MGEV都是有利的。在某些情况下，表达水平可以通过使用线性MGEV-P代替环状形式而得到增加。如先前描述的，可以发生通过S靶向内质网和通过V靶向液泡。线性MGEV可以具有少至2个结构域。线性MGEV-P的翻译后加工可以如所描述的发生，伴随着独个活性结构域(D_k)的释放。显示了具有3个缺乏C2_N和C2_C的蛋白质结构域的线性MGEV-P的图示，其中提供了非特异性肽P_N和P_C分别代替C2_N和C2_C，

S-P_N-(L_jD_k)_mL_jP_C-V

其中，j是1、2或4，k是1、2或3，m是3。

P_N和P_C可以分别是经修饰的或部分删除的形式的C2_N和C2_C。优选地，C2_N和C2_C被完全删除，从而使得线性3-结构域MGEV具有下述图示结构：

S-(D_kL_j)_mD_k+1 V

其中，j和k是1或2，和m是2。

如先前所述，V无需在C-末端处，而可以位于序列中的其他地方，例如S和D之间。

线性MGEV-P可以具有高至8个功能蛋白质结构域，其中至少一个不是2型蛋白酶抑制剂。与环状MGEV-P一样，线性形式可以通过删除液泡靶向序列V而从细胞中输出。

可以通过使核酸区段以指定顺序相组合的已知方法，通过DNA合成，或者通过这两种方法的组合来进行MGEV的构建。方便的方法是使用天然存在的2型PI多聚体的组分，例如来自花烟草的NaPI-iv，SEQ IDNO：2[Miller，(2000)，同上，Genbank登记号AF105340]。可以将编码并非2型PI的目的功能蛋白质结构域的一个或多个开放读码框连同合适的连接体一起插入天然存在的多聚体中，从而增加所表达的结构域的数目，或者可以删除预先存在的结构域，随后插入所需的结构域编码区段以维持结构域的总数目不变，只要所有编码区段从一个到下一个地保留在同一个读码框中。可以在MGEV中表达的蛋白质编码结构域的例子包括植物保护蛋白质，例如马铃薯1型蛋白酶抑制剂，例如在国际公开号WO 2004/094630中公开的，包括本文中例示的Pot1A，植物种子防卫素，植物花防卫素，昆虫毒性肽例如蝎毒素，苏云金芽孢杆菌毒素，热休克蛋白，Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂，以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂和指示剂例如绿色荧光蛋白(GFP)和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)。可以使用MGEV(利用高表达水平)来表达对于除植物保护外的其他用途而言具有经济价值的蛋白质，包括适合于医学用途的抗微生物肽、抗体片段等。当希望同时的且具有正确比例的表达时，大的异二聚或异多聚蛋白质也特别适合于MGEV表达。

下列实施例显示了编码植物保护蛋白质的MGEV’s的构建，用MGEV的植物转化，包含并表达MGEV的转基因植物，和由于在MGEV内编码的非马铃薯2型蛋白质的表达而不受植物害虫侵害的保护作用，以及编码大和小蛋白质的混合物的MGEVs。呈现这些实施例是为了举例说明而不是限制所要求保护的发明。

在被掺入植物转化载体中后，MGEV可以在植物或植物细胞中进行表达。许多植物转化载体是本领域众所周知并可用的，例如BIN19(Bevan，(1984)Nucl.Acid Res.12：8711-8721)、pBI 121(Chen，P-Y等人，(2003)Molecular Breeding 11：287-293)、pHEX 22(美国专利7,041,877)和本文中所例示的载体。此类载体是本领域众所周知的，由于其在细菌例如根瘤土壤杆菌和植物细胞中复制的能力而通常称为“二元”载体。典型的植物转化载体，例如本文中所例示的，包括用于在待转化的植物细胞中具有活性的合适的启动子和终止子序列(在下文中称为“植物活性”启动子或终止子)的控制下表达选择标记例如NPTII的遗传元件，用于插入目的基因(包括在合适的植物活性启动子和植物活性终止子序列的表达控制下的MGEV)的位点，以及侧翼为MGEV和选择标记的T-DNA边界以将所述基因整合入植物基因组中。

使用根瘤土壤杆菌的菌株，通常是可广泛获得的菌株LBA4404，来转化植物。在构建携带编码所需蛋白质的MGEV的植物转化载体后，将该载体用于转化根瘤土壤杆菌菌株例如LBA4404。然后，将经转化的LBA4404用于转化所需植物细胞，其中使用适合于待转化的植物物种的本领域已知的方案。使用用于选择经转化的植物细胞、增殖和再生所选细胞的标准和本领域认可的方案，以获得转基因植物。本文中的实施例进一步公开了用于转化和再生棉花植物的方法和材料，以及被各种MGEVs转化并表达各种MGEVs的转基因棉花植物。除了本文例示的那些外，还可以通过几种已知方法中的任何一种将MGEV转化到植物细胞中。众所周知的方法的例子包括微粒轰击、电穿孔和其他生物学载体(包括其他细菌或病毒)。

MGEV可以用于在任何单子叶或双子叶植物中的多基因表达。特别地，有用的植物是粮食作物例如玉米(玉蜀黍)、小麦、稻、大麦、大豆和甘蔗，以及油籽作物例如向日葵和油菜。特别有用的非食物常见作物包括棉花、亚麻和其他纤维作物。花卉和观赏性作物包括玫瑰、康乃馨、碧冬茄、洋桔梗(lisianthus)、百合、鸢尾、郁金香、香雪兰、翠雀花、补血草和天竺葵。

用于将载体、嵌合遗传构建体等引入细胞中的技术包括但不限于，使用CaCl₂的转化及其变化形式、直接的向原生质体中的DNA摄入、PEG介导的向原生质体中的摄入、微粒轰击、电穿孔、DNA的显微注射、组织外植体或细胞的微粒轰击、核酸对组织的真空-渗透、以及T-DNA介导的从土壤杆菌向植物组织的转移。

关于细胞的微粒轰击，将微粒推进到细胞中以产生转化的细胞。任何合适的射弹细胞转化方法和装置可以用于施行本发明。示例性的操作程序公开于Sanford和Wolf(美国专利号4,945,050、5,036,006、5,100,792、5,371,015)中。当使用射弹转化操作程序时，遗传构建体可以掺入能够在待转化的细胞中复制的质粒。

适合于在此类系统中使用的微粒的例子包括0.1-10μm，和更特别地10.5-5μm的钨或金球体。可以通过任何合适的技术，例如通过沉淀，来将DNA构建体沉积在微粒上。

如本文所例示的，可以用本发明的MGEV来转化能够随后进行克隆繁殖(无论是通过器官发生，还是通过胚胎发生)的植物组织，并由此产生出全植物。取决于对于被转化的具体物种而言可获得并且最适合的克隆繁殖系统，所选择的具体组织将发生变化。组织靶的例子包括叶盘、花粉、胚胎、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、现有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)、以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。

可以通过各种方法，例如通过克隆繁殖或常规育种技术，来繁殖再生出的经转化的植物。例如，第一代(或T1)经转化的植物可以进行自交以产生纯合的第二代(或T2)转化体，和T2植物通过常规育种技术进一步进行繁殖。

因此，在其涉及植物的范围内，本发明的这个方面进一步延伸至经改造从而表达MGEV的核酸的植物的子代，以及所述植物的营养、繁殖和生殖部分，例如花(包括切割或切断的花)，植株的部分，来自植物(例如，棉花)的纤维材料，和生殖部分(包括插条、花粉、种子和愈伤组织)。

本发明的另一个方面提供了经遗传修饰的植物细胞或多细胞植物或其子代或者经遗传修饰的植物的部分，其能够产生由本文所述的MGEV编码的蛋白质或肽，其中所述转基因植物已获得与所述蛋白质或肽的表达相关的新型表型性状。

在表2中列出了本文中所例示的MGEV结构和MGEV表达载体，以及在其中对它们进行了描述的实施例的编号。表3中列出了序列ID列表。

实施例1

具有一个1型PI和三个马铃薯2型PI′s的MGEV的构建和表达

这个实施例中描述的MGEV(MGEV-5)(SEQ ID NO：6)具有如下图示的结构：

S-C2_N-L₁D₁-L₂D₂-L₃D₃-L₄-C2_C-V

其中L_1-4编码连接体氨基酸序列-EEKKN-(SEQ ID NO：5)；D₁编码马铃薯2型胰蛋白酶抑制剂，T1(SEQ ID NO：3)(SEQ ID NO：1，氨基酸112-164)；D₂编码马铃薯1型胰凝乳蛋白酶抑制剂，马铃薯Pot 1A(SEQ ID NO：11)(也是SEQ ID NO：5，碱基352-376)；D₃编码2型胰凝乳蛋白酶抑制剂，C1(SEQ ID NO：2，氨基酸54-106)；C2_N(SEQ ID NO：1，氨基酸31-48)和C2_C(SEQ ID NO：1，氨基酸344-373)编码这样的肽，所述肽彼此相互作用从而形成通过二硫化物交联而稳定化的异二聚体C2，该交联的蛋白质具有马铃薯2型胰凝乳蛋白酶抑制剂活性。S编码信号肽，和V编码液泡易位肽。

由上文鉴定的区段编码的氨基酸序列描述在下述来源中：

关于S-C_N-L₁D₁，SEQ ID NO：2的氨基酸1-29(S)；30-48(C2_N)；112-164(D₁)；

关于L₂，氨基酸EEKKN，SEQ ID NO：5；

关于D₂，(SEQ ID NO：11)[还可参见国际公开号WO2004/094630(2004年11月4日)SEQ ID NO：81，通过提及而合并入本文，至与本文不相矛盾的程度]；

关于L₃D₃，SEQ ID NO：2的氨基酸49-106；

关于L₄C2_CV，SEQ ID NO：2的氨基酸223-257(L₄C2_C)；和258-281(V)。

构建了多用途载体pRR19。该载体包含获自NaPI-iv(SEQ ID NO：2)和NaPI-ii(SEQ ID NO：1)[Miller(2000)同上]的序列以及用于插入新基因的限制位点。将整个MGEV-1序列以连续顺序装配到pRR19中。

载体pRR19被设计为允许将连接体(L)和开放读码框(D)方便地以模块方式装配到具有所需的组分组合的MGEV中。作为步骤1，聚合酶链反应(PCR)用于扩增NaPI-iv的各自的N-和C-末端区段，具体地S-C2_N(SEQ ID NO：2，氨基酸1-48)和C2_C-V(SEQ ID NO：2，氨基酸228-281)，并提供Xho1限制位点。提供Xho1限制位点以允许在末端区段之间连接`所需区段，从而使得扩增的区段分别具有图示结构S-C2_NL₁-Xho1和Xho1-C2_C-V。在切割和连接后，将区段S-C2_N-L₁-Xho1-C2_C-V克隆到pGEMT-Easy(Promega，Madison，WI)载体中。

然后，可以将在其N-和C-末端处具有Xho1位点的任何所需DNA区段插入到所得到的载体的Xho1位点中。

作为步骤2，在平行制备中，经PCR扩增编码NaPI-ii的T1(SEQ IDNO：1，氨基酸112-164)(将在MGEV-5的位置D₁中)的DNA和编码NaPI-iv的C1结构域(SEQ ID NO：2，氨基酸54-106)(将在MGEV-5的位置D₃中)的DNA，具有如下图示而添加的限制位点：

Xho1-T1-L₁-Xba1和Xba1-C1-L₁-Xho1。

将所述构建体中的每一种分开地克隆到用Xba1和Xho1进行消化并纯化的pGEM T-easy载体中。

将来自前面步骤的经修饰的T1和C1结构域合并到具有第一个步骤的Xho1消化产物的DNA连接反应混合物中。将该连接混合物转化到大肠杆菌XL1-Blue细胞(Stratagene，LaJolla，CA)中，并且进行限制酶切消化和测序以证实蛋白酶抑制剂结构域的所需方向和顺序。预测的连接反应是编码下述组分的DNA区段：

S-C2_N-L₁-Xho1....Xho1-T1-L₁-Xba1....Xba1-C1-L₁Xho1....Xho1-C2c-V

(步骤1产物) (步骤2产物) (步骤2产物) (步骤1产物)。

如通过限制酶切消化产物的电泳以及序列分析所证实的，连接产物是

S-C2_N-L₁-Xho1-T1-L₁-Xba1-C1-L₁-Xho1-C2_C-V。

连接产物包含唯一的Xba1位点(加下划线的)，可以向其中插入任何所需的编码序列，条件是在两个末端处具有Xba1限制位点。将具有所描述的构建体的载体标示为pRR19。

关于D₂结构域，给先前描述的编码Pot 1A的DNA提供位于C-末端编码末端处的连接体(L)，随后为在3′和5′末端处的Xba1限制位点。在pRR19的Xba1位点处的插入导致获得构建体，该构建体随后插入到pAM9(pAM9从pDHA进行修饰，Tabe等人，Journal of Animal Science，73：2752-2759，1995)中从而产生MGEV-5。在pAM9中的插入导致35SCaMV启动子附着在3′末端和35S CaMV终止子附着在5′末端。然后，将MGEV-5于EcoR1位点处插入pBIN19中，导致获得在图3中图示的载体pHEX 29。还可参见图4A。

需要时，通过使用DNA合成来制备表1的所公开的MGEV-5序列，可以避免在MGEV-5中使用限制位点。还可参见SEQ ID NO：6(DNA序列)和SEQ ID NO：12(推导的氨基酸序列)。

表1.信号肽(碱基7-93)，N-末端抱握肽结构域(碱基94-150)(C2_N)和C-末端抱握肽结构域(778-864)(C2_C)，T1结构域(碱基172-330)，Pot 1A(碱基352-576)，C1结构域(碱基598-756)和液泡靶向序列(碱基865-939)。

BamHI

1 GGATCCATGGCTGCTCACAGAGTTAGTTTCCTTGCTCTCCTCCTCTTATTTGGAATGTCT

G S M A A H R V S F L A L L L L F G M S

61 CTGCTTGTAAGCAATGTGGAACATGCAGATGCCAAGGCTTGTACCTTAAACTGTGATCCA

L L V S N V E H A D A K A C T L N C D P

XhoI

121 AGAATTGCCTATGGAGTTTGCCCGCGTTCAGAAGAAAAGAAGAATCTCGAGGATCGGATA

R I A Y G V C P R S E E K K N L E D R I

181 TGCACCAACTGTTGTGCAGGCACGAAGGGTTGTAAGTACTTCAGTGATGATGGAACTTTT

C T N C C A G T K G C K Y F S D D G T F

241 GTTTGTGAAGGAGAGTCTGATCCTAGAAATCCAAAGGCTTGTCCTCGGAATTGCGATCCA

V C E G E S D P R N P K A C P R N C D P

XbaI

301 AGAATTGCCTATGGGATTTGCCCACTTTCAGAAGAAAAGAAGAATTCTAGAAAGGAATCG

R I A Y G I C P L S E E K K N S R K E S

361 GAATCTGAATCTTGGTGCAAAGGAAAACAATTCTGGCCAGAACTTATTGGTGTACCAACA

E S E S W C K G K Q F W P E L I G V P T

421 AAGCTTGCTAAGGAAATAATTGAGAAGGAAAATCCATCCATAAATGATGTTCCAATAATA

K L A K E I I E K E N P S I N D V P I I

481 TTGAATGGCACTCCAGTCCCAGCTGATTTTAGATGTAATCGAGTTCGTCTTTTTGATAAC

L N G T P V P A D F R C N R V R L F D N

XbaI

541 ATTTTGGGTGATGTTGTACAAATTCCTAGGGTGGCTGAAGAAAAGAAGAATTCTAGAGAT

I L G D V V Q I P R V A E E K K N S R D

601 CGGATATGCACCAACTGTTGCGCAGGCACGAAGGGTTGTAAGTACTTCAGTGATGATGGA

R I C T N C C A G T K G C K Y F S D D G

661 ACTTTTGTTTGTGAAGGAGAGTCTGATCCTAGAAATCCAAAGGCTTGTACCTTAAACTGT

T F V C E G E S D P R N P K A C T L N C

XhoI

721 GATCCAAGAATTGCCTATGGAGTTTGCCCGCGTTCAGAAGAAAAGAAGAATCTCGAGGAT

D P R I A Y G V C P R S E E K K N L E D

781 CGGATATGCACCAATTGTTGCGCAGGCAAGAAGGGCTGTAAGTACTTTAGTGATGATGGA

R I C T N C C A G K K G C K Y F S D D G

841 ACTTTTATTTGTGAAGGAGAATCTGAATATGCCAGCAAAGTGGATGAATATGTTGGTGAA

T F I C E G E S E Y A S K V D E Y V G E

SalI

901 GTGGAGAATGATCTCCAGAAGTCCAAGGTTGCTGTTTCCTAAGTCGAC

V E N D L Q K S K V A V S ＊ V D。

使陆地棉(Gossypium hirsutum)栽培种Coker 315的种子在次氯酸钠(2％有效氯)中进行表面灭菌60分钟，随后在无菌水中洗涤几次。将经灭菌的种子播种在棉籽培养基(Cotton Seed Medium，CSM)[0.22％w/v MS(Murashige和Skoog盐混合物Austratec M524)，0.05％ w/vB5维生素(Sigma G1019)，1.5％ w/v葡萄糖(Austratec G386)，0.2％ w/v吉兰糖胶Gelrite，Merck&Co.的商标，(Phyto TechnologyLaboratories)，pH 5.8]上，并于30℃在黑暗中温育10天。将用pHEX29构建体转化的根瘤土壤杆菌(LBA4404)在补充有抗生素卡那霉素(50μg/mL)的25ml LB培养基中于28℃生长过夜。测量在550nm处的吸光度，并且将细胞在MS液体培养基(0.43％ w/v Murashige和Skoog基础盐，pH 5.8)中稀释至2×10⁸细胞/ml。将棉花下胚轴切成1.5-2cm的碎片，并且在稀释的土壤杆菌培养物中短暂混合(0.5-3分钟)。将外植体弄干并转移到培养基1(0.43％ w/v Murashige和Skoog盐混合物，0.1％ v/v Gamborg’s B5维生素溶液(Sigma)，0.1g/L肌醇，0.9g/L MgCl₂(六水合物)，1.9g/L硝酸钾，0.2％ w/v Gelrite，3％w/v葡萄糖，pH 5.8)中，用无菌滤纸覆盖，并于26℃在光照下温育3天。

在共培养后，将外植体转移至培养基2(培养基1加上0.1mg/L细胞分裂素，0.1mg/L 2，4-D，500mg/L羧苄青霉素，35mg/L卡那霉素)，并于30℃在低光照下进行维持。4周后，将外植体转移至培养基3(培养基1加上500mg/L羧苄青霉素，25mg/L卡那霉素)，并于30℃在低光照下进行维持。每4周将外植体和愈伤组织在培养基3上进行亚培养，并于30℃在低光照下进行维持。从组织中切出胚胎，并在培养基4(1.2mM CaCl₂2H₂O，5.0mM KNO₃，2.0mM MgSO₄7H₂O，3.0mM NH₄NO₃，0.2mM KH₂PO₄，4μM烟酸，4μM吡哆醇HCl，4μM硫胺素HCl，30μM H₃BO₃，30μM MnSO₄H₂O，9μM ZnSO₄7H₂O，1.5μM KI，0.9μM Na₂MoO₄2H₂O，0.03μM CuSO₄5H₂O，0.03μM CoCl₂6H₂O，15μM FeNaEDTA，0.5％ w/v葡萄糖，0.3％ w/v吉兰糖胶Gelrite，pH 5.5)中进行萌芽，并且于30℃在高光照下进行维持。

然后，将已萌发的胚胎转移至包含培养基4的Magenta盒中，并且于30℃在高光照下进行维持。一旦植物已形成良好的根系并产生几片新叶，就将它转移至在罐中的土壤中并在处于28℃的生长室中进行适应，然后在温室中进行生长(27-29℃日，20-24℃夜)。

PCR分析

DNA分离：从第2片完全展开的叶取样棉花叶盘(0.5-0.7cm)，避开叶脉组织。将来自REDExtract-N-Amp Plant PCR试剂盒(Sigma)的提取溶液(100μl)加至每个叶盘，确保该组织被完全浸没。使样品在涡旋振荡前于95℃在加热块上加热10分钟。加入稀释溶液(100μl，Sigma)，和使样品充分涡旋振荡并置于冰上。

PCR反应混合物由下述组分组成：10μl PCR准备好的混合物(REDExtract-N-Amp，Sigma)、0.8μl正向引物、0.8μl反向引物、2.8μl H₂O、4μl DNA提取物(来自上文)。PCR条件是94℃4分钟，随后为94℃30秒、62℃30秒、72℃1分钟的33个循环，然后为72℃10分钟。将样品贮存于4℃。

引物：

npt II正向：GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGAC-SEQ ID NO：7

npt II反向：CGGGTAGCCAACGCTATGTCC-SEQ ID NO：8

StPot 1A正向：GCTCTAGAAAGGAATCGGAATCTGAATC-SEQ ID NO：9

StPot 1A反向：GCTCTAGAATTCTTCTTTTCTTCAGCCACCCTAGGAATTTG-SEQ ID NO：10

在转基因棉花中NaPI和StPot1A的检测

ELISA

蛋白质提取物：从在生长室或温室中生长的植物上切下叶。将组织(100mg)冷冻于液氮中，并在混合式磨机(mixer mill)(RetschMM300)中以频率30研磨2x15秒。在涡旋20秒之前，加入1mL 2％不溶性PVP(Polyclar)/PBS/0.05％Tween 20。使样品离心10分钟并收集上清液。

用100μL/孔的在PBS中的一抗包被ELISA平板(Nunc Maxisorp#442404)。

用100ng/孔的抗-NaPI(通过标准方法制备的针对从柱头分离出的纯化的NaPI肽的多克隆抗体)或抗-Pot 1A(针对Pot 1A制备的抗体，所述Pot 1A作为与C1的二聚体在大肠杆菌中进行表达，然后进行切割并分开纯化)于4℃在潮湿的盒中温育过夜。用PBS/0.05％Tween 20洗涤平板2分钟×4。用200μL/孔的在PBS中的3％BSA(Sigma A-7030：98％ELISA级别)封闭平板。于25℃温育2小时。用PBS/0.05％Tween20洗涤平板2分钟×4。抗-NaPI抗体与花烟草的T和C蛋白酶抑制剂结合。

施加100μL/孔的棉花蛋白质提取物(在PBS/0.05％ Tween 20中稀释的)。于25℃温育2小时。用PBS/0.05％Tween 20洗涤平板2分钟×4。施加100μL/孔的在PBS中的二抗(50ng/孔的经生物素标记的NaPI抗体，200ng/孔的经生物素标记的Pot 1A抗体)。于25℃温育1小时。使用EZ-联Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒(EZ-linkSulfo-NHS-LC-biotinylation kit)(Pierce)来制备经生物素标记的抗体。使用2ml的经蛋白A纯化的抗体和2mg的生物素试剂。

用PBS/0.05％Tween 20洗涤平板2分钟×4。施加100μL/孔的在PBS中的NeutriAvidin HRP-缀合物(Pierce#31001；1∶1000稀释度；0.1μL/孔)。于25℃温育1小时。

用PBS/0.05％Tween 20洗涤平板2分钟×4，随后用H₂O洗涤平板2分钟×2。紧在使用前，通过将1片ImmunoPure OPD(Pierce#34006)溶解于9mL H₂O中来制备底物，然后加入1mL稳定的过氧化物缓冲液(10x，Pierce#34062)。添加100μL/孔的底物。于25℃温育直至颜色产生。用50μL 2.5M硫酸终止反应。在平板阅读器(MolecularDevices，Milenia Kinetic Analyzer)中测量在490nm处的吸光度。

免疫印迹分析

从在生长室或温室中生长的植物上切下叶。将叶组织(100mg)冷冻于液氮中，并在混合式磨机(Retsch MM300)中研磨成细粉，其中以频率30研磨2x15秒。将粉末加入至2×样品缓冲液(300μl，NovexNuPAGE LDS样品缓冲液，10％ v/v β-巯基乙醇)中，涡旋振荡30秒，煮沸5分钟，然后在14,000rpm下离心10分钟，并保留上清液用于SDS-PAGE。备选地，将粉末加入至1ml丙酮中，充分涡旋振荡并在14,000rpm(18,000g)下离心2分钟，并弃去上清液。通过充分涡旋振荡将粒状沉淀重悬浮于含2％Polyclar AT(水溶性聚乙烯聚吡咯烷(polyvinyl polypyrrolidine))的300μl IP裂解缓冲液(50mM TrispH 8、5mM EDTA、150mM NaCl、0.1％Trton X-100)中，并在14,000rpm下离心10分钟后收集上清液。对于通过SDS-PAGE进行的分析，使用30μl的在1×样品缓冲液(Novex NuPAGE LDS样品缓冲液)和5％v/vβ-巯基乙醇中的样品。

通过在预制的4-12％ w/v聚丙烯酰胺梯度凝胶(Novex，NuPAGEbis-tris，MES缓冲液)上，在ovex X Cell II小型池电泳装置中，以200V进行SDS-PAGE 35分钟来分离提取的叶蛋白质。包括了预染的分子量标准参照物(Novex SeeBlue Plus 2)作为标准。使用Novex X CellII小型池电泳装置，在含10％v/v甲醇的NuPAGE转移缓冲液中，以30V将蛋白质向硝酸纤维素膜(Osmonics 0.22微米NitroBind)转移60分钟。转移后，将膜在异丙醇中温育1分钟，随后在TBS中洗涤5分钟。

将膜在RT下在3％ w/v BSA中封闭1小时，随后与一抗一起在RT下温育过夜(NaPI抗体：1mg/ml原液在TBS/1％BSA中作1∶2000稀释，Pot 1A抗体：1mg/ml原液在TBS/1％BSA中作1∶1000稀释)。将膜在TBST中洗涤5x10分钟，然后与缀合至辣根过氧化物酶的山羊抗兔IgG一起在RT下温育60分钟(Pierce，在TBS中作1∶100,000稀释)。在根据制造商的说明书将膜与SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce)一起温育前，进行5次额外的10分钟TBST洗涤。将膜暴露于ECL Hyperfilm(Amersham)。

结果

从两次实验(CT 89和CT 90)产生了86株可能的转基因植物。使用npt引物和StPotIA引物，通过PCR来筛选所有植物。通过ELISA就NaPI蛋白表达来评估npt II阳性植物。38株植物表达可检测水平的NaPI(图4)。

使品系89.5.1进行自交，和让T2子代种子进行生长，并通过ELISA就NaPI表达来评估植物。27株植物中的20株(74％)表达NaPI，和7株植物(26％)是无效分离子(图4C)，这证明该基因已经以可遗传的方式转移至下一代。

使用NaPI抗体来进行的所选品系的免疫印迹分析证实，存在前体蛋白和经加工的肽(图4D和4E)。然而，PotI的检测并不成功，这暗示该测定法中的检测灵敏度不够。

结果证明，编码4种肽(其中至少一种不是2型蛋白酶抑制剂)的MGEV可以使用常规方法来构建，并用于成功转化与组分DNA区段中任一种所源自的物种不同的物种的植物(棉花)。所编码的蛋白质进行表达并进行翻译后加工，从而产生预期大小的组分肽。

实施例2

具有一个1型PI和两个马铃薯2型PIs的线性MGEV的构建和表达

这个实施例中描述的MGEV(MGEV-8)具有如下图示的结构：

S-D₁L₁D₂L₂D₃L₃-V

其中，D₁是NaPI-ii的T1-SEQ ID NO：2，aa 112-164

D₂是马铃薯Pot 1A-SEQ ID NO：11

D₃是C1或SEQ ID NO：2的氨基酸200-252

L₁和L₂和L₃各自是EEKKN(SEQ ID NO：5)

S是NaPI-iv的信号肽-SEQ ID NO：2，aa 1-29

和V是NaPI-iv的液泡靶向肽-SEQ ID NO：2，aa 258-281。

如下构建线性MGEV(MGEV-8)(图6A)。经PCR扩增NaPI-iv的信号序列(SEQ ID NO：2，aa 1-29)，其在5′末端处具有Bam H1位点和在3′末端处具有Xho 1位点。经PCR扩增NaPI-iv的液泡靶向肽，其在5′末端处具有Xho 1位点和在3′末端处具有Sal 1位点。将这些DNA片段一起连接到用Bam H1和Sal 1切割的pAM9中(参见实施例1)。

从多用途载体pRR20(参见实施例3)中切出侧翼具有Xho 1的T1-Xba 1-C1片段，并连接到上文描述的S-Xho 1-V构建体中，导致获得S-Xho 1-T1-Xba 1-C1-Xho 1-V构建体。将该线性多用途载体标示为pSP1。

经PCR扩增马铃薯Pot 1A的成熟结构域(参见实施例1)，其在3′末端处具有EEKKN连接体序列(SEQ ID NO：5)和在两个末端处具有Xba 1位点。然后将这连接到pSP1的Xba 1位点中，从而产生MGEV-8(图6A)。将MGEV-8插入pBIN19中，从而产生载体pHEX 56，在图5中图示。

在棉花子叶中的瞬时表达

将pHEX 56引入根瘤土壤杆菌中，并且通过使用棉花子叶的瞬时测定法来测定T1、C1和Pot 1A的表达。

将土壤杆菌的细菌“菌苔”涂布到选择性平板上，并在黑暗中于30℃生长3天。然后，在渗透缓冲液(10mM氯化镁和10μM乙酰丁香酮(在DMSO中的0.1M原液))中将细菌重悬浮至1.0的OD600，并在室温下温育2-4小时。棉花植物在受控温度生长室(25℃，16小时/8小时的光/暗循环)中生长8天。通过对叶轻轻按压1ml注射器并用土壤杆菌悬浮液充填叶腔来对子叶的下侧进行渗透。在叶的顶侧上注意到渗透区域(由变暗来指示)。每片子叶进行最多4次渗透。使植物再生长4天。然后切下经渗透的区域，称重，并冷冻于液氮中。如实施例1中所述的，通过ELISA和免疫印迹来测定蛋白质表达。

结果

通过ELISA在棉花子叶中检测出NaPI(图6B)和Pot 1A(图6C)。使用NaPI抗体的免疫印迹分析证实，存在前体蛋白和经加工的肽(图6D)。

结果确证了来自实施例1的先前结论，并且另外证明了Pot1A的表达。结果还证明，原初MGEV表达产物的环化不是进行加工以产生预测的组分肽所必需的。

实施例3

具有一个防卫素和三个马铃薯2型PIs的MGEV的构建和表达

注：在实施例3-16中，从MGEV图示中省略了连接体肽(L)以便简化图示。

这个实施例中描述的MGEV(MGEV-6)具有如下图示的结构：

(还可参见图8A)。

基本上如对于MGEV-5(实施例1)所描述的，来构建表达防卫素和三个马铃薯2型PI′s的MGEV-6，除了使用经修饰的多用途载体(pRR20)和插入防卫素编码序列代替Pot 1A外。所述防卫素是NaD1，其描述于美国专利7,041,877，和在本文中描述于SEQ ID NO：14，氨基酸26-72，其具有成熟的防卫素结构域但缺乏C-末端酸性肽尾巴，并且不含N-末端信号肽。

经修饰的多用途载体(pRR20)与实施例1中描述的多用途载体(pRR19)相同，除了在Xho1-T1-L₁-XbaI DNA片段的EEKKN连接体(SEQID NO：5)(L₁)中编码N的密码子从AAT变成AAC(SEQ ID NO：12)。这删除了在pRR19存在中的不希望的Eco R1限制位点。

将NaD1 DNA连接到pRR20的Xba 1位点中，然后用Bam H1和Sal1切出，并将完整片段插入pAM9中，从而产生MGEV-6。然后，将MGEV-6插入pBIN19中，从而产生载体pHEX31，在图7中图示。

棉花的转化

如实施例1中所述，进行使用pHEX31的棉花转化。

蛋白质检测

如实施例1中所述，通过ELISA来测定蛋白质表达。初级NaD1抗体和次级NaD1-生物素抗体以50ng/孔进行使用。

如实施例1中所述，并采用实施例2中所述的修饰，进行免疫印迹分析。初级NaD1抗体从1mg/ml原液以1∶1,000的稀释度进行稀释，和二抗(缀合至辣根过氧化物酶的山羊抗兔IgG)以1∶50,000的稀释度进行使用。

结果

从一次实验(CT 93)产生了88株可能的转基因植物。使用nptII引物和对于NaD1特异的引物，通过PCR来筛选所有植物。57株植物对于nptII基因的存在而言是阳性的，其中这些植物中的33株还携带NaD1基因。通过ELISA就NaPI和NaD1蛋白表达来评估PCR阳性的植物。13株原初转基因植物表达可检测水平的NaPI和NaD1。

选择3种转基因品系(93.4、93.36和93.279)用于进一步研究。使原初转基因品系进行自交，并收集T2种子。通过ELISA就NaPI表达(图8B、8D)和NaD1表达(图8C、8E)来评估来自这些品系中的两种(93.4和93.279)的T2植物。这两种品系均产生与以孟德尔方式转移的基因相一致的分离群体。

使用NaPI抗体来进行的品系93.4和93.36的免疫印迹分析证实，存在前体蛋白和经加工的肽(图8F)。使用NaD1抗体来进行的品系93.4的进一步分析证实，存在成熟的NaD1蛋白(图8G)，尽管水平较低。

结果证明了MGEV用于同时表达除了蛋白酶抑制剂外的蛋白质(NaD1、防卫素)的效用。

实施例4

具有一个GFP和三个马铃薯2型PI′s的MGEV的构建和表达

这个实施例中描述的MGEV(MGEV-7)具有如下图示的结构：

(还可参见10A)。

MGEV-7具有与MGEV-5(实施例1)类似的结构，除了插入编码绿色荧光蛋白(GFP)的DNA序列代替Pot 1A外。所述GFP是用于在高等植物中使用的绿色荧光蛋白(GFP)的可溶性、高荧光变体(Davies，SJ和Vierstra，RD：Plant Mol.Biol.36(4)：521-528(1998))。DNA获自TAIR(拟南芥信息资源)(SEQ ID NO：13)。序列信息可以登记号U70495从Genbank获得，和在本文中以SEQ ID NO：13获得。

关于MGEV-7的构建，使用第三种多用途载体(pRR21)。这以与pRR20相同的方式进行，除了下列之外：经PCR扩增编码NaPI-iv的C1结构域的DNA，其在3′末端处具有额外的EEKKN连接体序列(SEQ IDNO：5)，这导致获得Xba1-L-C1-L-Xho1 DNA片段。pRR21具有下述结构：S-C2_N-L-Xho1-T1-L-Xba1-L-C1-L-Xho1-C2_C-V。此外，在进行另外的插入前，将该构建体插入pAM9中。经PCR扩增具有Xba1末端(无3′连接体序列)的编码GFP的DNA序列，并插入至在pRR21的T1和C1之间的Xba1位点中，从而产生MGEV-7。将MGEV-7插入pBIN19中，从而产生载体pHEX 46，在图9中图示。

在烟草叶中的瞬时表达

将pHEX 46引入根瘤土壤杆菌中，并且通过使用烟草叶的瞬时测定法来测定T1、C1和GFP的表达。该方法基本上是在实施例2中对于棉花子叶所描述的那种，除了使本氏烟草植物在受控温度生长室(25℃，16小时/8小时的光/暗循环)中生长5周外。通过轻轻按压1ml注射器并用土壤杆菌悬浮液充填叶腔来对子叶的下侧(距离顶端4-6个节，最大宽度6-10cm)进行渗透。对每片叶进行4-6次渗透。使植物再生长4天。然后切下经渗透的区域，称重，并冷冻于液氮中。如实施例1中所述的，通过免疫印迹来测定蛋白质表达。

在棉花子叶中的瞬时表达

如先前在实施例2中所述，也是在使用棉花子叶的瞬时测定法中测定pHEX 46的表达。

蛋白质检测

如实施例1中所述，通过ELISA来测定NaPI的表达。

如实施例1中所述，并采用实施例2中所述的修饰，进行免疫印迹分析。

显微术

用根瘤土壤杆菌进行渗透后3天，使本氏烟草和棉花植物置于黑暗中24小时。然后，取出经渗透的叶区域，并制备表皮揭片(peel)(～5mm²)。将表皮或中胚层组织的小片(1-2mm²)置于载玻片上，用水作为封固剂。将盖玻片置于顶上并用热蜡进行密封。使用OlympusBX50荧光显微镜来检查切片的GFP荧光。对于荧光激发，使用W1B滤波器(激发范围460-490nm)，和对于发射，使用在515nm+处检测信号的长通滤波器(long pass filter)。还使用Leica TCS SP2共聚焦激光显微镜来检查GFP荧光。氩激光器激发波长是488nm；用关于FITC的滤波器组(505-530nm)来检测GFP发射。

结果

进行使用烟草叶和棉花子叶的几个瞬时测定法。通过ELISA在棉花子叶中检测出NaPI(图10B)。使用NaPI抗体的免疫印迹分析证实，在棉花子叶中存在经加工的肽(图10C)。

在瞬时表达后烟草叶提取物的免疫印迹分析证实，存在GFP蛋白(图10D)。GFP和NaD1抗体都与约50kDa(这与由pHEX 46编码的前体蛋白的预期大小一致)的蛋白质结合。GFP抗体还加亮突出～28kDa(这是与经细菌表达的GFP相同的大小)的蛋白质，并因此表示已从由pHEX 46编码的前体上经蛋白水解而切出的GFP。

由MGEV-7在棉花叶的表皮细胞中瞬时表达而产生的GFP定位于液泡中(图10E)。这与由构建体MGEV-7A产生的GFP荧光形成对比，所述构建体MGEV-7A与MGEV-7相同，除了液泡靶向肽(V)被删除外(参见实施例7)。MGEV-7A的瞬时表达导致GFP荧光的细胞外定位(图10F)。

结果证明，可以使用MGEV将具有不等大小的蛋白质表达为多蛋白，并在翻译后进行正确加工，从而产生独个蛋白质组分。在这个实施例中，大小为～6kDa至～28kDa的4种蛋白质有效地一起表达并进行正确加工。单个液泡靶向肽导致每种经表达的蛋白质在加工前转移至细胞液泡。因此，在MGEV中使用GFP是用于指明在MGEV中共表达的蛋白质的细胞内定位的方便方法。

实施例5

具有一个防卫素、一个1型PI和三个马铃薯2型PIs的MGEV的构建和表达

这个实施例中描述的MGEV(MGEV-9)具有如下图示的结构：

(参见图12A)。

使用下述方法来构建表达6种蛋白质(防卫素、两种马铃薯1型PI′s和三种2型PI′s)的MGEV-9。根据实施例3来制备NaD1。通过剪接重叠PCR(splice overlap PCR)来构建Pot 1A二聚体。经PCR扩增具有5′XbaI位点和3′连接体序列的第一Pot 1A。经PCR扩增在两个末端处具有连接体序列并具有3′XbaI位点的第二Pot 1A。使这两个PCR片段彼此退火，并延伸8个循环；随后添加外部引物以PCR扩增二聚体序列。将NaD1和Pot 1A二聚体片段以三向连接(3wayligation)的方式插入至pSP1(实施例2)的Xba 1位点中。在Xho 1位点处切割新的更大片段(T1-NaD1-Pot 1A-Pot 1A-C1)，从而产生MGEV-9。将MGEV-9插入pBIN19中，从而产生载体pHEX55，在图11中图示。

在棉花子叶中的瞬时表达

如先前在实施例2中所述，在使用棉花子叶的瞬时测定法中测定pHEX55的表达。

蛋白质检测

如实施例1、2和3中所述，通过ELISA来测定NaPI的表达。

结果

通过ELISA在棉花子叶中检测出NaPI(图12B)、NaD1(图12C)和Pot 1A(12D)。使用NaPI抗体的免疫印迹分析证实，存在前体蛋白和经加工的NaPI 6 kDa肽(图12E)。

结果证明了在6-结构域环状MGEV中的几种不同蛋白质的同时表达和正确加工。

实施例6

在植物组织中将蛋白质靶向细胞外间隙的MGEV的构建和表达

这个实施例中描述的MGEV具有如下图示的结构：

(参见图14A，MGEV 10)。

该MGEV(MGEV-10)与MGEV-7(实施例4)基本上相同，除了它不具有NaPI液泡靶向肽(V)并且使用多用途载体pRR20(实施例3)外。使用反向引物来PCR扩增pRR20，所述反向引物排除了液泡靶向肽(V)。然后，将侧翼具有XbaI的GFP连接到XbaI位点中。GFP的细节在实施例4中给出。然后，将该片段(S-C2_N-T1-GFP-C1-C2_C)插入pAM9中，从而产生MGEV-10。然后，将MGEV-10插入pBIN19中，从而产生载体pHEX45，在图13中图示。

瞬时表达测定法

如实施例4中所述，在使用烟草叶和棉花子叶的瞬时测定法中测定pHEX45的表达。如实施例4中所述，通过免疫印迹来测定蛋白质表达。两种非MGEV构建体C1和C2(图14A)用作对照。这些构建体使用与MGEV构建体相同的启动子和终止子，并克隆到相同载体中以用于在植物细胞中表达。C1的编码序列包含具有来自MGEV的信号序列(S)的GFP。第二种对照构建体(C2)编码具有来自MGEV的内质网信号序列(S)和液泡靶向序列(V)的GFP。如实施例4中所述，通过显微术来证实GFP在植物组织中的定位。

结果

进行使用烟草叶的几个瞬时测定法。在瞬时表达后烟草叶提取物的免疫印迹分析证实，GFP蛋白从两种对照构建体(C1和C2)中产生，并且与28kDa经细菌表达的GFP的大小相同(图14F)。此外，C2构建体产生另一种略微更大的蛋白质，其相应于GFP加上液泡靶向序列(V)。GFP-抗体在来自表达MGEV-7和MGEV-10的叶的提取物中检测出～50kDa和28kDa的蛋白质。如对于由MGEV编码的未加工的产物所预期的，50kDa蛋白质也与NaPI抗体结合。相应于游离GFP的28kDa蛋白质的存在与加工MGEV中的连接体从而释放独个PI和GFP结构域相一致。

由MGEV-7在棉花叶的表皮细胞中瞬时表达而产生的GFP定位于液泡中(实施例4，图10E)。这与由构建体MGEV-10产生的GFP荧光形成对比，所述构建体MGEV-10与MGEV-7相同，除了液泡靶向肽(V)被删除外。从MGEV-10的瞬时表达导致GFP荧光的细胞外定位(实施例4，图10F)。

当在本氏烟草的叶中瞬时表达MGEV-10时，GFP也被导向细胞外。图14B、C、D和E显示了当在本氏烟草中表达MGEV-10以及仅编码GFP和信号肽的对照构建体(C1)时所获得的共聚焦图像。这两种构建体都缺乏液泡靶向序列(V)，因此GFP被分泌到表皮细胞和叶肉细胞外部并且不被导向液泡。

结果证实并增强了在实施例4中获得的那些。观察到GFP的液泡靶向，其与靶向序列直接附着至GFP蛋白还是附着至未加工的MGEV蛋白质无关。

实施例7

具有一个含CTPP的防卫素和三个马铃薯2型PIs的MGEV的构建和表达

这个实施例中描述的MGEV(MGEV-11)具有如下图示的结构：

(还可参见图16A)。

基本上如对于MGEV-7(实施例4)所描述的，来构建表达防卫素和三个马铃薯2型PI′s的MGEV，除了NaD1防卫素包括C-末端酸性肽尾巴外。将NaD1CTPP(SEQ ID NO：14，氨基酸26-105)插入至多用途载体pRR21(实施例4)的Xba1位点中，从而产生MGEV-11。然后，将MGEV-11插入pBIN19中，从而产生载体pHEX 42，在图15中图示。

在棉花子叶中的瞬时表达

如实施例2中所述，在使用棉花子叶的瞬时测定法中测定pHEX42的表达。

蛋白质检测

如实施例4中所述，通过ELISA和免疫印迹来测定蛋白质表达。结果

通过ELISA在用pHEX42转染的棉花子叶中检测出NaPI(图16B)和NaD1(图16C)。使用NaPI抗体的免疫印迹分析证实，存在前体蛋白和经加工的NaPI 6 kDa肽(图16D)。通过NaD1抗体也可以检测出前体蛋白和NaD1蛋白(图16E)。该经加工的蛋白质具有关于成熟的NaD1蛋白的正确大小(～6kDa)，这表明CTPP尾巴已进行了正确加工(图16E)。

结果证明了，除了MGEV的液泡靶向序列外，表达并正确加工了具有其自身的液泡靶向序列(CTPP)的NaD1。

实施例8

具有两个1型PIs和三个马铃薯2型PIs的MGEV的构建和表达

这个实施例中描述的MGEV具有如下图示的结构：

(参见图18A)。

使用pSP2(实施例6)来构建表达两个马铃薯1型PIs和三个马铃薯2型PI′s的MGEV。如实施例5中所述，产生Pot 1A二聚体，并插入pSP2中，从而产生MGEV-12。然后将MGEV-12插入pBIN19中，从而产生载体pHEX 33，在图17中图示。

在棉花子叶中的瞬时表达

如实施例2中所述，在使用棉花子叶的瞬时测定法中测定pHEX33的表达。

蛋白质检测

通过ELISA来测定蛋白质表达。

结果

通过ELISA在用pHEX 33转染的棉花子叶中检测出NaPI(图18B)和Pot 1A(图18C)。Pot 1A的表达是显著的，因为在瞬时测定法中无法检测出使用pHEX29(其仅具有1个拷贝的该基因)的Pot 1A表达(数据未显示)。

结果表明，与其他蛋白质共同一致地，Pot1A在MGEV中进行表达并进行正确加工。

蛋白质检测

如实施例3中所述，通过ELISA来测定蛋白质表达。

结果

通过ELISA在用pHEX39转染的棉花子叶中检测出NaPI(图20B)和NaD1(图20C)。

结果证实了使用MGEV来同时表达多个植物保护蛋白质的价值。

实施例10

具有两个1型PIs和两个马铃薯2型PIs的线性MGEV的构建和表达

这个实施例中描述的MGEV具有如下图示的结构：

S-T1-Pot 1A-Pot1A-C1-V

(参见图22A)。

基本上如对于MGEV-8(实施例2)所描述的，来构建表达两个马铃薯1型PIs和两个马铃薯2型PI′s的线性MGEV，除了插入两个Pot1As外。如实施例5中所述，通过PCR重叠来产生Pot 1A-Pot 1A二聚体，并插入线性多用途载体pSP1(实施例2)中，从而产生MGEV-14。然后，将MGEV-14插入pBIN19中，从而产生载体pHEX48，在图21中图示。

在棉花子叶中的瞬时表达

如实施例2中所述，在使用棉花子叶的瞬时测定法中测定pHEX48的表达。

蛋白质检测

如实施例2中所述，通过ELISA和免疫印迹来测定蛋白质表达。结果

通过ELISA在用pHEX 48转染的棉花子叶中检测出NaPI(图22B)和Pot 1A(图22C)。Pot 1A的表达水平类似于在用pHEX 33转染的棉花子叶中产生的那些，所述pHEX 33还包含2个拷贝的Pot 1A基因(实施例8)。使用NaPI抗体的免疫印迹分析证实，存在经加工的NaPI6kDa肽(图22D)。

结果证明，对于表达多种蛋白质而言，线性MGEV蛋白质的表达至少与环状形式一样有效。MGEV功效不依赖于“抱握”蛋白质的存在。

实施例11

具有一个防卫素和两个马铃薯2型PIs的线性MGEV的构建和表达

这个实施例中描述的MGEV具有如下图示的结构：

S-T1-NaD1-C1-V

(参见图24A)。

基本上如对于MGEV-8(实施例2)所描述的，来构建表达一个防卫素(NaD1)(SEQ ID NO：14，氨基酸26-72)和两个马铃薯2型PI′s(T1和C1)的线性MGEV，除了插入防卫素(NaD1)代替Pot 1A外。将NaD1(在实施例3中描述的)插入线性多用途载体pSP1(实施例2)中，从而产生MGEV-15。然后，将MGEV-15插入pBIN19中，从而产生载体pHEX47，在图23中图示。

在棉花子叶中的瞬时表达

如实施例2中所述，在使用棉花子叶的瞬时测定法中测定pHEX47的表达。

蛋白质检测

如实施例3中所述，通过ELISA和免疫印迹来测定蛋白质表达。

结果

通过ELISA在用pHEX 47转染的棉花子叶中检测出NaPI(图24B)和NaD1(图24C)。使用NaPI抗体的免疫印迹分析证实，存在经加工的NaPI 6kDa肽(图24D)。

结果进一步证明了使用线性MGEV来同时表达具有不等功能的多种蛋白质的功效，所述线性MGEV缺乏用于环化所表达的多蛋白的编码序列。

实施例12

具有两个马铃薯1型PIs的线性MGEV的构建和表达

这个实施例中描述的MGEV具有如下图示的结构：

S-ProPot 1A-Pot 1A

(参见图26A)。

通过剪接重叠PCR来构建表达两个马铃薯1型PIs的线性MGEV。经PCR扩增由Pot 1A信号序列、前结构域(SEQ ID NO：20)(Pro)和成熟的结构域Pot1A(SEQ ID NO：11，本文)组成的第一个片段，其具有5′Bam H1位点和3′连接体序列。经PCR扩增由成熟的Pot 1A组成的第二个片段，其具有5′连接体序列和终止密码子(TAA)，随后为在3′末端处的Sal 1位点。使这两个PCR片段彼此退火，并延伸8个循环；随后添加外部引物以PCR扩增完整序列。然后，将S-ProPot1A-Pot 1A片段插入pAM9中，从而产生MGEV-16。然后，将MGEV-16插入pBIN19中，从而产生载体pHEX35，在图25中图示。

在棉花子叶中的瞬时表达

如实施例2中所述，在使用棉花子叶的瞬时测定法中测定pHEX35的表达。

蛋白质检测

如实施例1中所述，通过ELISA来测定Pot 1A的表达，除了使用不同的Pot 1A抗体外。该抗体通过使用经细菌表达的C1-PotIA二聚体(C1结构域来自NaPIii(SEQ ID NO：1，aa 54-106))来产生，并且可以检测C1和Pot1A蛋白。这种抗体在检测Pot 1A方面比实施例1和2中所述的Pot 1A特异性抗体更佳，然而，该C1-Pot 1A抗体只有当在不存在NaPI肽的情况下表达Pot 1A蛋白时才可以使用。初级C1-Pot 1A抗体和次级C1-Pot 1A-生物素抗体以100ng/孔进行使用。

如实施例1中所述，并采用实施例2中所述的修饰，进行免疫印迹以检测Pot 1A。初级C1-Pot 1A抗体从1mg/ml原液以1∶2,000的稀释度进行稀释，和二抗(缀合至辣根过氧化物酶的山羊抗兔IgG)以1∶50,000的稀释度进行使用。

结果

通过ELISA在用pHEX 35转染的棉花子叶中检测出Pot 1A(图26B)。与由单个拷贝的Pot 1A基因产生的Pot 1A表达相比较，使用包含两个拷贝的Pot 1A基因的这种线性构建体，Pot 1A的表达更高(图26B)。为了比较，使用载体pHEX6(参见公开申请WO2004/094630，实施例6)来测量作为单基因(非MGEV)的Pot 1A的表达。CaMV 35S启动子用于驱动在pHEX6和pHEX35中的表达。

使用C1-Pot 1A抗体的免疫印迹分析证实，存在Pot 1A蛋白(图26C)。在该样品中检测出两个其他Pot 1A特异性条带。在约20kDa处的条带可能是前体蛋白。在约49kDa处的条带可能是Pot 1A成熟蛋白质的聚集体，因为已报道了来自马铃薯块茎的天然PotI蛋白形成寡聚体。

结果进一步确证了Pot1A在MGEV样结构中的表达，并且显示出，作为液泡靶向序列的在Pot 1上的前肽通过蛋白水解被去除。

实施例13

具有一个马铃薯2型PI和一个防卫素的线性MGEV的构建和表达

这个实施例中描述的MGEV具有如下图示的结构：

S-T1-NaD1CTPP

(参见图28A)。

构建表达一个马铃薯2型PI(T1)和一个具有C-末端尾巴(CTPP)的防卫素(NaD1)的线性MGEV。经PCR扩增具有5′Xba 1位点和3′Sal1位点的NaD1CTPP(参见实施例7)。将该片段插入pSP1(其中C1-V被去除)的Xba1-Sal 1切割位点中，从而产生MGEV-17。然后，将MGEV-17插入pBIN19中，从而产生载体pHEX 41，在图27中图示。

在棉花子叶中的瞬时表达

如实施例2中所述，在使用棉花子叶的瞬时测定法中测定pHEX41的表达。

蛋白质检测

如实施例3中所述，通过ELISA和免疫印迹来测定NaD1的表达。

结果

通过ELISA在用pHEX41转染的棉花子叶中检测出NaPI和NaD1(图28B、C和D)。当两者都由35S启动子驱动时，在瞬时棉花测定法中，从这种线性构建体(其中NaD1 CTPP与T1连接)中的NaD1的表达显著高于单独的NaD1 CTPP的表达(pHEX3)(参见U.S.7,041,877)(图28B)。CTPP将NaD1靶向液泡，在那里它经蛋白水解而被去除，从而释放成熟的～6kDa NaD1。

使用NaP I抗体的免疫印迹分析证实，存在经加工的NaPI 6kDa肽(图28E)。NaD1抗体检测出16kDa前体和成熟的NaD1～6kDa蛋白质，这证实了T1和NaD1之间的连接体的正确加工以及CTPP尾巴的正确加工(图28D)。

实施例14

具有一个1类防卫素和一个2类防卫素的线性MGEV的构建和表达

这个实施例中描述的MGEV具有如下图示的结构：

S-NaD2-NaD1 CTPP。

基本上如实施例13中所述，通过剪接重叠PCR来构建表达一个1类防卫素(NaD2)和一个2类防卫素(含C-末端尾巴的NaD1)的线性MGEV，除了使用两个防卫素外。NaD2描述于实施例10中，和NaD1-CTPP描述于实施例7中。第一个片段由信号序列和NaD2的编码序列组成，第二个片段由成熟的NaD1和来自NaD1的CTPP尾巴组成。在PCR后，将完全片段(S-NaD2-NaD1 CTPP)插入pAM9中，从而产生MGEV-18。然后，将MGEV-18插入pBIN19中，从而产生载体pHEX52，在图29中图示。MGEV-18的图示显示于图30A中。

在棉花子叶中的瞬时表达

如实施例2中所述，在使用棉花子叶的瞬时测定法中测定pHEX52的表达。

蛋白质检测

如实施例3中所述，通过ELISA来测定NaD1的表达。

结果

通过ELISA在用pHEX52转染的棉花子叶中检测出NaD1(图30B)。结果证实，在不存在任何2型PI的情况下，可以在线性MGEV中表达多个不同的蛋白质。

实施例15

具有一个1类防卫素和一个2类防卫素(删除了CTPP)的线性MGEV的构建和表达

这个实施例中描述的MGEV具有如下图示的结构：

S-NaD2-NaD1

如实施例15中所述，构建表达一个1类防卫素(NaD2)和一个2类防卫素(NaD1)(但缺乏CTPP尾巴)的线性MGEV，除了CTPP尾巴不被扩增外。将S-NaD2-NaD1片段插入pAM9中，从而产生MGEV-19。然后，将MGEV-19插入pBIN19中，从而产生载体pHEX51，在图31中图示。MGEV-19的图示显示于图32A中。

在棉花子叶中的瞬时表达

如实施例2中所述，在使用棉花子叶的瞬时测定法中测定pHEX51的表达。

蛋白质检测

如实施例3中所述，通过ELISA来测定NaD1的表达。

结果

通过ELISA在用pHEX51转染的棉花子叶中检测出NaD1(图32B)。

实施例16

具有一个β-葡糖醛酸糖苷酶GUS和两个马铃薯2型PIs的线性MGEV的构建和表达

这个实施例中描述的MGEV具有如下图示的结构：

S-T1-GUSC1-V

基本上如对于MGEV-8(实施例2)所描述的，来构建表达一个GUS和两个马铃薯2型PI′s(T1和C1)的线性MGEV，除了插入编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的DNA序列代替Pot 1A外。GUS是一种具有约68,000Da的分子量的大肠杆菌酶，并由gusA基因编码，SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19分别为GUS的DNA和氨基酸序列。从二元载体pBI121(Invitrogen)中PCR扩增出在每个末端处具有Xba 1位点的GUS，并插入线性多用途载体pSP1(实施例2)中，从而产生MGEV-20。然后，将MGEV-20插入pBIN19中，从而产生载体pHEX58，在图33中图示。在这个构建体中，在GUS和C1之间不存在连接体。表达和加工没有受到不利的影响。

在棉花子叶中的瞬时表达

如实施例2中所述，在使用棉花子叶的瞬时测定法中测定pHEX58的表达。

蛋白质检测

如实施例1中所述，通过ELISA来测定NaPI的表达。

如实施例1中所述，并采用实施例2中所述的修饰，进行免疫印迹分析以检测NaPIs。

结果

通过ELISA在用pHEX58转染的棉花子叶中检测出NaPI(图34B)。

使用NaPI抗体的免疫印迹分析证实，存在成熟的NaPI肽(图34C)。

结果证明，具有至少68kDa的蛋白质可以在MGEV进行表达并进行正确加工。

如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括式的或开放式的，和不排除另外的、未描述的元素或方法步骤。如本文所使用的，“由......组成”排除了在该权利要求要素中未指定的任何元素、步骤或成分。如本文所使用的，“基本上由......组成”不排除实质上不影响该权利要求的基本和新型特征的材料或步骤。在本文中术语“包含”的任何描述，特别是在组合物的组分的描述或装置的元件的描述中，应当被理解为包括基本上由所述组分或元素组成的那些组合物和方法，以及由所述组分或元素组成的那些组合物和方法。在本文中适当地举例说明性地描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实施。

将已使用的术语和表述用作描述性而非限制性的术语，并且不希望此类术语和表述的使用排除了所显示和描述的特征的任何等价物或其部分，但应认识到各种修饰在所要求保护的本发明的范围内都是可能的。因此，应当理解，尽管本发明已通过优选的实施方案和任选的特征而进行了具体公开，但本领域技术人员可以采取本文公开的概念的修饰和变化形式，并且此类修饰和变化形式被视为在由所附权利要求定义的本发明的范围内。

一般而言，本文使用的术语和短语具有其在本领域中所公认的含义，这可以通过参考本领域技术人员已知的标准教科书、期刊参考文献和上下文而找到。提供了下述定义以澄清其在本发明的背景中的具体用途。

说明书中提及的所有专利和出版物通过提及而合并，至与本公开内容不相矛盾的程度，并且那些参考文献反映了本发明所属领域的技术人员的技术水平。

本领域技术人员会容易地意识到，本发明完全适合于实现所提及的目的并获得所提及的结果和优点，以及本发明中所固有的那些。在本文中作为优选实施方案的目前代表而描述的方法、组分、材料和尺度是作为例子而提供的，并不希望作为对于本发明的范围的限制。本领域技术人员将会想起在本发明的精神内所包括的其中变化和其他用途，它们包括在权利要求书的范围内。

尽管本文的描述包括某些具体信息和例子，但它们不应被解释为限制了本发明的范围，而应被解释为仅仅提供了本发明的某些实施方案的举例说明。因此，另外的实施方案也在本发明的范围内，并且在下述权利要求书的范围内。

表2

实施例	MGEV	(图)	载体	(图)
实施例	MGEV	(图)	载体	(图)	1	MGEV 5	(4A)	pHEX 29	(3)
2	MGEV 8	(6A)	pHEX 56	(5)	1	MGEV 5	(4A)	pHEX 29	(3)
2	MGEV 8	(6A)	pHEX 56	(5)	3	MGEV 6	(8A)	pHEX 31	(7)
4	MGEV 7	(10A)	pHEX 46	(9)	3	MGEV 6	(8A)	pHEX 31	(7)
4	MGEV 7	(10A)	pHEX 46	(9)	5	MGEV 9	(12A)	pHEX 55	(11)
6	MGEV 10	(14A)	pHEX 45	(13)	5	MGEV 9	(12A)	pHEX 55	(11)
6	MGEV 10	(14A)	pHEX 45	(13)	7	MGEV 11	(16A)	pHEX 42	(15)
8	MGEV 12	(18A)	pHEX 33	(17)	7	MGEV 11	(16A)	pHEX 42	(15)
8	MGEV 12	(18A)	pHEX 33	(17)	9	MGEV 13	(20A)	pHEX 39	(19)
10	MGEV 14	(22A)	pHEX 48	(21)	9	MGEV 13	(20A)	pHEX 39	(19)
10	MGEV 14	(22A)	pHEX 48	(21)	11	MGEV 15	(24A)	pHEX 47	(23)
12	MGEV 16	(26A)	pHEX 35	(25)	11	MGEV 15	(24A)	pHEX 47	(23)
12	MGEV 16	(26A)	pHEX 35	(25)	13	MGEV 17	(28A)	pHEX 41	(27)
14	MGEV 18	(30A)	pHEX 52	(29)	13	MGEV 17	(28A)	pHEX 41	(27)
14	MGEV 18	(30A)	pHEX 52	(29)	15	MGEV 19	(32A)	pHEX 51	(31)
16	MGEV 20	(34A)	pHEX 58	(33)	15	MGEV 19	(32A)	pHEX 51	(31)

表3.序列ID列表

SEQ.ID NO：			(图)
SEQ.ID NO：			(图)	1	氨基酸	Na PI-ii	(图1)
2	氨基酸	Na PI-iv	(图1)	1	氨基酸	Na PI-ii	(图1)
2	氨基酸	Na PI-iv	(图1)	3	氨基酸	花烟草T1蛋白酶抑制剂	(图2)
4	氨基酸	花烟草T5	(图2)	3	氨基酸	花烟草T1蛋白酶抑制剂	(图2)
4	氨基酸	花烟草T5	(图2)	5	氨基酸	连接体肽	(图2)
6	DNA	MGEV 5	(表1)	5	氨基酸	连接体肽	(图2)
6	DNA	MGEV 5	(表1)	7	DNA	引物	(实施例1)
8	DNA	引物	(实施例1)	7	DNA	引物	(实施例1)
8	DNA	引物	(实施例1)	9	DNA	引物	(实施例1)
10	DNA	引物	(实施例1)	9	DNA	引物	(实施例1)
10	DNA	引物	(实施例1)	11	氨基酸	Pot 1A	(实施例1)
12	氨基酸	MGEV5	(表1)	11	氨基酸	Pot 1A	(实施例1)
12	氨基酸	MGEV5	(表1)	13	氨基酸	绿色荧光蛋白	(实施例4)
14	氨基酸	N_aD₁		13	氨基酸	绿色荧光蛋白	(实施例4)
14	氨基酸	N_aD₁		15	DNA	N_aD₂
16	氨基酸	N_aD₂		15	DNA	N_aD₂
16	氨基酸	N_aD₂		17	氨基酸	连接体共有序列
18	DNA	β-葡糖醛酸糖苷酶		17	氨基酸	连接体共有序列
18	DNA	β-葡糖醛酸糖苷酶		19	氨基酸	β-葡糖醛酸糖苷酶
20	氨基酸	Pot1A信号序列前结构域		19	氨基酸	β-葡糖醛酸糖苷酶

序列表

<110>Hexima Limited

Anderson，Marilyn

Heath，Robyn

<120>多基因表达运载体

<130>30222500/EJH/AJH

<150>US 60803206

<151>2006-05-25

<160>20

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>397

<212>PRT

<213>花烟草

<400>1

Met Ala Val His Arg Val Ser Phe Leu Ala Leu Leu Leu Leu Phe Gly

1 5 10 15

Met Ser Leu Leu Val Ser Asn Val Glu His Ala Asp Ala Lys Ala Cys

20 25 30

Thr Leu Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Val Cys Pro Arg Ser

35 40 45

Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr

50 55 60

Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly

65 70 75 80

Glu Ser Asp Pro Arg Asn Pro Lys Ala Cys Thr Leu Asn Cys Asp Pro

85 90 95

Arg Ile Ala Tyr Gly Val Cys Pro Arg Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp

100 105 110

Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys Lys Tyr Phe

115 120 125

Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg Asn

130 135 140

Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Ile

145 150 155 160

Cys Pro Leu Ala Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys

165 170 175

Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe

180 185 190

Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Lys Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg

195 200 205

Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu

210 215 220

Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly

225 230 235 240

Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser

245 250 255

Asp Pro Lys Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile

260 265 270

Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile

275 280 285

Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp

290 295 300

Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg Asn Pro Lys

305 310 315 320

Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro

325 330 335

Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala

340 345 350

Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Ile Cys

355 360 365

Glu Gly Glu Ser Glu Tyr Ala Ser Lys Val Asp Glu Tyr Val Gly Glu

370 375 380

Val Glu Asn Asp Leu Gln Lys Ser Lys Val Ala Val Ser

385 390 395

<210>2

<211>281

<212>PRT

<213>花烟草

<400>2

Met Ala Ala His Arg Val Ser Phe Leu Ala Leu Leu Leu Leu Phe Gly

1 5 10 15

Met Ser Leu Leu Val Ser Asn Val Glu His Ala Asp Ala Lys Ala Cys

20 25 30

Thr Leu Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Val Cys Pro Arg Ser

35 40 45

Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr

50 55 60

Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly

65 70 75 80

Glu Ser Asp Pro Arg Asn Pro Lys Ala Cys Thr Leu Asn Cys Asp Pro

85 90 95

Arg Ile Ala Tyr Gly Val Cys Pro Arg Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp

100 105 110

Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys Lys Tyr Phe

115 120 125

Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Lys Asn

130 135 140

Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Ile

145 150 155 160

Cys Pro Leu Ser Glu Glu Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys

165 170 175

Cys Ala Gly Lys Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe

180 185 190

Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg

195 200 205

Asn Cys Asp Gly Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu

210 215 220

Lys Lys Asn Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly

225 230 235 240

Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Ile Cys Glu Gly Glu Ser

245 250 255

Glu Tyr Ala Ser Lys Val Asp Glu Tyr Val Gly Glu Val Glu Asn Asp

260 265 270

Leu Gln Lys Ser Lys Val Ala Val Ser

275 280

<210>3

<211>53

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的构建体：T1肽序列

<400>3

Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys Lys Tyr

1 5 10 15

Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg

20 25 30

Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly

35 40 45

Ile Cys Pro Leu Ala

50

<210>4

<211>53

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的构建体：T5肽序列

<400>4

Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys Lys Tyr

1 5 10 15

Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly

35 40 45

Ile Cys Pro Leu Ser

50

<210>5

<211>5

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的构建体：连接体肽序列

<400>5

Glu Glu Lys Lys Asn

1 5

<210>6

<211>948

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的构建体：MGEV-5序列

<400>6

ggatccatgg ctgctcacag agttagtttc cttgctctcc tcctcttatt tggaatgtct 60

ctgcttgtaa gcaatgtgga acatgcagat gccaaggctt gtaccttaaa ctgtgatcca 120

agaattgcct atggagtttg cccgcgttca gaagaaaaga agaatctcga ggatcggata 180

tgcaccaact gttgtgcagg cacgaagggt tgtaagtact tcagtgatga tggaactttt 240

gtttgtgaag gagagtctga tcctagaaat ccaaaggctt gtcctcggaa ttgcgatcca 300

agaattgcct atgggatttg cccactttca gaagaaaaga agaattctag aaaggaatcg 360

gaatctgaat cttggtgcaa aggaaaacaa ttctggccag aacttattgg tgtaccaaca 420

aagcttgcta aggaaataat tgagaaggaa aatccatcca taaatgatgt tccaataata 480

ttgaatggca ctccagtccc agctgatttt agatgtaatc gagttcgtct ttttgataac 540

attttgggtg atgttgtaca aattcctagg gtggctgaag aaaagaagaa ttctagagat 600

cggatatgca ccaactgttg cgcaggcacg aagggttgta agtacttcag tgatgatgga 660

acttttgttt gtgaaggaga gtctgatcct agaaatccaa aggcttgtac cttaaactgt 720

gatccaagaa ttgcctatgg agtttgcccg cgttcagaag aaaagaagaa tctcgaggat 780

cggatatgca ccaattgttg cgcaggcaag aagggctgta agtactttag tgatgatgga 840

acttttattt gtgaaggaga atctgaatat gccagcaaag tggatgaata tgttggtgaa 900

gtggagaatg atctccagaa gtccaaggtt gctgtttcct aagtcgac 948

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的构建体：可用作引物的寡核苷酸

<400>7

gtggagaggc tattcggcta tgac 24

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的构建体：可用作引物的寡核苷酸

<400>8

cgggtagcca acgctatgtc c 21

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的构建体：可用作引物的寡核苷酸

<400>9

gctctagaaa ggaatcggaa tctgaatc 28

<210>10

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的构建体：可用作引物的寡核苷酸

<400>10

gctctagaat tcttcttttc ttcagccacc ctaggaattt g 41

<210>11

<211>67

<212>PRT

<213>马铃薯(Solanum tuberosum)

<400>11

Lys Glu Ser Glu Ser Glu Ser Trp Cys Lys Gly Lys Gln Phe Trp Pro

1 5 10 15

Glu Leu Gly Val Pro Thr Lys Leu Ala Lys Glu Glu Lys Glu Asn Pro

20 25 30

Ser Asn Asp Val Pro Leu Asn Gly Thr Pro Val Pro Ala Asp Phe Arg

35 40 45

Cys Asn Arg Val Arg Leu Phe Asp Asn Leu Gly Asp Val Val Gln Pro

50 55 60

Arg Val Ala

65

<210>12

<211>313

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的构建体：MGEV-5的序列

<400>12

Gly Ser Met Ala Ala His Arg Val Ser Phe Leu Ala Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Phe Gly Met Ser Leu Leu Val Ser Asn Val Glu His Ala Asp Ala Lys

20 25 30

Ala Cys Thr Leu Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Val Cys Pro

35 40 45

Arg Ser Glu Glu Lys Lys Asn Leu Glu Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys

50 55 60

Cys Ala Gly Thr Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe

65 70 75 80

Val Cys Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg Asn Pro Lys Ala Cys Pro Arg

85 90 95

Asn Cys Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Ile Cys Pro Leu Ser Glu Glu

100 105 110

Lys Lys Asn Ser Arg Lys Glu Ser Glu Ser Glu Ser Trp Cys Lys Gly

115 120 125

Lys Gln Phe Trp Pro Glu Leu Ile Gly Val Pro Thr Lys Leu Ala Lys

130 135 140

Glu Ile Ile Glu Lys Glu Asn Pro Ser Ile Asn Asp Val Pro Ile Ile

145 150 155 160

Leu Asn Gly Thr Pro Val Pro Ala Asp Phe Arg Cys Asn Arg Val Arg

165 170 175

Leu Phe Asp Asn Ile Leu Gly Asp Val Val Gln Ile Pro Arg Val Ala

180 185 190

Glu Glu Lys Lys Asn Ser Arg Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala

195 200 205

Gly Thr Lys Gly Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Val Cys

210 215 220

Glu Gly Glu Ser Asp Pro Arg Asn Pro Lys Ala Cys Thr Leu Asn Cys

225 230 235 240

Asp Pro Arg Ile Ala Tyr Gly Val Cys Pro Arg Ser Glu Glu Lys Lys

245 250 255

Asn Leu Glu Asp Arg Ile Cys Thr Asn Cys Cys Ala Gly Lys Lys Gly

260 265 270

Cys Lys Tyr Phe Ser Asp Asp Gly Thr Phe Ile Cys Glu Gly Glu Ser

275 280 285

Glu Tyr Ala Ser Lys Val Asp Glu Tyr Val Gly Glu Val Glu Asn Asp

290 295 300

Leu Gln Lys Ser Lys Val Ala Val Ser

305 310

<210>13

<211>238

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的构建体：可溶性的、经修饰的绿色荧光蛋白

<400>13

Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe

50 55 60

Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser

195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

210 215 220

Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210>14

<211>105

<212>PRT

<213>花烟草

<400>14

Met Ala Arg Ser Leu Cys Phe Met Ala Phe Ala Ile Leu Ala Met Met

1 5 10 15

Leu Phe Val Ala Tyr Glu Val Gln Ala Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser

20 25 30

Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala

35 40 45

Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly His Cys Ser Lys Ile Leu Arg

50 55 60

Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys Val Phe Asp Glu Lys Met Thr Lys

65 70 75 80

Thr Gly Ala Glu Ile Leu Ala Glu Glu Ala Lys Thr Leu Ala Ala Ala

85 90 95

Leu Leu Glu Glu Glu Ile Met Asp Asn

100 105

<210>15

<211>237

<212>DNA

<213>花烟草

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(234)

<400>15

atg gca aac tcc atg cgc ttc ttt gct act gtg tta ctt cta aca ttg 48

Met Ala Asn Ser Met Arg Phe Phe Ala Thr Val Leu Leu Leu Thr Leu

1 5 10 15

ctt ttc atg gct aca gag atg gga cca atg aca att gca gag gca aga 96

Leu Phe Met Ala Thr Glu Met Gly Pro Met Thr Ile Ala Glu Ala Arg

20 25 30

act tgc gag tct cag agc cac cgt ttc aag gga cca tgc gca aga gat 144

Thr Cys Glu Ser Gln Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Ala Arg Asp

35 40 45

agc aac tgt gcc acc gtc tgt ttg aca gaa gga ttt tcc ggt ggc gac 192

Ser Asn Cys Ala Thr Val Cys Leu Thr Glu Gly Phe Ser Gly Gly Asp

50 55 60

tgc cgt gga ttc cgc cgc cgt tgt ttc tgt acc agc cct tgc taa 237

Cys Arg Gly Phe Arg Arg Arg Cys Phe Cys Thr Ser Pro Cys

65 70 75

<210>16

<211>78

<212>PRT

<213>花烟草

<400>16

Met Ala Asn Ser Met Arg Phe Phe Ala Thr Val Leu Leu Leu Thr Leu

1 5 10 15

Leu Phe Met Ala Thr Glu Met Gly Pro Met Thr Ile Ala Glu Ala Arg

20 25 30

Thr Cys Glu Ser Gln Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Ala Arg Asp

35 40 45

Ser Asn Cys Ala Thr Val Cys Leu Thr Glu Gly Phe Ser Gly Gly Asp

50 55 60

Cys Arg Gly Phe Arg Arg Arg Cys Phe Cys Thr Ser Pro Cys

65 70 75

<210>17

<211>5

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>合成的构建体：在MGEV多肽中的连接体肽的共有序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(2)

<223>在位置1和2处，Xaa可以为谷氨酸或天冬氨酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(4)

<223>在位置3和4处，Xaa可以为赖氨酸或精氨酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>在位置5处，Xaa可以为天冬酰胺或谷氨酰胺

<400>17

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210>18

<211>1812

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>18

atgttacgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60

ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120

gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180

cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240

ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300

aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360

tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg 420

cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac 480

ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg 540

aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg 600

tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat 660

caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac 720

ctctggcaac cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca 780

gagtgtgata tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag 840

ttcctgatta accacaaacc gttctacttt actggctttg gtcgtcatga agatgcggac 900

ttgcgtggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt aatggactgg 960

attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg 1020

gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct 1080

ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc 1140

aacggggaaa ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa 1200

aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaaggt 1260

gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg 1320

atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt 1380

gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg 1440

gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt 1500

atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg 1560

tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc 1620

agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata 1680

ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg 1740

gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga 1800

ggcaaacaat ga 1812

<210>19

<211>603

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>19

Met Leu Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Arg Glu Ile Lys Lys Leu Asp

1 5 10 15

Gly Leu Trp Ala Phe Ser Leu Asp Arg Glu Asn Cys Gly Ile Asp Gln

20 25 30

Arg Trp Trp Glu Ser Ala Leu Gln Glu Ser Arg Ala Ile Ala Val Pro

35 40 45

Gly Ser Phe Asn Asp Gln Phe Ala Asp Ala Asp Ile Arg Asn Tyr Ala

50 55 60

Gly Asn Val Trp Tyr Gln Arg Glu Val Phe Ile Pro Lys Gly Trp Ala

65 70 75 80

Gly Gln Arg Ile Val Leu Arg Phe Asp Ala Val Thr His Tyr Gly Lys

85 90 95

Val Trp Val Asn Asn Gln Glu Val Met Glu His Gln Gly Gly Tyr Thr

100 105 110

Pro Phe Glu Ala Asp Val Thr Pro Tyr Val Ile Ala Gly Lys Ser Val

115 120 125

Arg Ile Thr Val Cys Val Asn Asn Glu Leu Asn Trp Gln Thr Ile Pro

130 135 140

Pro Gly Met Val Ile Thr Asp Glu Asn Gly Lys Lys Lys Gln Ser Tyr

145 150 155 160

Phe His Asp Phe Phe Asn Tyr Ala Gly Ile His Arg Ser Val Met Leu

165 170 175

Tyr Thr Thr Pro Asn Thr Trp Val Asp Asp Ile Thr Val Val Thr His

180 185 190

Val Ala Gln Asp Cys Asn His Ala Ser Val Asp Trp Gln Val Val Ala

195 200 205

Asn Gly Asp Val Ser Val Glu Leu Arg Asp Ala Asp Gln Gln Val Val

210 215 220

Ala Thr Gly Gln Gly Thr Ser Gly Thr Leu Gln Val Val Asn Pro His

225 230 235 240

Leu Trp Gln Pro Gly Glu Gly Tyr Leu Tyr Glu Leu Cys Val Thr Ala

245 250 255

Lys Ser Gln Thr Glu Cys Asp Ile Tyr Pro Leu Arg Val Gly Ile Arg

260 265 270

Ser Val Ala Val Lys Gly Glu Gln Phe Leu Ile Asn His Lys Pro Phe

275 280 285

Tyr Phe Thr Gly Phe Gly Arg His Glu Asp Ala Asp Leu Arg Gly Lys

290 295 300

Gly Phe Asp Asn Val Leu Met Val His Asp His Ala Leu Met Asp Trp

305 310 315 320

Ile Gly Ala Asn Ser Tyr Arg Thr Ser His Tyr Pro Tyr Ala Glu Glu

325 330 335

Met Leu Asp Trp Ala Asp Glu His Gly Ile Val Val Ile Asp Glu Thr

340 345 350

Ala Ala Val Gly Phe Asn Leu Ser Leu Gly Ile Gly Phe Glu Ala Gly

355 360 365

Asn Lys Pro Lys Glu Leu Tyr Ser Glu Glu Ala Val Asn Gly Glu Thr

370 375 380

Gln Gln Ala His Leu Gln Ala Ile Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asp Lys

385 390 395 400

Asn His Pro Ser Val Val Met Trp Ser Ile Ala Asn Glu Pro Asp Thr

405 410 415

Arg Pro Gln Gly Ala Arg Glu Tyr Phe Ala Pro Leu Ala Glu Ala Thr

420 425 430

Arg Lys Leu Asp Pro Thr Arg Pro Ile Thr Cys Val Asn Val Met Phe

435 440 445

Cys Asp Ala His Thr Asp Thr Ile Ser Asp Leu Phe Asp Val Leu Cys

450 455 460

Leu Asn Arg Tyr Tyr Gly Trp Tyr Val Gln Ser Gly Asp Leu Glu Thr

465 470 475 480

Ala Glu Lys Val Leu Glu Lys Glu Leu Leu Ala Trp Gln Glu Lys Leu

485 490 495

His Gln Pro Ile Ile Ile Thr Glu Tyr Gly Val Asp Thr Leu Ala Gly

500 505 510

Leu His Ser Met Tyr Thr Asp Met Trp Ser Glu Glu Tyr Gln Cys Ala

515 520 525

Trp Leu Asp Met Tyr His Arg Val Phe Asp Arg Val Ser Ala Val Val

530 535 540

Gly Glu Gln Val Trp Asn Phe Ala Asp Phe Ala Thr Ser Gln Gly Ile

545 550 555 560

Leu Arg Val Gly Gly Asn Lys Lys Gly Ile Phe Thr Arg Asp Arg Lys

565 570 575

Pro Lys Ser Ala Ala Phe Leu Leu Gln Lys Arg Trp Thr Gly Met Asn

580 585 590

Phe Gly Glu Lys Pro Gln Gln Gly Gly Lys Gln

595 600

<210>20

<211>36

<212>PRT

<213>马铃薯

<400>20

Met Glu Ser Lys Phe Ala His Ile Ile Val Phe Phe Leu Leu Ala Thr

1 5 10 15

Ser Phe Glu Thr Leu Met Ala Arg Lys Glu Gly Asp Gly Ser Glu Val

20 25 30

Ile Lys Leu Leu

35

Claims

1.多基因表达运载体(MGEV)，其基本上由包含2-8个结构域区段D的多核苷酸组成，每个结构域编码功能蛋白质，每个结构域通过编码连接体肽的连接体(L)区段与线性序列中的下一个结构域连接，所述D和L区段都在同一个读码框中，并且所述结构域中的至少一个不是2型蛋白酶抑制剂。

2.权利要求1的MGEV，其中每个连接体具有SEQ I.D.No.17的序列。

3.权利要求1的MGEV，其进一步包含编码位于功能蛋白质的N-末端处的信号肽(S)的区段。

4.权利要求3的MGEV，其进一步包含编码液泡靶向信号肽V的区段。

5.权利要求2的MGEV，其进一步包含编码N-末端抱握肽的区段C_N和编码C-末端抱握肽的区段C_C，所述N-末端和C-末端抱握肽在翻译后通过二硫键彼此连接，从而形成具有蛋白酶抑制剂活性的单个蛋白质。

6.权利要求2的MGEV，其中所述D和L编码区段按标示为(D_kL_j)的翻译顺序进行连接，其中k是关于从1到k进行编号的每个结构域的序数，且k在2-8的范围内，并且j是关于从1到k-1进行编号的每个连接体的序数。

7.权利要求5的MGEV，其中所述C_N、D、L和C_C区段按标示为C_N-L_j-D_k-L_k+1-C_C的翻译顺序进行连接，其中k是关于从1到k进行编号的每个结构域的序数，且k在2-7的范围内，并且j是关于从1到k+1进行编号的每个连接体的序数。

8.权利要求6的MGEV，其进一步包含编码区段S，该区段编码以S-D_k-L_j这一顺序进行组合的信号肽。

9.权利要求7的MGEV，其进一步包含编码区段S，该区段编码以S-C_N-L_j-D_k-L_k+1-C_C这一顺序进行组合的信号肽。

10.权利要求6的MGEV，其进一步包含编码区段V，其中V在编码D₁-D_k中任一个的区段的任一末端处与D₁-D_k中任一个的编码区段相组合。

11.权利要求7的MGEV，其进一步包含编码区段V，其中V在编码D₁-D_k+1、C_N或C_C中任一个的区段的任一末端处与D₁-D_k+1、C_N或C_C中任一个的编码区段相组合。

12.权利要求7的MGEV，其进一步包含编码液泡转运肽的编码区段V，其中V在编码D_k、C_N或C_C中任一个的区段的任一末端处与D_k中任一个相组合。

13.MGEV表达载体，其包含携带并复制权利要求6或7的MGEV的植物转化载体，所述MGEV被插入在所述载体中的位于植物活性启动子和植物活性终止子的表达控制下的座位处。

14.植物细胞，其包含并表达由权利要求6或7的MGEV编码的蛋白质。

15.转基因植物，其由权利要求6或7的MGEV转化，并同时表达由权利要求6或7的MGEV编码的蛋白质。

16.权利要求11的多基因表达运载体(MGEV)，其按翻译顺序具有下述区段：

S-C_N-L₁-D₁-L₂-D₂-L₃-D₃-L₄-C_C-V

其中，S编码信号肽，

C_N编码N-末端抱握肽，

C_C是C-末端抱握肽，

L₁、L₂、L₃、L₄各自编码连接体肽，

D₁编码2型胰蛋白酶抑制剂，

D₂编码Pot 1A，

D₃编码2型胰凝乳蛋白酶抑制剂，和

V编码液泡靶向肽。

17.MGEV表达载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求16的MGEV。

18.权利要求10的MGEV，其按翻译顺序具有下述编码区段：

S-D₁-L₁-D₂-L₂-D₃-V

其中，S编码信号肽，

D₁编码2型胰蛋白酶抑制剂，

D₂编码Pot 1A，

D₃编码2型胰凝乳蛋白酶抑制剂，

L₁和L₂编码连接体肽，

V编码液泡靶向肽。

19.MGEV表达载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求18的MGEV。

20.权利要求11的MGEV，其按翻译顺序具有下述编码区段：

S-C_N-L₁-D₁-L₂-D₂-L₃-D₃-L₄-C_C-V

其中，S编码信号肽，

C_N编码N-末端抱握肽，

L₁、L₂、L₃和L₄各自编码连接体肽，

D₁编码2型胰蛋白酶抑制剂，

D₂编码Pot 1A，

D₃编码2型胰凝乳蛋白酶抑制剂，

V编码液泡靶向肽。

21.MGEV表达载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求20的MGEV。

22.权利要求11的MGEV，其按翻译顺序具有下述编码区段：

S-C_N-L₁-D₁-L₂-D₂-L₃-D₃-L₄-C_C-V

其中，S编码信号肽，

C_N编码N-末端抱握肽，

L₁、L₂、L₃和L₄各自编码连接体肽，

D₁编码2型胰蛋白酶抑制剂，

D₂编码绿色荧光蛋白，

D₃编码2型胰凝乳蛋白酶抑制剂，

C_C编码C-末端抱握肽，和

V编码液泡靶向肽。

23.MGEV表达载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求22的MGEV。

24.权利要求11的MGEV，其按翻译顺序具有下述编码区段：

S-C_N-L₁-D₁-L₂-D₂-L₃-D₃-L₄-D₄-L₅-D₅-L₆-C_C-V

其中，S编码信号肽，

C_N编码N-末端抱握肽，

L₁、L₂、L₃、L₄、L₅和L₆各自编码连接体肽，

D₁编码2型胰蛋白酶抑制剂，D₂编码植物防卫素，和

D₃和D₄各自编码Pot 1A，

D₅编码2型胰凝乳蛋白酶抑制剂，

C_C编码C-末端抱握肽，和

V编码液泡靶向肽。

25.MGEV表达载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求24的MGEV。

26.权利要求9的MGEV，其按翻译顺序具有下述编码区段：

S-C_N-L₁-D₁-L₂-D₂-L₃-D₃-L₄-C_C

其中，S编码信号肽，和

C_N编码抱握肽，

D₁编码2型胰蛋白酶抑制剂，

D₂编码绿色荧光蛋白，

D₃编码2型胰凝乳蛋白酶抑制剂，

C_C编码抱握肽，和

L₁、L₂、L₃和L₄各自编码连接体肽。

27.植物转化载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求26的MGEV。

28.权利要求11的MGEV，其按翻译顺序具有下述编码区段：

S-C_N-L₁-D₁-L₂-D₂-L₃-D₃-L₄-C_C-V

其中，S编码信号肽，

C_N编码抱握肽，

D₁编码2型胰蛋白酶抑制剂，

D₂编码具有C-末端前肽的防卫素，

D₃编码2型胰凝乳蛋白酶抑制剂，

C_C编码抱握肽，

L₁、L₂、L₃和L₄各自编码连接体肽，和

V编码液泡靶向肽。

29.MGEV表达载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求28的MGEV。

30.权利要求11的MGEV，其按翻译顺序具有下述编码区段：

S-C_N-L₁-D₁-L₂-D₂-L₃-D₃-L₄-D₄-L₅-C_C-V

其中，S编码信号肽，和

C_N编码抱握肽，和

D₁编码2型胰蛋白酶抑制剂，和

D₂和D₃各自编码Pot 1A，和

D₄编码胰凝乳蛋白酶抑制剂，和

C_C编码胰凝乳蛋白酶抑制剂，和

L₁、L₂、L₃、L₄和L₅各自编码连接体肽，和

V编码液泡靶向肽。

31.植物转化载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求30的MGEV。

32.权利要求11的MGEV，其按翻译顺序具有下述编码区段：

S-C_N-L₁--D₁-L₂-D₂-L₃-D₃-L₄-D₄-L₅-C_C-V

其中，S编码信号肽，

C_N编码N-末端抱握肽，

L₁、L₂、L₃、L₄和L₅各自编码连接体肽，

C_C编码C-末端抱握肽，

V编码液泡靶向肽，

D₁编码2型胰蛋白酶抑制剂，

D₂编码第一种植物防卫素，

D₃编码第二种植物防卫素，和

D₄编码2型胰凝乳蛋白酶抑制剂。

33.MGEV表达载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求32的MGEV。

34.权利要求10的MGEV，其按翻译顺序具有下述编码区段：

S-D₁-L₁-D₂-L₂-D₃-L₃-D₄-V

其中，S编码信号肽，

D₁编码2型胰蛋白酶抑制剂，

D₂和D₃各自编码Pot 1A，

D₄编码2型胰凝乳蛋白酶抑制剂，

V编码液泡靶向肽，和

L₁、L₂和L₃各自编码连接体肽。

35.MGEV表达载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求34的MGEV。

36.权利要求10的MGEV，其按翻译顺序具有下述编码区段：

S-D₁-L₁-D₂-L₂-D₃-V

其中，S编码信号肽，

D₁编码2型胰蛋白酶抑制剂，

D₂编码第一种植物防卫素，

D₃编码2型胰凝乳蛋白酶抑制剂，

V编码液泡靶向肽，和

L₁和L₂各自编码连接体肽。

37.MGEV表达载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求36的MGEV。

38.权利要求8的MGEV，其按翻译顺序具有下述编码区段：

S-D₁-L₁-D₂

其中，S编码信号肽，

L₁编码连接体肽，

D₁和D₂各自编码马铃薯1型蛋白酶抑制剂。

39.MGEV表达载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求38的MGEV。

40.权利要求10的MGEV，其按翻译顺序具有下述编码区段：

S-D₁-L₁-D₂-V

其中，S编码信号肽，

L₁编码连接体肽，

D₁编码2型胰蛋白酶抑制剂，

D₂编码植物防卫素，和

V编码液泡靶向肽。

41.MGEV表达载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求40的MGEV。

42.权利要求10的MGEV，其按翻译顺序具有下述编码区段：

S-D₁-L₁-D₂-V

其中，S编码信号肽，

L₁编码连接体肽，

V编码液泡靶向肽，

D₁编码第一种植物防卫素，和

D₂编码第二种植物防卫素。

43.MGEV表达载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求42的MGEV。

44.权利要求10的MGEV，其按翻译顺序具有下述编码区段：

S-D₁-L₁-D₂

其中，S编码信号肽，

L₁编码连接体肽，

D₁编码第一种植物防卫素，和

D₂编码第二种植物防卫素。

45.MGEV表达载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求44的MGEV。

46.权利要求10的MGEV，其按翻译顺序具有下述编码区段：

S-D₁-L₁-D₂-L₂-D₃-V

其中，S编码信号肽，

V编码液泡靶向肽，

L₁和L₂各自编码连接体肽，

D₁编码2型胰蛋白酶抑制剂，

D₂编码β-葡糖醛酸糖苷酶，和

D₃编码2型胰凝乳蛋白酶抑制剂。

47.植物转化载体，其包含位于植物活性启动子的表达控制下的权利要求46的MGEV。

48.权利要求4的MGEV，其选自由下述组成的MGEV’s的组：MGEV 5、MGEV 8、MGEV 6、MGEV 7、MGEV 9、MGEV 10、MGEV 11、MGEV 12、MGEV13、MGEV 14、MGEV 15、MGEV 16、MGEV 17、MGEV 18、MGEV 19、MGEV20。

49.权利要求5的MGEV，其选自由下述组成的MGEV’s的组：MGEV 5、MGEV 6、MGEV 7、MGEV 9、MGEV 10、MGEV 11、MGEV 12、MGEV 13。

50.MGEV表达载体，其选自由下述组成的MGEV表达载体的组：pHEX29、pHEX 56、pHEX 31、pHEX 46、pHEX 55、pHEX 45、pHEX 42、pHEX33、pHEX 39、pHEX 48、pHEX 47、pHEX 35、pHEX 41、pHEX 52、pHEX51、pHEX 58。

51.在植物细胞中同时表达2-8种所需蛋白质的方法，其包括下述步骤：

a.装配基本上由包含2-8个结构域区段D_k的多核苷酸区段组成的多基因表达运载体(MGEV)，每个结构域编码功能蛋白质，其中至少一种此类蛋白质不是2型蛋白酶抑制剂，和每个结构域通过连接体区段L与线性序列中的下一个结构域连接，所述连接体区段编码具有SEQ IDNO：17的序列的连接体肽，所有所述D和L编码区段按标示为D_kL_j的翻译顺序连接在同一个读码框中，和其中k是关于从1到k进行编号的每个结构域的序数，且k在2-8的范围内，并且j是关于从1到k-1进行编号的每个连接体的序数，

b.在植物转化载体中的位于植物活性启动子和植物活性终止子的表达控制下的座位处，将所述MGEV与所述植物转化载体相组合，从而提供MGEV表达载体，和

c.用所述MGEV表达载体转化植物细胞，从而提供经MGEV转化的细胞，和

d.在适合于在所述细胞内进行基因表达的条件下维持所述经MGEV转化的细胞及其子代，从而同时表达在经MGEV转化的细胞内所编码的基因。

52.权利要求51的方法，其中蛋白质D_1-k独立地选自由下述组成的蛋白质的组：2型胰蛋白酶抑制剂、2型胰凝乳蛋白酶抑制剂、Pot I蛋白酶抑制剂、防卫素、具有C-末端前肽的防卫素、绿色荧光蛋白和指示酶。

53.权利要求52的方法，其中所述MGEV表达载体选自由下述组成的MGEV表达载体的组：pHEX 56、pHEX 48、pHEX 47、pHEX 17、pHEX 18、pHEX 19、pHEX 20。

54.权利要求52的方法，其进一步包括从所述经MGEV转化的细胞再生出成体转基因植物的步骤。

55.权利要求54的方法，其中所述成体的经转化的植物选自由棉花、大豆、玉米和稻组成的植物的组。

56.在植物细胞中同时表达3-8种蛋白质的方法，其包括下述步骤：

a.装配基本上由包含3-8个结构域区段D_k的多核苷酸区段组成的多基因表达运载体(MGEV)，每个结构域编码功能蛋白质，其中至少一种此类蛋白质不是2型蛋白酶抑制剂，和每个结构域通过连接体区段L与线性序列中的下一个结构域进行连接，所述连接体区段编码具有SEQID NO：17的序列的连接体肽，所有所述D和L编码区段按标示为C_N-L_j-D_k-L_k+1-C_C的翻译顺序连接在同一个读码框中，其中k是关于从1到k进行编号的每个结构域的序数，且k在3-7的范围内，并且j是关于从1到k+1进行编号的每个连接体的序数，

d.在适合于在所述细胞内进行基因表达的条件下维持所述经MGEV转化的细胞及其子代，从而同时表达在转移有MGEV的细胞内所编码的基因。

57.植物转化载体，其选自由下述组成的植物转化载体的组：pHEX10、pHEX 29、pHEX 31、pHEX 46、pHEX 55、pHEX 45、pHEX 42、pHEX33和pHEX 39。

58.权利要求56的方法，其进一步包括从所述经MGEV转化的细胞再生出成体转基因植物的步骤。

59.权利要求56的方法，其中所述成体的经转化的植物选自由棉花、大豆、玉米和稻组成的植物的组。

60.用于在植物细胞中同时表达2-8种蛋白质的方法，其包括用权利要求2的MGEV转化植物细胞，其中所述MGEV位于单个启动子的表达控制下。

61.权利要求60的方法，其中所述连接体具有SEQ ID NO：5的序列。