JP2002523047A - 植物中のポリタンパク質発現の遺伝的方法 - Google Patents
植物中のポリタンパク質発現の遺伝的方法Info
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Abstract
(57)【要約】
トランスジェニック植物中の１種類またはそれ以上のタンパク質の発現方法または発現レベルを向上させる方法であって、該植物のゲノム中に、２またはそれ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター領域に作動可能なように結合したプロモーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、該タンパク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって互いに隔てられていて、該プロペプチドは、発現されるポリタンパク質が成分タンパク質分子中に翻訳後プロセシングされるところの切断部位を与える上記方法。詳しくは、シグナル配列は、翻訳後プロセシングが、植物の分泌経路中で行われるように含まれてもいる。該方法で用いるのに適したリンカー配列およびＤＮＡ構築物も記載する。
Description
【０００１】 本発明は、特に、植物中の２またはそれ以上のタンパク質の一つの転写単位中
での共発現によってタンパク質発現レベルを増加させる方法、植物中の２または
それ以上のタンパク質の共発現および分泌、本発明の方法で用いるためのリンカ
ー配列、本発明で用いるためのＤＮＡ構築物、および本発明の構築物を用いてト
ランスフェクションされた植物に関する。
での共発現によってタンパク質発現レベルを増加させる方法、植物中の２または
それ以上のタンパク質の共発現および分泌、本発明の方法で用いるためのリンカ
ー配列、本発明で用いるためのＤＮＡ構築物、および本発明の構築物を用いてト
ランスフェクションされた植物に関する。
【０００２】 遺伝子導入による植物の遺伝子修飾に基づく多数の用途に関して、２またはそ
れ以上の導入遺伝子を共役発現させることが望まれる。例えば、異なった生化学
的標的を有する抗微生物性タンパク質をコードしている導入遺伝子の植物中での
共発現は、増加した疾患抵抗レベル、より広範囲の病原体に対する耐性、または
病原体の突然変異適応によって克服するのが一層難しい耐性をもたらすことがで
きる。他の例には、生合成経路に関与する多数の導入遺伝子の共発現によってト
ランスジェニック植物中の特定の代謝産物の生産を目的とするものが含まれる。
多数の導入遺伝子を発現するトランスジェニック植物を得るには、いろいろな方
法がある。一つのしばしば選択される選択肢は、それぞれの導入遺伝子を別々の
形質転換によって個々に導入することおよび異なった単一導入遺伝子発現ライン
を交差させることである。この方法の欠点は、得られた子孫の異なった導入遺伝
子が異なった遺伝子座に挿入されることであり、それは、引き続きの育種過程を
複雑にする。更に、この方法は、例えば、バレイショのような栄養繁殖する作物
、多数の観賞植物および果樹種に利用できない。
れ以上の導入遺伝子を共役発現させることが望まれる。例えば、異なった生化学
的標的を有する抗微生物性タンパク質をコードしている導入遺伝子の植物中での
共発現は、増加した疾患抵抗レベル、より広範囲の病原体に対する耐性、または
病原体の突然変異適応によって克服するのが一層難しい耐性をもたらすことがで
きる。他の例には、生合成経路に関与する多数の導入遺伝子の共発現によってト
ランスジェニック植物中の特定の代謝産物の生産を目的とするものが含まれる。
多数の導入遺伝子を発現するトランスジェニック植物を得るには、いろいろな方
法がある。一つのしばしば選択される選択肢は、それぞれの導入遺伝子を別々の
形質転換によって個々に導入することおよび異なった単一導入遺伝子発現ライン
を交差させることである。この方法の欠点は、得られた子孫の異なった導入遺伝
子が異なった遺伝子座に挿入されることであり、それは、引き続きの育種過程を
複雑にする。更に、この方法は、例えば、バレイショのような栄養繁殖する作物
、多数の観賞植物および果樹種に利用できない。
【０００３】 次の可能性は、異なった導入遺伝子を、一つの形質転換ベクター中に、それら
自体のプロモーターおよびターミネーターをそれぞれ含む連鎖発現カセットとし
て導入することである。このような導入遺伝子セットは、この場合、単一遺伝子
座として分離するであろう。しかしながら、トランスジェニック植物中の同じプ
ロモーターの多重コピーの存在は、しばしば、導入遺伝子の転写沈黙（silencin
g）を引き起こすことが認められている（Matzke,M.A. および Matzke,A.J.M., 1
998, Cellular and Molecular Life Sciences 54,94-103）。ＣａＭＶ３５Ｓプ
ロモーターによってそれぞれ作動する４個連鎖した導入遺伝子を含有するベクタ
ーを導入する試みにおいて、Van den Elzen P.J. ら（Phil.Trans.R.Soc.Lon.B.
, 1993,342:271-278）は、分析された導入遺伝子ラインで、４個の導入遺伝子全
部をかなりの高レベルで発現したものは無かったことを認めた。この問題を避け
るために、構築物中で用いられる発現カセットそれぞれに別々のプロモーターを
用いることが考えられる。しかしながら、現在のところ、発現レベル、細胞の種
類および発生特異性、および環境因子への応答に関して比較に値する特性を有す
るプロモーターセットの選択は極めて限られているにすぎない。
自体のプロモーターおよびターミネーターをそれぞれ含む連鎖発現カセットとし
て導入することである。このような導入遺伝子セットは、この場合、単一遺伝子
座として分離するであろう。しかしながら、トランスジェニック植物中の同じプ
ロモーターの多重コピーの存在は、しばしば、導入遺伝子の転写沈黙（silencin
g）を引き起こすことが認められている（Matzke,M.A. および Matzke,A.J.M., 1
998, Cellular and Molecular Life Sciences 54,94-103）。ＣａＭＶ３５Ｓプ
ロモーターによってそれぞれ作動する４個連鎖した導入遺伝子を含有するベクタ
ーを導入する試みにおいて、Van den Elzen P.J. ら（Phil.Trans.R.Soc.Lon.B.
, 1993,342:271-278）は、分析された導入遺伝子ラインで、４個の導入遺伝子全
部をかなりの高レベルで発現したものは無かったことを認めた。この問題を避け
るために、構築物中で用いられる発現カセットそれぞれに別々のプロモーターを
用いることが考えられる。しかしながら、現在のところ、発現レベル、細胞の種
類および発生特異性、および環境因子への応答に関して比較に値する特性を有す
るプロモーターセットの選択は極めて限られているにすぎない。
【０００４】 三番目の選択肢は、いわゆる内部リボソームエントリー部位（internal ribos
omal entry sites）によって異なったコーディング領域を分離することによって
一つの転写単位から多数のタンパク質を生産することが考えられ、それは、ｍＲ
ＮＡ種中の内部位置でリボソームが翻訳を繰り返すことを可能にする。内部リボ
ソームエントリー部位は、動物の系では充分に実証されているが（Kaminski A.
ら，1994, Genet.Eng. 16,115-155）、このような部位が、植物からの核にコー
ドされた遺伝子中でも機能するかどうかは、今のところ知られていない。ポリシ
ストロン性遺伝子は、植物葉緑体ゲノム中に挿入された場合に発現されうるが（
Daniell H. ら，1998, Nature Biotechnology 16,345-348）、この場合、遺伝子
産物は葉緑体に限られ、それは、必ずしも、異種タンパク質の沈着に好ましい部
位ではない。
omal entry sites）によって異なったコーディング領域を分離することによって
一つの転写単位から多数のタンパク質を生産することが考えられ、それは、ｍＲ
ＮＡ種中の内部位置でリボソームが翻訳を繰り返すことを可能にする。内部リボ
ソームエントリー部位は、動物の系では充分に実証されているが（Kaminski A.
ら，1994, Genet.Eng. 16,115-155）、このような部位が、植物からの核にコー
ドされた遺伝子中でも機能するかどうかは、今のところ知られていない。ポリシ
ストロン性遺伝子は、植物葉緑体ゲノム中に挿入された場合に発現されうるが（
Daniell H. ら，1998, Nature Biotechnology 16,345-348）、この場合、遺伝子
産物は葉緑体に限られ、それは、必ずしも、異種タンパク質の沈着に好ましい部
位ではない。
【０００５】 最後に、四番目の戦略は、一つの転写単位によってコードされる一つのポリタ
ンパク質前駆体のタンパク質分解切断による多数のタンパク質の生産に基づく。
例えば、ポティウイルスは、それらのゲノムＲＮＡを、ポリタンパク質前駆体を
in cis 切断できるタンパク質分解ドメインを包含する一つのポリタンパク質前
駆体中に翻訳する（Dougherty,W.G. および Carrington,J.C., 1988, Annu.Rev.
Phytopathol. 26,123-143）。Beck von Bodman,S. ら（1995, Bio/Technology 1
3,587-591）は、マンノパイン（mannopine）の生合成に関与する二つの酵素を共
発現するポティウイルス系を既に開発している。それら二つの生合成酵素は、ポ
ティウイルスポリタンパク質前駆体に由来するプロテアーゼと一緒に一つの読み
取り枠中に融合され、それら隣接する領域は、そのプロテアーゼの特異的切断部
位である８アミノ酸の長いスペーサーによって隔てられた。この構築物を用いて
形質転換された植物はマンノパインを合成し、それら二つの酵素が、どういうわ
けか、少なくとも部分的に機能性である形で生産されていることが示唆されたが
、考えられる in planta 切断の直接的な証拠は得られなかった。この系の欠点
は、ウイルスタンパク質が目的のタンパク質と一緒に共発現される必要があると
いうことであり、それは必ずしも望ましいとは限らない。より最近では、Urwin
P.E. ら（1998, Planta 204,472-479）が、植物メタロチオネイン様タンパク質
に由来するプロテアーゼ感受性プロペプチドによって結合した２種類の異なった
プロテイナーゼインヒビターを共発現することが可能であるということを示して
いる。システインプロテアーゼインヒビター（病害からのイネシスタチン（oryz
acystatin from vice））、エンドウメタロチオネイン様タンパク質由来プロペ
プチドおよびセリンプロテアーゼインヒビター（ササゲトリプシンインヒビター
）から成るポリタンパク質前駆体は、トランスジェニック植物アラビドプシス・
タリアナ（Arabidopsis thaliana）中で切断されることが判明した。その切断は
、しかしながら、切断されていないポリタンパク質前駆体も、それらトランスジ
ェニック植物中で検出されうるので、単に部分的であった。ポリタンパク質前駆
体は、リーダーペプチドを含有していなかったので、翻訳産物はサイトゾル中に
沈着すると考えられる。プロペプチドが由来するメタロチオネインも、リーダー
ペプチドを含有していなかったので（Evans IM 1990, FEBS Lett. 262,29-32）
、そのプロセシングはサイトゾル中で起こるはずである。
ンパク質前駆体のタンパク質分解切断による多数のタンパク質の生産に基づく。
例えば、ポティウイルスは、それらのゲノムＲＮＡを、ポリタンパク質前駆体を
in cis 切断できるタンパク質分解ドメインを包含する一つのポリタンパク質前
駆体中に翻訳する（Dougherty,W.G. および Carrington,J.C., 1988, Annu.Rev.
Phytopathol. 26,123-143）。Beck von Bodman,S. ら（1995, Bio/Technology 1
3,587-591）は、マンノパイン（mannopine）の生合成に関与する二つの酵素を共
発現するポティウイルス系を既に開発している。それら二つの生合成酵素は、ポ
ティウイルスポリタンパク質前駆体に由来するプロテアーゼと一緒に一つの読み
取り枠中に融合され、それら隣接する領域は、そのプロテアーゼの特異的切断部
位である８アミノ酸の長いスペーサーによって隔てられた。この構築物を用いて
形質転換された植物はマンノパインを合成し、それら二つの酵素が、どういうわ
けか、少なくとも部分的に機能性である形で生産されていることが示唆されたが
、考えられる in planta 切断の直接的な証拠は得られなかった。この系の欠点
は、ウイルスタンパク質が目的のタンパク質と一緒に共発現される必要があると
いうことであり、それは必ずしも望ましいとは限らない。より最近では、Urwin
P.E. ら（1998, Planta 204,472-479）が、植物メタロチオネイン様タンパク質
に由来するプロテアーゼ感受性プロペプチドによって結合した２種類の異なった
プロテイナーゼインヒビターを共発現することが可能であるということを示して
いる。システインプロテアーゼインヒビター（病害からのイネシスタチン（oryz
acystatin from vice））、エンドウメタロチオネイン様タンパク質由来プロペ
プチドおよびセリンプロテアーゼインヒビター（ササゲトリプシンインヒビター
）から成るポリタンパク質前駆体は、トランスジェニック植物アラビドプシス・
タリアナ（Arabidopsis thaliana）中で切断されることが判明した。その切断は
、しかしながら、切断されていないポリタンパク質前駆体も、それらトランスジ
ェニック植物中で検出されうるので、単に部分的であった。ポリタンパク質前駆
体は、リーダーペプチドを含有していなかったので、翻訳産物はサイトゾル中に
沈着すると考えられる。プロペプチドが由来するメタロチオネインも、リーダー
ペプチドを含有していなかったので（Evans IM 1990, FEBS Lett. 262,29-32）
、そのプロセシングはサイトゾル中で起こるはずである。
【０００６】 いくつかの用途に関しては、サイトゾルのプロセシングおよび沈着は不都合で
ある。多数のタンパク質、特に、グリコシル化タンパク質または多数のジスルフ
ィド架橋を含むタンパク質は、機能性の形で折りたたまれるためには、（小胞体
およびゴルジ装置を包含する）分泌経路で合成されなければならない（Bednarek
and Raikhel 1992, Plant Mol.Biol. 20,133-150）。更に、例えば、抗微生物
性タンパク質の発現などのいくつかの用途に関しては、細胞外空間は、大部分の
微生物が、少なくとも感染初期段階においてはその細胞外空間にいるので、好ま
しい沈着部位である。細胞外空間に行くことになっているタンパク質は、分泌経
路によっても合成されるが、リーダーペプチド以外の追加のターゲッティング情
報を欠いている（Bednarek and Raikhel 1992, Plant Mol.Biol. 20,133-150）
。この戦略の適用の他の例は、ＷＯ９５／２４４８６号およびＷＯ９５／１７５
１４号に記載されている。
ある。多数のタンパク質、特に、グリコシル化タンパク質または多数のジスルフ
ィド架橋を含むタンパク質は、機能性の形で折りたたまれるためには、（小胞体
およびゴルジ装置を包含する）分泌経路で合成されなければならない（Bednarek
and Raikhel 1992, Plant Mol.Biol. 20,133-150）。更に、例えば、抗微生物
性タンパク質の発現などのいくつかの用途に関しては、細胞外空間は、大部分の
微生物が、少なくとも感染初期段階においてはその細胞外空間にいるので、好ま
しい沈着部位である。細胞外空間に行くことになっているタンパク質は、分泌経
路によっても合成されるが、リーダーペプチド以外の追加のターゲッティング情
報を欠いている（Bednarek and Raikhel 1992, Plant Mol.Biol. 20,133-150）
。この戦略の適用の他の例は、ＷＯ９５／２４４８６号およびＷＯ９５／１７５
１４号に記載されている。
【０００７】 出願人らは、予想外にも、ポリタンパク質前駆体構築物を用いてトランスフォ
ームされた植物中の植物デフェンシンの発現レベルが、単一の植物デフェンシン
構築物を用いてトランスフォームされた植物中のそれと比較してはるかに高いこ
とを発見している。
ームされた植物中の植物デフェンシンの発現レベルが、単一の植物デフェンシン
構築物を用いてトランスフォームされた植物中のそれと比較してはるかに高いこ
とを発見している。
【０００８】 本発明は、したがって、トランスジェニック植物中のタンパク質の発現レベル
を改善する方法であって、その植物のゲノム中に、２またはそれ以上のタンパク
質コード領域および３’ターミネーター領域に作動可能なように結合したプロモ
ーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、それらタン
パク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって互
いに隔てられていて、そのプロペプチドは、発現されるポリタンパク質が成分タ
ンパク質分子中に翻訳後プロセシングされるところの切断部位を与える上記方法
を提供する。
を改善する方法であって、その植物のゲノム中に、２またはそれ以上のタンパク
質コード領域および３’ターミネーター領域に作動可能なように結合したプロモ
ーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、それらタン
パク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって互
いに隔てられていて、そのプロペプチドは、発現されるポリタンパク質が成分タ
ンパク質分子中に翻訳後プロセシングされるところの切断部位を与える上記方法
を提供する。
【０００９】 本明細書中に記載のプロセシング系は、２またはそれ以上の異なったタンパク
質を共発現させるだけでなく、タンパク質、特に、低分子タンパク質のより高い
発現レベルを得るのにも用いることができる。翻訳効率への認められる刺激作用
の理由は、現在のところ不明である。それは、翻訳効率へのｍＲＮＡ長さまたは
翻訳一次産物の長さの作用によると考えられる。
質を共発現させるだけでなく、タンパク質、特に、低分子タンパク質のより高い
発現レベルを得るのにも用いることができる。翻訳効率への認められる刺激作用
の理由は、現在のところ不明である。それは、翻訳効率へのｍＲＮＡ長さまたは
翻訳一次産物の長さの作用によると考えられる。
【００１０】 好ましくは、シグナル配列は、タンパク質コーディング領域と作動可能なよう
に連結されている。 本明細書中で用いられる“シグナル配列”という表現は、新生ポリペプチドが
小胞体に入るのを可能にし且つこの転位後除去されるリーダーペプチドをコード
している配列を定義するのに用いられる。
に連結されている。 本明細書中で用いられる“シグナル配列”という表現は、新生ポリペプチドが
小胞体に入るのを可能にし且つこの転位後除去されるリーダーペプチドをコード
している配列を定義するのに用いられる。
【００１１】 そのシグナル配列は、任意の適当な源に由来しうるし、そして例えば、それが
作動可能なように結合するプロモーターと自然に関連していてもよい。本発明者
らは、本発明の方法で用いるのに特に適しているデフェンシン（Broekaert ら，
1995 Plant Physiol 108,1353-1358；Broekaert ら，1997, Crit.Rev.Plant Sci
. 16,297-323）として知られる植物タンパク質のクラスからのシグナル配列の使
用を見出している。
作動可能なように結合するプロモーターと自然に関連していてもよい。本発明者
らは、本発明の方法で用いるのに特に適しているデフェンシン（Broekaert ら，
1995 Plant Physiol 108,1353-1358；Broekaert ら，1997, Crit.Rev.Plant Sci
. 16,297-323）として知られる植物タンパク質のクラスからのシグナル配列の使
用を見出している。
【００１２】 したがって、もう一つ好ましい実施態様において、トランスジェニック植物中
のタンパク質の発現レベルを向上させる方法であって、その植物のゲノム中に、
シグナル配列であって２またはそれ以上のタンパク質コード領域および３’ター
ミネーター領域に作動可能なように結合しているそのシグナル配列に作動可能な
ように結合したプロモーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここ
において、そのタンパク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列によって互いに隔てられていて、そのプロペプチドは、発現されるポリ
タンパク質が成分タンパク質分子中に翻訳後プロセシングされるところの切断部
位を与える上記方法を提供する。
のタンパク質の発現レベルを向上させる方法であって、その植物のゲノム中に、
シグナル配列であって２またはそれ以上のタンパク質コード領域および３’ター
ミネーター領域に作動可能なように結合しているそのシグナル配列に作動可能な
ように結合したプロモーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここ
において、そのタンパク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列によって互いに隔てられていて、そのプロペプチドは、発現されるポリ
タンパク質が成分タンパク質分子中に翻訳後プロセシングされるところの切断部
位を与える上記方法を提供する。
【００１３】 本発明のこの方法は、１００アミノ酸またはそれ未満の長さであるタンパク質
の発現に特に適している。 本発明は、植物中の２またはそれ以上のタンパク質を一つの転写単位として共
発現する好都合で且つ高効率の方法であって、それら２つのタンパク質が切断可
能なリンカーによって結合していて、その構築物は植物の分泌経路中で切断が起
こることによってタンパク質を細胞外に放出するように設計されている方法を提
供する。
の発現に特に適している。 本発明は、植物中の２またはそれ以上のタンパク質を一つの転写単位として共
発現する好都合で且つ高効率の方法であって、それら２つのタンパク質が切断可
能なリンカーによって結合していて、その構築物は植物の分泌経路中で切断が起
こることによってタンパク質を細胞外に放出するように設計されている方法を提
供する。
【００１４】 本発明のもう一つの態様により、トランスジェニック植物中の多数のタンパク
質の発現方法であって、その植物のゲノム中に、シグナル配列であって２または
それ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター領域に作動可能なよ
うに結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合したプロモーター領
域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、それらタンパク質コ
ード領域はリンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって互いに隔てら
れていて、そのプロペプチドは発現されるポリタンパク質が成分タンパク質分子
中に翻訳後プロセシングされるところの切断部位を与える方法を提供する。
質の発現方法であって、その植物のゲノム中に、シグナル配列であって２または
それ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター領域に作動可能なよ
うに結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合したプロモーター領
域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、それらタンパク質コ
ード領域はリンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって互いに隔てら
れていて、そのプロペプチドは発現されるポリタンパク質が成分タンパク質分子
中に翻訳後プロセシングされるところの切断部位を与える方法を提供する。
【００１５】 本発明の全ての態様による２またはそれ以上のタンパク質コード領域は、好ま
しくは、同一のタンパク質をコードするのではない、すなわち、本発明の方法は
、一つの転写単位で異なったタンパク質の生産を可能にする。本発明の方法によ
って発現されるＤＮＡ配列は、多数のタンパク質の生産に用いられる植物中に天
然に存在しないものである、すなわち、そのＤＮＡ配列の成分の一つまたはそれ
以上は、植物宿主にとって異種であろう。
しくは、同一のタンパク質をコードするのではない、すなわち、本発明の方法は
、一つの転写単位で異なったタンパク質の生産を可能にする。本発明の方法によ
って発現されるＤＮＡ配列は、多数のタンパク質の生産に用いられる植物中に天
然に存在しないものである、すなわち、そのＤＮＡ配列の成分の一つまたはそれ
以上は、植物宿主にとって異種であろう。
【００１６】 本明細書中に記載の多数のタンパク質の発現の方法は、Ｉｂ−ＡＭＰ遺伝子に
よって発現されるような、および公開国際特許出願第ＷＯ９５／２４４８６号の
配列番号１４、１５、１６、１７または１８に記載のような、Ｒｓ−ＡＦＰ２を
それぞれコードする３種類のタンパク質コード領域を隔てるリンカーペプチドの
使用を含まないし、植物ゲノム中にそれを挿入することもない。好適には、本発
明の方法は、ＷＯ９５／２４４８６号の配列番号１４、１５、１６、１７または
１８に示される天然のＩｂ−ＡＭＰ遺伝子のリンカープロペプチドを使用しない
。
よって発現されるような、および公開国際特許出願第ＷＯ９５／２４４８６号の
配列番号１４、１５、１６、１７または１８に記載のような、Ｒｓ−ＡＦＰ２を
それぞれコードする３種類のタンパク質コード領域を隔てるリンカーペプチドの
使用を含まないし、植物ゲノム中にそれを挿入することもない。好適には、本発
明の方法は、ＷＯ９５／２４４８６号の配列番号１４、１５、１６、１７または
１８に示される天然のＩｂ−ＡＭＰ遺伝子のリンカープロペプチドを使用しない
。
【００１７】 もう一つの態様において、本発明は、トランスジェニック植物中の多数のタン
パク質の発現方法であって、その植物のゲノム中に、シグナル配列であって２ま
たはそれ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター領域に作動可能
なように結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合したプロモータ
ー領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、それらタンパク
質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって互いに
隔てられていて、そのプロペプチドは、発現されるポリタンパク質が成分タンパ
ク質分子中に翻訳後プロセシングされるところの切断部位を与え、但し、そのリ
ンカープロペプチドが、公開国際特許出願第ＷＯ９５／２４４８６号の配列番号
１４、１５、１６、１７または１８に記載のＩｂ−ＡＭＰ遺伝子に由来する場合
、それは、Ｒｓ−ＡＦＰ２をそれぞれコードする３種類のタンパク質コード領域
を隔てないという条件付きである方法を提供する。
パク質の発現方法であって、その植物のゲノム中に、シグナル配列であって２ま
たはそれ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター領域に作動可能
なように結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合したプロモータ
ー領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、それらタンパク
質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって互いに
隔てられていて、そのプロペプチドは、発現されるポリタンパク質が成分タンパ
ク質分子中に翻訳後プロセシングされるところの切断部位を与え、但し、そのリ
ンカープロペプチドが、公開国際特許出願第ＷＯ９５／２４４８６号の配列番号
１４、１５、１６、１７または１８に記載のＩｂ−ＡＭＰ遺伝子に由来する場合
、それは、Ｒｓ−ＡＦＰ２をそれぞれコードする３種類のタンパク質コード領域
を隔てないという条件付きである方法を提供する。
【００１８】 Ｒｓ−ＡＦＰ２の配列は、１９９３年３月１８日公開の公開国際特許出願第Ｗ
Ｏ９３／０５１５３号に充分に記載されている。 プロモーター配列は、例えば、シグナル配列と自然に関連しているものであっ
てよいし、および／またはそれが結合する、タンパク質をコードしている配列と
自然に関連していてよいし、または植物中の転写を行う任意の他のプロモーター
配列であってよい。それは、構成性プロモーターであってよいしまたは誘導プロ
モーターであってよい。
Ｏ９３／０５１５３号に充分に記載されている。 プロモーター配列は、例えば、シグナル配列と自然に関連しているものであっ
てよいし、および／またはそれが結合する、タンパク質をコードしている配列と
自然に関連していてよいし、または植物中の転写を行う任意の他のプロモーター
配列であってよい。それは、構成性プロモーターであってよいしまたは誘導プロ
モーターであってよい。
【００１９】 本明細書中に記載の本発明の全ての態様および実施態様において用いるための
リンカープロペプチドは、好ましくは、ポリタンパク質前駆体をコードしている
ＤＮＡのパッセージ（ｐａｓｓａｇｅ）で、ポリタンパク質をコードしているＤ
ＮＡが発現される植物細胞の分泌経路によって切断されるリンカープロペプチド
である。そのリンカープロペプチドは、好ましくは、ポリタンパク質をコードし
ているＤＮＡが発現される植物細胞中の分泌経路に天然に存在するプロテアーゼ
によってプロペプチドの切断が起こるように設計されるまたは選択される。この
ようなプロテアーゼの例である３５Ｓ ＲＮＡの Penh ２５Ｓプロモーターのよ
うなカリフラワーモザイクウイルスの具体的なプロモーターには、ズブチリシン
様プロテアーゼが含まれる。
リンカープロペプチドは、好ましくは、ポリタンパク質前駆体をコードしている
ＤＮＡのパッセージ（ｐａｓｓａｇｅ）で、ポリタンパク質をコードしているＤ
ＮＡが発現される植物細胞の分泌経路によって切断されるリンカープロペプチド
である。そのリンカープロペプチドは、好ましくは、ポリタンパク質をコードし
ているＤＮＡが発現される植物細胞中の分泌経路に天然に存在するプロテアーゼ
によってプロペプチドの切断が起こるように設計されるまたは選択される。この
ようなプロテアーゼの例である３５Ｓ ＲＮＡの Penh ２５Ｓプロモーターのよ
うなカリフラワーモザイクウイルスの具体的なプロモーターには、ズブチリシン
様プロテアーゼが含まれる。
【００２０】 好ましい実施態様において、本発明は、したがって、トランスジェニック植物
中の多数のタンパク質の発現方法であって、その植物のゲノム中に、シグナル配
列であって２またはそれ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター
領域に作動可能なように結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合
したプロモーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、
それらタンパク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列
によって互いに隔てられていて、そのプロペプチドは、発現されるポリタンパク
質が成分タンパク質分子中に翻訳後プロセシングされるところの切断部位を与え
、そのリンカープロペプチドは、ポリタンパク質前駆体をコードしているＤＮＡ
のパッセージで、ポリタンパク質をコードしているＤＮＡが発現される植物細胞
の分泌経路によって切断される方法を提供する。
中の多数のタンパク質の発現方法であって、その植物のゲノム中に、シグナル配
列であって２またはそれ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター
領域に作動可能なように結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合
したプロモーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、
それらタンパク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列
によって互いに隔てられていて、そのプロペプチドは、発現されるポリタンパク
質が成分タンパク質分子中に翻訳後プロセシングされるところの切断部位を与え
、そのリンカープロペプチドは、ポリタンパク質前駆体をコードしているＤＮＡ
のパッセージで、ポリタンパク質をコードしているＤＮＡが発現される植物細胞
の分泌経路によって切断される方法を提供する。
【００２１】 本明細書中に記載の多数のタンパク質の発現方法は、公開国際特許出願第ＷＯ
９５／２４４８６号の配列番号１４、１５、１６、１７または１８に記載のよう
な、Ｒｓ−ＡＦＰ２をそれぞれコードする３種類のタンパク質コード領域を隔て
る、Ｉｂ−ＡＭＰ遺伝子に由来するリンカーペプチドの使用および植物ゲノム中
へのその挿入を含まない。
９５／２４４８６号の配列番号１４、１５、１６、１７または１８に記載のよう
な、Ｒｓ−ＡＦＰ２をそれぞれコードする３種類のタンパク質コード領域を隔て
る、Ｉｂ−ＡＭＰ遺伝子に由来するリンカーペプチドの使用および植物ゲノム中
へのその挿入を含まない。
【００２２】 本発明のいくつかの実施態様において、リンカープロペプチドはウイルスに由
来しない。 特に好ましい実施態様において、本発明は、トランスジェニック植物中の多数
のタンパク質の発現方法であって、その植物のゲノム中に、シグナル配列であっ
て２またはそれ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター領域に作
動可能なように結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合したプロ
モーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、それらタ
ンパク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって
互いに隔てられていて、そのプロペプチドは、発現されるポリタンパク質が成分
タンパク質分子中に翻訳後プロセシングされるところの切断部位を与え、そのリ
ンカープロペプチドは、ポリタンパク質前駆体をコードしているＤＮＡのパッセ
ージにおいて、ポリタンパク質をコードしているＤＮＡが発現される植物細胞の
分泌経路によって切断され、ここにおいて、プロペプチドの切断が、その植物細
胞の分泌経路中に天然に存在するプロテアーゼによって起こる方法を提供する。
来しない。 特に好ましい実施態様において、本発明は、トランスジェニック植物中の多数
のタンパク質の発現方法であって、その植物のゲノム中に、シグナル配列であっ
て２またはそれ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター領域に作
動可能なように結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合したプロ
モーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、それらタ
ンパク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって
互いに隔てられていて、そのプロペプチドは、発現されるポリタンパク質が成分
タンパク質分子中に翻訳後プロセシングされるところの切断部位を与え、そのリ
ンカープロペプチドは、ポリタンパク質前駆体をコードしているＤＮＡのパッセ
ージにおいて、ポリタンパク質をコードしているＤＮＡが発現される植物細胞の
分泌経路によって切断され、ここにおいて、プロペプチドの切断が、その植物細
胞の分泌経路中に天然に存在するプロテアーゼによって起こる方法を提供する。
【００２３】 そのリンカープロペプチドは、Ｉｂ−ＡＭＰ遺伝子に由来する内部プロペプチ
ドのような植物の分泌経路中に存在するプロテアーゼの、本明細書中に更に記載
されるプロセシング部位を天然に含有するペプチドであってよいし、またはこの
ようなプロテアーゼプロセシング部位が、配列の切断を容易にするようにそのど
ちらか一方の末端または両末端で操作されているペプチドであってよい。プロペ
プチドが一つのこのようなプロテアーゼプロセシング部位を有する場合、追加の
プロテアーゼプロセシング部位を加えることができる。必要ならばまたは所望な
らば、プロセシング部位の繰り返し体、例えば、最大６個までの繰り返し体が含
まれてよい。
ドのような植物の分泌経路中に存在するプロテアーゼの、本明細書中に更に記載
されるプロセシング部位を天然に含有するペプチドであってよいし、またはこの
ようなプロテアーゼプロセシング部位が、配列の切断を容易にするようにそのど
ちらか一方の末端または両末端で操作されているペプチドであってよい。プロペ
プチドが一つのこのようなプロテアーゼプロセシング部位を有する場合、追加の
プロテアーゼプロセシング部位を加えることができる。必要ならばまたは所望な
らば、プロセシング部位の繰り返し体、例えば、最大６個までの繰り返し体が含
まれてよい。
【００２４】 例えば、本明細書中に充分に記載されるように、追加のプロテアーゼプロセシ
ング部位は、未知の分泌経路プロテアーゼに関してＮ末端にプロテアーゼプロセ
シング部位を天然に有するダリア（Dahlia）およびアマランサス（Amaranthus）
からのＣ末端プロペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’末端に加えられている
が、これらペプチドは、本発明の方法によって用いるのに特に適している。Ｃ末
端プロペプチド配列を含めたいくつかのダリア配列は、同時係属英国特許出願第
９８１８００３．７号に記載され且つ請求の範囲に記載されている。
ング部位は、未知の分泌経路プロテアーゼに関してＮ末端にプロテアーゼプロセ
シング部位を天然に有するダリア（Dahlia）およびアマランサス（Amaranthus）
からのＣ末端プロペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’末端に加えられている
が、これらペプチドは、本発明の方法によって用いるのに特に適している。Ｃ末
端プロペプチド配列を含めたいくつかのダリア配列は、同時係属英国特許出願第
９８１８００３．７号に記載され且つ請求の範囲に記載されている。
【００２５】 なおもう一つの戦略は、ポリタンパク質の切断を引き起こす、口蹄疫ウイルス
（ＦＭＤＶ）ＲＮＡの２Ａ配列と称される２０アミノ酸配列のような、ウイルス
、例えば、ピコルナウイルス（picornovirus）配列の使用に基づく（Ryan and D
rew 1994, EMPO J., 13,928-933）。しかしながら、この場合、タンパク質生成
物上の望ましくないアミノ酸の保持を避けるために、Ｎ末端配列、例えば、植物
由来配列またはそのフラグメントを生じる配列と混合して、キメラプロペプチド
を形成させる。
（ＦＭＤＶ）ＲＮＡの２Ａ配列と称される２０アミノ酸配列のような、ウイルス
、例えば、ピコルナウイルス（picornovirus）配列の使用に基づく（Ryan and D
rew 1994, EMPO J., 13,928-933）。しかしながら、この場合、タンパク質生成
物上の望ましくないアミノ酸の保持を避けるために、Ｎ末端配列、例えば、植物
由来配列またはそのフラグメントを生じる配列と混合して、キメラプロペプチド
を形成させる。
【００２６】 本発明において、本発明者は、分泌経路で切断される人工ポリタンパク質前駆
体を製造する新規戦略を開発している。最初の一つは、ＩｂＡＭＰ遺伝子に由来
するプロペプチドの使用に基づいた。ＩｂＡＭＰは、１６〜２８アミノ酸長さの
プロペプチドがそれぞれ隣接する６個連続した抗微生物性ペプチドおよびリーダ
ーペプチドを特徴とする特異ポリタンパク質前駆体をコードする、インペイシャ
ンツ・バルサミナ（Impatiens balsamina）植物からの遺伝子である（Tailor R.
H. ら，1997, J.Biol.Chem. 272,24480-24487）。ＩｂＡＭＰ前駆体のプロセシ
ングがその由来植物中のどこでどのように起こるかは知られていない。ＩｂＡＭ
Ｐからの内部プロペプチドの一つを用いて、二つの異なった植物デフェンシンコ
ーディング領域、すなわち、ハツカダイコン種子由来の領域（ＲｓＡＦＰ２，Te
rras F.R.G. ら，1992, J.Biol.Chem. 267,15301-15309；Terras ら，1995 Plan
t Cell, 7,573-588）およびダリア種子由来の領域（ＤｍＡＭＰ１，Osborn R.W.
ら，1995, FEBS Lett. 368,257-262）を分離した。
体を製造する新規戦略を開発している。最初の一つは、ＩｂＡＭＰ遺伝子に由来
するプロペプチドの使用に基づいた。ＩｂＡＭＰは、１６〜２８アミノ酸長さの
プロペプチドがそれぞれ隣接する６個連続した抗微生物性ペプチドおよびリーダ
ーペプチドを特徴とする特異ポリタンパク質前駆体をコードする、インペイシャ
ンツ・バルサミナ（Impatiens balsamina）植物からの遺伝子である（Tailor R.
H. ら，1997, J.Biol.Chem. 272,24480-24487）。ＩｂＡＭＰ前駆体のプロセシ
ングがその由来植物中のどこでどのように起こるかは知られていない。ＩｂＡＭ
Ｐからの内部プロペプチドの一つを用いて、二つの異なった植物デフェンシンコ
ーディング領域、すなわち、ハツカダイコン種子由来の領域（ＲｓＡＦＰ２，Te
rras F.R.G. ら，1992, J.Biol.Chem. 267,15301-15309；Terras ら，1995 Plan
t Cell, 7,573-588）およびダリア種子由来の領域（ＤｍＡＭＰ１，Osborn R.W.
ら，1995, FEBS Lett. 368,257-262）を分離した。
【００２７】 他の戦略は、ＤｍＡＭＰ１前駆体かまたはＡｃＡＭＰ２前駆体（De Bolle M.F
.C. ら，1993, Plant Mol.Biol. 22,1187-1190）またはこれらのフラグメントか
らのＣ末端プロペプチドの使用に基づいた。これらＣ末端プロペプチドは、トラ
ンスジェニックタバコ植物中では、それらが前駆体中で結合している成熟タンパ
ク質の細胞外沈着に影響を与えることなくそれらを明らかに切断することができ
るという本発明者の以前の知見（R.W.Osborn and S.Attenborough, 私的文書；D
e Bolle M.F.C. ら，1996, Plant Mol.Biol. 31,993-1008）に基づいて選択され
たが、その知見は、このような切断が、液胞を除いた分泌経路中に存在するプロ
テアーゼによって行われることを意味している。これらＣ末端プロペプチドを内
部プロペプチドに変換するために、ズブチリシン様プロテアーゼプロセシング部
位をそれらプロペプチドのＣ末端部分で操作した。
.C. ら，1993, Plant Mol.Biol. 22,1187-1190）またはこれらのフラグメントか
らのＣ末端プロペプチドの使用に基づいた。これらＣ末端プロペプチドは、トラ
ンスジェニックタバコ植物中では、それらが前駆体中で結合している成熟タンパ
ク質の細胞外沈着に影響を与えることなくそれらを明らかに切断することができ
るという本発明者の以前の知見（R.W.Osborn and S.Attenborough, 私的文書；D
e Bolle M.F.C. ら，1996, Plant Mol.Biol. 31,993-1008）に基づいて選択され
たが、その知見は、このような切断が、液胞を除いた分泌経路中に存在するプロ
テアーゼによって行われることを意味している。これらＣ末端プロペプチドを内
部プロペプチドに変換するために、ズブチリシン様プロテアーゼプロセシング部
位をそれらプロペプチドのＣ末端部分で操作した。
【００２８】 ズブチリシン様プロテアーゼは、少なくとも２個の残基が塩基性である認識部
位で特異的に切断する酵素である（Barr,P.J., 1991, Cell 66,1-3；Park C.M.
ら，1994, Mol.Microbiol. 11,155-164）。ズブチリシン様プロテアーゼは、真
菌（例えば、Ｋｅｘ２様プロテアーゼ）および高等動物（例えば、フューリン）
において最もよく示されているが、最近の証明では、このような酵素が、シロイ
ヌナズナ（Arabidopsis）（Ribeiro A. ら，1995, Plant Cell 7,785-794）を含
めた植物中にも存在することが示唆されている（Kinal H. ら，1995, Plant Cel
l 7,677-688；Tornero P. ら，1997, J.Biol.Chem. 272,14412-14419）。
位で特異的に切断する酵素である（Barr,P.J., 1991, Cell 66,1-3；Park C.M.
ら，1994, Mol.Microbiol. 11,155-164）。ズブチリシン様プロテアーゼは、真
菌（例えば、Ｋｅｘ２様プロテアーゼ）および高等動物（例えば、フューリン）
において最もよく示されているが、最近の証明では、このような酵素が、シロイ
ヌナズナ（Arabidopsis）（Ribeiro A. ら，1995, Plant Cell 7,785-794）を含
めた植物中にも存在することが示唆されている（Kinal H. ら，1995, Plant Cel
l 7,677-688；Tornero P. ら，1997, J.Biol.Chem. 272,14412-14419）。
【００２９】 本発明者は、リーダーペプチドの次に、上記の内部プロペプチドのいずれかに
よって互いに隔てられる二つの異なった植物デフェンシンから成るポリタンパク
質前駆体をトランスジェニック植物中でプロセシングして、両方の植物デフェン
シンを同時に放出することができるということを発見している。その切断は、植
物デフェンシンの少なくとも主要部分を細胞外空間に沈着させるように起こる。
したがって、その前駆体のプロセシングは、分泌経路かまたは細胞外空間中で生
じた。トランスジェニック植物中で切断されることが分かっているいろいろなプ
ロペプチドは、一次配列相同性を示さない。しかしながら、それら配列は全て、
低分子アミノ酸Ａ、Ｖ、ＳおよびＴが多いと考えられ、そして全て、２個の酸性
残基か、２個の塩基性残基かまたは、１個の酸性および１個の塩基性残基から成
るジペプチド配列を含有する。本発明において示される実施例でのプロペプチド
切断は、明らかに、液胞内では起こらなかったが、液胞タンパク質（例えば、２
Ｓアルブミン）からの内部プロペプチドは、それらタンパク質の液胞沈着が望ま
れるならば、用いてもよいと考えられる。本明細書中に記載の共発現実験では、
２種類の異なった植物デフェンシンを用いたが、他の種類のタンパク質が用いら
れた場合、または３個以上の成熟タンパク質ドメインがポリタンパク質前駆体構
造中で用いられた場合、同様の結果が得られるであろうと考えられる。
よって互いに隔てられる二つの異なった植物デフェンシンから成るポリタンパク
質前駆体をトランスジェニック植物中でプロセシングして、両方の植物デフェン
シンを同時に放出することができるということを発見している。その切断は、植
物デフェンシンの少なくとも主要部分を細胞外空間に沈着させるように起こる。
したがって、その前駆体のプロセシングは、分泌経路かまたは細胞外空間中で生
じた。トランスジェニック植物中で切断されることが分かっているいろいろなプ
ロペプチドは、一次配列相同性を示さない。しかしながら、それら配列は全て、
低分子アミノ酸Ａ、Ｖ、ＳおよびＴが多いと考えられ、そして全て、２個の酸性
残基か、２個の塩基性残基かまたは、１個の酸性および１個の塩基性残基から成
るジペプチド配列を含有する。本発明において示される実施例でのプロペプチド
切断は、明らかに、液胞内では起こらなかったが、液胞タンパク質（例えば、２
Ｓアルブミン）からの内部プロペプチドは、それらタンパク質の液胞沈着が望ま
れるならば、用いてもよいと考えられる。本明細書中に記載の共発現実験では、
２種類の異なった植物デフェンシンを用いたが、他の種類のタンパク質が用いら
れた場合、または３個以上の成熟タンパク質ドメインがポリタンパク質前駆体構
造中で用いられた場合、同様の結果が得られるであろうと考えられる。
【００３０】 ポリタンパク質を分泌経路に沿って特定の細胞小器官に集中させることが望ま
れる場合、適当なターゲッティング配列を、１またはそれ以上の多数のタンパク
質コード領域に加えてよい。例えば、ＫＤＥＬ（配列番号６５）をコードしてい
るような小胞体ターゲッティング配列を、１またはそれ以上の成熟タンパク質コ
ード領域領域の３’末端に加えてよいし、または液胞ターゲッティング配列（Ch
ispeels and Raikhel 1992, Cell 68,613-616）を、１またはそれ以上のタンパ
ク質コード領域の３’または５’末端に加えることができる。後者の例は、他の
場合には液胞に分泌される異種タンパク質の行き先を決定することが分かってい
るオオムギレクチンカルボキシ末端プロペプチドである（Bednarek and Raikhel
1991, Plant Cell 3,1195-1206；De Bolle ら，1996 Plant Mol.Biol. 31,993-
1008）。
れる場合、適当なターゲッティング配列を、１またはそれ以上の多数のタンパク
質コード領域に加えてよい。例えば、ＫＤＥＬ（配列番号６５）をコードしてい
るような小胞体ターゲッティング配列を、１またはそれ以上の成熟タンパク質コ
ード領域領域の３’末端に加えてよいし、または液胞ターゲッティング配列（Ch
ispeels and Raikhel 1992, Cell 68,613-616）を、１またはそれ以上のタンパ
ク質コード領域の３’または５’末端に加えることができる。後者の例は、他の
場合には液胞に分泌される異種タンパク質の行き先を決定することが分かってい
るオオムギレクチンカルボキシ末端プロペプチドである（Bednarek and Raikhel
1991, Plant Cell 3,1195-1206；De Bolle ら，1996 Plant Mol.Biol. 31,993-
1008）。
【００３１】 本明細書中に記載の本発明の全ての態様および方法によって用いるためのリン
カープロペプチドの配列の少なくとも４０％は、好ましくは、アラニン、バリン
、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンお
よびチロシンより選択される２〜５個連続した疎水性残基の伸長かまたはアスパ
ラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、トレオニ
ン、グルタミンおよびアスパラギンより選択される２〜５個連続した親水性残基
の伸長から成る。
カープロペプチドの配列の少なくとも４０％は、好ましくは、アラニン、バリン
、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンお
よびチロシンより選択される２〜５個連続した疎水性残基の伸長かまたはアスパ
ラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、トレオニ
ン、グルタミンおよびアスパラギンより選択される２〜５個連続した親水性残基
の伸長から成る。
【００３２】 それら疎水性残基は、好ましくは、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン
および／またはイソロイシンであり、親水性残基は、好ましくは、アスパラギン
酸、グルタミン酸、リシンおよび／またはアルギニンである。
および／またはイソロイシンであり、親水性残基は、好ましくは、アスパラギン
酸、グルタミン酸、リシンおよび／またはアルギニンである。
【００３３】 リンカープロペプチドは、そのＮ−またはＣ末端切断部位の７残基中に、２〜
５個連続した酸性残基、２〜５個の塩基性残基または２〜５個連続した酸性およ
び塩基性混合残基を含む配列を有するのが更に好ましい。
５個連続した酸性残基、２〜５個の塩基性残基または２〜５個連続した酸性およ
び塩基性混合残基を含む配列を有するのが更に好ましい。
【００３４】 本明細書中に記載の本発明の全ての態様によって用いるためのリンカープロペ
プチドの配列の少なくとも４０％は、好ましくは、アラニン、バリン、イソロイ
シン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシ
ンより選択される２〜５個連続した疎水性残基の伸長かまたはアスパラギン酸、
グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、グルタ
ミンおよびアスパラギンより選択される２〜５個連続した親水性残基の伸長から
成り、そしてそのＮ−またはＣ末端切断部位の７残基中に、２〜５個連続した酸
性残基、２〜５個の塩基性残基または２〜５個連続した酸性および塩基性混合残
基を含む配列を有するのが特に好ましい。
プチドの配列の少なくとも４０％は、好ましくは、アラニン、バリン、イソロイ
シン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシ
ンより選択される２〜５個連続した疎水性残基の伸長かまたはアスパラギン酸、
グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、グルタ
ミンおよびアスパラギンより選択される２〜５個連続した親水性残基の伸長から
成り、そしてそのＮ−またはＣ末端切断部位の７残基中に、２〜５個連続した酸
性残基、２〜５個の塩基性残基または２〜５個連続した酸性および塩基性混合残
基を含む配列を有するのが特に好ましい。
【００３５】 発現されるポリタンパク質が成分タンパク質分子中に翻訳後プロセシングされ
るところの切断部位を翻訳時に与える２個の酸性残基か、２個の塩基性残基かま
たは、１個の酸性および１個の塩基性残基から成るジペプチド配列を含有する、
低分子アミノ酸Ａ、Ｖ、ＳおよびＴの多いリンカープロペプチドの使用も好適で
ある。
るところの切断部位を翻訳時に与える２個の酸性残基か、２個の塩基性残基かま
たは、１個の酸性および１個の塩基性残基から成るジペプチド配列を含有する、
低分子アミノ酸Ａ、Ｖ、ＳおよびＴの多いリンカープロペプチドの使用も好適で
ある。
【００３６】 本明細書中で用いられる‘多い’という用語は、残基Ａ、Ｖ、ＳおよびＴが、
無作為のアミノ酸分布に基づいて予想されるよりも多く存在することを意味する
のに用いられる。
無作為のアミノ酸分布に基づいて予想されるよりも多く存在することを意味する
のに用いられる。
【００３７】 リンカープロペプチドは、そのＮ−および／またはＣ末端から７アミノ酸中に
ジペプチド配列を有するのが更に好ましく、それらジペプチド配列は、２個の酸
性残基か、２個の塩基性残基かまたは、１個の酸性および１個の塩基性残基から
成り、ここにおいて、それらジペプチド配列は、それぞれの末端で同じであって
よいしまたは異なっていてよい。
ジペプチド配列を有するのが更に好ましく、それらジペプチド配列は、２個の酸
性残基か、２個の塩基性残基かまたは、１個の酸性および１個の塩基性残基から
成り、ここにおいて、それらジペプチド配列は、それぞれの末端で同じであって
よいしまたは異なっていてよい。
【００３８】 更に好ましい実施態様において、それらジペプチド配列は、次の、ＥＥ、ＥＤ
および／またはＫＫより選択される。 リンカープロペプチドは、適当に且つ独立して折りたたまれることができるよ
うに充分に遠く離れた二つ（またはそれ以上）のタンパク質ドメインを保持すべ
きであるということが特に望まれる。この目的に関して、リンカーポリペプチド
は、好適には、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは、少なくとも１５アミノ酸
長さである。更に、リンカープロペプチドは、それが結合する２種類のタンパク
質中の任意の二次構造要素と相互作用すべきではなく、したがって、それ自体が
特別な二次構造を持たないかまたはαヘリックスのような単独の二次構造要素を
形成すべきであるということが好都合である。
および／またはＫＫより選択される。 リンカープロペプチドは、適当に且つ独立して折りたたまれることができるよ
うに充分に遠く離れた二つ（またはそれ以上）のタンパク質ドメインを保持すべ
きであるということが特に望まれる。この目的に関して、リンカーポリペプチド
は、好適には、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは、少なくとも１５アミノ酸
長さである。更に、リンカープロペプチドは、それが結合する２種類のタンパク
質中の任意の二次構造要素と相互作用すべきではなく、したがって、それ自体が
特別な二次構造を持たないかまたはαヘリックスのような単独の二次構造要素を
形成すべきであるということが好都合である。
【００３９】 本明細書中に記載の本発明のこのおよび他の全ての態様および実施態様におい
て、切断部位を与えるリンカープロペプチド配列は、好ましくは、植物またはウ
イルスのような天然の源から単離可能であるリンカー配列、またはその変異体、
またはこれらどちらかのフラグメントを含む。特に、リンカープロペプチドは、
植物タンパク質、または適当な切断部位を与えることができるそのフラグメント
または変異体若しくは誘導体から単離可能である。具体的な例には、同時係属英
国特許出願第９８１８００３．７号に記載され且つ請求の範囲に記載されている
ような、ダリア遺伝子のＣ末端プロペプチド領域に由来する切断可能リンカーが
含まれる。
て、切断部位を与えるリンカープロペプチド配列は、好ましくは、植物またはウ
イルスのような天然の源から単離可能であるリンカー配列、またはその変異体、
またはこれらどちらかのフラグメントを含む。特に、リンカープロペプチドは、
植物タンパク質、または適当な切断部位を与えることができるそのフラグメント
または変異体若しくは誘導体から単離可能である。具体的な例には、同時係属英
国特許出願第９８１８００３．７号に記載され且つ請求の範囲に記載されている
ような、ダリア遺伝子のＣ末端プロペプチド領域に由来する切断可能リンカーが
含まれる。
【００４０】 ウイルス配列が用いられる場合、それは、好ましくは、キメラプロペプチド配
列の要素である。 “変異体”という表現は、配列中の一つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミ
ノ酸に置き換えられているという点で、それらが由来する塩基配列とは異なるア
ミノ酸配列を意味する。アミノ酸置換は、あるアミノ酸が、概して同様の性質を
有する別のアミノ酸で置き換えられている場合、“保存的”と考えることができ
る。非保存的置換は、アミノ酸が異なった種類のアミノ酸で置き換えられている
場合である。概して、より少ない非保存的置換は、ポリペプチドの生物学的活性
を変化させることなく可能であろう。好適には、変異体は、塩基配列に少なくと
も８５％の類似性、好ましくは、少なくとも９０％の類似性を有する。
列の要素である。 “変異体”という表現は、配列中の一つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミ
ノ酸に置き換えられているという点で、それらが由来する塩基配列とは異なるア
ミノ酸配列を意味する。アミノ酸置換は、あるアミノ酸が、概して同様の性質を
有する別のアミノ酸で置き換えられている場合、“保存的”と考えることができ
る。非保存的置換は、アミノ酸が異なった種類のアミノ酸で置き換えられている
場合である。概して、より少ない非保存的置換は、ポリペプチドの生物学的活性
を変化させることなく可能であろう。好適には、変異体は、塩基配列に少なくと
も８５％の類似性、好ましくは、少なくとも９０％の類似性を有する。
【００４１】 本発明の場合、互いに少なくとも８５％の類似性を有する二つのアミノ酸配列
は、最大３個までのギャップを考慮して最適に配列された場合、同様の位置にす
くなとも８５％類似の（同一のまたは保存的に置換される）アミノ酸残基を有す
るが、但し、それらギャップに関して、合計１５以下のアミノ酸残基が影響を受
けるという条件付きである。同様に、互いに少なくとも９０％の類似性を有する
二つのアミノ酸配列は、最大３個までのギャップを考慮して最適に配列された場
合、同様の位置にすくなとも９０％同一のまたは保存的に置換されるアミノ酸残
基を有するが、但し、それらギャップに関して、合計１５以下のアミノ酸残基が
影響を受けるという条件付きである。
は、最大３個までのギャップを考慮して最適に配列された場合、同様の位置にす
くなとも８５％類似の（同一のまたは保存的に置換される）アミノ酸残基を有す
るが、但し、それらギャップに関して、合計１５以下のアミノ酸残基が影響を受
けるという条件付きである。同様に、互いに少なくとも９０％の類似性を有する
二つのアミノ酸配列は、最大３個までのギャップを考慮して最適に配列された場
合、同様の位置にすくなとも９０％同一のまたは保存的に置換されるアミノ酸残
基を有するが、但し、それらギャップに関して、合計１５以下のアミノ酸残基が
影響を受けるという条件付きである。
【００４２】 本発明の目的に関して、保存的アミノ酸は、未修飾タンパクと比較した場合に
、タンパク質の活性／機能を変化させないものとして定義される。特に、保存的
置換は、次の群内のアミノ酸間で行ってもよい。
、タンパク質の活性／機能を変化させないものとして定義される。特に、保存的
置換は、次の群内のアミノ酸間で行ってもよい。
【００４３】 （ｉ）アラニン、セリン、グリシンおよびトレオニン （ii）グルタミン酸およびアスパラギン酸 （iii）アルギニンおよびリシン （iv）イソロイシン、ロイシン、バリンおよびメチオニン （ｖ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン 配列類似性は、例えば、Myers および Miller（Comput.Appl.Biosci. 4 11-17
(1988)）および Wilbur および Lipman（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,726-30(19
83)）による Clustal 法、および Watterman and Eggert 法（The Journal of M
olecular Biology (1987) 197,723-728）のような当該技術分野において知られ
ている配列整列アルゴリズムを用いて計算することができる。Lasergene システ
ムの一部分として、ＤＮＡstar Inc，１２２８セルフパーク・ストリート， マ
ディソン，ウィスコンシン州，５３７１５，米国から入手することができる Meg
Align Lipman Pearson ワンペア法（暗黙値パラメーターを用いる）も用いるこ
とができる。
(1988)）および Wilbur および Lipman（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,726-30(19
83)）による Clustal 法、および Watterman and Eggert 法（The Journal of M
olecular Biology (1987) 197,723-728）のような当該技術分野において知られ
ている配列整列アルゴリズムを用いて計算することができる。Lasergene システ
ムの一部分として、ＤＮＡstar Inc，１２２８セルフパーク・ストリート， マ
ディソン，ウィスコンシン州，５３７１５，米国から入手することができる Meg
Align Lipman Pearson ワンペア法（暗黙値パラメーターを用いる）も用いるこ
とができる。
【００４４】 特に、リンカープロペプチドは、植物タンパク質から、より好ましくは、デフ
ェンシンのような植物抗微生物性タンパク質の前駆体またはヘベイン型抗微生物
性ペプチドから単離可能な配列である（Broekaert ら，1997, Crit.Rev.Plant.S
ci. 16,297-323）。そのリンカープロペプチドは、最も好ましくは、デフェンシ
ンおよび／またはヘベイン型抗微生物性ペプチド、特に、Ｄｍ−ＡＭＰ１および
Ａｃ−ＡＭＰ２からのＣ末端プロペプチドに由来しうるが、それらの配列は、本
明細書中の図２に記載の通りである（配列番号５および配列番号８）。
ェンシンのような植物抗微生物性タンパク質の前駆体またはヘベイン型抗微生物
性ペプチドから単離可能な配列である（Broekaert ら，1997, Crit.Rev.Plant.S
ci. 16,297-323）。そのリンカープロペプチドは、最も好ましくは、デフェンシ
ンおよび／またはヘベイン型抗微生物性ペプチド、特に、Ｄｍ−ＡＭＰ１および
Ａｃ−ＡＭＰ２からのＣ末端プロペプチドに由来しうるが、それらの配列は、本
明細書中の図２に記載の通りである（配列番号５および配列番号８）。
【００４５】 ツリフネソウ属（Impatiens）に由来する抗微生物性ペプチドに由来するリン
カープロペプチドの使用も好適である。Ｉｂ−ＡＭＰ遺伝子は、本発明において
用いるのに全て適している５個のプロペプチド領域を含むが、それらは、本明細
書中にその内容が援用される公開国際特許出願第ＷＯ９５／２４４８６号の２９
頁および４０〜４２頁に充分に記載されている。Ｄｍ−ＡＭＰおよびＡｃ−ＡＭ
Ｐ遺伝子に由来するＣ末端プロペプチドの全部または一部分を用いることができ
る。
カープロペプチドの使用も好適である。Ｉｂ−ＡＭＰ遺伝子は、本発明において
用いるのに全て適している５個のプロペプチド領域を含むが、それらは、本明細
書中にその内容が援用される公開国際特許出願第ＷＯ９５／２４４８６号の２９
頁および４０〜４２頁に充分に記載されている。Ｄｍ−ＡＭＰおよびＡｃ−ＡＭ
Ｐ遺伝子に由来するＣ末端プロペプチドの全部または一部分を用いることができ
る。
【００４６】 特に好ましい実施態様において、用いられるリンカープロペプチド配列は、天
然に存在するリンカープロペプチドを含むが、それは、タンパク質産物に結合し
た状態のその配列からのアミノ酸がその切断後に減少するように、好ましくは、
何も残らないように修飾される。好適な修飾は、以下に記載の常套法を用いて決
定することができる。その最も簡単な形では、本発明のタンパク質産物を単離し
、分析して、それらが、プロペプチドリンカーに由来するいずれかの残留アミノ
酸を含むかどうか調べる。次に、翻訳後切断の機能が残っているならば、そのリ
ンカー配列を修飾して、これら残基のいくつかまたは全部を排除してもよい。
然に存在するリンカープロペプチドを含むが、それは、タンパク質産物に結合し
た状態のその配列からのアミノ酸がその切断後に減少するように、好ましくは、
何も残らないように修飾される。好適な修飾は、以下に記載の常套法を用いて決
定することができる。その最も簡単な形では、本発明のタンパク質産物を単離し
、分析して、それらが、プロペプチドリンカーに由来するいずれかの残留アミノ
酸を含むかどうか調べる。次に、翻訳後切断の機能が残っているならば、そのリ
ンカー配列を修飾して、これら残基のいくつかまたは全部を排除してもよい。
【００４７】 “フラグメント”という用語は、アミノ酸が除去されている配列、好ましくは
、その末端領域配列から除去されているものを意味する。したがって、これらに
は、上述の天然の配列の修飾された形も含まれる。
、その末端領域配列から除去されているものを意味する。したがって、これらに
は、上述の天然の配列の修飾された形も含まれる。
【００４８】 本発明のリンカープロペプチドは、翻訳後切断部位としてそれが機能するなら
ば、異なった源からの１またはそれ以上のこのようなフラグメントを含んでいて
よい。リンカープロペプチド配列の例は、本明細書中に示される配列番号３、４
、６、７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８および２９、およ
びしたがってプロペプチドとして作用する変異体である。これらの具体的な例は
、配列番号３、４、６、７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８
および２９自体である。
ば、異なった源からの１またはそれ以上のこのようなフラグメントを含んでいて
よい。リンカープロペプチド配列の例は、本明細書中に示される配列番号３、４
、６、７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８および２９、およ
びしたがってプロペプチドとして作用する変異体である。これらの具体的な例は
、配列番号３、４、６、７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８
および２９自体である。
【００４９】 特に、プロペプチド配列は、配列番号３、４、６または７を含む。 好ましい実施態様により、本発明は、更に、トランスジェニック植物中の多数
のタンパク質の発現方法であって、その植物のゲノム中に、シグナル配列であっ
て２またはそれ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター領域に作
動可能なように結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合したプロ
モーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、それらタ
ンパク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって
互いに隔てられていて、そのリンカープロペプチドは、デフェンシンおよび／ま
たはヘベイン型抗微生物性ペプチドに由来することができ、そのプロペプチドは
、発現されるポリタンパク質が成分タンパク質分子中に翻訳後プロセシングされ
るところの切断部位を与える上記方法を提供する。
のタンパク質の発現方法であって、その植物のゲノム中に、シグナル配列であっ
て２またはそれ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター領域に作
動可能なように結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合したプロ
モーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、それらタ
ンパク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって
互いに隔てられていて、そのリンカープロペプチドは、デフェンシンおよび／ま
たはヘベイン型抗微生物性ペプチドに由来することができ、そのプロペプチドは
、発現されるポリタンパク質が成分タンパク質分子中に翻訳後プロセシングされ
るところの切断部位を与える上記方法を提供する。
【００５０】 本明細書中の図２に記載のＤｍ−ＡＭＰ１およびＡｃ−ＡＭＰ２からのＣ末端
プロペプチドの切断可能なリンカーとしての使用、すなわち、切断可能な結合部
位を与えるための使用は、特に好適である。プロペプチドの選択によっては、追
加の特異的プロテアーゼ認識部位をどちらか一方の末端または両末端で操作して
、配列の切断を容易にすることが必要かもしれない。好適な特異的プロテアーゼ
認識部位には、例えば、２個の塩基性残基から成るジペプチド配列か；疎水性残
基、任意の残基、塩基性残基および塩基性残基から成るテトラペプチド配列かま
たは、塩基性残基、任意の残基、塩基性残基および塩基性残基から成るテトラペ
プチド配列を認識するズブチリシン様プロテアーゼの認識部位が含まれる。ズブ
チリシン様プロテアーゼ認識部位は、本発明の方法で用いるのに特に好適である
。
プロペプチドの切断可能なリンカーとしての使用、すなわち、切断可能な結合部
位を与えるための使用は、特に好適である。プロペプチドの選択によっては、追
加の特異的プロテアーゼ認識部位をどちらか一方の末端または両末端で操作して
、配列の切断を容易にすることが必要かもしれない。好適な特異的プロテアーゼ
認識部位には、例えば、２個の塩基性残基から成るジペプチド配列か；疎水性残
基、任意の残基、塩基性残基および塩基性残基から成るテトラペプチド配列かま
たは、塩基性残基、任意の残基、塩基性残基および塩基性残基から成るテトラペ
プチド配列を認識するズブチリシン様プロテアーゼの認識部位が含まれる。ズブ
チリシン様プロテアーゼ認識部位は、本発明の方法で用いるのに特に好適である
。
【００５１】 また更に好ましい実施態様により、本発明は、更に、トランスジェニック植物
中の多数のタンパク質の発現方法であって、その植物のゲノム中に、シグナル配
列であって２またはそれ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター
領域に作動可能なように結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合
したプロモーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、
それらタンパク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列
によって互いに隔てられていて、そのプロペプチドは、発現されるポリタンパク
質が成分タンパク質分子中に翻訳後プロセシングされるところの切断部位を与え
、そしてここにおいて、追加の特異的プロテアーゼ認識部位が、配列の切断を容
易にするように、そのリンカープロペプチドのどちらか一方のまたは両末端で操
作されている上記方法を提供する。
中の多数のタンパク質の発現方法であって、その植物のゲノム中に、シグナル配
列であって２またはそれ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター
領域に作動可能なように結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合
したプロモーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、
それらタンパク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列
によって互いに隔てられていて、そのプロペプチドは、発現されるポリタンパク
質が成分タンパク質分子中に翻訳後プロセシングされるところの切断部位を与え
、そしてここにおいて、追加の特異的プロテアーゼ認識部位が、配列の切断を容
易にするように、そのリンカープロペプチドのどちらか一方のまたは両末端で操
作されている上記方法を提供する。
【００５２】 また更に好ましい実施態様により、本発明は、更に、トランスジェニック植物
中の多数のタンパク質の発現方法であって、その植物のゲノム中に、シグナル配
列であって２またはそれ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター
領域に作動可能なように結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合
したプロモーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、
それらタンパク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列
によって互いに隔てられていて、そのリンカープロペプチドは、デフェンシンお
よび／またはヘベイン型抗微生物性ペプチドに由来することができ、そのプロペ
プチドは、発現されるポリタンパク質が成分タンパク質分子中に翻訳後プロセシ
ングされるところの切断部位を与え、そしてここにおいて、追加の特異的プロテ
アーゼ認識部位が、配列の切断を容易にするように、そのリンカープロペプチド
のどちらか一方の末端または両末端で操作されている上記方法を提供する。
中の多数のタンパク質の発現方法であって、その植物のゲノム中に、シグナル配
列であって２またはそれ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター
領域に作動可能なように結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合
したプロモーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて、
それらタンパク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列
によって互いに隔てられていて、そのリンカープロペプチドは、デフェンシンお
よび／またはヘベイン型抗微生物性ペプチドに由来することができ、そのプロペ
プチドは、発現されるポリタンパク質が成分タンパク質分子中に翻訳後プロセシ
ングされるところの切断部位を与え、そしてここにおいて、追加の特異的プロテ
アーゼ認識部位が、配列の切断を容易にするように、そのリンカープロペプチド
のどちらか一方の末端または両末端で操作されている上記方法を提供する。
【００５３】 本発明は、更に、トランスジェニック植物中の分泌経路によって合成されるポ
リタンパク質前駆体中の切断可能なリンカーとしての、植物由来タンパク質から
単離可能なプロペプチドの使用を提供する。それらプロペプチドは、好ましくは
、植物デフェンシンの前駆体またはヘベイン型抗微生物性ペプチドから単離可能
である（Broekaert ら，1997, Crit.Rev.Plant.Sci. 16,297-323）。それらプロ
ペプチドは、好ましくは、Impatiens 属に由来する抗微生物性ペプチドから単離
可能でもありうる。
リタンパク質前駆体中の切断可能なリンカーとしての、植物由来タンパク質から
単離可能なプロペプチドの使用を提供する。それらプロペプチドは、好ましくは
、植物デフェンシンの前駆体またはヘベイン型抗微生物性ペプチドから単離可能
である（Broekaert ら，1997, Crit.Rev.Plant.Sci. 16,297-323）。それらプロ
ペプチドは、好ましくは、Impatiens 属に由来する抗微生物性ペプチドから単離
可能でもありうる。
【００５４】 もう一つの態様において、本発明は、トランスジェニック植物中の分泌経路に
よって合成されるポリタンパク質前駆体中の切断可能なリンカーとしてのプロペ
プチドの使用であって、そのプロペプチドの配列の少なくとも４０％が、アラニ
ン、バリン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプ
トファンおよびチロシンより選択される２〜５個連続した疎水性残基の伸長かま
たはアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、セリン
、トレオニン、グルタミンおよびアスパラギンより選択される２〜５個連続した
親水性残基の伸長から成る上記使用を提供する。
よって合成されるポリタンパク質前駆体中の切断可能なリンカーとしてのプロペ
プチドの使用であって、そのプロペプチドの配列の少なくとも４０％が、アラニ
ン、バリン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプ
トファンおよびチロシンより選択される２〜５個連続した疎水性残基の伸長かま
たはアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、セリン
、トレオニン、グルタミンおよびアスパラギンより選択される２〜５個連続した
親水性残基の伸長から成る上記使用を提供する。
【００５５】 そのリンカープロペプチドは、そのＮ−またはＣ末端切断部位の７残基中に、
２〜５個連続した酸性残基、２〜５個の塩基性残基または２〜５個連続した酸性
および塩基性混合残基を含む配列を有することが更に好適である。
２〜５個連続した酸性残基、２〜５個の塩基性残基または２〜５個連続した酸性
および塩基性混合残基を含む配列を有することが更に好適である。
【００５６】 そのリンカープロペプチドの配列の少なくとも４０％は、アラニン、バリン、
イソロイシン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよ
びチロシンより選択される２〜５個連続した疎水性残基の伸長かまたはアスパラ
ギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、トレオニン
、グルタミンおよびアスパラギンより選択される２〜５個連続した親水性残基の
伸長から成り、そしてそのＮ−またはＣ末端切断部位の７残基中に、２〜５個連
続した酸性残基、２〜５個の塩基性残基または２〜５個連続した酸性および塩基
性混合残基を含む配列を有することが特に好適である。
イソロイシン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよ
びチロシンより選択される２〜５個連続した疎水性残基の伸長かまたはアスパラ
ギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、トレオニン
、グルタミンおよびアスパラギンより選択される２〜５個連続した親水性残基の
伸長から成り、そしてそのＮ−またはＣ末端切断部位の７残基中に、２〜５個連
続した酸性残基、２〜５個の塩基性残基または２〜５個連続した酸性および塩基
性混合残基を含む配列を有することが特に好適である。
【００５７】 もう一つの態様において、本発明は、低分子アミノ酸Ａ、Ｖ、ＳおよびＴが多
く且つ２個の酸性残基か、２個の塩基性残基かまたは、１個の酸性および１個の
塩基性残基から成るジペプチド配列を含有するペプチド配列の、切断可能なリン
カー配列としての使用であって、その配列が植物デフェンシンまたはヘベイン型
抗微生物性タンパク質から単離可能である上記使用を提供する。
く且つ２個の酸性残基か、２個の塩基性残基かまたは、１個の酸性および１個の
塩基性残基から成るジペプチド配列を含有するペプチド配列の、切断可能なリン
カー配列としての使用であって、その配列が植物デフェンシンまたはヘベイン型
抗微生物性タンパク質から単離可能である上記使用を提供する。
【００５８】 本発明の方法は、任意の所望のタンパク質の有効な発現および分泌を行うのに
用いることができ、機能性の形で折りたたまれるためには分泌経路中で天然に合
成されなければならないタンパク質（例えば、グリコシル化タンパク質およびジ
スルフィド架橋を有するものなど）の発現に特に適している。更に、病原体によ
る攻撃への植物の防御に関与するタンパク質を細胞外空間に効率よく分泌させる
ことは、通常は、これが最初の病原体攻撃部位であるので極めて好都合であり、
本発明の方法は、多数のタンパク質を細胞外に送る有効な手段を提供する。
用いることができ、機能性の形で折りたたまれるためには分泌経路中で天然に合
成されなければならないタンパク質（例えば、グリコシル化タンパク質およびジ
スルフィド架橋を有するものなど）の発現に特に適している。更に、病原体によ
る攻撃への植物の防御に関与するタンパク質を細胞外空間に効率よく分泌させる
ことは、通常は、これが最初の病原体攻撃部位であるので極めて好都合であり、
本発明の方法は、多数のタンパク質を細胞外に送る有効な手段を提供する。
【００５９】 本発明の方法は、免疫感作目的に用いてもよい低分子ペプチドを製造するのに
も特に適している、すなわち、トランスジェニック植物またはそれに由来する種
子は、食物として直接的に用いられることによって、受容者を受動免疫感作する
ことができる。
も特に適している、すなわち、トランスジェニック植物またはそれに由来する種
子は、食物として直接的に用いられることによって、受容者を受動免疫感作する
ことができる。
【００６０】 本発明の方法によって発現させることができるタンパク質の例には、例えば、
Ｒｓ−ＡＦＰ１、Ｒｓ−ＡＦＰ２、Ｄｍ−ＡＭＰ１、Ｄｍ−ＡＭＰ２、Ｈｓ−Ａ
ＦＰ１、Ａｈ−ＡＭＰ１、Ｃｔ−ＡＭＰ１、Ｃｔ−ＡＭＰ２、Ｂｎ−ＡＦＰ１、
Ｂｎ−ＡＦＰ２、Ｂｒ−ＡＦＰ１、Ｂｒ−ＡＦＰ２、Ｓａ−ＡＦＰ１、Ｓａ−Ａ
ＦＰ２、Ｃｂ−ＡＭＰ１、Ｃｂ−ＡＭＰ２、Ｃａ−ＡＭＰ１、Ｂｍ−ＡＭＰ１、
Ａｃｅ−ＡＭＰ１、Ａｃ−ＡＭＰ１、Ａｃ−ＡＭＰ２、Ｍｊ−ＡＭＰ１、Ｍｊ−
ＡＭＰ２、Ｉｂ−ＡＭＰ１、Ｉｂ−ＡＭＰ２、Ｉｂ−ＡＭＰ３、Ｉｂ−ＡＭＰ４
、キチナーゼのようなＰＲ−１型タンパク質、β１，３およびβ１，６グルカナ
ーゼのようなグルカナーゼ、キチン結合レクチン、ゼアマチン（zeamatins）、
オスモチン、チオニンおよびリボソーム不活性化タンパク質およびそれらに由来
するペプチドを含めた、公開国際特許出願第ＷＯ９２／１５６９１号、同ＷＯ９
２／２１６９９号、同ＷＯ９３／０５１５３号、同ＷＯ９３／０４５８６号、同
ＷＯ９４／１１５１１号、同ＷＯ９５／０４７５４号、同ＷＯ９５／１８２２９
号、同ＷＯ９５／２４４８６号、同ＷＯ９７／２１８１４号および同ＷＯ９７／
２１８１５号に記載の抗真菌性タンパク質、または配列同一性が上に定義の通り
であるそれらタンパク質のいずれかと８５％の配列同一性、好ましくは、９０％
を越える配列同一性、より好ましくは、９５％を越える配列同一性を示す抗真菌
性タンパク質が含まれる。
Ｒｓ−ＡＦＰ１、Ｒｓ−ＡＦＰ２、Ｄｍ−ＡＭＰ１、Ｄｍ−ＡＭＰ２、Ｈｓ−Ａ
ＦＰ１、Ａｈ−ＡＭＰ１、Ｃｔ−ＡＭＰ１、Ｃｔ−ＡＭＰ２、Ｂｎ−ＡＦＰ１、
Ｂｎ−ＡＦＰ２、Ｂｒ−ＡＦＰ１、Ｂｒ−ＡＦＰ２、Ｓａ−ＡＦＰ１、Ｓａ−Ａ
ＦＰ２、Ｃｂ−ＡＭＰ１、Ｃｂ−ＡＭＰ２、Ｃａ−ＡＭＰ１、Ｂｍ−ＡＭＰ１、
Ａｃｅ−ＡＭＰ１、Ａｃ−ＡＭＰ１、Ａｃ−ＡＭＰ２、Ｍｊ−ＡＭＰ１、Ｍｊ−
ＡＭＰ２、Ｉｂ−ＡＭＰ１、Ｉｂ−ＡＭＰ２、Ｉｂ−ＡＭＰ３、Ｉｂ−ＡＭＰ４
、キチナーゼのようなＰＲ−１型タンパク質、β１，３およびβ１，６グルカナ
ーゼのようなグルカナーゼ、キチン結合レクチン、ゼアマチン（zeamatins）、
オスモチン、チオニンおよびリボソーム不活性化タンパク質およびそれらに由来
するペプチドを含めた、公開国際特許出願第ＷＯ９２／１５６９１号、同ＷＯ９
２／２１６９９号、同ＷＯ９３／０５１５３号、同ＷＯ９３／０４５８６号、同
ＷＯ９４／１１５１１号、同ＷＯ９５／０４７５４号、同ＷＯ９５／１８２２９
号、同ＷＯ９５／２４４８６号、同ＷＯ９７／２１８１４号および同ＷＯ９７／
２１８１５号に記載の抗真菌性タンパク質、または配列同一性が上に定義の通り
であるそれらタンパク質のいずれかと８５％の配列同一性、好ましくは、９０％
を越える配列同一性、より好ましくは、９５％を越える配列同一性を示す抗真菌
性タンパク質が含まれる。
【００６１】 切断可能なリンカーは、目的の２またはそれ以上のタンパク質を結合するのに
用いられ、そのポリタンパク質が成分タンパク質分子に翻訳後プロセシングされ
るところの切断部位を与える。
用いられ、そのポリタンパク質が成分タンパク質分子に翻訳後プロセシングされ
るところの切断部位を与える。
【００６２】 もう一つの態様において、本発明は、植物由来のシグナル配列であって２また
はそれ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター領域に作動可能な
ように結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合したプロモーター
領域を含むＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、それらタンパク質コード領
域が、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって互いに隔てられて
いて、そのプロペプチドが翻訳後切断部位を与える上記ＤＮＡ構築物を提供する
。
はそれ以上のタンパク質コード領域および３’ターミネーター領域に作動可能な
ように結合しているそのシグナル配列に作動可能なように結合したプロモーター
領域を含むＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、それらタンパク質コード領
域が、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって互いに隔てられて
いて、そのプロペプチドが翻訳後切断部位を与える上記ＤＮＡ構築物を提供する
。
【００６３】 好適には、タンパク質コード領域は、異なったタンパク質をコードしている。
プロペプチドリンカー配列の好ましい例は、上に詳述された通りである。 この態様の好ましい実施態様において、本発明は、ＤＮＡ構築物であって、リ
ンカープロペプチドをコードしているそのＤＮＡ配列が、Ｉｂ−ＡＭＰ遺伝子か
らの内部プロペプチドをコードするＤＮＡ構築物を提供する。この態様の更に好
ましい実施態様において、本発明は、ＤＮＡ構築物であって、リンカープロペプ
チドをコードしているそのＤＮＡ配列が、Ｄｍ−ＡＭＰ遺伝子またはＡｃ−ＡＭ
Ｐ遺伝子からのＣ末端プロペプチドをコードするＤＮＡ構築物を提供する。
プロペプチドリンカー配列の好ましい例は、上に詳述された通りである。 この態様の好ましい実施態様において、本発明は、ＤＮＡ構築物であって、リ
ンカープロペプチドをコードしているそのＤＮＡ配列が、Ｉｂ−ＡＭＰ遺伝子か
らの内部プロペプチドをコードするＤＮＡ構築物を提供する。この態様の更に好
ましい実施態様において、本発明は、ＤＮＡ構築物であって、リンカープロペプ
チドをコードしているそのＤＮＡ配列が、Ｄｍ−ＡＭＰ遺伝子またはＡｃ−ＡＭ
Ｐ遺伝子からのＣ末端プロペプチドをコードするＤＮＡ構築物を提供する。
【００６４】 特に好ましい実施態様において、本発明は、上記のようなＤＮＡ構築物であっ
て、リンカープロペプチドをコードしているそのＤＮＡ配列が、Ｄｍ−ＡＭＰ遺
伝子またはＡｃ−ＡＭＰ遺伝子に由来する場合、そのどちらか一方の末端または
両末端に一つまたはそれ以上のプロテアーゼ認識部位を更に含むＤＮＡ構築物を
提供する。
て、リンカープロペプチドをコードしているそのＤＮＡ配列が、Ｄｍ−ＡＭＰ遺
伝子またはＡｃ−ＡＭＰ遺伝子に由来する場合、そのどちらか一方の末端または
両末端に一つまたはそれ以上のプロテアーゼ認識部位を更に含むＤＮＡ構築物を
提供する。
【００６５】 もう一つの態様において、本発明は、２またはそれ以上のタンパク質コード領
域および３’ターミネーター領域に作動可能なように結合したプロモーター領域
を含むＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、それらタンパク質コード領域が
、Ｄｍ−ＡＭＰ遺伝子またはＡｃ−ＡＭＰ遺伝子からのＣ末端プロペプチドをコ
ードしているリンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって互いに隔て
られていて、そのプロペプチドが翻訳後切断部位を与える上記ＤＮＡ構築物を提
供する。
域および３’ターミネーター領域に作動可能なように結合したプロモーター領域
を含むＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、それらタンパク質コード領域が
、Ｄｍ−ＡＭＰ遺伝子またはＡｃ−ＡＭＰ遺伝子からのＣ末端プロペプチドをコ
ードしているリンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって互いに隔て
られていて、そのプロペプチドが翻訳後切断部位を与える上記ＤＮＡ構築物を提
供する。
【００６６】 特に好ましい実施態様において、本発明は、上記のようなＤＮＡ構築物であっ
て、Ｄｍ−ＡＭＰまたはＡｃ−ＡＭＰからのリンカープロペプチドをコードして
いるＤＮＡ配列が、そのどちらか一方の末端または両末端に一つまたはそれ以上
のプロテアーゼ認識部位を更に含むＤＮＡ構築物を提供する。
て、Ｄｍ−ＡＭＰまたはＡｃ−ＡＭＰからのリンカープロペプチドをコードして
いるＤＮＡ配列が、そのどちらか一方の末端または両末端に一つまたはそれ以上
のプロテアーゼ認識部位を更に含むＤＮＡ構築物を提供する。
【００６７】 なおもう一つの態様において、本発明は、本発明の上の態様のいずれかによる
ＤＮＡ構築物を用いてトランスフェクションされたトランスジェニック植物を提
供する。
ＤＮＡ構築物を用いてトランスフェクションされたトランスジェニック植物を提
供する。
【００６８】 もう一つの態様において、本発明は、シグナル配列であって２またはそれ以上
のタンパク質コード領域および３’ターミネーター領域に作動可能なように結合
しているそのシグナル配列に作動可能なように結合したプロモーター領域を含む
ＤＮＡ配列を用いてトランスフェクションされたトランスジェニック植物であっ
て、それらタンパク質コード領域が、翻訳時に切断部位を与えるリンカープロペ
プチドをコードするＤＮＡ配列によって互いに隔てられているトランスジェニッ
ク植物を提供する。
のタンパク質コード領域および３’ターミネーター領域に作動可能なように結合
しているそのシグナル配列に作動可能なように結合したプロモーター領域を含む
ＤＮＡ配列を用いてトランスフェクションされたトランスジェニック植物であっ
て、それらタンパク質コード領域が、翻訳時に切断部位を与えるリンカープロペ
プチドをコードするＤＮＡ配列によって互いに隔てられているトランスジェニッ
ク植物を提供する。
【００６９】 この態様の好ましい実施態様において、そのリンカープロペプチドの配列の少
なくとも４０％は、アラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、
フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンより選択される２〜５個連続
した疎水性残基の伸長かまたはアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギ
ニン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、グルタミンおよびアスパラギンより選
択される２〜５個連続した親水性残基の伸長から成る。
なくとも４０％は、アラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、
フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンより選択される２〜５個連続
した疎水性残基の伸長かまたはアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギ
ニン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、グルタミンおよびアスパラギンより選
択される２〜５個連続した親水性残基の伸長から成る。
【００７０】 それら疎水性残基は、好ましくは、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン
および／またはイソロイシンであり、親水性残基は、好ましくは、アスパラギン
酸、グルタミン酸、リシンおよび／またはアルギニンである。
および／またはイソロイシンであり、親水性残基は、好ましくは、アスパラギン
酸、グルタミン酸、リシンおよび／またはアルギニンである。
【００７１】 リンカープロペプチドは、そのＮ−またはＣ末端切断部位の７残基中に、２〜
５個連続した酸性残基、２〜５個の塩基性残基または２〜５個連続した酸性およ
び塩基性混合残基を含む配列を有するのが更に好ましい。
５個連続した酸性残基、２〜５個の塩基性残基または２〜５個連続した酸性およ
び塩基性混合残基を含む配列を有するのが更に好ましい。
【００７２】 リンカープロペプチドの配列の少なくとも４０％は、アラニン、バリン、イソ
ロイシン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチ
ロシンより選択される２〜５個連続した疎水性残基の伸長かまたはアスパラギン
酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、グ
ルタミンおよびアスパラギンより選択される２〜５個連続した親水性残基の伸長
から成り、そしてそのＮ−またはＣ末端切断部位の７残基中に、２〜５個連続し
た酸性残基、２〜５個の塩基性残基または２〜５個連続した酸性および塩基性混
合残基を含む配列を有するのが特に好ましい。
ロイシン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチ
ロシンより選択される２〜５個連続した疎水性残基の伸長かまたはアスパラギン
酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、グ
ルタミンおよびアスパラギンより選択される２〜５個連続した親水性残基の伸長
から成り、そしてそのＮ−またはＣ末端切断部位の７残基中に、２〜５個連続し
た酸性残基、２〜５個の塩基性残基または２〜５個連続した酸性および塩基性混
合残基を含む配列を有するのが特に好ましい。
【００７３】 本発明のこの態様の更に好ましい実施態様において、切断部位を与えるＤＮＡ
配列は、低分子アミノ酸Ａ、Ｖ、ＳおよびＴが多く且つ２個の酸性残基か、２個
の塩基性残基かまたは、１個の酸性および１個の塩基性残基から成るジペプチド
配列を含有するペプチド配列をコードする。
配列は、低分子アミノ酸Ａ、Ｖ、ＳおよびＴが多く且つ２個の酸性残基か、２個
の塩基性残基かまたは、１個の酸性および１個の塩基性残基から成るジペプチド
配列を含有するペプチド配列をコードする。
【００７４】 本発明のこの態様の特に好ましい実施態様において、切断部位を与えるＤＮＡ
配列は、例えば、図２に記載されるようなＩｂ−ＡＭＰ遺伝子に由来するプロペ
プチドをコードする。本発明のこの態様の更に別の特に好ましい実施態様におい
て、切断部位を与えるＤＮＡ配列は、ズブチリシン様プロテアーゼ認識部位をコ
ードしている追加のＤＮＡ配列を含むように操作されていてよい図２に記載のＤ
ｍ−ＡＭＰ１およびＡｃ−ＡＭＰ２からのＣ末端プロペプチドをコードする。
配列は、例えば、図２に記載されるようなＩｂ−ＡＭＰ遺伝子に由来するプロペ
プチドをコードする。本発明のこの態様の更に別の特に好ましい実施態様におい
て、切断部位を与えるＤＮＡ配列は、ズブチリシン様プロテアーゼ認識部位をコ
ードしている追加のＤＮＡ配列を含むように操作されていてよい図２に記載のＤ
ｍ−ＡＭＰ１およびＡｃ−ＡＭＰ２からのＣ末端プロペプチドをコードする。
【００７５】 もう一つの態様において、本発明は、上記のようなＤＮＡ構築物を含むベクタ
ーを提供する。 本明細書中に記載のいくつかのリンカー配列は新規であり、これらおよびこれ
らのコーディング配列は、本発明のもう一つの態様を成している。したがって、
具体的には、配列番号４、６、７、２９、２１、２２、２３、２４、２５、２６
、２７、２８のリンカーペプチドまたは図３４に示されるリンカーペプチド、更
にはその変異体をコードする核酸を提供する。具体的な変異体は、Ｃ末端に結合
した配列番号７７を有するものであろう。
ーを提供する。 本明細書中に記載のいくつかのリンカー配列は新規であり、これらおよびこれ
らのコーディング配列は、本発明のもう一つの態様を成している。したがって、
具体的には、配列番号４、６、７、２９、２１、２２、２３、２４、２５、２６
、２７、２８のリンカーペプチドまたは図３４に示されるリンカーペプチド、更
にはその変異体をコードする核酸を提供する。具体的な変異体は、Ｃ末端に結合
した配列番号７７を有するものであろう。
【００７６】 当業者に容易に明らかになるように、ＤＮＡ配列の個々の成分の配列、すなわ
ち、本発明による方法で用いるためのシグナル配列、プロモーター配列、リンカ
ー配列、１種類または複数のタンパク質配列、ターミネーター配列は、その既知
のアミノ酸配列から予想することができ、タンパク質をコードしているＤＮＡは
、標準的な核酸合成機を用いて製造することができる。或いは、本発明の成分を
コードしているＤＮＡは、天然の源から適当な単離によって製造することができ
る。
ち、本発明による方法で用いるためのシグナル配列、プロモーター配列、リンカ
ー配列、１種類または複数のタンパク質配列、ターミネーター配列は、その既知
のアミノ酸配列から予想することができ、タンパク質をコードしているＤＮＡは
、標準的な核酸合成機を用いて製造することができる。或いは、本発明の成分を
コードしているＤＮＡは、天然の源から適当な単離によって製造することができ
る。
【００７７】 本発明を、次の非制限実施例および図面に関して更に詳しく説明する。 次の実施例は、本発明を詳しく説明する。 実施例１ ＤｍＡＭＰ１ ｃＤＮＡおよびＤｍＡＭＰ１遺伝子のクローニング クローニング手順およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順は、標準的なプ
ロトコールにしたがって行われた（Sambrook ら，1989, Molecular Cloning: a
laboratory manual, 第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，コールド
・スプリング・ハーバー，ＮＹ）。ｃＤＮＡライブラリーは、ダリア・マーキイ
（Dahlia merckii）の花から集められたほぼ乾燥した種子から構築した。全ＲＮ
Ａを、Jepson I. ら（1991, Plant Mol.Biol.Reporter 9,131-138）の方法を用
いて、それら種子から精製した。０．６ｍｇの全ＲＮＡが、２ｇの D.merckii
種子から得られた。ポリＡ Tract 磁気ビーズ（Promega）を用いて、約２μｇの
ポリＡ＋ＲＮＡを０．２ｍｇの全ＲＮＡから単離した。
ロトコールにしたがって行われた（Sambrook ら，1989, Molecular Cloning: a
laboratory manual, 第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，コールド
・スプリング・ハーバー，ＮＹ）。ｃＤＮＡライブラリーは、ダリア・マーキイ
（Dahlia merckii）の花から集められたほぼ乾燥した種子から構築した。全ＲＮ
Ａを、Jepson I. ら（1991, Plant Mol.Biol.Reporter 9,131-138）の方法を用
いて、それら種子から精製した。０．６ｍｇの全ＲＮＡが、２ｇの D.merckii
種子から得られた。ポリＡ Tract 磁気ビーズ（Promega）を用いて、約２μｇの
ポリＡ＋ＲＮＡを０．２ｍｇの全ＲＮＡから単離した。
【００７８】 ポリＡ＋ＲＮＡは、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット（Stratagene）を用いてｃＤ
ＮＡを構築するのに用いられた。第一および第二鎖合成後、ｃＤＮＡをベクター
ＤＮＡと連結した。Gigapack Gold（Stratagene）包装抽出物を用いたファージ
組立後、約１ｘ１０5プラーク形成単位（ｐｆｕ）を得た。ＤｍＡＭＰ１のＮ末
端配列ＣＥＫＡＳＫＴＷ（配列番号１４）に基づくオリゴヌクレオチドＡＦＰ−
５（５’−ＴＧ（Ｔ，Ｃ）ＧＡＮＡＡＮＧＣＮ（Ａ，Ｔ）（Ｇ，Ｃ）ＮＡＡ（Ａ
，Ｇ）ＡＣＮＴＧＧ）（配列番号１３）（Osborn R.W. ら，1995, FEBS Lett. 3
68,257-262）およびＤｍＡＭＰ１のＣ末端配列ＭＣＦＣＹＦＮＣ（配列番号５３
）に基づくＡＦＰ−３ＥＸ（５’−ＣＡ（Ａ，Ｇ）ＴＴ（Ａ，Ｇ）ＡＡＮＴＡＮ
ＣＡＮＡＡＡ（Ａ，Ｇ）ＣＡＣＡＴ）（配列番号５２）および D.merckii 葉か
ら単離されたゲノムＤＮＡを用いて、１４４ｂｐのＰＣＲ産物を製造し、アガロ
ースゲルから単離した。そのＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローン
化した。１０個の形質転換体のインサートを配列決定した。それら配列は３個の
極めて相同のＤｍＡＭＰ１様遺伝子を示したが、その内の一つであるＰＣＲクロ
ーン４は、認められた成熟ＤｍＡＭＰ１をコードしていた。32Ｐ ＣＴＰを用い
て標識された１４４ｂｐ ＰＣＲ産物混合物を用いて、全部で６ｘ１０4ｐｆｕ
のｃＤＮＡライブラリーを含有するプレートから得られた Hybond Ｎ（Amersham
）フィルターリフトをプローブした。３０の潜在的に正のシグナルが認められた
。２２個のプラークを集め、更に２回のスクリーニングによって得た。in vivo
切除後、１３個のクローンを、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。４クラス
のＤｍＡＭＰ関連ペプチドは、それら１３のｃＤＮＡクローンによってコードさ
れていた。ＤｍＡＭＰ成熟タンパク質領域の３種類の変形は、それら四つのクラ
スで示された。それらクラスの一つ（Ｄｍ２．５型）は、ＤｍＡＭＰ２に対応し
うる成熟タンパク質領域を含有していた（Osborn R.W. ら，1995, FEBS Lett. 3
68,257-262）。それらｃＤＮＡで、認められた成熟ＤｍＡＭＰ１ペプチド配列に
等しい成熟タンパク質領域をコードしたものはなかった。
ＮＡを構築するのに用いられた。第一および第二鎖合成後、ｃＤＮＡをベクター
ＤＮＡと連結した。Gigapack Gold（Stratagene）包装抽出物を用いたファージ
組立後、約１ｘ１０5プラーク形成単位（ｐｆｕ）を得た。ＤｍＡＭＰ１のＮ末
端配列ＣＥＫＡＳＫＴＷ（配列番号１４）に基づくオリゴヌクレオチドＡＦＰ−
５（５’−ＴＧ（Ｔ，Ｃ）ＧＡＮＡＡＮＧＣＮ（Ａ，Ｔ）（Ｇ，Ｃ）ＮＡＡ（Ａ
，Ｇ）ＡＣＮＴＧＧ）（配列番号１３）（Osborn R.W. ら，1995, FEBS Lett. 3
68,257-262）およびＤｍＡＭＰ１のＣ末端配列ＭＣＦＣＹＦＮＣ（配列番号５３
）に基づくＡＦＰ−３ＥＸ（５’−ＣＡ（Ａ，Ｇ）ＴＴ（Ａ，Ｇ）ＡＡＮＴＡＮ
ＣＡＮＡＡＡ（Ａ，Ｇ）ＣＡＣＡＴ）（配列番号５２）および D.merckii 葉か
ら単離されたゲノムＤＮＡを用いて、１４４ｂｐのＰＣＲ産物を製造し、アガロ
ースゲルから単離した。そのＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローン
化した。１０個の形質転換体のインサートを配列決定した。それら配列は３個の
極めて相同のＤｍＡＭＰ１様遺伝子を示したが、その内の一つであるＰＣＲクロ
ーン４は、認められた成熟ＤｍＡＭＰ１をコードしていた。32Ｐ ＣＴＰを用い
て標識された１４４ｂｐ ＰＣＲ産物混合物を用いて、全部で６ｘ１０4ｐｆｕ
のｃＤＮＡライブラリーを含有するプレートから得られた Hybond Ｎ（Amersham
）フィルターリフトをプローブした。３０の潜在的に正のシグナルが認められた
。２２個のプラークを集め、更に２回のスクリーニングによって得た。in vivo
切除後、１３個のクローンを、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。４クラス
のＤｍＡＭＰ関連ペプチドは、それら１３のｃＤＮＡクローンによってコードさ
れていた。ＤｍＡＭＰ成熟タンパク質領域の３種類の変形は、それら四つのクラ
スで示された。それらクラスの一つ（Ｄｍ２．５型）は、ＤｍＡＭＰ２に対応し
うる成熟タンパク質領域を含有していた（Osborn R.W. ら，1995, FEBS Lett. 3
68,257-262）。それらｃＤＮＡで、認められた成熟ＤｍＡＭＰ１ペプチド配列に
等しい成熟タンパク質領域をコードしたものはなかった。
【００７９】 ＰＣＲクローン４（上記）の配列およびｃＤＮＡ配列から推論されるペプチド
のＮ−およびＣ末端からの情報を用いて、ＤｍＡＭＰ１をコードしている遺伝子
の増幅のための２対のオリゴヌクレオチドを設計した。D.merckii からのゲノム
ＤＮＡを、ＰＣＲ反応において、オリゴヌクレオチドＭＡＴＡＦＰ−５Ｐ（５’
−ＡＴＧＧＣ（Ｃ，Ｇ）ＡＡＮ（Ａ，Ｃ）（Ａ，Ｇ）ＮＴＣ（Ａ，Ｇ）ＧＴＴＧ
ＣＮＴＴ）（配列番号６６）およびＭＡＴＡＦＰ−５（５’−ＡＡＡＣＡＣＡＴ
ＧＴＧＴＴＴＣＣＣＡＴＴ）（配列番号５４）と一緒に用い、そのＰＣＲ産物を
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローン化し、クローンを配列決定した。ＤｍＡＭ
Ｐ１遺伝子の５’半分を含有するクローンを識別した。D.merckii からのゲノム
ＤＮＡを、ＰＣＲ反応において、ＭＡＴＡＦＰ−３（５’−ＡＧＣＧＴＧＴＣＡ
ＴＧＴＧＣＧＴＡＡＴ）（配列番号５５）およびＤＭ２５ＭＡＴ−３（５’−Ｔ
ＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＡＣＣＣＴＴＴＣＡＣＧＧ）（配列番号５６）と一緒に用
い、そのＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローン化し、クローンを配
列決定した。ＤｍＡＭＰ１遺伝子の３’半分を含有するクローンを識別した。成
熟遺伝子の５’および３’部分を一緒にして、ＤｍＡＭＰ１遺伝子のコーディン
グ領域の配列を組み立てた（図１）。
のＮ−およびＣ末端からの情報を用いて、ＤｍＡＭＰ１をコードしている遺伝子
の増幅のための２対のオリゴヌクレオチドを設計した。D.merckii からのゲノム
ＤＮＡを、ＰＣＲ反応において、オリゴヌクレオチドＭＡＴＡＦＰ−５Ｐ（５’
−ＡＴＧＧＣ（Ｃ，Ｇ）ＡＡＮ（Ａ，Ｃ）（Ａ，Ｇ）ＮＴＣ（Ａ，Ｇ）ＧＴＴＧ
ＣＮＴＴ）（配列番号６６）およびＭＡＴＡＦＰ−５（５’−ＡＡＡＣＡＣＡＴ
ＧＴＧＴＴＴＣＣＣＡＴＴ）（配列番号５４）と一緒に用い、そのＰＣＲ産物を
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローン化し、クローンを配列決定した。ＤｍＡＭ
Ｐ１遺伝子の５’半分を含有するクローンを識別した。D.merckii からのゲノム
ＤＮＡを、ＰＣＲ反応において、ＭＡＴＡＦＰ−３（５’−ＡＧＣＧＴＧＴＣＡ
ＴＧＴＧＣＧＴＡＡＴ）（配列番号５５）およびＤＭ２５ＭＡＴ−３（５’−Ｔ
ＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＡＣＣＣＴＴＴＣＡＣＧＧ）（配列番号５６）と一緒に用
い、そのＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローン化し、クローンを配
列決定した。ＤｍＡＭＰ１遺伝子の３’半分を含有するクローンを識別した。成
熟遺伝子の５’および３’部分を一緒にして、ＤｍＡＭＰ１遺伝子のコーディン
グ領域の配列を組み立てた（図１）。
【００８０】 ＤｍＡＭＰ１遺伝子は、２８アミノ酸リーダーペプチド、５０アミノ酸成熟タ
ンパク質および４０アミノ酸Ｃ末端プロペプチドを含む前駆体をコードしている
。その読み取り枠は、リーダーペプチド領域内に位置する９２ｂｐイントロンに
よって分断されている。そのイントロンをＤｍＡＭＰ１遺伝子配列から除去し且
つそのＤｍＡＭＰ１をコードしている領域を、Ｃ末端プロペプチドを含んでまた
は含むことなく、発現カセットベクター中にクローニングさせるために、二つの
ＰＣＲ反応を、ＤＭＶＥＣ−３（５’−ＡＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＴＣ
ＧＧＴＣＧＧＴＴＧＣＧＴＴＣＴＣＣＧＣＧＴＴＣＧＴＴＣＴＧＡＴＣＣＴＴＴ
ＴＣＧＴＧＣＴＣＧＣＣＡＴＣＴＣＡＧＡＴＡＴＣＧＣＡＴＣＣＧＴＴＡＧＴＧ
ＧＡＧＡＡＣＴＡＴＧＣＧＡＧＡＡＡ）（配列番号５７）とＤＭＶＥＣ−２（５
’−ＡＡＡＣＣＧＡＣＣＧＡＧＣＴＣＡＣＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＣＧＴＴＴＧＧ
ＡＡＣ）（配列番号５８）、およびＤＭＶＥＣ−３とＤＭＶＥＣ４（５’−ＡＧ
ＣＡＡＧＣＴＴＴＴＣＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＣＡＡＴＴＧＡＡＧＴＡＡ）（配列
番号５９）のプライマーセットをそれぞれ用いて行った。ＤＭＶＥＣ−３は、Ｄ
ｍＡＭＰ１遺伝子の上部鎖で開始し、イントロンを含まないリーダーペプチド領
域に対応し、翻訳開始時にＮｃｏＩ部位を導入する。ＤＭＶＥＣ−２は、ＤｍＡ
ＭＰ１遺伝子の下部鎖においてＣ末端プロペプチド領域の３’末端で開始し、翻
訳停止コドンの後にＳａｃＩ部位を導入する。ＤＭＶＥＣ−４は、ＤＭＡＭＰ１
遺伝子の下部鎖において成熟タンパク質領域の３’末端で開始し、この領域の後
の停止コドンを融合し、その停止コドンの後にＳａｃＩ部位を導入する。
ンパク質および４０アミノ酸Ｃ末端プロペプチドを含む前駆体をコードしている
。その読み取り枠は、リーダーペプチド領域内に位置する９２ｂｐイントロンに
よって分断されている。そのイントロンをＤｍＡＭＰ１遺伝子配列から除去し且
つそのＤｍＡＭＰ１をコードしている領域を、Ｃ末端プロペプチドを含んでまた
は含むことなく、発現カセットベクター中にクローニングさせるために、二つの
ＰＣＲ反応を、ＤＭＶＥＣ−３（５’−ＡＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＴＣ
ＧＧＴＣＧＧＴＴＧＣＧＴＴＣＴＣＣＧＣＧＴＴＣＧＴＴＣＴＧＡＴＣＣＴＴＴ
ＴＣＧＴＧＣＴＣＧＣＣＡＴＣＴＣＡＧＡＴＡＴＣＧＣＡＴＣＣＧＴＴＡＧＴＧ
ＧＡＧＡＡＣＴＡＴＧＣＧＡＧＡＡＡ）（配列番号５７）とＤＭＶＥＣ−２（５
’−ＡＡＡＣＣＧＡＣＣＧＡＧＣＴＣＡＣＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＣＧＴＴＴＧＧ
ＡＡＣ）（配列番号５８）、およびＤＭＶＥＣ−３とＤＭＶＥＣ４（５’−ＡＧ
ＣＡＡＧＣＴＴＴＴＣＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＣＡＡＴＴＧＡＡＧＴＡＡ）（配列
番号５９）のプライマーセットをそれぞれ用いて行った。ＤＭＶＥＣ−３は、Ｄ
ｍＡＭＰ１遺伝子の上部鎖で開始し、イントロンを含まないリーダーペプチド領
域に対応し、翻訳開始時にＮｃｏＩ部位を導入する。ＤＭＶＥＣ−２は、ＤｍＡ
ＭＰ１遺伝子の下部鎖においてＣ末端プロペプチド領域の３’末端で開始し、翻
訳停止コドンの後にＳａｃＩ部位を導入する。ＤＭＶＥＣ−４は、ＤＭＡＭＰ１
遺伝子の下部鎖において成熟タンパク質領域の３’末端で開始し、この領域の後
の停止コドンを融合し、その停止コドンの後にＳａｃＩ部位を導入する。
【００８１】 両方のＰＣＲ産物を、成熟タンパク質領域中の内部ＮｃｏＩ部位のためにＰＣ
Ｒ産物を二つのフラグメントに切断するＮｃｏＩおよびＳａｃＩを用いて切断し
た。得られたＮｃｏＩ−ＳａｃＩおよびＮｃｏＩ−ＮｃｏＩフラグメントを、プ
ラスミドｐＭＪＢ１中に逐次的にクローン化した。ｐＭＪＢ１は、ＨｉｎｄIII
部位、増強されたカリフラワーモザイク３５Ｓ ＲＮＡ（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロ
モーター（Kay R. ら，1987, Science 236,1299-1302）、ＸｈｏＩ部位、タバコ
モザイクウイルス（ＴＭＶ）の５’非翻訳リーダー配列（Gallie D.R. and Walb
ot V., 1992, Nucl.Ac.Res. 20,4631-4638）、ＮｃｏＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩお
よびＳａｃＩ部位を含めたポリリンカー、アグロバクテリウム・ツメファシエン
ス（Agrobacterium tumefaciens）ノパリンシンターゼ遺伝子の３’非翻訳ター
ミネーター領域（Bevan M.W. ら，1983, Nature 304,184-187）、およびＥｃｏ
ＲＩ部位を配列中に含有する発現カセットベクターである。得られたプラスミド
を、それぞれ、ｐＤＭＡＭＰＥ（リーダーペプチド領域、成熟タンパク質領域お
よびＣ末端プロペプチド領域）およびｐＤＭＡＭＰＤ（リーダーペプチド領域お
よび成熟タンパク質領域）と称した。それらコーディング領域は、ＤＮＡ配列決
定によって確かめられた。
Ｒ産物を二つのフラグメントに切断するＮｃｏＩおよびＳａｃＩを用いて切断し
た。得られたＮｃｏＩ−ＳａｃＩおよびＮｃｏＩ−ＮｃｏＩフラグメントを、プ
ラスミドｐＭＪＢ１中に逐次的にクローン化した。ｐＭＪＢ１は、ＨｉｎｄIII
部位、増強されたカリフラワーモザイク３５Ｓ ＲＮＡ（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロ
モーター（Kay R. ら，1987, Science 236,1299-1302）、ＸｈｏＩ部位、タバコ
モザイクウイルス（ＴＭＶ）の５’非翻訳リーダー配列（Gallie D.R. and Walb
ot V., 1992, Nucl.Ac.Res. 20,4631-4638）、ＮｃｏＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩお
よびＳａｃＩ部位を含めたポリリンカー、アグロバクテリウム・ツメファシエン
ス（Agrobacterium tumefaciens）ノパリンシンターゼ遺伝子の３’非翻訳ター
ミネーター領域（Bevan M.W. ら，1983, Nature 304,184-187）、およびＥｃｏ
ＲＩ部位を配列中に含有する発現カセットベクターである。得られたプラスミド
を、それぞれ、ｐＤＭＡＭＰＥ（リーダーペプチド領域、成熟タンパク質領域お
よびＣ末端プロペプチド領域）およびｐＤＭＡＭＰＤ（リーダーペプチド領域お
よび成熟タンパク質領域）と称した。それらコーディング領域は、ＤＮＡ配列決
定によって確かめられた。
【００８２】 実施例２ 植物形質転換ベクターの構築 植物中のポリタンパク質前駆体遺伝子を発現する可能性を探究するために、抗
真菌性を有する２種類の異なったシステインの多い植物デフェンシン、すなわち
、ＲｓＡＦＰ２およびＤｍＡＭＰ１を共発現させる目的で、４種類の異なった形
質転換ベクターを製造した。これら構築物のポリタンパク質前駆体領域は全て、
ＤｍＡＭＰ１ ｃＤＮＡに由来するリーダーペプチド領域、ＤｍＡＭＰ１の成熟
タンパク質ドメイン、内部プロペプチド領域、およびＲｓＡＦＰ２の成熟タンパ
ク質ドメインを特徴とした。それら４種類の構築物は、内部プロペプチドだけが
異なった（図２）。
真菌性を有する２種類の異なったシステインの多い植物デフェンシン、すなわち
、ＲｓＡＦＰ２およびＤｍＡＭＰ１を共発現させる目的で、４種類の異なった形
質転換ベクターを製造した。これら構築物のポリタンパク質前駆体領域は全て、
ＤｍＡＭＰ１ ｃＤＮＡに由来するリーダーペプチド領域、ＤｍＡＭＰ１の成熟
タンパク質ドメイン、内部プロペプチド領域、およびＲｓＡＦＰ２の成熟タンパ
ク質ドメインを特徴とした。それら４種類の構築物は、内部プロペプチドだけが
異なった（図２）。
【００８３】 ・構築物３１０５は、ＤｍＡＭＰ１およびＲｓＡＦＰ２を隔てるプロペプチド
としてＩｂＡＭＰ内部プロペプチドの一つを有する。 ・構築物３１０６は、ＤｍＡＭＰ１プロペプチドの一部分およびそのＣ末端に
ある推定上のズブチリシン様プロテアーゼプロセシング部位（ＩＧＫＲ）（配列
番号６７）から成るプロペプチドを有する。
としてＩｂＡＭＰ内部プロペプチドの一つを有する。 ・構築物３１０６は、ＤｍＡＭＰ１プロペプチドの一部分およびそのＣ末端に
ある推定上のズブチリシン様プロテアーゼプロセシング部位（ＩＧＫＲ）（配列
番号６７）から成るプロペプチドを有する。
【００８４】 ・構築物３１０７は、ＤｍＡＭＰ１プロペプチド全体が用いられたこと以外は
構築物３１０６と一致する。 ・構築物３１０８は、ＡｃＡＭＰ２プロペプチドおよびそのＣ末端にある推定
上のズブチリシン様プロテアーゼプロセシング部位（ＩＧＫＲ）から成るプロペ
プチドを有する。
構築物３１０６と一致する。 ・構築物３１０８は、ＡｃＡＭＰ２プロペプチドおよびそのＣ末端にある推定
上のズブチリシン様プロテアーゼプロセシング部位（ＩＧＫＲ）から成るプロペ
プチドを有する。
【００８５】 構築物３１０６、３１０７および３１０８を裏付ける原理は、ＡｃＡＭＰ２お
よびＤｍＡＭＰ１のＣ末端プロペプチドが、タバコ中でＡｃＡＭＰ２−およびＤ
ｍＡＭＰ１プレプロタンパク質としてそれぞれ発現される場合、それらのＮ末端
で切除されるが、このプロセシング現象は、成熟タンパク質がアポプラストへと
割り当てられるのを損なわないという本発明者の知見に基づいている（De Bolle
ら，1996 Plant Mol.Biol. 31,993-1008；R.W.Osborn および S.Attenborough
，私的文書）。これにより、プロセシング酵素は分泌経路中かまたはアポプラス
ト中にあるということが推論される。もう一方において、これら構築物中の内部
プロペプチドのＣ末端切断は、ズブチリシン様プロテアーゼによって行われるは
ずであるが、そのメンバーは、酵母（Ｋｅｘ２）の場合、ゴルジ装置中にあるこ
とが知られているが（Wilcox C.A. および Fuller R.S., 1991, J.Cell. Biol.
115,297）、トマトの場合のメンバーはアポプラスト中にある（Tornero P. ら，
1997, J.Biol.Chem. 272,14412-14419）。遺伝子操作される抗微生物性タンパク
質のトランスジェニック植物中の好ましい沈着部位であるアポプラスト中に沈着
するタンパク質（Jongedijk E. ら，1995, Euphytica 85,173-180；De Bolle ら
，1996 Plant Mol.Biol. 31,993-1008）は、通常は、ゴルジ装置を包含する分泌
経路によって合成される。構築物は、ＤｍＡＭＰ１だけの発現についても製造さ
れた（構築物３１０９，図７）。
よびＤｍＡＭＰ１のＣ末端プロペプチドが、タバコ中でＡｃＡＭＰ２−およびＤ
ｍＡＭＰ１プレプロタンパク質としてそれぞれ発現される場合、それらのＮ末端
で切除されるが、このプロセシング現象は、成熟タンパク質がアポプラストへと
割り当てられるのを損なわないという本発明者の知見に基づいている（De Bolle
ら，1996 Plant Mol.Biol. 31,993-1008；R.W.Osborn および S.Attenborough
，私的文書）。これにより、プロセシング酵素は分泌経路中かまたはアポプラス
ト中にあるということが推論される。もう一方において、これら構築物中の内部
プロペプチドのＣ末端切断は、ズブチリシン様プロテアーゼによって行われるは
ずであるが、そのメンバーは、酵母（Ｋｅｘ２）の場合、ゴルジ装置中にあるこ
とが知られているが（Wilcox C.A. および Fuller R.S., 1991, J.Cell. Biol.
115,297）、トマトの場合のメンバーはアポプラスト中にある（Tornero P. ら，
1997, J.Biol.Chem. 272,14412-14419）。遺伝子操作される抗微生物性タンパク
質のトランスジェニック植物中の好ましい沈着部位であるアポプラスト中に沈着
するタンパク質（Jongedijk E. ら，1995, Euphytica 85,173-180；De Bolle ら
，1996 Plant Mol.Biol. 31,993-1008）は、通常は、ゴルジ装置を包含する分泌
経路によって合成される。構築物は、ＤｍＡＭＰ１だけの発現についても製造さ
れた（構築物３１０９，図７）。
【００８６】 製造された植物形質転換ベクターｐＦＡＪ３１０５、ｐＦＡＪ３１０６、ｐＦ
ＡＪ３１０７、ｐＦＡＪ３１０８およびｐＦＡＪ３１０９の略図を、それぞれ図
３〜７に示す。これらプラスミドのＸｈｏＩおよびＳａｃＩ部位間に含まれるヌ
クレオチド配列は、抗微生物性タンパク質をコードしている領域を包含し、図８
〜１３に示される。プラスミドｐＦＡＪ３１０５のＸｈｏＩおよびＳａｃＩ部位
間に含まれる領域（図８に示される）は、Pont-Kindom G.A.D.（1994, Biotechn
iques 16,1010-1011）の二段組換えＰＣＲプロトコールにしたがって構築された
。プライマーＯＷＢ１７５（５’ＡＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧ）
および（配列番号６８）、ＯＷＢ２７８（５’−ＧＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＣ
ＴＴＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＣＴＣＴＧＧＧＧＴＡＧＣＣＡＣＣ
ＴＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＴＧＧＡＡＣＡＡＴＴＧＡＡＧＴＡＡＣＡＧＡＡＡ
ＣＡＣ）（配列番号６０）を、最初のＰＣＲ反応において、鋳型としてのプラス
ミドｐＤＭＡＭＰＥ（上を参照されたい）と一緒に用いた。次のＰＣＲ反応は、
鋳型としてプラスミドｐＦＲＧ４（Terras F.R.G. ら，1995, Plant Cell 7,573
-588）、およびプライマーとして、最初のＰＣＲ反応のＰＣＲ産物、プライマー
ＯＷＢ１７５およびプライマーＯＷＢ１７２（５’ＴＴＡＧＡＧＣＴＣＣＴＡＴ
ＴＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＧＴＡＧＣ（配列番号６１），ＳａｃＩ部位に下線を施
している）の混合物を用いて行われた。得られたＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよび
ＳａｃＩを用いて消化し、発現カセットベクターｐＭＪＢ１（上を参照されたい
）中にクローン化した。ｐＦＡＪ３０９９と称される得られたプラスミド中の発
現カセットを、ＨｉｎｄIII（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの５’末端に隣接す
る）およびＥｃｏＲＩ（ノパリンシンターゼターミネーターの３’末端に隣接す
る）を用いて消化し、植物形質転換ベクターｐＧＰＴＶｂａｒ（Becker D. ら，
1992, Plant Mol.Biol. 20,1195-1197）の該当する部位にクローン化して、プラ
スミドｐＦＡＪ３１０５を生じた。
ＡＪ３１０７、ｐＦＡＪ３１０８およびｐＦＡＪ３１０９の略図を、それぞれ図
３〜７に示す。これらプラスミドのＸｈｏＩおよびＳａｃＩ部位間に含まれるヌ
クレオチド配列は、抗微生物性タンパク質をコードしている領域を包含し、図８
〜１３に示される。プラスミドｐＦＡＪ３１０５のＸｈｏＩおよびＳａｃＩ部位
間に含まれる領域（図８に示される）は、Pont-Kindom G.A.D.（1994, Biotechn
iques 16,1010-1011）の二段組換えＰＣＲプロトコールにしたがって構築された
。プライマーＯＷＢ１７５（５’ＡＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧ）
および（配列番号６８）、ＯＷＢ２７８（５’−ＧＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＣ
ＴＴＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＣＴＣＴＧＧＧＧＴＡＧＣＣＡＣＣ
ＴＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＴＧＧＡＡＣＡＡＴＴＧＡＡＧＴＡＡＣＡＧＡＡＡ
ＣＡＣ）（配列番号６０）を、最初のＰＣＲ反応において、鋳型としてのプラス
ミドｐＤＭＡＭＰＥ（上を参照されたい）と一緒に用いた。次のＰＣＲ反応は、
鋳型としてプラスミドｐＦＲＧ４（Terras F.R.G. ら，1995, Plant Cell 7,573
-588）、およびプライマーとして、最初のＰＣＲ反応のＰＣＲ産物、プライマー
ＯＷＢ１７５およびプライマーＯＷＢ１７２（５’ＴＴＡＧＡＧＣＴＣＣＴＡＴ
ＴＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＧＴＡＧＣ（配列番号６１），ＳａｃＩ部位に下線を施
している）の混合物を用いて行われた。得られたＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよび
ＳａｃＩを用いて消化し、発現カセットベクターｐＭＪＢ１（上を参照されたい
）中にクローン化した。ｐＦＡＪ３０９９と称される得られたプラスミド中の発
現カセットを、ＨｉｎｄIII（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの５’末端に隣接す
る）およびＥｃｏＲＩ（ノパリンシンターゼターミネーターの３’末端に隣接す
る）を用いて消化し、植物形質転換ベクターｐＧＰＴＶｂａｒ（Becker D. ら，
1992, Plant Mol.Biol. 20,1195-1197）の該当する部位にクローン化して、プラ
スミドｐＦＡＪ３１０５を生じた。
【００８７】 プラスミドｐＦＡＪ３１０６、ｐＦＡＪ３１０７およびｐＦＡＪ３１０８を、
最初のＰＣＲ反応中のプライマーＯＷＢ２７８を次のプライマーでそれぞれ置き
換えたことを除いて、同様に構築した。
最初のＰＣＲ反応中のプライマーＯＷＢ２７８を次のプライマーでそれぞれ置き
換えたことを除いて、同様に構築した。
【００８８】 ＯＷＢ２７９（５’−ＧＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴ
ＴＣＣＧＡＴＧＡＧＴＴＧＴＴＣＧＧＣＴＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＣ）（配列番号
６２）、 ＯＷＢ３０３（５’−ＧＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴ
ＴＣＣＧＡＴＣＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＣＧＴＴＴＧＧＡＡＣＣ）（配列番号６３
）； ＯＷＢ３０４（５’−ＧＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴ
ＴＣＣＧＡＴＡＧＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧ
ＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＧＴＡＣＴＧＧＣＡＣＡＡＴＴＧＡＡＧＴＡＡＣＡＧＡＡ
ＡＣＡＣ）（配列番号６４）。
ＴＣＣＧＡＴＧＡＧＴＴＧＴＴＣＧＧＣＴＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＣ）（配列番号
６２）、 ＯＷＢ３０３（５’−ＧＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴ
ＴＣＣＧＡＴＣＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＣＧＴＴＴＧＧＡＡＣＣ）（配列番号６３
）； ＯＷＢ３０４（５’−ＧＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴ
ＴＣＣＧＡＴＡＧＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧ
ＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＧＴＡＣＴＧＧＣＡＣＡＡＴＴＧＡＡＧＴＡＡＣＡＧＡＡ
ＡＣＡＣ）（配列番号６４）。
【００８９】 プラスミドｐＦＡＪ３１０９は、プラスミドｐＤＭＡＭＰＤ（上を参照された
い）のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩフラグメントを、植物形質転換ベクターｐＧＰ
ＴＶｂａｒ（上を参照されたい）の該当する部位にクローニングすることによっ
て構築した。
い）のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩフラグメントを、植物形質転換ベクターｐＧＰ
ＴＶｂａｒ（上を参照されたい）の該当する部位にクローニングすることによっ
て構築した。
【００９０】 実施例３ 植物形質転換 Arabidopsis thaliana 生態型コロンビア・オー（Columbia-Ｏ）を、Bechtold
N. ら（1993, C.R.Acad.Sci. 316,1194-1199）の花序浸透法（inflorescence i
nfiltration method）によって Agrobacterium tumefaciens を用いて形質転換
した。形質転換体は、活性成分ホスフィノトリシン（phosphinothricin）に関し
て、除草剤 Basta（Agrevo）を５ｍｇ／ｌの最終濃度で含有する水を用いて灌漑
した砂／パーライト混合物上で選択した。
N. ら（1993, C.R.Acad.Sci. 316,1194-1199）の花序浸透法（inflorescence i
nfiltration method）によって Agrobacterium tumefaciens を用いて形質転換
した。形質転換体は、活性成分ホスフィノトリシン（phosphinothricin）に関し
て、除草剤 Basta（Agrevo）を５ｍｇ／ｌの最終濃度で含有する水を用いて灌漑
した砂／パーライト混合物上で選択した。
【００９１】 実施例４ エリザ検定およびタンパク質検定を含めた標的タンパク質の検定 抗血清は、ＲｓＡＦＰ２（Terras F.R.G. ら，1992, J.BIol.Chem. 267,15301
-15309 に記載のように精製される）かまたはＤｍＡＭＰ１（Osborn R.W. ら，1
995, FEBS Lett. 368,257-262 の場合のように精製される）を注射されたウサギ
で生じさせた。ＥＬＩＳＡ検定は、本質的には、Penninckx I.A.M.A. ら（1996,
Plant Cell 8,2309-2323）によって記載のような競合型検定として設定された
。ＥＬＩＳＡ微量滴定プレートのコーティングは、コーティング用緩衝液中５０
ｎｇ／ｍｌのＲｓＡＦＰ２またはＤｍＡＭＰ１を用いて行われた。一次抗血清を
、０．０５％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０を含有するＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）ゼラ
チン中の１０００倍および２０００倍希釈溶液として用いた（ＤｍＡＭＰ１およ
びＲｓＡＦＰ２それぞれ）。
-15309 に記載のように精製される）かまたはＤｍＡＭＰ１（Osborn R.W. ら，1
995, FEBS Lett. 368,257-262 の場合のように精製される）を注射されたウサギ
で生じさせた。ＥＬＩＳＡ検定は、本質的には、Penninckx I.A.M.A. ら（1996,
Plant Cell 8,2309-2323）によって記載のような競合型検定として設定された
。ＥＬＩＳＡ微量滴定プレートのコーティングは、コーティング用緩衝液中５０
ｎｇ／ｍｌのＲｓＡＦＰ２またはＤｍＡＭＰ１を用いて行われた。一次抗血清を
、０．０５％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０を含有するＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）ゼラ
チン中の１０００倍および２０００倍希釈溶液として用いた（ＤｍＡＭＰ１およ
びＲｓＡＦＰ２それぞれ）。
【００９２】 全タンパク質含量は、Bradford（1976, Anal.Biochem. 72,248-254）にしたが
って、ウシ血清アルブミンを標準として用いて決定された。 Arabidopsis 葉を、液体窒素下でホモジナイゼーションし、１０ｍＭ ＮａＨ 2 ＰＯ4、１５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１００ｍＭ ＫＣｌ、１．５Ｍ ＮａＣｌか
ら成る緩衝液を用いて抽出した。そのホモジネートを８５℃で１０分間加熱し、
氷上で冷却した。熱処理済み抽出物を、１５０００ｘｇで１５分間遠心分離し、
そして０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて平衡にされたＣ
８シリカ（０．４６ｃｍｘ２５ｃｍ；Rainin）から成る逆相高圧液体クロマトグ
ラフィーカラム（ＲＰ−ＨＰＬＣ）に注入した。そのカラムを、０．１％（ｖ／
ｖ）ＴＦＡ中１５％〜５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの３５分以内の直線勾配
において１ｍｌ／分で溶離した。その溶出液を、２１４ｎｍでの吸光度について
監視し、１ｍｌ画分として集め、蒸発させ、最終的には、水中に再溶解させた。
それら画分をＥＬＩＳＡ検定によって調べた。
って、ウシ血清アルブミンを標準として用いて決定された。 Arabidopsis 葉を、液体窒素下でホモジナイゼーションし、１０ｍＭ ＮａＨ 2 ＰＯ4、１５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１００ｍＭ ＫＣｌ、１．５Ｍ ＮａＣｌか
ら成る緩衝液を用いて抽出した。そのホモジネートを８５℃で１０分間加熱し、
氷上で冷却した。熱処理済み抽出物を、１５０００ｘｇで１５分間遠心分離し、
そして０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて平衡にされたＣ
８シリカ（０．４６ｃｍｘ２５ｃｍ；Rainin）から成る逆相高圧液体クロマトグ
ラフィーカラム（ＲＰ−ＨＰＬＣ）に注入した。そのカラムを、０．１％（ｖ／
ｖ）ＴＦＡ中１５％〜５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの３５分以内の直線勾配
において１ｍｌ／分で溶離した。その溶出液を、２１４ｎｍでの吸光度について
監視し、１ｍｌ画分として集め、蒸発させ、最終的には、水中に再溶解させた。
それら画分をＥＬＩＳＡ検定によって調べた。
【００９３】 実施例５ 細胞内抽出物の製造 細胞間液を、Arabidopsis 葉から、抽出用緩衝液（１０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、
１５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１００ｍＭ ＫＣｌ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）が入って
いるビーカー中に葉を浸漬することによって集めた。それら葉の入ったビーカー
を真空室中に置き、そして２分間の真空後、急な真空解除を６回連続して行った
。浸透処理された葉を、遠心管中の管底から離れた格子上に静かに置いた。細胞
間液は、それら管を１８００ｘｇで１５分間遠心分離後、管底から集められた。
それら葉に、真空浸透および遠心分離をもう１回繰り返し、得られた（細胞外）
液を、最初の真空浸透後に得られた液と一緒にした。この工程後、それら葉を、
Phastprep（ＢＩＯ１０１／Savant）往復振とう器中で抽出し、その抽出物を遠
心分離（１０，０００ｘｇで１０分間）によって清澄にし、得られた上澄みを細
胞内抽出物とみなした。
１５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１００ｍＭ ＫＣｌ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）が入って
いるビーカー中に葉を浸漬することによって集めた。それら葉の入ったビーカー
を真空室中に置き、そして２分間の真空後、急な真空解除を６回連続して行った
。浸透処理された葉を、遠心管中の管底から離れた格子上に静かに置いた。細胞
間液は、それら管を１８００ｘｇで１５分間遠心分離後、管底から集められた。
それら葉に、真空浸透および遠心分離をもう１回繰り返し、得られた（細胞外）
液を、最初の真空浸透後に得られた液と一緒にした。この工程後、それら葉を、
Phastprep（ＢＩＯ１０１／Savant）往復振とう器中で抽出し、その抽出物を遠
心分離（１０，０００ｘｇで１０分間）によって清澄にし、得られた上澄みを細
胞内抽出物とみなした。
【００９４】 ＤｍＡＭＰ１およびＲｓＡＦＰ２の発現レベルは、上記構築物を用いた形質転
換の結果として生じる一連のＴ１トランスジェニック植物 Arabidopsis から得
られる葉で分析した。上記のようなエリザ検定に基づく発現分析の結果を、表１
に示す。
換の結果として生じる一連のＴ１トランスジェニック植物 Arabidopsis から得
られる葉で分析した。上記のようなエリザ検定に基づく発現分析の結果を、表１
に示す。
【００９５】 表１：トランスジェニック Arabidopsis 系統中のＤｍ−ＡＭＰ１およびＲｓ
−ＡＦＰ２の発現レベル
−ＡＦＰ２の発現レベル
【００９６】
【表１】
【００９７】 ポリタンパク質構築物３１０５、３１０６、３１０７および３１０８を用いて
形質転換された試験系統の大部分は、明らかに、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰ（ＤｍＡ
ＭＰ１交差反応性タンパク質）およびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰ（ＲｓＡＦＰ２交差
反応性タンパク質）両方を発現した。概して、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰレベルとＲ
ｓＡＦＰ２−ＣＲＰレベルとの間には、充分な相関関係があった。しかしながら
、ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰレベルは、概して、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰレベルより２
倍〜５倍低かった。抽出物中のＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰを測定するエリザ検定は、
しかしながら、Ｄｍ−ＡＭＰ１−ＣＲＰに関する検定よりもあまり信頼できない
。Ｒｓ−ＡＦＰ２エリザ検定の場合、トランスジェニック植物の抽出物の希釈は
、基準のＲｓ−ＡＦＰ２を含有する標準溶液の希釈で得られるものからはずれた
用量反応曲線を生じ、抽出物中のＲｓ−ＡＦＰ２−ＣＲＰの大部分が、ＲｓＡＦ
Ｐ２自体と免疫学的に一致しないことが示された。ＲｓＡＦＰ２標準用量反応曲
線からの偏差は、構築物３１０６、３１０７および３１０８を用いて形質転換さ
れた植物からの抽出物に関して、３１０５を用いて形質転換された植物の場合よ
りもはるかに顕著であった。
形質転換された試験系統の大部分は、明らかに、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰ（ＤｍＡ
ＭＰ１交差反応性タンパク質）およびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰ（ＲｓＡＦＰ２交差
反応性タンパク質）両方を発現した。概して、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰレベルとＲ
ｓＡＦＰ２−ＣＲＰレベルとの間には、充分な相関関係があった。しかしながら
、ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰレベルは、概して、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰレベルより２
倍〜５倍低かった。抽出物中のＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰを測定するエリザ検定は、
しかしながら、Ｄｍ−ＡＭＰ１−ＣＲＰに関する検定よりもあまり信頼できない
。Ｒｓ−ＡＦＰ２エリザ検定の場合、トランスジェニック植物の抽出物の希釈は
、基準のＲｓ−ＡＦＰ２を含有する標準溶液の希釈で得られるものからはずれた
用量反応曲線を生じ、抽出物中のＲｓ−ＡＦＰ２−ＣＲＰの大部分が、ＲｓＡＦ
Ｐ２自体と免疫学的に一致しないことが示された。ＲｓＡＦＰ２標準用量反応曲
線からの偏差は、構築物３１０６、３１０７および３１０８を用いて形質転換さ
れた植物からの抽出物に関して、３１０５を用いて形質転換された植物の場合よ
りもはるかに顕著であった。
【００９８】 Ｄｍ−ＡＭＰ１エリザ検定の用量反応曲線において、Ｄｍ−ＡＭＰ１標準から
の偏差を示した抽出物はなかった。ポリタンパク質構築物３１０５、３１０６、
３１０７または３１０８を用いて形質転換された系統におけるＤｍＡＭＰ１−Ｃ
ＲＰレベルは、概して、単一タンパク質構築物３１０９を用いて形質転換された
系統の場合と比較して、はるかに高かった。これは、図１３にも示されているが
、そこでは、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰ発現レベルを、ポリタンパク質構築物３１０
５を用いて形質転換された植物および単一タンパク質構築物３１０９を用いて形
質転換された植物について比較している。全タンパク質の４％程度に高い発現レ
ベル（例えば、系統３１０５〜１５および３１０５〜１８におけるＤｍＡＭＰ１
−ＣＲＰレベル，表１を参照されたい）は、これまで、トランスジェニック植物
中で発現されるペプチドについて文献で報告されたことがなかった。したがって
、ポリタンパク質構築物の使用は、顕著に増加した発現を引き起こすと考えられ
るが、それは予想外の知見である。
の偏差を示した抽出物はなかった。ポリタンパク質構築物３１０５、３１０６、
３１０７または３１０８を用いて形質転換された系統におけるＤｍＡＭＰ１−Ｃ
ＲＰレベルは、概して、単一タンパク質構築物３１０９を用いて形質転換された
系統の場合と比較して、はるかに高かった。これは、図１３にも示されているが
、そこでは、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰ発現レベルを、ポリタンパク質構築物３１０
５を用いて形質転換された植物および単一タンパク質構築物３１０９を用いて形
質転換された植物について比較している。全タンパク質の４％程度に高い発現レ
ベル（例えば、系統３１０５〜１５および３１０５〜１８におけるＤｍＡＭＰ１
−ＣＲＰレベル，表１を参照されたい）は、これまで、トランスジェニック植物
中で発現されるペプチドについて文献で報告されたことがなかった。したがって
、ポリタンパク質構築物の使用は、顕著に増加した発現を引き起こすと考えられ
るが、それは予想外の知見である。
【００９９】 実施例６ ポリタンパク質前駆体からプロセシングされるタンパク質の分離 トランスジェニック系統を、構築物３１０５（系統１）かまたは３１０６（系
統２）を用いて形質転換された集団のそれぞれから選択し、そして選択された系
統を、導入遺伝子にホモ接合性の植物を得るように更に交配させた。ＤｍＡＭＰ
１およびＲｓＡＦＰ２が、これら系統中で正しくプロセシングされたかどうか分
析するために、それら植物からの抽出物を、実施例１に記載のように製造し、Ｃ
８シリカカラム上のＲＰ−ＨＰＬＣによって分離した。画分を集め、そしてＤｍ
ＡＭＰ１かまたはＲｓＡＦＰ２に対して生じる抗体と交差反応する化合物の存在
について、実施例４に記載のエリザ検定を用いて評価した。
統２）を用いて形質転換された集団のそれぞれから選択し、そして選択された系
統を、導入遺伝子にホモ接合性の植物を得るように更に交配させた。ＤｍＡＭＰ
１およびＲｓＡＦＰ２が、これら系統中で正しくプロセシングされたかどうか分
析するために、それら植物からの抽出物を、実施例１に記載のように製造し、Ｃ
８シリカカラム上のＲＰ−ＨＰＬＣによって分離した。画分を集め、そしてＤｍ
ＡＭＰ１かまたはＲｓＡＦＰ２に対して生じる抗体と交差反応する化合物の存在
について、実施例４に記載のエリザ検定を用いて評価した。
【０１００】 図１５に示されるように、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰは、構築物３１０５を用いて
形質転換された系統においても、構築物３１０６を用いて形質転換された系統に
おいても、基準ＤｍＡＭＰ１の場合と一致するまたは極めて近い位置で溶離した
。同様に、ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰは、構築物３１０５および３１０６の双方にお
いて、基準ＲｓＡＦＰ２の場合と一致するまたは極めて近い溶離位置で検出され
た。それら画分で、抗ＤｍＡＭＰ１抗体および抗ＲｓＡＦＰ２抗体双方と反応し
たものはなく、それら抽出物中には、切断されていない融合タンパク質が存在し
なかったことが示された。形質転換されていない系統においては、交差反応性化
合物は認められなかった。
形質転換された系統においても、構築物３１０６を用いて形質転換された系統に
おいても、基準ＤｍＡＭＰ１の場合と一致するまたは極めて近い位置で溶離した
。同様に、ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰは、構築物３１０５および３１０６の双方にお
いて、基準ＲｓＡＦＰ２の場合と一致するまたは極めて近い溶離位置で検出され
た。それら画分で、抗ＤｍＡＭＰ１抗体および抗ＲｓＡＦＰ２抗体双方と反応し
たものはなく、それら抽出物中には、切断されていない融合タンパク質が存在し
なかったことが示された。形質転換されていない系統においては、交差反応性化
合物は認められなかった。
【０１０１】 したがって、構築物３１０５（リンカーペプチドとしてのＩｂＡＭＰ内部プロ
ペプチド）および構築物３１０６（リンカーペプチドとしてのズブチリシン様プ
ロテアーゼ部位を含む部分ＤｍＡＭＰ１ Ｃ末端プロペプチド）の転写単位の一
次翻訳産物は、どういうわけかプロセシングされて、それらのクロマトグラフィ
ー挙動によれば、ＤｍＡＭＰ１およびＲｓＡＦＰ２それぞれと同一または極めて
近縁であると考えられる、別々のＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−Ｃ
ＲＰを生じるということが考えられる。
ペプチド）および構築物３１０６（リンカーペプチドとしてのズブチリシン様プ
ロテアーゼ部位を含む部分ＤｍＡＭＰ１ Ｃ末端プロペプチド）の転写単位の一
次翻訳産物は、どういうわけかプロセシングされて、それらのクロマトグラフィ
ー挙動によれば、ＤｍＡＭＰ１およびＲｓＡＦＰ２それぞれと同一または極めて
近縁であると考えられる、別々のＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−Ｃ
ＲＰを生じるということが考えられる。
【０１０２】 実施例７ 共発現される植物デフェンシンの細胞下部位の分析 共発現される植物デフェンシンが、細胞外に分泌されるかまたは細胞内に沈着
するかどうか確認するために、構築物３１０５（系統２）か、３１０６（系統２
）かまたは３１０８（系統１２）を用いて形質転換されたホモ接合性トランスジ
ェニック系統 Arabidopsis の葉から、細胞外液および細胞内抽出物の画分を得
た。サイトゾル酵素グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをマーカーとして
用いて、細胞内成分を含む細胞外液画分の混入を検出した。表２に示されるよう
に、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは、細胞内抽出物画分と細胞外液
画分とに約８０／２０の比率で分配された。対照的に、試験される全トランスジ
ェニック植物中のＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰ含量の大部
分は、細胞外液画分で見出された。これら結果は、ポリタンパク質前駆体から放
出される双方の植物デフェンシンが、主としてアポプラスト中に沈着することを
示している。したがって、ポリタンパク質構造の切断を引き起こすプロセシング
工程は全て、アポプラスト中でかまたは分泌経路に沿って、すなわち、小胞体中
、ゴルジ装置中またはゴルジ装置とアポプラストとの間を行き来する小胞中で起
こらなければならない。
するかどうか確認するために、構築物３１０５（系統２）か、３１０６（系統２
）かまたは３１０８（系統１２）を用いて形質転換されたホモ接合性トランスジ
ェニック系統 Arabidopsis の葉から、細胞外液および細胞内抽出物の画分を得
た。サイトゾル酵素グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをマーカーとして
用いて、細胞内成分を含む細胞外液画分の混入を検出した。表２に示されるよう
に、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは、細胞内抽出物画分と細胞外液
画分とに約８０／２０の比率で分配された。対照的に、試験される全トランスジ
ェニック植物中のＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰ含量の大部
分は、細胞外液画分で見出された。これら結果は、ポリタンパク質前駆体から放
出される双方の植物デフェンシンが、主としてアポプラスト中に沈着することを
示している。したがって、ポリタンパク質構造の切断を引き起こすプロセシング
工程は全て、アポプラスト中でかまたは分泌経路に沿って、すなわち、小胞体中
、ゴルジ装置中またはゴルジ装置とアポプラストとの間を行き来する小胞中で起
こらなければならない。
【０１０３】 表２：トランスジェニック Arabidopsis 植物から得られる細胞外液（ＥＦ）
および細胞内抽出物（ＩＥ）画分中のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
活性（ＧＰＤ）、ＤｍＡＭＰ１およびＲｓＡＦＰ２の相対賦存量。
および細胞内抽出物（ＩＥ）画分中のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
活性（ＧＰＤ）、ＤｍＡＭＰ１およびＲｓＡＦＰ２の相対賦存量。
【０１０４】
【表２】
【０１０５】 実施例８ ポリタンパク質前駆体構築物３１０５からプロセシングされるタンパク質の精 製 構築物３１０５を用いて形質転換された集団からのトランスジェニック系統１
４を更に交配させて、導入遺伝子にホモ接合性の植物を得た。ＤｍＡＭＰ１−Ｃ
ＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰを、この系統の葉から調製される細胞外液から
、逆相クロマトグラフィーによって精製した。この目的には、５０ｍＭ ＭＥＳ
（ｐＨ６）およびプロテアーゼインヒビターの混合物（１ｍＭフェニルメチルス
ルホニルフルオリド、１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび
０．０２ｍＭペプスタチンＡ）を含有する緩衝液を用いて、葉を真空浸透処理し
、細胞外液を遠心分離によって集めた。この手順を用いて、ホモジナイゼーショ
ンおよびしたがって画分化プロテアーゼへのＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡ
ＦＰ２−ＣＲＰの暴露が避けられた。集められた細胞外液を、Ｃ８シリカカラム
（Microsorb−ＭＶ，４．６ｘ２５０ｍｍ，Rainin）上のＲＰ−ＨＰＬＣによっ
て分析し、それら画分のＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰの存
在について、ＤｍＡＭＰ１およびＲｓＡＦＰ２それぞれに対して生じる抗体を用
いるエリザによって調べた。構築物３１０５を用いて形質転換された Arabidops
is トランスジェニック系統１４に関するこの分析の結果を、図１５に示す。Ｄ
ｍＡＭＰ１−ＣＲＰは二つのピークで溶離したが、その後者は、基準ＤｍＡＭＰ
１の場合と極めて近い位置で溶離した。ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰは、たった一つの
ピークで見出されたが、それは、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰピークから充分に離れて
いて、基準ＲｓＡＦＰ２の場合と極めて近い位置で溶離した。それら画分で、抗
ＤｍＡＭＰ１抗体および抗ＲｓＡＦＰ２抗体双方と反応したものはなく、細胞外
液中からは、切断されていない融合タンパク質が不存在であったことが示された
。ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰのピーク面積と、基準のＤ
ｍＡＭＰ１およびＲｓＡＦＰ２から成る一連の標準のピーク面積とのそれぞれの
比較に基づき、構築物３１０５を用いて形質転換された系統の抽出物は、ほぼ等
量のＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰを含有していたと判断さ
れた。これは、この系統におけるポリタンパク質前駆体の切断が、ほぼ等モル量
のＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰを生じるということを示し
ている。トランスジェニック系統２から調製される細胞外液の分析では、極めて
類似のクロマトグラムが得られ（結果は示されてない）、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰ
およびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰのクロマトグラフィーパターンは、試験されるトラ
ンスジェニック系統とは無関係であることが示される。
４を更に交配させて、導入遺伝子にホモ接合性の植物を得た。ＤｍＡＭＰ１−Ｃ
ＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰを、この系統の葉から調製される細胞外液から
、逆相クロマトグラフィーによって精製した。この目的には、５０ｍＭ ＭＥＳ
（ｐＨ６）およびプロテアーゼインヒビターの混合物（１ｍＭフェニルメチルス
ルホニルフルオリド、１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび
０．０２ｍＭペプスタチンＡ）を含有する緩衝液を用いて、葉を真空浸透処理し
、細胞外液を遠心分離によって集めた。この手順を用いて、ホモジナイゼーショ
ンおよびしたがって画分化プロテアーゼへのＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡ
ＦＰ２−ＣＲＰの暴露が避けられた。集められた細胞外液を、Ｃ８シリカカラム
（Microsorb−ＭＶ，４．６ｘ２５０ｍｍ，Rainin）上のＲＰ−ＨＰＬＣによっ
て分析し、それら画分のＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰの存
在について、ＤｍＡＭＰ１およびＲｓＡＦＰ２それぞれに対して生じる抗体を用
いるエリザによって調べた。構築物３１０５を用いて形質転換された Arabidops
is トランスジェニック系統１４に関するこの分析の結果を、図１５に示す。Ｄ
ｍＡＭＰ１−ＣＲＰは二つのピークで溶離したが、その後者は、基準ＤｍＡＭＰ
１の場合と極めて近い位置で溶離した。ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰは、たった一つの
ピークで見出されたが、それは、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰピークから充分に離れて
いて、基準ＲｓＡＦＰ２の場合と極めて近い位置で溶離した。それら画分で、抗
ＤｍＡＭＰ１抗体および抗ＲｓＡＦＰ２抗体双方と反応したものはなく、細胞外
液中からは、切断されていない融合タンパク質が不存在であったことが示された
。ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰのピーク面積と、基準のＤ
ｍＡＭＰ１およびＲｓＡＦＰ２から成る一連の標準のピーク面積とのそれぞれの
比較に基づき、構築物３１０５を用いて形質転換された系統の抽出物は、ほぼ等
量のＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰを含有していたと判断さ
れた。これは、この系統におけるポリタンパク質前駆体の切断が、ほぼ等モル量
のＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰを生じるということを示し
ている。トランスジェニック系統２から調製される細胞外液の分析では、極めて
類似のクロマトグラムが得られ（結果は示されてない）、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰ
およびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰのクロマトグラフィーパターンは、試験されるトラ
ンスジェニック系統とは無関係であることが示される。
【０１０６】 細胞外液調製による精製手順が、トランスジェニック Arabidopsis 葉のＤｍ
ＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰの本来の組成に影響を与えるかど
うか調べるために、粗製葉抽出物から出発する別の精製手順を開発した。この目
的には、葉を液体窒素下でホモジナイゼーションし、プロテアーゼインヒビター
の混合物（１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭ Ｎ−エチルマ
レイミド、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０２ｍＭペプスタチンＡ）を含有する５
０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）を用いて抽出した。そのホモジネートを、遠心分離（
１００００ｘｇで１０分間）によって清澄にした。次に、その上澄みを、イオン
交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）およびその後の逆相クロマトグラフィー（Ｒ
ＰＣ）によって分別した。それぞれの分離後、画分を集め、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲ
ＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰについて、ＤｍＡＭＰ１およびＲｓＡＦＰ２それ
ぞれに対して生じる抗体を用いた二つの異なったエリザ検定を用いて評価した。
ＩＥＣは、抽出物を陽イオン交換カラム（Mono Ｓ，５ｘ５０ｍｍ，Pharmacia）
にｐＨ６で通過させることによって行われた。そのカラムを、５０ｍＭ Ｎ−モ
ルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）中の０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配を
ｐＨ６で用いて溶離した場合、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰは、０．１７〜０．３３Ｍ
ＮａＣｌで溶離する画分中で検出されたが、ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰは、０．２
４〜０．４９Ｍ ＮａＣｌで溶離した。ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰかまたはＲｓＡＦ
Ｐ２−ＣＲＰを含有する画分を二つの画分（０．１７〜０．３３Ｍ ＮａＣｌ；
および０．３３〜０．４９Ｍ ＮａＣｌ）にプールし、それぞれに、アセトニト
リルの直線勾配を用いて溶離されるＣ８シリカカラム（Microsorb−ＭＶ，４．
６ｘ２５０ｍｍ，Rainin）上のＲＰＣを行った（図１６）。ＤｍＡＭＰ１−ＣＲ
Ｐは二つのピークで溶離したが、その後者は、基準ＤｍＡＭＰ１の場合と極めて
近い位置で溶離した。ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰは、たった一つのピークで見出され
たが、それは、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰピークから充分に離れていて、基準ＲｓＡ
ＦＰ２の場合と極めて近い位置で溶離した。更に、それら画分で、抗ＤｍＡＭＰ
１抗体および抗ＲｓＡＦＰ２抗体双方と反応したものはなく、それら抽出物中に
は、切断されていない融合タンパク質が存在していなかったことが示された。
ＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰの本来の組成に影響を与えるかど
うか調べるために、粗製葉抽出物から出発する別の精製手順を開発した。この目
的には、葉を液体窒素下でホモジナイゼーションし、プロテアーゼインヒビター
の混合物（１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭ Ｎ−エチルマ
レイミド、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０２ｍＭペプスタチンＡ）を含有する５
０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）を用いて抽出した。そのホモジネートを、遠心分離（
１００００ｘｇで１０分間）によって清澄にした。次に、その上澄みを、イオン
交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）およびその後の逆相クロマトグラフィー（Ｒ
ＰＣ）によって分別した。それぞれの分離後、画分を集め、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲ
ＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰについて、ＤｍＡＭＰ１およびＲｓＡＦＰ２それ
ぞれに対して生じる抗体を用いた二つの異なったエリザ検定を用いて評価した。
ＩＥＣは、抽出物を陽イオン交換カラム（Mono Ｓ，５ｘ５０ｍｍ，Pharmacia）
にｐＨ６で通過させることによって行われた。そのカラムを、５０ｍＭ Ｎ−モ
ルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）中の０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配を
ｐＨ６で用いて溶離した場合、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰは、０．１７〜０．３３Ｍ
ＮａＣｌで溶離する画分中で検出されたが、ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰは、０．２
４〜０．４９Ｍ ＮａＣｌで溶離した。ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰかまたはＲｓＡＦ
Ｐ２−ＣＲＰを含有する画分を二つの画分（０．１７〜０．３３Ｍ ＮａＣｌ；
および０．３３〜０．４９Ｍ ＮａＣｌ）にプールし、それぞれに、アセトニト
リルの直線勾配を用いて溶離されるＣ８シリカカラム（Microsorb−ＭＶ，４．
６ｘ２５０ｍｍ，Rainin）上のＲＰＣを行った（図１６）。ＤｍＡＭＰ１−ＣＲ
Ｐは二つのピークで溶離したが、その後者は、基準ＤｍＡＭＰ１の場合と極めて
近い位置で溶離した。ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰは、たった一つのピークで見出され
たが、それは、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰピークから充分に離れていて、基準ＲｓＡ
ＦＰ２の場合と極めて近い位置で溶離した。更に、それら画分で、抗ＤｍＡＭＰ
１抗体および抗ＲｓＡＦＰ２抗体双方と反応したものはなく、それら抽出物中に
は、切断されていない融合タンパク質が存在していなかったことが示された。
【０１０７】 細胞外液から精製される別のＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲ
Ｐに、Ｎ末端アミノ酸配列分析（Cammue ら，1992, J.Biol.Chem., 2228-2233
に記載の手順）並びにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス介助レーザーデソープ
ションイオン化−飛行時間型）質量分析法（Mann and Talbo, 1996, Curr.Opini
on Biotechnol. 7,11-19）を行った。そのＣ末端アミノ酸は、経験的に決定され
る質量によって予想される理論質量の最もよい近似に基づいて決定された（表３
）。少ない方のＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰであるｐ３１０５ＥＦ１も、多い方のＤｍ
ＡＭＰ１−ＣＲＰであるｐ３１０５ＥＦ２も（図１５および表３と同様のタンパ
ク質コード）、成熟ＤｍＡＭＰ１と正確に同じＮ末端配列を有した。ｐ３１０５
ＥＦ１およびｐ３１０５ＥＦ２は、基準ＤｍＡＭＰ１と比較して、それらＣ末端
に追加の１個のセリン残基が存在することと一致した質量を有した。しかしなが
ら、ｐ３１０５ＥＦ２の質量は、Ｃ末端セリンを含むＤｍＡＭＰ１誘導体（以下
、ＤｍＡＭＰ１＋Ｓと称される）について計算される質量に正確に（実験誤差の
範囲内で）対応したが、ｐ３１０５ＥＦ１の質量は、ＤｍＡＭＰ１＋Ｓの計算質
量に相対して約８ダルトンだけ過剰であった。したがって、このタンパク質は、
還元されたジスルフィド架橋を含むＤｍＡＭＰ１＋Ｓ誘導体でありうる。ＲｓＡ
ＦＰ２−ＣＲＰ画分ｐ３１０５ＥＦ３は、Ｎ末端配列および質量データに基づき
、そのＮ末端に追加のペンタペプチド配列ＤＶＥＰＧを含むＲｓＡＦＰ２誘導体
である。このタンパク質は、更に、ＤＶＥＰＧ＋ＲｓＡＦＰ２と称される。全葉
抽出物から精製される別のＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰを
、同様に分析した。それら分析により、全葉抽出物中には、同様の分子種、すな
わち、ＤｍＡＭＰ１＋Ｓ、ＤｍＡＭＰ１＋Ｓの推定上の還元型、およびＤＶＥＰ
Ｇ＋ＲｓＡＦＰ２が存在したことが示された（表３，下の実施例１０を参照され
たい）。
Ｐに、Ｎ末端アミノ酸配列分析（Cammue ら，1992, J.Biol.Chem., 2228-2233
に記載の手順）並びにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス介助レーザーデソープ
ションイオン化−飛行時間型）質量分析法（Mann and Talbo, 1996, Curr.Opini
on Biotechnol. 7,11-19）を行った。そのＣ末端アミノ酸は、経験的に決定され
る質量によって予想される理論質量の最もよい近似に基づいて決定された（表３
）。少ない方のＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰであるｐ３１０５ＥＦ１も、多い方のＤｍ
ＡＭＰ１−ＣＲＰであるｐ３１０５ＥＦ２も（図１５および表３と同様のタンパ
ク質コード）、成熟ＤｍＡＭＰ１と正確に同じＮ末端配列を有した。ｐ３１０５
ＥＦ１およびｐ３１０５ＥＦ２は、基準ＤｍＡＭＰ１と比較して、それらＣ末端
に追加の１個のセリン残基が存在することと一致した質量を有した。しかしなが
ら、ｐ３１０５ＥＦ２の質量は、Ｃ末端セリンを含むＤｍＡＭＰ１誘導体（以下
、ＤｍＡＭＰ１＋Ｓと称される）について計算される質量に正確に（実験誤差の
範囲内で）対応したが、ｐ３１０５ＥＦ１の質量は、ＤｍＡＭＰ１＋Ｓの計算質
量に相対して約８ダルトンだけ過剰であった。したがって、このタンパク質は、
還元されたジスルフィド架橋を含むＤｍＡＭＰ１＋Ｓ誘導体でありうる。ＲｓＡ
ＦＰ２−ＣＲＰ画分ｐ３１０５ＥＦ３は、Ｎ末端配列および質量データに基づき
、そのＮ末端に追加のペンタペプチド配列ＤＶＥＰＧを含むＲｓＡＦＰ２誘導体
である。このタンパク質は、更に、ＤＶＥＰＧ＋ＲｓＡＦＰ２と称される。全葉
抽出物から精製される別のＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰを
、同様に分析した。それら分析により、全葉抽出物中には、同様の分子種、すな
わち、ＤｍＡＭＰ１＋Ｓ、ＤｍＡＭＰ１＋Ｓの推定上の還元型、およびＤＶＥＰ
Ｇ＋ＲｓＡＦＰ２が存在したことが示された（表３，下の実施例１０を参照され
たい）。
【０１０８】 主要プロセシング産物ＤｍＡＭＰ１＋ＳおよびＤＶＥＰＧ＋ＲｓＡＦＰ２をそ
れぞれ含有する精製画分に、Cammue ら（1992, J.Biol.Chem., 267,2228-2233）
によって概説された手順にしたがって、真菌フザリウム・クルモルム（Fusarium
culmorum）を用いる抗微生物活性試験を行った。試験微生物の５０％成長阻害
に必要なタンパク質濃度として表される精製ＤｍＡＭＰ１＋Ｓの特異的抗微生物
活性は、基準ＤｍＡＭＰ１の活性と一致した。精製ＤＶＰＥＧ＋ＲｓＡＦＰ２の
特異的抗微生物活性は、基準ＲｓＡＦＰ２の活性に相対して約２倍低かった。Ｄ
ＶＰＥＧ＋ＲｓＡＦＰ２の特異的抗微生物活性の僅かな降下は、おそらく、５個
の追加のＮ末端アミノ酸の存在のためである。それにもかかわらず、本発明者の
データにより、トランスジェニック植物中のポリタンパク質前駆体のプロセシン
グは、生物活性タンパク質の放出を引き起こすことがありうるということが示さ
れる。
れぞれ含有する精製画分に、Cammue ら（1992, J.Biol.Chem., 267,2228-2233）
によって概説された手順にしたがって、真菌フザリウム・クルモルム（Fusarium
culmorum）を用いる抗微生物活性試験を行った。試験微生物の５０％成長阻害
に必要なタンパク質濃度として表される精製ＤｍＡＭＰ１＋Ｓの特異的抗微生物
活性は、基準ＤｍＡＭＰ１の活性と一致した。精製ＤＶＰＥＧ＋ＲｓＡＦＰ２の
特異的抗微生物活性は、基準ＲｓＡＦＰ２の活性に相対して約２倍低かった。Ｄ
ＶＰＥＧ＋ＲｓＡＦＰ２の特異的抗微生物活性の僅かな降下は、おそらく、５個
の追加のＮ末端アミノ酸の存在のためである。それにもかかわらず、本発明者の
データにより、トランスジェニック植物中のポリタンパク質前駆体のプロセシン
グは、生物活性タンパク質の放出を引き起こすことがありうるということが示さ
れる。
【０１０９】 構築物３１０５を用いて形質転換されたトランスジェニック植物中で生産され
るＡＦＰの分析により、その前駆体は、明らかに三つの切断工程によってプロセ
シングされることが示される（図１７）。
るＡＦＰの分析により、その前駆体は、明らかに三つの切断工程によってプロセ
シングされることが示される（図１７）。
【０１１０】 （ｉ）前駆体は、基準ＤｍＡＭＰ１前駆体の場合と同様に、リーダーペプチド
のＣ末端で切断される； （ii）前駆体は、リンカーペプチドの最初のアミノ酸のＣ末端で切断されるの
で、ＤｍＡＭＰ１＋Ｓを放出する； （iii）前駆体は、リンカーペプチドの最後の５番目の残基のＮ末端で更にプ
ロセシングされるので、ＤＶＥＰＧ＋ＲｓＡＦＰ２を放出する。 認められた切断をどのプロテアーゼが行っているのかは知られていないし、多数
の異なったプロテアーゼがどのように関与しているのかも知られていない。リン
カーペプチド中の切断は、エンドプロテイナーゼだけを必要とするかまたは、切
断産物をそれらの末端で更に切り取るエンドプロテイナーゼおよびエキソペプチ
ダーゼの協同作用によって生じることがありうる。リンカーペプチドのＣ末端側
でのプロセシングは、二つの酸性残基ＥおよびＤの間で起こる。その酸性ダブレ
ットは、特異的エンドプロテイナーゼの標的配列でありうる。２個連続した酸性
残基の間を切断することができるアスパラギン酸エンドプロテイナーゼは、以前
に、Arabidopsis 種子から精製されている（D'Hondt ら，1993, J.Biol.Chem. 2
68,20884-20891）。配列ＥＤは、ＩｂＡＭＰ１ポリタンパク質前駆体の６個の内
部プロペプチドの内の５個の全くのＣ末端にあると述べることは価値のあること
である（Tailor ら，1997, J.Biol.Chem. 272,24480-24487）。６個の内部Ｉｂ
ＡＭＰプロペプチドの内の一つ、より厳密には、構築物３１０５中で用いられた
ものにおいて、そのＥＤ配列は、それらプロペプチドのＣ末端には存在しないが
、この末端から４アミノ酸だけ離れている。Impatiens balsamina におけるこの
プロペプチドのプロセシングは、ＥＤ配列の切断後、得られたタンパク質のアミ
ノペプチダーゼによる部分Ｎ末端切断を含むことがありうる。
のＣ末端で切断される； （ii）前駆体は、リンカーペプチドの最初のアミノ酸のＣ末端で切断されるの
で、ＤｍＡＭＰ１＋Ｓを放出する； （iii）前駆体は、リンカーペプチドの最後の５番目の残基のＮ末端で更にプ
ロセシングされるので、ＤＶＥＰＧ＋ＲｓＡＦＰ２を放出する。 認められた切断をどのプロテアーゼが行っているのかは知られていないし、多数
の異なったプロテアーゼがどのように関与しているのかも知られていない。リン
カーペプチド中の切断は、エンドプロテイナーゼだけを必要とするかまたは、切
断産物をそれらの末端で更に切り取るエンドプロテイナーゼおよびエキソペプチ
ダーゼの協同作用によって生じることがありうる。リンカーペプチドのＣ末端側
でのプロセシングは、二つの酸性残基ＥおよびＤの間で起こる。その酸性ダブレ
ットは、特異的エンドプロテイナーゼの標的配列でありうる。２個連続した酸性
残基の間を切断することができるアスパラギン酸エンドプロテイナーゼは、以前
に、Arabidopsis 種子から精製されている（D'Hondt ら，1993, J.Biol.Chem. 2
68,20884-20891）。配列ＥＤは、ＩｂＡＭＰ１ポリタンパク質前駆体の６個の内
部プロペプチドの内の５個の全くのＣ末端にあると述べることは価値のあること
である（Tailor ら，1997, J.Biol.Chem. 272,24480-24487）。６個の内部Ｉｂ
ＡＭＰプロペプチドの内の一つ、より厳密には、構築物３１０５中で用いられた
ものにおいて、そのＥＤ配列は、それらプロペプチドのＣ末端には存在しないが
、この末端から４アミノ酸だけ離れている。Impatiens balsamina におけるこの
プロペプチドのプロセシングは、ＥＤ配列の切断後、得られたタンパク質のアミ
ノペプチダーゼによる部分Ｎ末端切断を含むことがありうる。
【０１１１】 構築物３１０５中で用いられるＩｂＡＭＰ１プロペプチドに似ている内部プロ
ペプチドであるが、ジペプチド配列ＥＤがプロペプチドのＣ末端に移動している
内部プロペプチドは、その内部プロペプチドからＣ末端に位置するタンパク質中
に余分のＮ末端アミノ酸を１個だけ含むまたは全く含まない切断産物を生じるで
あろうと考えられる。或いは、ＥＤ配列をそのＣ末端に既に有する別のＩｂＡＭ
Ｐ１プロペプチド（Tailor ら，1997, J.Biol.Chem. 272,24480-24487）または
関連の配列は、プロセシング精度を同様に改善すると考えられる。
ペプチドであるが、ジペプチド配列ＥＤがプロペプチドのＣ末端に移動している
内部プロペプチドは、その内部プロペプチドからＣ末端に位置するタンパク質中
に余分のＮ末端アミノ酸を１個だけ含むまたは全く含まない切断産物を生じるで
あろうと考えられる。或いは、ＥＤ配列をそのＣ末端に既に有する別のＩｂＡＭ
Ｐ１プロペプチド（Tailor ら，1997, J.Biol.Chem. 272,24480-24487）または
関連の配列は、プロセシング精度を同様に改善すると考えられる。
【０１１２】 実施例９ ポリタンパク質前駆体構築物ｐＦＡＪ３１０６からプロセシングされるタンパ ク質の精製 構築物ｐＦＡＪ３１０６を用いて形質転換された Arabidopsis 植物の集団か
らのトランスジェニック系統９を更に交配させて、導入遺伝子にホモ接合性の植
物を得た。ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰを、構築物ｐＦＡ
Ｊ３１０５を用いて形質転換された系統について上の実施例８に記載されたのと
同様に調製される葉細胞外液から、逆相クロマトグラフィーによって精製した。
この分離のクロマトグラムを図１８に示す。ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰは、ｐ３１０
６ＥＦ１およびｐ３１０６ＥＦ２と称される二つのピークで溶離した。どちらの
画分も、ＤｍＡＭＰ１と同様のＮ末端配列を有した（表３，下の実施例１０を参
照されたい）。ｐ３１０６ＥＦ２の質量は、追加のリシンを含むＤｍＡＭＰ１誘
導体について予想される質量に対応した。したがって、本発明者は、それが、シ
グナルペプチド切断部位およびリンカーペプチドの最初の残基（リシン）の後の
Ｃ末端で切断される前駆体の切断産物であると結論する。このタンパク質を、更
に、ＤｍＡＭＰ１＋Ｋと称する。
らのトランスジェニック系統９を更に交配させて、導入遺伝子にホモ接合性の植
物を得た。ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰを、構築物ｐＦＡ
Ｊ３１０５を用いて形質転換された系統について上の実施例８に記載されたのと
同様に調製される葉細胞外液から、逆相クロマトグラフィーによって精製した。
この分離のクロマトグラムを図１８に示す。ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰは、ｐ３１０
６ＥＦ１およびｐ３１０６ＥＦ２と称される二つのピークで溶離した。どちらの
画分も、ＤｍＡＭＰ１と同様のＮ末端配列を有した（表３，下の実施例１０を参
照されたい）。ｐ３１０６ＥＦ２の質量は、追加のリシンを含むＤｍＡＭＰ１誘
導体について予想される質量に対応した。したがって、本発明者は、それが、シ
グナルペプチド切断部位およびリンカーペプチドの最初の残基（リシン）の後の
Ｃ末端で切断される前駆体の切断産物であると結論する。このタンパク質を、更
に、ＤｍＡＭＰ１＋Ｋと称する。
【０１１３】 ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰ画分は、配列ＬＩＧＫＲＱＫによって開始するＮ末端ア
ミノ酸配列決定によって見出された。したがって、ＱＬＩＧＫＲ＋ＲｓＡＦＰ２
と称されるこのタンパク質は、リンカーペプチドの最後の６番目の残基（グルタ
ミン）からＮ末端の前駆体の切断に由来する。構築物ｐＦＡＪ３１０６の前駆体
のプロセシングに関与する考えられる切断工程を、図１７に示す。
ミノ酸配列決定によって見出された。したがって、ＱＬＩＧＫＲ＋ＲｓＡＦＰ２
と称されるこのタンパク質は、リンカーペプチドの最後の６番目の残基（グルタ
ミン）からＮ末端の前駆体の切断に由来する。構築物ｐＦＡＪ３１０６の前駆体
のプロセシングに関与する考えられる切断工程を、図１７に示す。
【０１１４】 実施例１０ ポリタンパク質前駆体構築物ｐＦＡＪ３１０８からプロセシングされるタンパ ク質の精製 構築物ｐＦＡＪ３１０８を用いて形質転換された Arabidopsis 植物の集団か
らのトランスジェニック系統９を更に交配させて、導入遺伝子にホモ接合性の植
物を得た。ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰを、構築物３１０
５を用いて形質転換された系統について上の実施例８に記載のＩＥＣおよびＲＰ
Ｃに基づく手順にしたがって、この系統の全粗製葉抽出物から精製した。ＩＥＣ
およびＲＰＣの分離のクロマトグラムを図１９に示す。ＩＥＣ分離は、ＤｍＡＭ
Ｐ１−ＣＲＰを含有する二つのピークを生じた。しかしながら、ＲｓＡＦＰ２−
ＣＲＰは、溶出液画分のいずれにおいても検出することができなかった。ＲｓＡ
ＦＰ２−ＣＲＰは、ｐＦＡＪ３１０８を用いて形質転換された植物の粗製抽出物
およびＥＦ画分中に明らかに存在していたので（表１および２を参照されたい）
、ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰは、分離中に失われたに違いない。考えられる説明は、
ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰが、溶離勾配中で用いられる最高濃度である０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌを用いたＩＥＣカラムから溶離されなかったということである。ＤｍＡＭ
Ｐ１−ＣＲＰを含有する画分をＲＰＣによって分離して、二つのＤｍＡＭＰ１−
ＣＲＰピークを生じた。この画分のＮ末端配列決定およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質
量測定による分析（表３）は、それが、追加のアラニンをＣ末端に含むＤｍＡＭ
Ｐ１誘導体（ＤｍＡＭＰ１＋Ａ）であることを示した。このタンパク質は、シグ
ナルペプチド切断部位でのおよびリンカーペプチドの最初の残基（アラニン）か
らＣ末端での前駆体の切断によって生じる（図１７）。
らのトランスジェニック系統９を更に交配させて、導入遺伝子にホモ接合性の植
物を得た。ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰを、構築物３１０
５を用いて形質転換された系統について上の実施例８に記載のＩＥＣおよびＲＰ
Ｃに基づく手順にしたがって、この系統の全粗製葉抽出物から精製した。ＩＥＣ
およびＲＰＣの分離のクロマトグラムを図１９に示す。ＩＥＣ分離は、ＤｍＡＭ
Ｐ１−ＣＲＰを含有する二つのピークを生じた。しかしながら、ＲｓＡＦＰ２−
ＣＲＰは、溶出液画分のいずれにおいても検出することができなかった。ＲｓＡ
ＦＰ２−ＣＲＰは、ｐＦＡＪ３１０８を用いて形質転換された植物の粗製抽出物
およびＥＦ画分中に明らかに存在していたので（表１および２を参照されたい）
、ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰは、分離中に失われたに違いない。考えられる説明は、
ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰが、溶離勾配中で用いられる最高濃度である０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌを用いたＩＥＣカラムから溶離されなかったということである。ＤｍＡＭ
Ｐ１−ＣＲＰを含有する画分をＲＰＣによって分離して、二つのＤｍＡＭＰ１−
ＣＲＰピークを生じた。この画分のＮ末端配列決定およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質
量測定による分析（表３）は、それが、追加のアラニンをＣ末端に含むＤｍＡＭ
Ｐ１誘導体（ＤｍＡＭＰ１＋Ａ）であることを示した。このタンパク質は、シグ
ナルペプチド切断部位でのおよびリンカーペプチドの最初の残基（アラニン）か
らＣ末端での前駆体の切断によって生じる（図１７）。
【０１１５】 表３：図１５、１６、１８および１９に記載のように精製されるＤｍＡＭＰ１
−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰの画分の、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳまた
はＥＩ−ＭＳによって決定される質量および自動エドマン分解によって決定され
るＮ末端配列。実験質量と理論質量とを最もよく一致させる予想のＣ末端配列も
示す。
−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰの画分の、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳまた
はＥＩ−ＭＳによって決定される質量および自動エドマン分解によって決定され
るＮ末端配列。実験質量と理論質量とを最もよく一致させる予想のＣ末端配列も
示す。
【０１１６】
【表３】
【０１１７】 実施例１１ 構築物ｐＦＡＪ３１０５への修飾 構築物ｐＦＡＪ３１０５を用いて形質転換された Arabidopsis 植物の分析か
ら、ポリタンパク質前駆体が実際に切断されることは明らかである（表３，図１
７を参照されたい）。しかしながら、切断は、リンカーペプチドからの１個のア
ミノ酸が、リンカーペプチドからＮ末端に位置する成熟タンパク質に結合したま
まであるように、且つ５個のアミノ酸が、リンカーペプチドからＣ末端に位置す
る成熟タンパク質に結合したままであるように起こる（図１７を参照されたい）
。成熟タンパク質に結合したリンカーペプチド由来アミノ酸は、これら成熟タン
パク質の機能性を妨げる可能性があると考えられるが、それらの数を減少させる
ために、多数の構築物は、成熟タンパク質の境界の近くで（またはまさに選択的
に境界で）切断を生じさせるように設計されている。
ら、ポリタンパク質前駆体が実際に切断されることは明らかである（表３，図１
７を参照されたい）。しかしながら、切断は、リンカーペプチドからの１個のア
ミノ酸が、リンカーペプチドからＮ末端に位置する成熟タンパク質に結合したま
まであるように、且つ５個のアミノ酸が、リンカーペプチドからＣ末端に位置す
る成熟タンパク質に結合したままであるように起こる（図１７を参照されたい）
。成熟タンパク質に結合したリンカーペプチド由来アミノ酸は、これら成熟タン
パク質の機能性を妨げる可能性があると考えられるが、それらの数を減少させる
ために、多数の構築物は、成熟タンパク質の境界の近くで（またはまさに選択的
に境界で）切断を生じさせるように設計されている。
【０１１８】 構築物ｐＦＡＪ３３４３の場合、ｐＦＡＪ３１０５中に存在するリンカーペプ
チドのＮ末端残基のコドンが欠失している。成熟ＤｍＡＭＰ１の切断は、リンカ
ーペプチドからのアミノ酸が全く加えられなくても起こるであろうと考えられる
（図２０）。構築物ｐＦＡＪ３３４４、ｐＦＡＪ３３４５およびｐＦＡＪ３３４
６の場合、ｐＦＡＪ３１０５中のリンカーペプチドのカルボキシル末端のコドン
は、最後の２個、４個および５個の残基をそれぞれ欠失したように修飾されてい
る。切断後のＲｓＡＦＰ２のＮ末端に結合したままの残基の数は、構築物ｐＦＡ
Ｊ３３４４、ｐＦＡＪ３３４５およびｐＦＡＪ３３４６において、それぞれ３個
、１個および０個であろうと考えられる（図２０）。構築物ｐＦＡＪ３１０５中
のリンカーペプチド領域のＮ末端かまたはＣ末端の残基数が減少している他の構
築物を製造することができる。
チドのＮ末端残基のコドンが欠失している。成熟ＤｍＡＭＰ１の切断は、リンカ
ーペプチドからのアミノ酸が全く加えられなくても起こるであろうと考えられる
（図２０）。構築物ｐＦＡＪ３３４４、ｐＦＡＪ３３４５およびｐＦＡＪ３３４
６の場合、ｐＦＡＪ３１０５中のリンカーペプチドのカルボキシル末端のコドン
は、最後の２個、４個および５個の残基をそれぞれ欠失したように修飾されてい
る。切断後のＲｓＡＦＰ２のＮ末端に結合したままの残基の数は、構築物ｐＦＡ
Ｊ３３４４、ｐＦＡＪ３３４５およびｐＦＡＪ３３４６において、それぞれ３個
、１個および０個であろうと考えられる（図２０）。構築物ｐＦＡＪ３１０５中
のリンカーペプチド領域のＮ末端かまたはＣ末端の残基数が減少している他の構
築物を製造することができる。
【０１１９】 構築物ｐＦＡＪ３１０５の場合、リンカーペプチドは、ＩｂＡＭＰ前駆体の４
番目の内部プロペプチドに由来する（Tailor R.H. ら，1997, J.Biol.Chem. 272
,24480-24487）。構築物ｐＦＡＪ３３６９の場合、このリンカーペプチドは、Ｉ
ｂＡＭＰ前駆体の最初の内部プロペプチドによって置き換えられている（Tailor
R.H. ら，1997, 同書）。後者のリンカーペプチドの場合、酸性残基のダブレッ
トはＣ末端に存在している。切断は、１個の残基だけが、ＲｓＡＦＰ２のＮ末端
に結合したままであるように起こるであろうと考えられる（図２０）。
番目の内部プロペプチドに由来する（Tailor R.H. ら，1997, J.Biol.Chem. 272
,24480-24487）。構築物ｐＦＡＪ３３６９の場合、このリンカーペプチドは、Ｉ
ｂＡＭＰ前駆体の最初の内部プロペプチドによって置き換えられている（Tailor
R.H. ら，1997, 同書）。後者のリンカーペプチドの場合、酸性残基のダブレッ
トはＣ末端に存在している。切断は、１個の残基だけが、ＲｓＡＦＰ２のＮ末端
に結合したままであるように起こるであろうと考えられる（図２０）。
【０１２０】 実施例１２ ４個の成熟タンパク質ドメインを含むポリタンパク質の発現用の構築物の構築
構築物ｐＦＡＪ３３６７中のポリタンパク質領域は、ＤｍＡＭＰ１ ｃＤＮＡ のシグナルペプチド領域の次に、ＩｂＡＮＰ前駆体の最初の内部プロペプチド領
域によってそれぞれ隔てられている４種類の異なった抗微生物性ペプチドのコー
ディング領域から成る。４種類の異なった抗微生物性タンパク質のコーディング
領域は、順に、次である（図２１を参照されたい）。
構築物ｐＦＡＪ３３６７中のポリタンパク質領域は、ＤｍＡＭＰ１ ｃＤＮＡ のシグナルペプチド領域の次に、ＩｂＡＮＰ前駆体の最初の内部プロペプチド領
域によってそれぞれ隔てられている４種類の異なった抗微生物性ペプチドのコー
ディング領域から成る。４種類の異なった抗微生物性タンパク質のコーディング
領域は、順に、次である（図２１を参照されたい）。
【０１２１】 １．植物デフェンシンＤｍＡＭＰ１（Osborn R.W. ら，1995, FEBS Lett. 368
,257-262） ２．植物デフェンシンＲｓＡＦＰ２（Terras F.R.G. ら，1995, Plant Cell,
7,573-588） ３．植物デフェンシンＨｓＡＦＰ１（Osborn R.W. ら，1995, FEBS Lett. 368
,257-262） ４．脂質輸送タンパク質様タンパク質ＡｃｅＡＭＰ１（Cammue B.P.A. ら1995
, Plant Physiol. 109,445-455） この構築物は、細胞外空間にそれぞれ分泌される４種類の異なった抗微生物性タ
ンパク質（ＤｍＡＭＰ１、ＲｓＡＦＰ２、ＨｓＡＦＰ１およびＡｃｅＡＭＰ１）
を生じるであろう。
,257-262） ２．植物デフェンシンＲｓＡＦＰ２（Terras F.R.G. ら，1995, Plant Cell,
7,573-588） ３．植物デフェンシンＨｓＡＦＰ１（Osborn R.W. ら，1995, FEBS Lett. 368
,257-262） ４．脂質輸送タンパク質様タンパク質ＡｃｅＡＭＰ１（Cammue B.P.A. ら1995
, Plant Physiol. 109,445-455） この構築物は、細胞外空間にそれぞれ分泌される４種類の異なった抗微生物性タ
ンパク質（ＤｍＡＭＰ１、ＲｓＡＦＰ２、ＨｓＡＦＰ１およびＡｃｅＡＭＰ１）
を生じるであろう。
【０１２２】 他の構築物を、他の成熟ペプチド領域および上記の任意の他のリンカーペプチ
ド領域を用いて製造することができる。 実施例１３ 構築物ｐＦＡＪ３１０６、ｐＦＡＪ３１０７およびｐＦＡＪ３１０８への修飾
構築物ｐＦＡＪ３１０６、ｐＦＡＪ３１０７およびｐＦＡＪ３１０８によって コードされるポリタンパク質は、Ｋｅｘ２認識部位ＩＧＫＲをそれらのＣ末端に
含むリンカーペプチドを含有する。Jiang L. および Rogers J.C.（1999, Plant
J. 18,23-32）は、ＩＧＫＲ部位を含有するポリタンパク質が、トランスジェニ
ックタバコ植物において切断されないまたは不充分にしか切断されないことを示
している。改良された切断は、そのＩＧＫＲ配列が、配列ＩＧＫＲＩＧＫＲＩＧ
ＫＲ（配列番号７７）で置き換えられたポリタンパク質において認められた。
ド領域を用いて製造することができる。 実施例１３ 構築物ｐＦＡＪ３１０６、ｐＦＡＪ３１０７およびｐＦＡＪ３１０８への修飾
構築物ｐＦＡＪ３１０６、ｐＦＡＪ３１０７およびｐＦＡＪ３１０８によって コードされるポリタンパク質は、Ｋｅｘ２認識部位ＩＧＫＲをそれらのＣ末端に
含むリンカーペプチドを含有する。Jiang L. および Rogers J.C.（1999, Plant
J. 18,23-32）は、ＩＧＫＲ部位を含有するポリタンパク質が、トランスジェニ
ックタバコ植物において切断されないまたは不充分にしか切断されないことを示
している。改良された切断は、そのＩＧＫＲ配列が、配列ＩＧＫＲＩＧＫＲＩＧ
ＫＲ（配列番号７７）で置き換えられたポリタンパク質において認められた。
【０１２３】 構築物ｐＦＡＪ３１０６−２、ｐＦＡＪ３１０７−２およびｐＦＡＪ３１０８
−２は、ＩＧＫＲコーディング領域が、ＩＧＫＲＩＧＫＲＩＧＫＲをコードする
領域で置き換えられたこと以外は、構築物ｐＦＡＪ３１０６、ｐＦＡＪ３１０７
およびｐＦＡＪ３１０８と一致する（図２２）。これら構築物によってコードさ
れるポリタンパク質は、リンカーペプチドのＮ末端でもＣ末端でも、効率よく切
断されるであろう。
−２は、ＩＧＫＲコーディング領域が、ＩＧＫＲＩＧＫＲＩＧＫＲをコードする
領域で置き換えられたこと以外は、構築物ｐＦＡＪ３１０６、ｐＦＡＪ３１０７
およびｐＦＡＪ３１０８と一致する（図２２）。これら構築物によってコードさ
れるポリタンパク質は、リンカーペプチドのＮ末端でもＣ末端でも、効率よく切
断されるであろう。
【０１２４】 構築物ｐＦＡＪ３１０６、ｐＦＡＪ３１０７またはｐＦＡＪ３１０８中のリン
カーペプチド領域のＮ末端かまたはＣ末端の残基数が減少している他の構築物を
製造することができる。
カーペプチド領域のＮ末端かまたはＣ末端の残基数が減少している他の構築物を
製造することができる。
【０１２５】 実施例１４ ２Ａ配列を含有するハイブリッドリンカーペプチドに基づくポリタンパク質構 築物 口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ＲＮＡを、２Ａ配列と称される２０アミノ酸配列
に切断が依存するポリタンパク質として翻訳する（Ryan and Drew 1994, EMBO J
. 13,928-933）。その２Ａ配列によって結合したポリタンパク質の切断は、２Ａ
配列の１９番目のアミノ酸（Ｇ）と２０番目のアミノ酸（Ｐ）との間において、
プロセシング酵素とは明らかに無関係であり、しかもＧとＰとの間の不適当なペ
プチド結合形成のためでありうる過程によって起こる（Halpin ら，1999, Plant
J. 17,453-459）。Halpin ら，1999（Plant J. 17,453-459）は、ＦＭＤＶ ２
Ａ配列をリンカーペプチドとして含有するポリタンパク質が、植物中で発現され
る場合は効率よく切断されるということを示している。しかしながら、リンカー
ペプチドとしてのＦＭＤＶ ２Ａ配列の使用の一つの主な欠点は、リンカーペプ
チドのＮ末端で切断が起こらないということである。したがって、ＦＭＤＶ ２
Ａ配列の最初の１９残基に対応する１９アミノ酸の比較的長い伸長は、成熟タン
パク質のＣ末端に結合したまま残る。この追加の１９残基の伸長は、それが結合
しているタンパク質の機能性を妨げることがありうる。
に切断が依存するポリタンパク質として翻訳する（Ryan and Drew 1994, EMBO J
. 13,928-933）。その２Ａ配列によって結合したポリタンパク質の切断は、２Ａ
配列の１９番目のアミノ酸（Ｇ）と２０番目のアミノ酸（Ｐ）との間において、
プロセシング酵素とは明らかに無関係であり、しかもＧとＰとの間の不適当なペ
プチド結合形成のためでありうる過程によって起こる（Halpin ら，1999, Plant
J. 17,453-459）。Halpin ら，1999（Plant J. 17,453-459）は、ＦＭＤＶ ２
Ａ配列をリンカーペプチドとして含有するポリタンパク質が、植物中で発現され
る場合は効率よく切断されるということを示している。しかしながら、リンカー
ペプチドとしてのＦＭＤＶ ２Ａ配列の使用の一つの主な欠点は、リンカーペプ
チドのＮ末端で切断が起こらないということである。したがって、ＦＭＤＶ ２
Ａ配列の最初の１９残基に対応する１９アミノ酸の比較的長い伸長は、成熟タン
パク質のＣ末端に結合したまま残る。この追加の１９残基の伸長は、それが結合
しているタンパク質の機能性を妨げることがありうる。
【０１２６】 切断後のリンカーペプチドの不完全な除去についてのこの問題と取り組むため
に、構築物ｐＦＡＪ３１０５、ｐＦＡＪ３１０６、ｐＦＡＪ３１０７またはｐＦ
ＡＪ３１０８中に記載のリンカーペプチドのＮ末端部分（またはこのようなペプ
チドの一部分）およびＦＭＤＶ ２Ａ配列のＣ末端部分（またはこのようなペプ
チドの一部分）から成るハイブリッドリンカーペプチドが考えられる。この原理
に基づく構築物の例は、構築物ｐＦＡＪ３３７０およびｐＦＡＪ３３６８である
（図２３）。構築物ｐＦＡＪ３３７０は、リンカーペプチドが、ＩｂＡＭＰ前駆
体の４番目の内部プロペプチドの最初の９アミノ酸（Tailor R.H. ら，1997, J.
Biol.Chem. 272,24480-24487）の次に、ＦＭＤＶ ２Ａ配列全部の２０アミノ酸
から成る２９アミノ酸ペプチドであること以外は、構築物ｐＦＡＪ３１０５の場
合と一致するポリタンパク質領域を有する。このリンカーペプチドの切断は、追
加のセリンをＣ末端に含む成熟ＤｍＡＭＰ１および追加のプロリンをＮ末端に含
む成熟ＲｓＡＦＰ２を放出するはずである。
に、構築物ｐＦＡＪ３１０５、ｐＦＡＪ３１０６、ｐＦＡＪ３１０７またはｐＦ
ＡＪ３１０８中に記載のリンカーペプチドのＮ末端部分（またはこのようなペプ
チドの一部分）およびＦＭＤＶ ２Ａ配列のＣ末端部分（またはこのようなペプ
チドの一部分）から成るハイブリッドリンカーペプチドが考えられる。この原理
に基づく構築物の例は、構築物ｐＦＡＪ３３７０およびｐＦＡＪ３３６８である
（図２３）。構築物ｐＦＡＪ３３７０は、リンカーペプチドが、ＩｂＡＭＰ前駆
体の４番目の内部プロペプチドの最初の９アミノ酸（Tailor R.H. ら，1997, J.
Biol.Chem. 272,24480-24487）の次に、ＦＭＤＶ ２Ａ配列全部の２０アミノ酸
から成る２９アミノ酸ペプチドであること以外は、構築物ｐＦＡＪ３１０５の場
合と一致するポリタンパク質領域を有する。このリンカーペプチドの切断は、追
加のセリンをＣ末端に含む成熟ＤｍＡＭＰ１および追加のプロリンをＮ末端に含
む成熟ＲｓＡＦＰ２を放出するはずである。
【０１２７】 構築物ｐＦＡＪ３３６８は、Ｃ末端の成熟タンパク質ドメイン（この場合、Ｒ
ｓＡＦＰ２をコードしている）が、シグナルペプチドドメインが前にあるこの成
熟タンパク質ドメインをコードしているドメイン（この場合、それ自体のシグナ
ルペプチドを含むＲｓＡＦＰ２をコードしている）によって置き換えられている
こと以外は、構築物ｐＦＡＪ３３７０と一致する。ＦＭＤＶ ２Ａ配列のＧおよ
びＰ間の切断が、ポリタンパク質の小胞体中への完全翻訳の前に起こるならば、
構築物ｐＦＡＪ３３６８は、構築物ｐＦＡＪ３３７０と比較して、双方の成熟タ
ンパク質を細胞外空間へより良くターゲッティングさせるであろうと考えられる
。この場合、分泌される成熟タンパク質は、追加のセリンをＣ末端に含むＤｍＡ
ＭＰ１および追加のアミノ酸を含まないＲｓＡＦＰ２から成るであろう。ＦＭＤ
Ｖ ２Ａ配列のＧおよびＰ間の切断が、ポリタンパク質の小胞体中への翻訳後に
起こるならば、ＲｓＡＦＰ２に結合したシグナルペプチドは、効率よく除去され
ることはないであろうし、そしてこの場合、構築物ｐＦＡＪ３３７０がｐＦＡＪ
３３６８より好適であろうと考えられる。
ｓＡＦＰ２をコードしている）が、シグナルペプチドドメインが前にあるこの成
熟タンパク質ドメインをコードしているドメイン（この場合、それ自体のシグナ
ルペプチドを含むＲｓＡＦＰ２をコードしている）によって置き換えられている
こと以外は、構築物ｐＦＡＪ３３７０と一致する。ＦＭＤＶ ２Ａ配列のＧおよ
びＰ間の切断が、ポリタンパク質の小胞体中への完全翻訳の前に起こるならば、
構築物ｐＦＡＪ３３６８は、構築物ｐＦＡＪ３３７０と比較して、双方の成熟タ
ンパク質を細胞外空間へより良くターゲッティングさせるであろうと考えられる
。この場合、分泌される成熟タンパク質は、追加のセリンをＣ末端に含むＤｍＡ
ＭＰ１および追加のアミノ酸を含まないＲｓＡＦＰ２から成るであろう。ＦＭＤ
Ｖ ２Ａ配列のＧおよびＰ間の切断が、ポリタンパク質の小胞体中への翻訳後に
起こるならば、ＲｓＡＦＰ２に結合したシグナルペプチドは、効率よく除去され
ることはないであろうし、そしてこの場合、構築物ｐＦＡＪ３３７０がｐＦＡＪ
３３６８より好適であろうと考えられる。
【図１】 図１は、ＤｍＡＭＰ１遺伝子のコーディング領域のヌクレオチド配列（配列番
号１）および該当するアミノ酸配列（配列番号２）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１に
該当するアミノ酸に下線を施している。イントロンに該当するヌクレオチドには
二重下線を施している。
号１）および該当するアミノ酸配列（配列番号２）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１に
該当するアミノ酸に下線を施している。イントロンに該当するヌクレオチドには
二重下線を施している。
【図２】 図２は、ベクター構築物からのコーディング領域の略図を示す（配列番号３〜
８）。内部プロペプチドより下流のアミノ酸配列は、リンカープロペプチドが由
来するプロペプチド配列を示している。
８）。内部プロペプチドより下流のアミノ酸配列は、リンカープロペプチドが由
来するプロペプチド配列を示している。
【図３】 図３は、植物形質転換ベクターｐＦＡＪ３１０５の略図を示す。
【図４】 図４は、植物形質転換ベクターｐＦＡＪ３１０６の略図を示す。
【図５】 図５は、植物形質転換ベクターｐＦＡＪ３１０７の略図を示す。
【図６】 図６は、植物形質転換ベクターｐＦＡＪ３１０８の略図を示す。
【図７】 図７は、植物形質転換ベクターｐＦＡＪ３１０９の略図を示す。
【図８】 図８は、プラスミドｐＦＡＪ３１０５のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間に含ま
れる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号９）および該当するアミノ
酸配列（配列番号１０）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２に該
当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。
れる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号９）および該当するアミノ
酸配列（配列番号１０）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２に該
当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。
【図９】 図９は、プラスミドｐＦＡＪ３１０６のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間に含ま
れる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号１１）および該当するアミ
ノ酸配列（配列番号１２）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２に
該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。
れる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号１１）および該当するアミ
ノ酸配列（配列番号１２）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２に
該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。
【図１０】 図１０は、プラスミドｐＦＡＪ３１０７のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間に含
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号１３）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号１４）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号１３）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号１４）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。
【図１１】 図１１は、プラスミドｐＦＡＪ３１０８のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間に含
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号１５）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号１６）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号１５）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号１６）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。
【図１２】 図１２は、プラスミドｐＦＡＪ３１０９のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間に含
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号１９）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号２０）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１に該当するアミノ酸に下
線を施している。
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号１９）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号２０）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１に該当するアミノ酸に下
線を施している。
【図１３】 図１３は、構築物ｐＦＡＪ３１０５を用いて形質転換された一連のトランスジ
ェニック個体植物および構築物ｐＦＡＪ３１０９を用いて形質転換された一連の
トランスジェニック個体のＤｍ−ＡＭＰ１発現レベルを（全可溶性タンパク質％
として）示す。
ェニック個体植物および構築物ｐＦＡＪ３１０９を用いて形質転換された一連の
トランスジェニック個体のＤｍ−ＡＭＰ１発現レベルを（全可溶性タンパク質％
として）示す。
【図１４】 図１４は、構築物ｐＦＡＪ３１０５（Ａ）またはｐＦＡＪ３１０６（Ｂ）を用
いて形質転換された葉からの粗抽出物のＣ８シリカカラム上のＲＰ−ＨＰＬＣ分
析を示す。抽出物は、材料および方法に記載のように調製した。カラムは、０．
１％ＴＦＡ中のアセトニトリルの勾配を用いて溶離した（０〜３５分，０．１％
ＴＦＡ中１５％〜５０％アセトニトリル）。溶出液は、２１４ｎｍでの吸光度の
測定についてオンラインで監視し（上のトレース）、分別し、ＤｍＡＭＰ１（下
の棒グラフ，黒棒）およびＲｓＡＦＰ２（下の棒グラフ，白棒）についてエリザ
検定を施した。基準ＤｍＡＭＰ１およびＲｓＡＦＰ２の溶離位置は、Ａ214クロ
マトグラムに矢印で示されている。
いて形質転換された葉からの粗抽出物のＣ８シリカカラム上のＲＰ−ＨＰＬＣ分
析を示す。抽出物は、材料および方法に記載のように調製した。カラムは、０．
１％ＴＦＡ中のアセトニトリルの勾配を用いて溶離した（０〜３５分，０．１％
ＴＦＡ中１５％〜５０％アセトニトリル）。溶出液は、２１４ｎｍでの吸光度の
測定についてオンラインで監視し（上のトレース）、分別し、ＤｍＡＭＰ１（下
の棒グラフ，黒棒）およびＲｓＡＦＰ２（下の棒グラフ，白棒）についてエリザ
検定を施した。基準ＤｍＡＭＰ１およびＲｓＡＦＰ２の溶離位置は、Ａ214クロ
マトグラムに矢印で示されている。
【図１５】 図１５は、構築物３１０５を用いて形質転換された Arabidopsis 植物（系統
１４）の細胞外液画分の逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）の結果を示す。ＲＰ
Ｃは、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて平衡にされたＣ８シリカカ
ラム（Microsorb−ＭＶ，４．６ｘ２５０ｍｍ，Rainin）上で行われた。充填後
、カラムを、０．１％ＴＦＡを用いて１ｍｌ／分の流量で２０分間溶離し、その
後、３５分直線勾配を０．１％ＴＦＡ中１５〜５０％アセトニトリルから当ては
めた。吸光度（実線）は２８０ｎｍにおいてオンラインで測定し、アセトニトリ
ル濃度（破線）は導電率モニターを用いてオンラインで測定した。画分を集め、
ＥＬＩＳＡ検定を用いてＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰにつ
いて評価した。ボールド体のピーク番号はＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰの存在を示し、
イタリック体のピーク番号はＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰの存在を示している。
１４）の細胞外液画分の逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）の結果を示す。ＲＰ
Ｃは、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて平衡にされたＣ８シリカカ
ラム（Microsorb−ＭＶ，４．６ｘ２５０ｍｍ，Rainin）上で行われた。充填後
、カラムを、０．１％ＴＦＡを用いて１ｍｌ／分の流量で２０分間溶離し、その
後、３５分直線勾配を０．１％ＴＦＡ中１５〜５０％アセトニトリルから当ては
めた。吸光度（実線）は２８０ｎｍにおいてオンラインで測定し、アセトニトリ
ル濃度（破線）は導電率モニターを用いてオンラインで測定した。画分を集め、
ＥＬＩＳＡ検定を用いてＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰにつ
いて評価した。ボールド体のピーク番号はＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰの存在を示し、
イタリック体のピーク番号はＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰの存在を示している。
【図１６】 図１６は、構築物３１０５を用いて形質転換された Arabidopsis 植物（系統
１４）の抽出物のＲＰＣの結果を示す。試料は、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰかまたは
ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰの存在を示すＩＥＣからの二つの異なった画分、すなわち
、０．１７〜０．３３Ｍ ＮａＣｌ（Ａ）と０．３３〜０．４９ ＮａＣｌ（Ｂ
）との間で溶離する画分であった。ＲＰＣは、図１４の説明と同様に行われた。
吸光度（実線）は２８０ｎｍにおいてオンラインで測定し、アセトニトリル濃度
（破線）は導電率モニターを用いてオンラインで測定した。画分を集め、ＥＬＩ
ＳＡ検定を用いてＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰについて評
価した。ボールド体のピーク番号はＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰの存在を示し、イタリ
ック体のピーク番号はＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰの存在を示している。
１４）の抽出物のＲＰＣの結果を示す。試料は、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰかまたは
ＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰの存在を示すＩＥＣからの二つの異なった画分、すなわち
、０．１７〜０．３３Ｍ ＮａＣｌ（Ａ）と０．３３〜０．４９ ＮａＣｌ（Ｂ
）との間で溶離する画分であった。ＲＰＣは、図１４の説明と同様に行われた。
吸光度（実線）は２８０ｎｍにおいてオンラインで測定し、アセトニトリル濃度
（破線）は導電率モニターを用いてオンラインで測定した。画分を集め、ＥＬＩ
ＳＡ検定を用いてＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰについて評
価した。ボールド体のピーク番号はＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰの存在を示し、イタリ
ック体のピーク番号はＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰの存在を示している。
【図１７】 図１７は、構築物ｐＦＡＪ３１０５、ｐＦＡＪ３１０６およびｐＦＡＪ３１０
８によってコードされるポリタンパク質前駆体のアミノ酸配列を示す。ダッシュ
は、簡潔のために完全な配列からの省略を示す。イタリック体の配列は、ＤｍＡ
ＭＰ１リーダーペプチドであり、下線を施された配列は成熟ＤｍＡＭＰ１であり
、ボールド体の配列はリンカーペプチドであり、二重下線を施された配列は成熟
ＲｓＡＦＰ２である。矢印は、精製されたＤｍＡＭＰ−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ
２−ＣＲＰのＮ末端配列および質量スペクトルの分析によってプロセシング部位
を示している。
８によってコードされるポリタンパク質前駆体のアミノ酸配列を示す。ダッシュ
は、簡潔のために完全な配列からの省略を示す。イタリック体の配列は、ＤｍＡ
ＭＰ１リーダーペプチドであり、下線を施された配列は成熟ＤｍＡＭＰ１であり
、ボールド体の配列はリンカーペプチドであり、二重下線を施された配列は成熟
ＲｓＡＦＰ２である。矢印は、精製されたＤｍＡＭＰ−ＣＲＰおよびＲｓＡＦＰ
２−ＣＲＰのＮ末端配列および質量スペクトルの分析によってプロセシング部位
を示している。
【図１８】 図１８は、構築物ｐＦＡＪ３１０６を用いて形質転換された Arabidopsis 植
物（系統９）の細胞外液画分のＲＰＣを示す。ＲＰＣは、図１５の説明に記載の
ように行われ且つ画分を分析した。ボールド体のピーク番号はＤｍＡＭＰ１−Ｃ
ＲＰの存在を示し、イタリック体のピーク番号はＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰの存在を
示している。
物（系統９）の細胞外液画分のＲＰＣを示す。ＲＰＣは、図１５の説明に記載の
ように行われ且つ画分を分析した。ボールド体のピーク番号はＤｍＡＭＰ１−Ｃ
ＲＰの存在を示し、イタリック体のピーク番号はＲｓＡＦＰ２−ＣＲＰの存在を
示している。
【図１９】 図１９は、構築物３１０８を用いて形質転換された Arabidopsis 植物（系統
９）の抽出物のＲＰＣ結果を示す。試料は、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰかまたはＲｓ
ＡＦＰ２−ＣＲＰの存在を示すＩＥＣからの画分、すなわち、０．１７〜０．３
３Ｍ ＮａＣｌ間で溶離し且つＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰの存在を示す画分であった
。ＲＰＣは、図１５の説明と同様に行われ且つ画分を分析した。ボールド体のピ
ーク番号はＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰの存在を示している。
９）の抽出物のＲＰＣ結果を示す。試料は、ＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰかまたはＲｓ
ＡＦＰ２−ＣＲＰの存在を示すＩＥＣからの画分、すなわち、０．１７〜０．３
３Ｍ ＮａＣｌ間で溶離し且つＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰの存在を示す画分であった
。ＲＰＣは、図１５の説明と同様に行われ且つ画分を分析した。ボールド体のピ
ーク番号はＤｍＡＭＰ１−ＣＲＰの存在を示している。
【図２０】 図２０は、構築物ｐＦＡＪ３１０５、ｐＦＡＪ３３４３、ｐＦＡＪ３３４４、
ｐＦＡＪ３３４５、ｐＦＡＪ３３４６およびｐＦＡＪ３３６９のコーディング領
域の略図である。黒矢じり形は、経験的に決定される切断部位を示す。白矢じり
形は、推定される切断部位を示す。略語：ＳＰ ＤｍＡＭＰ１：ＤｍＡＭＰ１の
シグナルペプチド領域（図１を参照されたい）；ＤｍＡＭＰ１：ＤｍＡＭＰ１の
成熟タンパク質領域（図１を参照されたい）；ＲｓＡＦＰ２：ＲｓＡＦＰ２の成
熟タンパク質領域（Terras ら，1995, Plant Cell, 7,573-588）。リンカーペプ
チド配列は完全に示されている（それぞれ、配列番号３、２９、２１〜２４）。
ｐＦＡＪ３３４５、ｐＦＡＪ３３４６およびｐＦＡＪ３３６９のコーディング領
域の略図である。黒矢じり形は、経験的に決定される切断部位を示す。白矢じり
形は、推定される切断部位を示す。略語：ＳＰ ＤｍＡＭＰ１：ＤｍＡＭＰ１の
シグナルペプチド領域（図１を参照されたい）；ＤｍＡＭＰ１：ＤｍＡＭＰ１の
成熟タンパク質領域（図１を参照されたい）；ＲｓＡＦＰ２：ＲｓＡＦＰ２の成
熟タンパク質領域（Terras ら，1995, Plant Cell, 7,573-588）。リンカーペプ
チド配列は完全に示されている（それぞれ、配列番号３、２９、２１〜２４）。
【図２１】 図２１は、配列番号２４のリンカーペプチドを含む構築物ｐＦＡＪ３３６７の
コーディング領域の略図である。略語：ＳＰ ＤｍＡＭＰ１：ＤｍＡＭＰ１のシ
グナルペプチド領域（図１を参照されたい）；ＤｍＡＭＰ１：ＤｍＡＭＰ１の成
熟タンパク質領域（図１を参照されたい）；ＲｓＡＦＰ２：ＲｓＡＦＰ２の成熟
タンパク質領域（Terras ら，1995, Plant Cell, 7,573-588）；ＨｓＡＦＰ１：
ＨｓＡＦＰ１の成熟タンパク質領域（Osborn ら，1995, FEBS Lett. 368,257-26
2）；ＡｃｅＡＭＰ１；ＡｃｅＡＭＰ１の成熟タンパク質領域（Cammue ら，1995
, Plant.Physiol. 109,445-455）。
コーディング領域の略図である。略語：ＳＰ ＤｍＡＭＰ１：ＤｍＡＭＰ１のシ
グナルペプチド領域（図１を参照されたい）；ＤｍＡＭＰ１：ＤｍＡＭＰ１の成
熟タンパク質領域（図１を参照されたい）；ＲｓＡＦＰ２：ＲｓＡＦＰ２の成熟
タンパク質領域（Terras ら，1995, Plant Cell, 7,573-588）；ＨｓＡＦＰ１：
ＨｓＡＦＰ１の成熟タンパク質領域（Osborn ら，1995, FEBS Lett. 368,257-26
2）；ＡｃｅＡＭＰ１；ＡｃｅＡＭＰ１の成熟タンパク質領域（Cammue ら，1995
, Plant.Physiol. 109,445-455）。
【図２２】 図２２は、構築物ｐＦＡＪ３１０６−２、ｐＦＡＪ３１０７−２およびｐＦＡ
Ｊ３１０８−２のコーディング領域の略図である。略語：ＳＰ ＤｍＡＭＰ１：
ＤｍＡＭＰ１のシグナルペプチド領域（図１を参照されたい）；ＤｍＡＭＰ１：
ＤｍＡＭＰ１の成熟タンパク質領域（図１を参照されたい）；ＲｓＡＦＰ２：Ｒ
ｓＡＦＰ２の成熟タンパク質領域（Terras ら，1995, Plant Cell, 7,573-588）
；ＲＳ Ｋｅｘ２ｐ：Ｋｅｘ２プロテアーゼの認識配列（ＩＧＫＲ）（Jiang an
d Rogers, 1999, Plant J., 18,23-32）；ＡｃＡＭＰ１：ＡｃＡＭＰ１の成熟タ
ンパク質領域（De Bolle ら，Plant Mol Biol, 31,997-1008）。リンカープロペ
プチド配列は、配列番号２５、２６および２７としてそれぞれ完全に示されてい
る。
Ｊ３１０８−２のコーディング領域の略図である。略語：ＳＰ ＤｍＡＭＰ１：
ＤｍＡＭＰ１のシグナルペプチド領域（図１を参照されたい）；ＤｍＡＭＰ１：
ＤｍＡＭＰ１の成熟タンパク質領域（図１を参照されたい）；ＲｓＡＦＰ２：Ｒ
ｓＡＦＰ２の成熟タンパク質領域（Terras ら，1995, Plant Cell, 7,573-588）
；ＲＳ Ｋｅｘ２ｐ：Ｋｅｘ２プロテアーゼの認識配列（ＩＧＫＲ）（Jiang an
d Rogers, 1999, Plant J., 18,23-32）；ＡｃＡＭＰ１：ＡｃＡＭＰ１の成熟タ
ンパク質領域（De Bolle ら，Plant Mol Biol, 31,997-1008）。リンカープロペ
プチド配列は、配列番号２５、２６および２７としてそれぞれ完全に示されてい
る。
【図２３】 図２３は、構築物ｐＦＡＪ３３６８およびｐＦＡＪ３３７０のコーディング領
域の略図である。白矢じり形は、推定される切断部位を示す。略語：ＳＰ Ｄｍ
ＡＭＰ１：ＤｍＡＭＰ１のシグナルペプチド領域（図１を参照されたい）；Ｄｍ
ＡＭＰ１：ＤｍＡＭＰ１の成熟タンパク質領域（図１を参照されたい）；ＲｓＡ
ＦＰ２：ＲｓＡＦＰ２の成熟タンパク質領域（Terras ら，1995, Plant Cell, 7
,573-588）；２Ａ配列：口蹄疫ウイルスポリタンパク質の切断認識部位。リンカ
ープロペプチド配列は、配列番号２８として完全に示されている。
域の略図である。白矢じり形は、推定される切断部位を示す。略語：ＳＰ Ｄｍ
ＡＭＰ１：ＤｍＡＭＰ１のシグナルペプチド領域（図１を参照されたい）；Ｄｍ
ＡＭＰ１：ＤｍＡＭＰ１の成熟タンパク質領域（図１を参照されたい）；ＲｓＡ
ＦＰ２：ＲｓＡＦＰ２の成熟タンパク質領域（Terras ら，1995, Plant Cell, 7
,573-588）；２Ａ配列：口蹄疫ウイルスポリタンパク質の切断認識部位。リンカ
ープロペプチド配列は、配列番号２８として完全に示されている。
【図２４】 図２４は、プラスミドｐＦＡＪ３３４３のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間に含
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号３０）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号３１）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リンカ
ーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号２９）。
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号３０）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号３１）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リンカ
ーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号２９）。
【図２５】 図２５は、プラスミドｐＦＡＪ３３４４のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間に含
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号３２）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号３３）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リンカ
ーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号２１）。
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号３２）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号３３）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リンカ
ーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号２１）。
【図２６】 図２６は、プラスミドｐＦＡＪ３３４５のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間に含
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号３４）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号３５）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リンカ
ーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号２２）。
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号３４）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号３５）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リンカ
ーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号２２）。
【図２７】 図２７は、プラスミドｐＦＡＪ３３４６のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間に含
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号３６）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号３７）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リンカ
ーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号２３）。
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号３６）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号３７）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リンカ
ーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号２３）。
【図２８】 図２８は、プラスミドｐＦＡＪ３３６９のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間に含
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号３８）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号３９）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リンカ
ーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号２４）。
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号３８）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号３９）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リンカ
ーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号２４）。
【図２９】 図２９は、プラスミドｐＦＡＪ３３６７のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間に含
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列および該当するアミノ酸配列を示す
。成熟ＤｍＡＭＰ、成熟ＲｓＡＦＰ２、成熟ＨｓＡＦＰ１および成熟ＡｃｅＡＭ
Ｐ１に該当するアミノ酸に、下線、二重下線、破線の下線および点線の下線をそ
れぞれ施している。内部リンカーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示
されている（配列番号２４）。
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列および該当するアミノ酸配列を示す
。成熟ＤｍＡＭＰ、成熟ＲｓＡＦＰ２、成熟ＨｓＡＦＰ１および成熟ＡｃｅＡＭ
Ｐ１に該当するアミノ酸に、下線、二重下線、破線の下線および点線の下線をそ
れぞれ施している。内部リンカーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示
されている（配列番号２４）。
【図３０】 図３０は、プラスミドｐＦＡＪ３１０６−２のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間
に含まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号４２）および該当す
るアミノ酸配列（配列番号４３）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦ
Ｐ２に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リ
ンカーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号４）
。
に含まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号４２）および該当す
るアミノ酸配列（配列番号４３）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦ
Ｐ２に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リ
ンカーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号４）
。
【図３１】 図３１は、プラスミドｐＦＡＪ３１０７−２のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間
に含まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号４４）および該当す
るアミノ酸配列（配列番号４５）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦ
Ｐ２に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リ
ンカーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号６）
。
に含まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号４４）および該当す
るアミノ酸配列（配列番号４５）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦ
Ｐ２に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リ
ンカーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号６）
。
【図３２】 図３２は、プラスミドｐＦＡＪ３１０８−２のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間
に含まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号４６）および該当す
るアミノ酸配列（配列番号４７）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦ
Ｐ２に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リ
ンカーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号７）
。
に含まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号４６）および該当す
るアミノ酸配列（配列番号４７）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦ
Ｐ２に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。内部リ
ンカーペプチドに該当するアミノ酸はボールド体で示されている（配列番号７）
。
【図３３】 図３３は、プラスミドｐＦＡＪ３３７０のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間に含
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号４８）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号４９）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。リンカー配
列は、イタリック体太字で示される２Ａ配列に該当するアミノ酸と一緒に、ボー
ルド体で示されている（配列番号２８）。
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号４８）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号４９）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。リンカー配
列は、イタリック体太字で示される２Ａ配列に該当するアミノ酸と一緒に、ボー
ルド体で示されている（配列番号２８）。
【図３４】 図３４は、プラスミドｐＦＡＪ３３６８のＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位間に含
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号４８）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号４９）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。リンカー配
列は、イタリック体太字で示される２Ａ配列に該当するアミノ酸と一緒に、ボー
ルド体で示されている。
まれる領域の読み取り枠のヌクレオチド配列（配列番号４８）および該当するア
ミノ酸配列（配列番号４９）を示す。成熟ＤｍＡＭＰ１および成熟ＲｓＡＦＰ２
に該当するアミノ酸に、下線および二重下線をそれぞれ施している。リンカー配
列は、イタリック体太字で示される２Ａ配列に該当するアミノ酸と一緒に、ボー
ルド体で示されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 Ｆｅｒｎｈｕｒｓｔ，Ｈａｓｌｅｍｅｒ ｅ，Ｓｕｒｒｅｙ ＧＵ27 ３ＪＥ，Ｕｎ ｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ (72)発明者 フランソア，イザベル・エルサ・ジャン ヌ・オーギュスティーヌ ベルギー国ベー3001 ヘヴェルレー，カル ディナール・メルシエルラーン 92，カ ー・ユー・ルーバン，エフ・アー・ヤンセ ンズ・ラボラトリー・オブ・ジェネティッ クス (72)発明者 ドゥ・ボル，ミゲール・フランセスコ・コ レタ ベルギー国ベー3001 ヘヴェルレー，カル ディナール・メルシエルラーン 92，カ ー・ユー・ルーバン，エフ・アー・ヤンセ ンズ・ラボラトリー・オブ・ジェネティッ クス (72)発明者 エバンズ，イアン・ジェフリー イギリス国バークシャー アールジー42 ６イーティー，ブラックネル，ジェロッ ツ・ヒル・リサーチ・ステーション (72)発明者 レイ，ジョン・アンソニー イギリス国バークシャー アールジー42 ６イーティー，ブラックネル，ジェロッ ツ・ヒル・リサーチ・ステーション Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD10 4B024 AA08 BA80 CA04 CA05 CA07 CA20 DA01 DA05 EA04 FA10 GA11 GA27 HA01 HA03 4B064 AG01 CA11 CA19 CC01 CC24 CE10 CE20 DA11 4B065 AA88X AA88Y AA95Y AB01 AC14 BA02 BA25 BD14 BD50 CA24 CA53 4H045 AA20 BA10 BA41 CA01 CA30 EA05 FA16 GA25
Claims (35)
- 【請求項１】 トランスジェニック植物中の１種類またはそれ以上のタンパ
ク質の発現レベルを改善する方法であって、該植物のゲノム中に、２またはそれ
以上のタンパク質コード領域と３’ターミネーター領域とに作動可能なように結
合したプロモーター領域を含むＤＮＡ配列を挿入することを含み、ここにおいて
、該タンパク質コード領域はリンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によ
って互いに隔てられていて、該プロペプチドは発現されるポリタンパク質が成分
タンパク質分子中に翻訳後プロセシングされるところの切断部位を与える、上記
方法。 - 【請求項２】 前記プロモーター領域が、シグナル配列であって前記２また
はそれ以上のタンパク質コード領域と３’ターミネーター領域とに作動可能なよ
うに結合している該シグナル配列に、作動可能なように結合している、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項３】 トランスジェニック植物中の多数のタンパク質の発現方法で
あって、該植物のゲノム中に、シグナル配列であって２またはそれ以上のタンパ
ク質コード領域と３’ターミネーター領域とに作動可能なように結合している該
シグナル配列に作動可能なように結合したプロモーター領域を含むＤＮＡ配列を
挿入することを含み、ここにおいて、該タンパク質コード領域はリンカープロペ
プチドをコードするＤＮＡ配列によって互いに隔てられていて、該プロペプチド
は発現されるポリタンパク質が成分タンパク質分子中に翻訳後プロセシングされ
るところの切断部位を与える、上記方法。 - 【請求項４】 前記リンカープロペプチドの配列の少なくとも４０％が、ア
ラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、ト
リプトファンおよびチロシンより選択される２〜５個連続した疎水性残基の伸長
かまたはアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、セ
リン、トレオニン、グルタミンおよびアスパラギンより選択される２〜５個連続
した親水性残基の伸長から成る請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 前記リンカープロペプチドが、そのＮ−またはＣ末端切断部
位の７残基中に、２〜５個連続した酸性残基、２〜５個の塩基性残基または２〜
５個連続した酸性および塩基性混合残基を含む配列を有する請求項１〜４のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項６】 前記リンカープロペプチドをコードしているＤＮＡ配列が、
植物タンパク質またはウイルスから単離しうるプロペプチドまたはその変異体、
または発現されるポリタンパク質が成分タンパク質分子中に翻訳後プロセシング
されるところの切断部位を与えるこれらのどちらかのフラグメントをコードする
請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 前記リンカープロペプチドをコードしているＤＮＡ配列が、
植物タンパク質から単離しうるプロペプチドまたはそのフラグメントをコードす
る請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 前記リンカープロペプチドをコードしているＤＮＡ配列が、
１またはそれ以上の植物タンパク質および／またはウイルスから単離しうるプロ
ペプチドまたはその変異体、またはこれらのどちらかのフラグメントを含むキメ
ラプロペプチドをコードする請求項６または請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 植物タンパク質が、植物デフェンシンの前駆体またはヘベイ
ン型抗微生物性タンパク質である請求項７または請求項８のいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項１０】 植物タンパク質が、インパティエンス（Impatiens）属に
由来する抗微生物性タンパク質である請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 プロペプチドが、配列番号３、２９、２１、２２、２３ま
たは２４を含む請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 プロペプチドが、Ｄｍ−ＡＭＰ１またはＡｃ−ＡＭＰ２か
らのＣ末端プロペプチドまたはそのフラグメント、またはこれらのいずれかの変
異体を含む請求項８に記載の方法。 - 【請求項１３】 プロペプチドが、配列番号４、６、７、２５、２６または
２７を含む請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 プロペプチドがキメラプロペプチドである請求項１〜１３
のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１５】 キメラプロペプチドが、ウイルスプロペプチドまたはその
フラグメント、および植物タンパク質から単離されるプロペプチドまたはそのフ
ラグメントを含む請求項１３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１６】 ウイルスがピコルナウイルスである請求項１５に記載の方
法。 - 【請求項１７】 キメラプロペプチドが、ウイルスプロペプチド配列として
配列番号２８を含む請求項１５または請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 リンカープロペプチドが、そのどちらかまたは両末端で操
作されるプロテアーゼプロセシング部位を有する請求項１〜１７のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項１９】 プロテアーゼプロセシング部位が、ズブチリシン様プロテ
アーゼプロセシング部位である請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 シグナル配列が、植物デフェンシン遺伝子に由来する請求
項２または請求項３に記載の方法。 - 【請求項２１】 多数のタンパク質の一つまたはそれ以上がデフェンシンタ
ンパク質である請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２２】 トランスジェニック植物中で合成されるポリタンパク質前
駆体のための植物リンカーの分泌経路における切断可能なプロペプチドの使用。 - 【請求項２３】 プロペプチドが、植物タンパク質またはウイルスに由来す
る請求項２２に記載のプロペプチドの使用。 - 【請求項２４】 プロペプチドが植物タンパク質に由来し、該タンパク質が
、植物デフェンシンの前駆体またはヘベイン型抗微生物性タンパク質であるかま
たは Impatiens 属から単離可能である請求項２２または請求項２３に記載のプ
ロペプチドの使用。 - 【請求項２５】 トランスジェニック植物中の分泌経路によって合成される
ポリタンパク質前駆体中の切断可能なリンカーとしてのプロペプチドの使用であ
って、該プロペプチドリンカーが請求項４または請求項５に定義の通りである上
記使用。 - 【請求項２６】 低分子アミノ酸Ａ、Ｖ、ＳおよびＴが多く且つ２個の酸性
残基か、２個の塩基性残基かまたは、１個の酸性および１個の塩基性残基から成
るジペプチド配列を含有するプロペプチド配列の、切断可能なリンカー配列とし
ての使用であって、該配列が植物デフェンシンまたはヘベイン型抗微生物性ペプ
チドから単離可能である上記使用。 - 【請求項２７】 植物に由来するシグナル配列であって２またはそれ以上の
タンパク質コード領域と３’ターミネーター領域とに作動可能なように結合して
いる該シグナル配列に作動可能なように結合したプロモーター領域を含むＤＮＡ
配列を含むＤＮＡ構築物であって、該タンパク質コード領域がリンカープロペプ
チドをコードするＤＮＡ配列によって互いに隔てられていて、該プロペプチドが
翻訳後切断部位を与える上記ＤＮＡ構築物。 - 【請求項２８】 ２またはそれ以上のタンパク質コード領域と３’ターミネ
ーター領域とに作動可能なように結合したプロモーター領域を含むＤＮＡ配列を
含むＤＮＡ構築物であって、該タンパク質コード領域がＤｍ−ＡＭＰ遺伝子また
はＡｃ−ＡＭＰ遺伝子からのＣ末端プロペプチドをコードしているリンカープロ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列によって互いに隔てられていて、該プロペプチ
ドが翻訳後切断部位を与える上記ＤＮＡ構築物。 - 【請求項２９】 リンカープロペプチドをコードしているＤＮＡ配列が、そ
のどちらか一方の末端または両末端に一つまたはそれ以上のプロテアーゼ認識部
位を更に含む請求項２７または請求項２８に記載のＤＮＡ構築物。 - 【請求項３０】 請求項１９〜２１のいずれかに記載のＤＮＡ構築物を含む
ベクター。 - 【請求項３１】 請求項２７〜３０のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物ま
たはベクターを用いてトランスフェクションされたトランスジェニック植物。 - 【請求項３２】 トランスジェニック植物におけるタンパク質発現レベルを
増加させるための使用であって、２またはそれ以上のタンパク質コード領域と３
’ターミネーター領域とに作動可能なように結合したプロモーター領域を含むＤ
ＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物の使用、ここで該プロモーターをコードしている領
域がリンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列によって互いに隔てられてい
て、該プロペプチドがトランスジェニック植物におけるタンパク質発現レベルを
増加させる翻訳後切断部位を与える、あるいは該構築物を含むベクターの使用。 - 【請求項３３】 配列番号４、６、７、２９、２１、２２、２３、２４、２
５、２６、２７、２８のペプチドまたは図３４に示されるリンカーペプチドまた
はこれらのいずれかの変異体をコードする核酸。 - 【請求項３４】 配列番号４、６、７、２９、２１、２２、２３、２４、２
５、２６、２７、２８のペプチドまたは図３４に示されるリンカーペプチドをコ
ードする請求項３３に記載の核酸。 - 【請求項３５】 配列番号４、６、７、２９、２１、２２、２３、２４、２
５、２６、２７、２８のＣ末端に結合した配列番号７７を含むペプチドまたは図
３４に示されるリンカーペプチドをコードする請求項３３に記載の核酸。
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