CN110564754A - 利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法 - Google Patents

利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，包括步骤为：用dU修饰引物和dU耐受型高忠实性DNA聚合酶扩增目标基因和质粒载体；用尿嘧啶DNA糖苷酶处理，再进行碱裂解，得到3’端为单链的DNA产物；将产物混合，使目标基因和质粒载体的两端单链区发生配对连接起来，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体；含目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌后，缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。通过上述方式，本发明能用于基因工程领域，特别是重组DNA的构建与氨基酸定点突变方面的应用，同时本方法也可用于需要进行DNA文库构建的精准医疗、基因克隆等领域。

Description

利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法。
背景技术
基因克隆与氨基酸定点突变技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术首先利用限制性核酸内切酶消化目标基因DNA片段与质粒载体，然后DNA连接酶连接环化目标基因与质粒，形成完整的重组质粒。由于限制性核酸内切酶消化反应消化不完全，常常造成含有目标基因的阳性重组质粒百分比低于10%，甚至克隆失败。为了克服常规基因克隆方法的缺陷，开发了不依赖于连接酶的克隆方法。这些方法都依赖于目标基因与质粒载体DNA之间的重组反应，形成环状（带DNA缺口）质粒。
其中基于尿嘧啶修饰引物和尿嘧啶DNA糖苷酶的基因克隆技术，是一种高效的连接酶非依赖型基因重组技术。尿嘧啶DNA糖苷酶能够使带尿嘧啶的DNA片段产生一定长度的单链DNA，从而使目的基因片段和载体二者之间在末端彼此配对，形成稳定的双链DNA区，即环状重组DNA。转化大肠杆菌后，该双链DNA区域的缺口会被大肠杆菌修复，最终形成完整的重组DNA分子。该方法中线性化质粒和目的基因的获得需要通过尿嘧啶修饰引物进行PCR扩增。但PCR扩增只能利用Taq DNA聚合酶，而Taq DNA聚合酶的忠实性很低，会在扩增的线性化质粒和基因片段中引入一些错误碱基，对长片段目的基因和质粒而言这一问题尤为严重。由于重组表达载体需要目的基因和表达载体的DNA序列高度保守，不能具有碱基突变，因此该方法不适合于构建表达载体，而高忠实性的DNA聚合酶活性受到dU的严重抑制，不能够扩增得到含dU碱基的全长PCR产物，也就无法进行基因克隆。dU引物的这一问题严重限制了该方法的应用场所。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，能用于基因工程领域，特别是重组DNA的构建与氨基酸定点突变方面的应用，同时本方法也可用于需要进行DNA文库构建的精准医疗、基因克隆等领域。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，包括步骤为：（1）用dU修饰引物和dU耐受型高忠实性DNA聚合酶扩增目标基因和质粒载体，得到目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物；（2）将目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物用尿嘧啶DNA糖苷酶处理，再进行碱裂解，使目标基因和质粒载体的两端产生12-30bp 单链同源区域；（3）将步骤（2）得到的产物混合，使目标基因和质粒载体的两端单链区发生配对连接起来，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体；（4）步骤（3）得到的含目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述dU修饰引物的序列特征为：（a）扩增目标基因和质粒载体的正向引物5’端的第1-30位碱基序列彼此互补配对；（b）扩增目标基因和质粒载体的反向引物5’端的第1-30位碱基序列彼此互补配对；（c）引物长度40-50个碱基，3’端下游的18-25个碱基序列与目标基因和质粒载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对；（d）dU碱基位于1-30位碱基区，且每隔5-10个碱基为一个dU碱基。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因的DNA片段的正向引物、用于扩增质粒载体的DNA片段的正向引物、用于扩增目标基因的DNA片段的反向引物、用于扩增质粒载体的DNA片段的反向引物、目标核酸模板分子、dU耐受型高忠实性DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。
在本发明一个较佳实施例中，所述dU耐受型高忠实性DNA聚合酶，例如dU耐受型Pfu DNA聚合酶或dU耐受型KOD DNA聚合酶。
在本发明一个较佳实施例中，所述利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法在步骤（1）和步骤（2）之间还包括对质粒载体PCR产物用限制性核酸内切酶Dpn I消化。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（2）中所述尿嘧啶DNA糖苷酶处理方法为：将PCR扩增的DNA片段用常温或耐热尿嘧啶DNA糖苷酶，在25-37度（常温尿嘧啶DNA糖苷酶）或45-75度（耐热尿嘧啶DNA糖苷酶）反应1-15分钟。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（2）中所述碱裂解过程为：在10-200mM的NaOH溶液中在50-100度加热1-10分钟，在无碱基位点处断裂DNA，产生3’末端单链DNA，再加入等量的HCl中和加入的NaOH。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（3）中得到的产物混合是在4度到室温范围内，放置1-10分钟。
在本发明一个较佳实施例中，所述利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法还包括对含目标基因的完整重组质粒载体的鉴定：挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与Taq DNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组质粒载体的阳性克隆，培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组质粒载体。
本发明的有益效果是：
一、本发明利用高忠实性DNA聚合酶能够跨越dU碱基的特点，PCR扩增产生高忠实性的线性化质粒DNA和目标基因片段，二者经UDG和热碱处理形成互补配对的单链DNA，经二者间的单链尾巴彼此配对，形成环状重组分子。由于采用了高忠实性的DNA聚合酶扩增线性化质粒和基因片段，DNA序列忠实性大大提高，非常适合于构建用于表达蛋白的表达载体和其它需要防止基因产生基因突变的基因克隆。
二、操作通量大，适宜于多个目标基因同时克隆。由于在整个克隆过程中只需要PCR扩增、UDG处理、热碱处理，因此可以简单的扩大克隆通量，进行大规模基因克隆。
三、含有目标基因的阳性克隆率高。由于采用PCR扩增质粒载体，消除了限制性核酸内切酶消化质粒不彻底所造成的假阳性克隆，从而极大地提高了阳性克隆比例。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法一较佳实施例的流程图；
图2是本发明的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因点突变方法一较佳实施例的流程图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
能补充下具体的操作过程吗，包括使用物的含量、具体引物等，能根据这个操作过程进行实验。
请参阅图1和图2，提供一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，包括步骤为：
（1）设计合成用于扩增目标基因和质粒载体的dU修饰引物。其中所述dU修饰引物的序列特征为：（a）扩增目标基因和质粒载体的正向引物5’端的第1-30位碱基序列彼此互补配对；（b）扩增目标基因和质粒载体的反向引物5’端的第1-30位碱基序列彼此互补配对；（c）引物长度40-50个碱基，3’端下游的20-25个碱基序列与目标基因和质粒载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对；（d）dU碱基位于1-30位碱基区，且每隔5-10个碱基为一个dU碱基。
本实施例中目标基因是火球菌B型DNA聚合酶基因PF0212，将其克隆到pET28a表达质粒的SacI与HindIII位点之间。
设计合成用于扩增火球菌基因B型DNA聚合酶基因PF0212与pET28a载体的引物序列：
4条引物分别为PF0212-F、PF0212-R、pET28-F、pET28-R。其中PF0212-F、PF0212-R用于扩增火球菌B型DNA聚合酶基因PF0212，pET28-F与pET28-R用于扩增pET28a表达质粒。4条引物碱基序列如下：
1）PF0212-F: 5’ atccgaadUtcgagcdUcatgattttagatgtggatta（SEQ ID NO.1）
2）PF0212-R: 5’ agtgcggcdUgcaagctdUctaggattttttaatgttaag（SEQ ID NO.2）
3）pET28-F: 5’ agctcgaadUtcggadUccgcgacccat（SEQ ID NO.3）
4）pET28-R: 5’ aagctdUgcAgccgcacdUcgagcac（SEQ ID NO.4）。
其中，扩增目标基因与线性化质粒的正向引物的5’端15个碱基序列彼此互补配对，反向引物的3’端17个碱基序列彼此互补配对。
（2）用dU修饰引物和dU耐受型高忠实性DNA聚合酶聚合酶链式反应PCR扩增目标基因和质粒载体的DNA片段，得到目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物。所述目标基因DNA片段的PCR扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因的正向引物与反向引物（0.3 μM）、含目标基因的DNA模板分子（10纳克火球菌基因组DNA）、dU耐受型高忠实性DNA聚合酶为KODDNA聚合酶FX（1个单位）、4种脱氧核苷三磷酸dNTPs（200 μM）。所述线性化载体DNA片段的PCR扩增反应缓冲液中包括有用于扩增载体的正向引物与反向引物（0.3 μM）、目标质粒载体DNA（5纳克）、dU耐受型高忠实性DNA聚合酶KOD DNA聚合酶FX（1个单位）、4种脱氧核苷三磷酸dNTPs（200 μM）。PCR条件同一般的液相聚合酶链式反应。
（3）对质粒载体PCR产物用限制性核酸内切酶Dpn I（5个单位）消化，消除所述质粒载体PCR产物中的环状质粒模板DNA。
（4）将目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物用大肠杆菌尿嘧啶DNA糖苷酶UDG（10个单位），在37度处理15分钟，从目标基因和质粒载体的PCR片段上切除dU碱基，产生碱敏感的无碱基位点DNA。
（5）将步骤（4）得到的产物进行碱裂解，具体为在50mM的NaOH溶液中将DNA片段在90度加热5分钟，在无碱基位点处断裂DNA，产生3’末端单链DNA。然后加入等体积的50mMHCl中和加入的NaOH，生成5端’为单链DNA尾巴的PCR片段，使目标基因和质粒载体的两端产生单链同源区域。
（6）将步骤（5）得到的产物混合，在4度放置3分钟，使目标基因和质粒载体的两端单链区发生配对连接起来，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体。
（7）杂交步骤（6）得到的含目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌感受态细胞，在固体培养基上37度培养过夜。含目标基因的带缺口环状重组质粒载体中目标基因与质粒载体间的缺口会被大肠杆菌修复，形成含目标基因的完整重组质粒载体。
（8）含目标基因的完整重组质粒载体的鉴定：挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与Taq DNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组质粒载体的阳性克隆，培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组质粒载体。
本发明发明了不受dU抑制的DNA聚合酶，并将其用于基于dU修饰引物和UDG的基因克隆，显著提高了基因克隆的忠实性，使其非常适合于构建表达载体。本发明中目标基因和质粒载体PCR片段的单链尾巴彼此配对，简单的混合在一起，就能够形成重组质粒。由于本方法所用DNA聚合酶同时具有高忠实性和dU耐受性，消除了Taq忠实性低不适合构建表达载体的技术缺陷，显著提高了目的基因与质粒的忠实性，非常适合于进行表达载体的构建。
通过该方法的dU耐受型高忠实性DNA聚合酶可以利用dU修饰引物进行扩增，显著提高了目的基因和表达载的DNA忠实性，是一种非常适合于表达载体构建的高通量克隆技术。若用于氨基酸点突变体构建实验，仅需将质粒经PCR反应线性化，再经UDG与热碱处理，质粒自身两端的单链DNA彼此配对形成闭环质粒，转化大肠杆菌后缺口被修复，形成带点突变碱基的完整质粒。
本发明可用于基因克隆，基因片段拼接、目标基因定点突变等领域。目标基因与质粒载体无需限制性核酸内切酶消化，因此可以大大降低假阳性克隆（空质粒）百分比，提高目标基因克隆成功率。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：（1）用dU修饰引物和dU耐受型高忠实性DNA聚合酶扩增目标基因和质粒载体，得到目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物；（2）将目标基因PCR产物和质粒载体PCR产物用尿嘧啶DNA糖苷酶处理，再进行碱裂解，使目标基因和质粒载体的两端产生12-30bp 单链同源区域；（3）将步骤（2）得到的产物混合，使目标基因和质粒载体的两端单链区发生配对连接起来，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体；（4）步骤（3）得到的含目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。
2.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述dU修饰引物的序列特征为：（a）扩增目标基因和质粒载体的正向引物5’端的第1-30位碱基序列彼此互补配对；（b）扩增目标基因和质粒载体的反向引物5’端的第1-30位碱基序列彼此互补配对；（c）引物长度40-50个碱基，3’端下游的18-25个碱基序列与目标基因和质粒载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对；（d）dU碱基位于1-30位碱基区，且每隔5-10个碱基为一个dU碱基。
3.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因的DNA片段的正向引物、用于扩增质粒载体的DNA片段的正向引物、用于扩增目标基因的DNA片段的反向引物、用于扩增质粒载体的DNA片段的反向引物、目标核酸模板分子、dU耐受型高忠实性DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。
4.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，所述dU耐受型高忠实性DNA聚合酶，例如dU耐受型Pfu DNA聚合酶或dU耐受型KOD DNA聚合酶。
5.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，所述利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法在步骤（1）和步骤（2）之间还包括对质粒载体PCR产物用限制性核酸内切酶Dpn I消化。
6.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，步骤（2）中所述尿嘧啶DNA糖苷酶处理方法为：将PCR扩增的DNA片段用常温或耐热尿嘧啶DNA糖苷酶，在25-37度（常温尿嘧啶DNA糖苷酶）或45-75度（耐热尿嘧啶DNA糖苷酶）反应1-15分钟。
7.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，步骤（2）中所述碱裂解过程为：在10-200 mM的NaOH溶液中在50-100度加热1-10分钟，在无碱基位点处断裂DNA，产生3’末端单链DNA，再加入等量的HCl中和加入的NaOH。
8.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，步骤（3）中得到的产物混合是在4度到室温范围内，放置1-10分钟。
9.根据权利要求1所述的利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法，其特征在于，所述利用dU耐受型高忠实性DNA聚合酶的基因克隆方法还包括对含目标基因的完整重组质粒载体的鉴定：挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与Taq DNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组质粒载体的阳性克隆，培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组质粒载体。
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