CN110964737A

CN110964737A - 利用高保真聚合酶与udg的基因克隆与定点突变方法

Info

Publication number: CN110964737A
Application number: CN201911357763.0A
Authority: CN
Inventors: 袁慧; 田文齐
Original assignee: Suhou Bolaiheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suhou Bolaiheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2020-04-07

Abstract

本发明公开了一种利用高保真聚合酶与UDG的基因克隆与定点突变方法，包括步骤为：用dU修饰引物和dU耐受型高忠实性DNA聚合酶扩增目标基因和质粒载体；用热稳定性尿嘧啶DNA糖苷酶高温处理，得到3’端为单链的目标基因和质粒载体；将二者混合，使目标基因和质粒载体的两端单链区发生配对连接起来，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体；含目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌后，缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。采用上述方法显著提高了扩增反应的忠实性，避免了低忠实性的Taq DNA聚合酶导致的额外基因突变，尤其适用于进行蛋白表达为目的的载体构建；dU与dA碱基配对，配对结果等同于正常的dT/dA配对，避免了修饰碱基引入额外错误碱基导致的基因突变；热稳定性UDG在60‑80度仍具有酶活性，使得dU碱基的去除与DNA链的断裂同时进行，省略了加碱热裂解操作。

Description

利用高保真聚合酶与UDG的基因克隆与定点突变方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是高通量表达载体构建、基因定点突变等方面，更具体地说，它涉及一种利用高忠实性DNA聚合酶与UDG的基因克隆与基因定点突变方法。

背景技术

DNA连接酶和限制性内切酶使得体外重构特定DNA成为了可能。体外重构DNA又称基因克隆或基因工程，该技术极大地促进了现代蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术首先利用限制性核酸内切酶消化目标基因DNA片段与质粒载体，然后DNA连接酶连接环化目标基因与质粒，形成完整的重组质粒。由于限制性内切酶识别特定的DNA序列，不同限制性内切酶的识别序列不同，彼此间的序列兼容性很差，特别是同时克隆多个不同基因时导致限制性内切酶的选择非常困难。

为了克服限制性内切酶克隆法的缺陷，开发了不依赖于连接酶的克隆方法。这些方法一般基于目标基因与质粒载体DNA之间的一段互补的单链DNA，单链DNA的长度为12-25个核苷酸，从而保证互补单链DNA配对后能够在常温形成稳定的双链DNA(带DNA缺口)。为了保证DNA的正确率，扩增目标基因和载体的DNA聚合酶一般采用高忠实性DNA聚合酶。其中基于dU修饰引物的基因克隆技术，利用带有dU碱基的引物扩增目标基因和载体，然后利用尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)去除dU碱基形成无碱基的核糖核酸位点，热碱处理无碱基位点断裂DNA，形成单链DNA。然而大部分高忠实性DNA聚合酶活性受dU碱基抑制。因此在基于dU修饰引物的基因克隆技术中，目标基因和线性化载体片段都是用Taq DNA聚合酶扩增的，导致在目标基因(特别是长片段目标基因)和线性化载体片段中引入错误碱基。

发明内容

为了克服dU修饰引物基因克隆的上述缺陷，本发明提供了一种利用高保真聚合酶与UDG的基因克隆与定点突变方法。具体技术方案如下：

一种利用高保真聚合酶与UDG的基因克隆与定点突变方法，具体步骤如下：

(1)设计合成用于扩增目标基因与质粒载体的引物序列。引物的序列特征是：1)扩增目标基因与线性化载体的正向引物的5’端前10-25个碱基彼此互补配对，反向引物的5’端前10-25个碱基彼此互补配对；2)5’端前10-25个碱基中的dT碱基替换成dU碱基，且相邻dU碱基间隔5-10个正常碱基；3)引物3’端的18-25个碱基与目标模板DNA互补配对。

(2)聚合酶链式反应(PCR)扩增含目标基因/线性化质粒DNA片段。将正向引物与反向引物、目标基因DNA模板分子(含目标基因的DNA)/目标质粒DNA、dU耐受型高忠实性DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)加入PCR反应缓冲液中，进行PCR反应。

(3)线性化质粒载体DNA片段的限制性内切酶DpnI消化。对扩增的线性化质粒载体PCR产物，用限制性核酸内切酶Dpn I消化野生型环状质粒模板。由于质粒模板具有多处GmATC序列，DpnI处理使得质粒模板变成很多段短的DNA双链，这些短的DNA双链转化大肠杆菌不能够产生克隆，从而消除了野生型质粒模板产生的假阳性克隆。

(4)PCR片段的末端单链化。在目标基因与线性化载体PCR产物中加入热稳定性UDG，在70-80度反应5-30分钟，在dU碱基处形成无碱基位点并热断裂DNA链，断裂的短片段DNA链与互补链分离，从而在双链DNA片段的两端产生长度为10-25个核苷酸的3’突出端。

(5)目标基因与线性化质粒载体DNA片断间的杂交配对。UDG处理后的目标基因与线性化载体缓慢降温至室温，放置5～15分钟，使二者的3’单链DNA彼此杂交配对，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒。

(6)含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌。杂交混合物(即含目标基因的带缺口重组质粒、没有发生杂交配对的目标基因与线性化质粒片段)转化大肠杆菌感受态细胞，在固体培养基上37度培养过夜。带缺口重组质粒的缺口会被大肠杆菌修复，形成含目标基因的完整重组质粒。

(7)带目的基因的重组质粒的测序鉴定。挑取单菌落，培养后菌落PCR鉴定含有目标基因的阳性克隆。培养克隆后抽提重组质粒DNA，测序鉴定目标基因碱基序列是否正确。

综上所述，本发明具有以下有益效果：(1)利用耐受dU碱基的高忠实性DNA聚合酶进行载体与目的基因的PCR扩增反应，显著提高了扩增反应的忠实性，避免了低忠实性的Taq DNA聚合酶导致的额外基因突变，尤其适用于进行蛋白表达为目的的载体构建；(2)dU与dA碱基配对，配对结果等同于正常的dT/dA配对，避免了修饰碱基引入额外错误碱基导致的基因突变；(3)热稳定性UDG在60-80度仍具有酶活性，使得dU碱基的去除与DNA链的断裂同时进行，省略了加碱热裂解操作。

附图说明

图1为dU修饰引物与UDG进行的基因克隆流程图。

图2为dU修饰引物与UDG进行的基因定点突变流程图。

具体实施方式

在本实施例中用于扩增目标基因和线性化载体的引物具有如下特征：1)扩增目标基因及线性化载体的正向引物的5’端前15个碱基彼此互补配对，反向引物的5’端前15个碱基彼此互补配对，2)正向与反向突变引物的dT碱基替换成dU碱基，且相邻dU碱基间隔5个正常碱基，而且第15个碱基为dU碱基。利用引物对分别PCR扩增目标基因、线性化载体。PCR产物经热稳定性UDG在70-80度处理一段时间，会产生长15个核苷酸的3’单链DNA尾巴。由于产生的3’单链DNA尾巴的碱基序列互补配对，目标基因与线性化载体之间形成稳定的配对双链区，环化成带4个DNA缺口的环状质粒。环状质粒转化大肠杆菌后，质粒载体上的DNA缺口被大肠杆菌DNA修复系统修复，形成完整的含有目标基因的重组DNA分子。

利用高保真聚合酶与UDG的基因克隆与定点突变方法具体步骤如下：

1、设计合成用于扩增目标基因与质粒载体的引物序列。引物的序列特征是：1)扩增目标基因与线性化载体的正向引物的5’端前15个碱基彼此互补配对，反向引物的5’端前15个碱基彼此互补配对；2)5’端前15个碱基中的dT碱基替换成dU碱基，且相邻dU碱基间隔5个正常碱基，另外第15个碱基为dU碱基；3)引物3’端的22个碱基与目标模板DNA互补配对。

2、聚合酶链式反应(PCR)扩增含目标基因/线性化质粒DNA片段。将正向引物与反向引物、目标基因DNA模板分子(含目标基因的DNA)/目标质粒DNA、dU耐受型高忠实性DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)加入PCR反应缓冲液中，进行PCR反应。

3、线性化质粒载体DNA片段的限制性内切酶DpnI消化。对扩增的线性化质粒载体PCR产物，用限制性核酸内切酶Dpn I消化野生型环状质粒模板。由于质粒模板具有多处GmATC序列，DpnI处理使得质粒模板变成很多段短的DNA双链，这些短的DNA双链转化大肠杆菌不能够产生克隆，从而消除了野生型质粒模板产生的假阳性克隆。

4、PCR片段的末端单链化。在目标基因与线性化载体PCR产物中加入热稳定性UDG，在70-80度反应5-30分钟，在dU碱基处形成无碱基位点并热断裂DNA链，断裂的短片段DNA链与互补链分离，从而在双链DNA片段的两端产生长度为15个核苷酸的3’突出端。

5、目标基因与线性化质粒载体DNA片断间的杂交配对。UDG处理后的目标基因与线性化载体缓慢降温至室温，放置5～15分钟，使二者的3’单链DNA彼此杂交配对，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒。

6、含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌。杂交混合物(即含目标基因的带缺口重组质粒、没有发生杂交配对的目标基因与线性化质粒片段)转化大肠杆菌感受态细胞，在固体培养基上37度培养过夜。带缺口重组质粒的缺口会被大肠杆菌修复，形成含目标基因的完整重组质粒。

7、带目的基因的重组质粒的测序鉴定。挑取单菌落，培养后菌落PCR鉴定含有目标基因的阳性克隆。培养克隆后抽提重组质粒DNA，测序鉴定目标基因碱基序列是否正确。

本实施例达到的有益效果：(1)利用耐受dU碱基的高忠实性DNA聚合酶进行载体与目的基因的PCR扩增反应，显著提高了扩增反应的忠实性，避免了低忠实性的Taq DNA聚合酶导致的额外基因突变，尤其适用于进行蛋白表达为目的的载体构建；(2)dU与dA碱基配对，配对结果等同于正常的dT/dA配对，避免了修饰碱基引入额外错误碱基导致的基因突变。(3)热稳定性UDG在60-80度仍具有酶活性，使得dU碱基的去除与DNA链的断裂同时进行，省略了加碱热裂解操作。

Claims

1.利用高保真聚合酶与UDG的基因克隆与定点突变方法，具体步骤如下：

(1)设计合成用于扩增目标基因与质粒载体的引物序列；(2)聚合酶链式反应(PCR)扩增含目标基因/线性化质粒DNA片段；(3)线性化质粒载体DNA片段的限制性内切酶DpnI消化；(4)PCR片段的末端单链化；(5)目标基因与线性化质粒载体DNA片断间的杂交配对；(6)含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌；(7)带目的基因的重组质粒的测序鉴定。

2.根据权利要求1所述的方法，步骤(1)中引物的序列特征是：1)扩增目标基因与线性化载体的正向引物的5’端前10-25个碱基彼此互补配对，反向引物的5’端前10-25个碱基彼此互补配对；2)5’端前10-25个碱基中的dT碱基替换成dU碱基，且相邻dU碱基间隔5-10个正常碱基；3)引物3’端的18-25个碱基与目标模板DNA互补配对。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)具体是将正向引物与反向引物、目标基因DNA模板分子(含目标基因的DNA)/目标质粒DNA、dU耐受型高忠实性DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)加入PCR反应缓冲液中，进行PCR反应。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)具体是对扩增的线性化质粒载体PCR产物，用限制性核酸内切酶DpnI消化野生型环状质粒模板，由于质粒模板具有多处GmATC序列，DpnI处理使得质粒模板变成很多段短的DNA双链，这些短的DNA双链转化大肠杆菌不能够产生克隆，从而消除了野生型质粒模板产生的假阳性克隆。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)具体是在目标基因与线性化载体PCR产物中加入热稳定性UDG，在70-80度反应5-30分钟，在dU碱基处形成无碱基位点并热断裂DNA链，断裂的短片段DNA链与互补链分离，从而在双链DNA片段的两端产生长度为10-25个核苷酸的3’突出端。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)具体是UDG处理后的目标基因与线性化载体缓慢降温至室温，放置5～15分钟，使二者的3’单链DNA彼此杂交配对，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)具体是杂交混合物(即含目标基因的带缺口重组质粒、没有发生杂交配对的目标基因与线性化质粒片段)转化大肠杆菌感受态细胞，在固体培养基上37度培养过夜，带缺口重组质粒的缺口会被大肠杆菌修复，形成含目标基因的完整重组质粒。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(7)具体是挑取单菌落，培养后菌落PCR鉴定含有目标基因的阳性克隆，培养克隆后抽提重组质粒DNA，测序鉴定目标基因碱基序列是否正确。