CN108103169A - 一种基于热不对称反应的接头介导的pcr方法 - Google Patents
一种基于热不对称反应的接头介导的pcr方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108103169A CN108103169A CN201711309403.4A CN201711309403A CN108103169A CN 108103169 A CN108103169 A CN 108103169A CN 201711309403 A CN201711309403 A CN 201711309403A CN 108103169 A CN108103169 A CN 108103169A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr
- primer
- short circuit
- restriction enzyme
- circuit head
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于热不对称反应的接头介导的PCR方法，本发明通过运用热不对称反应程序，采用两个具有不同Tm值的引物，进一步提高目的片段的产率。此外，本发明还利用识别简并序列的限制性内切酶或识别四个碱基序列的限制性内切酶可将基因组切割成更多短片段，增加了克隆目的片段的几率；而短接头的运用减少了错配的几率，并且降低了成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于热不对称反应的接头介导的PCR方法。
背景技术
目前有多种克隆T-DNA插入未知侧翼序列的方法存在，比如接头介导的PCR也叫adapter介导的PCR法(简称A PCR)，热不对称交错PCR(TAIL-PCR)，Alu PCR，质粒拯救，反向PCR等等，但克隆效率都较低。目前常用的方法之一是A PCR，所以对于提高A PCR的克隆效率显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供热不对称反应在接头介导的PCR方法中的应用，提高克隆未知侧翼序列的效率。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种基于热不对称反应的接头介导的PCR方法，包括以下步骤：
(1)对基因组进行酶切，纯化回收后得到酶切产物；
(2)将纯化回收的酶切产物和外源接头进行连接，得到连接液；
(3)将步骤2得到的连接液作为模板，采用两个具有不同Tm值的引物，通过热不对称反应进行扩增。
进一步地，所述步骤2中，纯化回收的酶切产物采用具有限制性内切酶位点的外源短接头进行连接，所述外源短接头由两条长短不同的核苷酸链组成，两条核苷酸链的5′末端都不含磷酸基。两条核苷酸链(0.5μM)混合，95℃，5min变性，混合液自然恢复到室温(约25℃)，两条链互补配对形成了短接头。长链包含热不对称反应过程中，Tm值较低的引物；同时，短接头含有一个粘性末端，以便于与内切酶消化的基因组片段进行连接。且短链中除粘性末端以外的碱基序列Tm值约40℃，以防止室温解链。
进一步地，所述步骤1中，采用识别简并序列的限制性内切酶或识别四个碱基序列的限制性内切酶进行酶切。
进一步地，所述识别简并序列的限制性内切酶选自：AccⅠ、BanⅡ(HgiJⅡ)、BmeT110Ⅰ(AvaⅠ)、BspT107Ⅰ(HgiCⅠ)、Cfr10Ⅰ、EaeⅠ(CfrⅠ)、EcoO109Ⅰ(DraⅡ)、EcoT14Ⅰ(StyⅠ)、HaeⅡ、Hin1Ⅰ(AcyⅠ,BbiⅡ)、MflⅠ(XhoⅡ)、BciT130Ⅰ(EcoRⅡ,MvaⅠ)、BcnⅠ(CauⅡ)、Bsp1286Ⅰ(SduⅠ)、VpaK11BⅠ(AvaⅡ)、BmgT120Ⅰ(AsuⅠ,Cfr13Ⅰ)、DdeⅠ、HinfⅠ；所述识别四个碱基序列的限制性内切酶选自HhaⅠ、MboⅠ(Sau3AⅠ)、MspⅠ(HpaⅡ,HapⅡ)、RspRSⅡ(MseⅠ)、TaqⅠ(TthHB8Ⅰ)、XspⅠ(BfaⅠ,MaeⅠ)。
本发明的有益效果在于：1.识别简并序列的酶或识别四个碱基序列的酶可将基因组切割成更多短片段，增加了克隆目的片段的几率；2.短接头的运用减少了错配的几率，并且降低了成本；3.运用热不对称反应程序，使目的片段产率较高。
附图说明
图1按照短接头设计短引物的示意图；
图2 TADEA-PCR设计原理图；
图3 HindⅢ酶消化后，PCR反应结果图，图3a:A PCR与TAA-PCR对比图；图3b:只经过第一轮PCR反应程序后，A PCR与TAA-PCR的对比图；图3c：用已商品化的长接头作为接头，TAA-PCR反应结果图；图3d：用已商品化的长接头作为接头，A PCR反应结果图；图3e:用改进后的短接头作为接头，TAA-PCR反应结果图；图3g:HindⅢ长接头和HindⅢ短接头，及其碱基序列；
图4 EcoT14Ⅰ或HgiCⅠ酶消化后，TADEA-PCR反应结果图，图4b：用EcoT14Ⅰ酶消化后，连接相应短接头，TADEA-PCR反应结果图；图4c：用HgiCⅠ酶消化后，连接相应短接头，TADEA-PCR反应结果图。
具体实施方式
目前，T-DNA突变体是突变体的重要资源，A PCR是克隆突变基因的重要方法。本发明通过两方面改进了该方法，主要包括：(1)引入了热不对称反应；(2)使用了识别简并序列的限制性内切酶或识别四个碱基序列的限制性内切酶。以三级PCR反应，即三高一低反应为例，具体步骤如下：
(1)对基因组进行酶切，纯化回收后得到酶切产物；
(2)将纯化回收的酶切产物和外源长接头通过T4 DNA ligase在16℃进行连接，12小时后得到连接液；
(3)将步骤2得到的连接液作为模板，进行第一轮PCR；然后以上一轮PCR的产物为模板，进行第二轮PCR。两轮PCR的反应体系如下：
ddH2O，8.45μL；10×LAPCRBufferⅡ(Mg2+free)，1.5μL；MgCl2，1.5μL；dNTPMixture，1.2μL；引物1(10uM)，0.6μL；引物2(10uM)，0.6μL；模板，1μL；酶(TaKaRa LA Taq)，0.15μL；引物1是Tm值为50℃的短引物，引物2是Tm值为65℃的长引物。
第一、二轮PCR的热不对称反应程序相同，如下：
初级反应：95℃，3min；1个循环；
预扩增：95℃，30sec；65℃，30sec；72℃，3min；4个循环；
三级反应：95℃，30sec；65℃，30sec；72℃，3min；
95℃，30sec；65℃，30sec；72℃，3min；
95℃，30sec；65℃，30sec；72℃，3min；
95℃，30sec；50℃，1min；72℃，3min；
7～14个循环；
四级反应：72℃，5min；16℃，10min；1个循环。
其中，引物1和引物2是本领域技术人员根据本领域公知常识进行设计即可获得的，通过热不对称反应，可大大提高A PCR的扩增效率。
步骤2中，设计接头对酶切产物进行连接也是本领域的常用技术手段，且该接头包含步骤3两轮PCR程序中的引物。作为优选的方案，本发明采用具有限制性内切酶位点的外源短接头进行连接。所述外源短接头由两条长短不同的核苷酸链组成，两条核苷酸链的5′末端都不含磷酸基。两条核苷酸链(0.5μM)混合，95℃，5min变性，混合液自然恢复到室温(约25℃)，两条链互补配对形成了短接头。其碱基序列可随机设计，其中，长链要包含第一轮和第二轮Tm值为50℃的短引物(Adapter AC1和Adapter AC2)。同时，短接头含有一个粘性末端，以便于与内切酶消化的基因组片段进行连接。且短链中除粘性末端以外的碱基序列Tm值约40℃，以防止室温解链。使用短接头后不仅不影响反应效率，还可减少错配，提高准确性。
步骤1中的酶切方法也属于本领域的常用技术手段，作为优选的方案，可以采用识别简并序列的限制性内切酶或识别四个碱基序列的限制性内切酶进行酶切，可将基因组DNA酶切成能被LA Taq DNA聚合酶有效扩增的片段。
利用上述方法，我们成功克隆到了9株转基因植物的22个T-DNA插入位点，其成功率为91.7％。因此，改进后的A PCR极大地提高了它克隆T-DNA侧翼序列的效率。
我们对常规限制酶进行统计，用于本实验的有两种类型的酶，识别简并序列的限制性内切酶和识别四个碱基序列的酶，如表1所示。识别简并序列的限制性内切酶，如EcoT14Ⅰ，在基因组上该种酶的酶切位点出现的概率为四的五次方分之一，拟南芥基因组大约为120Mb，即约1024bp出现一个酶切位点；识别四个碱基序列的酶，则约256bp出现一个酶切位点。之前的A PCR运用识别六个碱基序列的限制性内切酶，大约4096bp会出现一个该酶识别位点。相比之下，识别简并序列的限制性内切酶或识别四个碱基序列的酶，可将基因组酶解成大量短片段，能极大地提高我们扩增目的片段的效率。
表1限制性内切酶
酶消化后，取部分消化产物跑胶得到电泳图结果，结果显示全为弥散的带，表示全部切开，通过DNA纯化回收试剂盒纯化回收得到酶切产物。
设计具有限制性内切酶位点的外源短接头代替A PCR中的长接头，不同的酶对应不同的接头。将短接头和纯化回收的酶切产物通过T4 DNA ligase在16℃进行连接，12小时后得到连接液。所述外源短接头由两条长短不同的核苷酸链组成，两条核苷酸链的5′末端都不含磷酸基。两条核苷酸链(0.5μM)混合，95℃，5min变性，混合液自然恢复到室温(约25°C)，两条链互补配对形成了短接头。其碱基序列可随机设计，其中，长链要包含第一轮和第二轮Tm值为50℃的短引物(Adapter AC1和Adapter AC2)。同时，短接头含有一个粘性末端，以便于与内切酶消化的基因组片段进行连接。且短链中除粘性末端以外的碱基序列Tm值约40℃，以防止室温解链。换成短接头后不仅不影响反应效率，还可减少错配，提高准确性。本实验中我们随机设计了短接头，按照短接头设计短引物，如图1所示,以EcoT14Ⅰ和HgiCⅠ短接头为例，设计了第一轮PCR短引物Adapter AC1(引物1)和第二轮PCR短引物Adapter AC2(引物1)。短引物(引物1)碱基序列如表2所示。
表2引物序列
| 引物名称 | 引物序列5′-3′ |
| adapter-AC1(SEQ ID NO.1) | TTGTCGTTAGAACGCG |
| adapter-AC2(SEQ ID NO.2) | CGCGTAATACGACTCAC |
将连接液作为第一轮PCR反应的模板，引物1是接头端Tm值为50℃的短引物，引物2是根据T-DNA上已知序列随机设计的Tm值为65℃的长引物，按表3 PCR反应体系和表4热不对称反应程序进行反应。以上一轮PCR的产物为模板，进行第二轮PCR，引物1与引物2分别为第一轮PCR的内部引物，按表3 PCR反应体系和表4热不对称反应程序进行反应。实验过程中，根据实验材料与要求可将表4热不对称反应程序中三级反应的循环数改为7、8、9、10、11、12、13、14以达到最好的效果。PCR反应结束后，第二轮的PCR产物跑胶得到电泳图，将亮的条带送测序。在以下实施例中，如果不做说明，均为第二轮PCR产物跑胶得到的电泳图。
表3 PCR反应体系
| 试剂 | 用量(15μL体系) |
| ddH2O | 8.45μL |
| 10×LAPCRBuffer(Mg2+free) | 1.5μL |
| MgCl2 | 1.5μL |
| dNTP Mixture | 1.2μL |
| 引物1(10uM) | 0.6μL |
| 引物2(10uM) | 0.6μL |
| 模板 | 1μL |
| 酶(TaKaRa LA Taq) | 0.15μL |
表4热不对称反应程序
| 反应 | 文件数 | 循环数 | 热设置 |
| 初级反应 | 1 | 1 | 95℃，3min |
| 预扩增 | 1 | 4 | 95℃，30sec；65℃，30sec；72℃，3min |
| 三级反应 | 4 | 7～14 | 95℃，30sec；65℃，30sec；72℃，3min |
| 95℃，30sec；65℃，30sec；72℃，3min | |||
| 95℃，30sec；65℃，30sec；72℃，3min | |||
| 95℃，30sec；50℃，1min；72℃，3min | |||
| 四级反应 | 1 | 1 | 72℃，5min；16℃，10min |
图2是TADEA-PCR设计原理图。
TADEA-PCR法是在A PCR法的基础上引用热不对称反应程序和识别简并序列的限制性内切酶或识别四个碱基序列的限制性内切酶的改进方法。
如图2A所示，识别简并序列的酶如EcoT14Ⅰ，消化拟南芥基因组后，大约会产生120，000个片段。只有一个片段含有T-DNA插入位点。
如图2B所示我们引用了TAIL PCR中的热不对称交错反应，经两轮PCR反应即可得到目的片段(以表4热不对称反应程序为例)。
第一轮PCR：
在模板中，短接头的5′末端与回收后的酶切产物的3′末端之间的连接部位形成一个缺口。首先PCR进行预扩增，四个循环，退火温度为65℃，由于短接头一端的短引物S-AP(Adapter AC1)退火温度较低(50℃)，所以在预扩增时，该引物不起作用，此时只进行从T-DNA一端设计的长引物(L-SP)开始延伸到接头部位缺口处停止的线性扩增，增加了目的片段在模板中的比重。之后PCR进行三级反应，开始三高(65℃)一低(50℃)的循环。三次退火温度较高(65℃)的变性，退火，延伸，此时仍只进行从T-DNA一端的长引物(L-SP)开始延伸到接头部位缺口处停止的线性扩增，进一步提高目的片段的数量。然后通过一次退火温度较低(50℃)的变性，退火，延伸时，短接头一端退火温度较低的短引物S-AP(Adapter AC1)则开始扩增，此时目的片段进入特异性的扩增，以指数形式增加PCR的产量，这四次组成一个循环，以此来提高目的片段的特异性扩增，如图2 TADEA-PCR设计原理图和表4热不对称反应程序所示。其PCR反应体系如表3所示。
第二轮PCR：
仍采用第一轮PCR的热不对称反应程序，其反应体系如表3所示，模板为第一轮PCR产物。经过第一轮PCR反应，含有目的片段的模板大量提高。预扩增时，短接头一端的短引物Adapter AC2(Adapter AC1的内侧引物)，退火温度较低，不扩增，只进行从T-DNA一端设计的长引物(L-SP的内侧引物)开始延伸到接头部位缺口处停止的线性扩增，之后进行三级PCR反应，即三高一低反应，退火温度为50℃时Adapter AC2开始扩增，此时目的片段进入特异性的扩增，以指数形式增加PCR的产量，这四次组成一个循环，以此来提高目的片段的特异性扩增，按表4热不对称反应程序进行反应，大量扩增目的片段。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本实验中的转基因材料均来自本实验自己所拥有的拟南芥转基因植株。
针对图3做以下实验。
在A PCR的基础上只引入热不对称反应程序则称为TAA-PCR。
图3是通过A PCR和TAA-PCR同时克隆同一株植物的插入位点的对比图。图中白色星号所指向的带为目的条带。
图3a为采用含HindⅢ酶位点的长接头，A PCR和TAA-PCR均进行两轮PCR反应的电泳对比图。从Takara公司购买的体外克隆试剂盒提供长接头-HindⅢ和其引物CassettePrimer C1和Cassette Primer C2。长接头-HindⅢ，其序列如图3g所示，是5′GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA3′(SEQ ID NO.3)与5′AGCTTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGTTCTAACGACAATATGTAC3′(SEQ ID NO.4)互补配对形成的。A PCR中采用的长接头端的长引物，为体外克隆试剂盒提供的Cassette Primer C1(第一轮)和Cassette Primer C2(第二轮)。Cassette Primer C1，GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA(SEQ ID NO.5)，Cassette Primer C2，CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA(SEQ ID NO.6)。另一引物为根据T-DNA上已知序列随机设计的Tm值为65℃的长引物L1(第一轮)和L2(第二轮)。L1,序列为TTGGCTACCCGTGATATTGCTG(SEQ ID NO.7)；L2,序列为GCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTA(SEQ IDNO.8)。TAA-PCR过程中采用的短引物(引物1)为Adapter AC1(第一轮)和Adapter AC2(第二轮)。Adapter AC1为TTGTCGTTAGAACGCG(SEQ ID NO.9)，Adapter AC2为CGCGTAATACGACTCAC(SEQ ID NO.10)。采用对称的引物(引物2)：L1(第一轮)和L2(第二轮)。
根据电泳图可得到，A PCR的两轮PCR反应均进行22、25、30个循环时，目标条带也不甚明显，而引入热不对称序的TAA-PCR，第一轮进行8个循环，第二轮进行12个循环，目标条带的亮度已超过A PCR反应30个循环时的条带的亮度。故而我们可以得出引入热不对称反应程序可提高扩增目的片段的效率。即TAA-PCR更容易扩增出目的条带。
图3b A PCR和TAA-PCR均只进行第一轮PCR反应的电泳对比图。所用接头和引物与3a相同，A PCR分别扩增30、35个循环，TAA-PCR分别扩增14、17个循环。
从电泳图上可知，A PCR第一轮扩增35个循环时仍没有目的条带，即PCR产量还不够多以至于用电泳检测还不能看见条带。而TAA-PCR第一轮扩增14个循环时，已经可以看见预期的目的条带，扩增17个循环时，已明显看出目的条带。自此，我们可以更进一步的得出，只有将第一轮中目标条带富集较多后，在使用内部引物进行第二轮扩增时，才会得到更多的目的条带。说明热不对称程序极大的提高了目标片段的扩增。
图3c和图3d为采用HindⅢ酶位点的长接头，TAA-PCR和A PCR均进行两轮PCR反应的电泳图。TAA-PCR反应过程中，采用短引物Adapter AC1(第一轮)、Adapter AC2(第二轮)，以及不同的引物组F1、F2、F3、F4、F5(均包含第一轮扩增引物S1和第二轮扩增引物S2)；A-PCR反应过程中，采用长引物Cassette Primer C1和Cassette Primer C2，和对称的引物组F1、F2、F3、F4、F5进行扩增，各个引物组的序列如下：
F1-S1(SEQ ID NO.11)：TGCTGGACAGGCTAATAGGAATCTTG；
F1-S2(SEQ ID NO.12)：GAATCTTGCTGGAGAGGGGAATGG。
F2-S1(SEQ ID NO.13)：CAGCATTGATAGTTGTGCCAGTTTCG；
F2-S2(SEQ ID NO.14)：CTGAGTCATTCTTTGGCACGGGTT。
F3-S1(SEQ ID NO.15)：GGGAGAAGTAACTGCTAAGAAACCGTC；
F3-S2(SEQ ID NO.16)：ACCAACCATAACTCCCACTCTTCTACTTT。
F4-S1(SEQ ID NO.17)：GCGTTGTTACGAAACCCGCTAAAAG；
F4-S2(SEQ ID NO.18)：CTCAGCAAATCATACCTTTCTCGGC。
F5-S1(SEQ ID NO.19)：TCCGAAACAACCAGCATCATCCA；
F5-S2(SEQ ID NO.20)：TCGAAATCAACCATGAAGAACGTAAAAA。
通过将图3c与图3d对比可得，优化后TAA-PCR每一对引物均能得到目的条带，而APCR有且仅有一对引物扩增出目的条带并且其目的条带亮度较弱，由此可得，TAA-PCR的效率相对于A PCR提高了很多，且能得到大量的目的片段，为后期的测序，得出准确序列提供更为可靠的结果，保证为后续的实验提供正确的依据。
图3e中，用改进后的HindⅢ短接头代替长接头后，TAA-PCR反应结果图；短接头序列为5′TTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACA3′(SEQ ID NO.21)与5′AGCTTGTGAGTCGTATTAC3′(SEQ ID NO.22)互补配对后得到HindⅢ短接头。6个引物分别与短引物进行两轮热不对称PCR扩增，其中L1、F1、F2、F3、F4、F5(均包含第一轮扩增引物和第二轮扩增引物)。对比图3c与图3e，发现对于TAA-PCR，无论使用长接头还是短接头，所扩增的目的片段的亮度几乎一样，由此可知我们可以用短接头来代替长接头。由于长接头序列较长，在退火时，较易出现不严谨配对的现象，即出现错配，而一旦错配完成会使此片段进入特异性循环，导致目的片段与其竞争，使我们的目标片段扩增量减少，因此我们将接头改短，使该端的引物具有严格的反应条件，减少其错配率，提高目的片段扩增的效率。
图3结果表明，引入热不对称反应的A PCR能大大提高目的片段的扩增效率。
针对图4做以下实验。
TADEA-PCR法
1.取一个株系的转基因植株，通过植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取基因组。用EcoT14Ⅰ和HgiCⅠ这两种识别简并序列的限制性内切酶消化基因组，取少量酶切产物跑胶后，电泳图显示全部切开，将剩余的酶切产物用纯化回收试剂盒进行纯化回收。
2.分别设计含有EcoT14Ⅰ和HgiCⅠ位点的外源短接头，序列如图1 EcoT14Ⅰ短接头和HgiCⅠ短接头所示，其5′末端不含磷酸基，将短接头和纯化回收的酶切产物通过T4 DNAligase在16℃进行连接，12小时后得到连接液；
3.根据步骤2中的EcoT14Ⅰ短接头和HgiCⅠ短接头，设计Tm值为50℃的短引物(引物1)，引物1为Adapter AC1和Adapter AC2，其序列如表2所示。引物2为根据T-DNA上已知序列随机设计的Tm值为65℃的长引物，分别为L1、F1、F2、F3、F4’、F5。其中L1、F1、F2、F3、F5与图3中所用引物相同，F4’为F4’-S1和F4’-S2。
F4’-S1(SEQ ID NO.23)：TCCATGAACGTCCGTCTTTCTTG；
F4’-S2(SEQ ID NO.24)：CGTCTTTCTTGTATAGCCCATGACAG。
4.使用改进的热不对称反应程序进行PCR扩增，两轮PCR反应均按表3 PCR反应体系，表4热不对称反应程序进行扩增。
5.PCR反应结果分析
图4PCR反应结果图中白色星号所指向的带为目的条带。图4b：用EcoT14Ⅰ酶消化后，连接相应短接头，TADEA-PCR反应结果图；图4c：用HgiCⅠ酶消化后，连接相应短接头，TADEA-PCR反应结果图；由图4b电泳图可得，EcoT14Ⅰ酶切后，连接相应短接头，分别扩增六个片段，均得到了目的条带且条带较强。图4c中有三个反应得到了目的条带且条带较强，其余两个反应未得到目的条带是由于此处酶切位点较远，目的片段的大小超出了LA Taq酶的扩增能力范围。EcoT14Ⅰ限制性内切酶有较好的酶切位点，在基因组上分布较多，能够更好的得到目的片段，而HgiCⅠ限制性内切酶的酶切位点较不常见，在基因组上分布较少，限制较多，可能有较多的目的片段超出了LA Taq酶的扩增范围，但是由于T-DNA插入基因组中的不确定性，故这两种酶并没有好坏之分。TADEA-PCR反应，无论是用EcoT14Ⅰ酶酶切还是用HgiCⅠ酶酶切，均可得到目的片段。
由此说明识别简并序列的限制性内切酶或识别四个碱基序列的酶，可将基因组酶解成大量短片段，能极大地提高我们扩增目的片段的效率。
序列表
<110> 西北大学
<120> 一种基于热不对称反应的接头介导的PCR方法
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 1
ttgtcgttag aacgcg 16
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 2
cgcgtaatac gactcac 17
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 3
gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata gggaga 46
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 4
agcttctccc tatagtgagt cgtattacgc gttctaacga caatatgtac 50
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 5
gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actca 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 6
cgttagaacg cgtaatacga ctcactatag ggaga 35
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 7
ttggctaccc gtgatattgc tg 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 8
gctgaccgct tcctcgtgct tta 23
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 9
ttgtcgttag aacgcg 16
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 10
cgcgtaatac gactcac 17
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 11
tgctggacag gctaatagga atcttg 26
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 12
gaatcttgct ggagagggga atgg 24
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 13
cagcattgat agttgtgcca gtttcg 26
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 14
ctgagtcatt ctttggcacg ggtt 24
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 15
gggagaagta actgctaaga aaccgtc 27
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 16
accaaccata actcccactc ttctacttt 29
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 17
gcgttgttac gaaacccgct aaaag 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 18
ctcagcaaat catacctttc tcggc 25
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 19
tccgaaacaa ccagcatcat cca 23
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 20
tcgaaatcaa ccatgaagaa cgtaaaaa 28
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 21
ttgtcgttag aacgcgtaat acgactcaca 30
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 22
agcttgtgag tcgtattac 19
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 23
tccatgaacg tccgtctttc ttg 23
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(unknown)
<400> 24
cgtctttctt gtatagccca tgacag 26
Claims (4)
1.一种基于热不对称反应的接头介导的PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对基因组进行酶切，纯化回收后得到酶切产物；
(2)将纯化回收的酶切产物和外源接头进行连接，得到连接液；
(3)将步骤2得到的连接液作为模板，采用两个具有不同Tm值的引物，通过热不对称反应进行扩增。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中，纯化回收的酶切产物采用具有限制性内切酶位点的外源短接头进行连接，所述外源短接头由两条长短不同的核苷酸链组成，两条核苷酸链的5′末端都不含磷酸基。两条核苷酸链(0.5μM)混合，95℃，5min变性，混合液自然恢复到室温(约25℃)，两条链互补配对形成了短接头。长链包含热不对称反应过程中，Tm值较低的引物；同时，短接头含有一个粘性末端。且短链中除粘性末端以外的碱基序列Tm值约40℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中，采用识别简并序列的限制性内切酶或识别四个碱基序列的限制性内切酶进行酶切。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述识别简并序列的限制性内切酶选自：AccⅠ、BanⅡ(HgiJⅡ)、BmeT110Ⅰ(AvaⅠ)、BspT107Ⅰ(HgiCⅠ)、Cfr10Ⅰ、EaeⅠ(CfrⅠ)、EcoO109Ⅰ(DraⅡ)、EcoT14Ⅰ(StyⅠ)、HaeⅡ、Hin1Ⅰ(AcyⅠ,BbiⅡ)、MflⅠ(XhoⅡ)、BciT130Ⅰ(EcoRⅡ,MvaⅠ)、BcnⅠ(CauⅡ)、Bsp1286Ⅰ(SduⅠ)、VpaK11BⅠ(AvaⅡ)、BmgT120Ⅰ(AsuⅠ,Cfr13Ⅰ)、DdeⅠ、HinfⅠ；所述识别四个碱基序列的限制性内切酶选自HhaⅠ、MboⅠ(Sau3AⅠ)、MspⅠ(HpaⅡ,HapⅡ)、RspRSⅡ(MseⅠ)、TaqⅠ(TthHB8Ⅰ)、XspⅠ(BfaⅠ,MaeⅠ)。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711309403.4A CN108103169A (zh) | 2017-12-11 | 2017-12-11 | 一种基于热不对称反应的接头介导的pcr方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711309403.4A CN108103169A (zh) | 2017-12-11 | 2017-12-11 | 一种基于热不对称反应的接头介导的pcr方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108103169A true CN108103169A (zh) | 2018-06-01 |
Family
ID=62208468
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711309403.4A Pending CN108103169A (zh) | 2017-12-11 | 2017-12-11 | 一种基于热不对称反应的接头介导的pcr方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108103169A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110331446A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-10-15 | 上海鹍远生物技术有限公司 | Dna甲基化标志物筛查试剂盒及方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101012482A (zh) * | 2007-02-12 | 2007-08-08 | 中国农业大学 | 一种筛选基因组dna中差异位点及其侧翼序列的方法 |
| CN101285084A (zh) * | 2008-06-02 | 2008-10-15 | 东北林业大学 | 一种克隆多拷贝t-dna旁侧植物dna序列的方法 |
| KR20110065228A (ko) * | 2009-12-09 | 2011-06-15 | 경희대학교 산학협력단 | 배추 속 식물의 유전체 기능 분석용 ｔａｉｌ ｐｃｒ 방법 |
| CN102559710A (zh) * | 2011-06-27 | 2012-07-11 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 等鞭金藻δ4-脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法 |
| CN102634506A (zh) * | 2012-04-06 | 2012-08-15 | 湖南杂交水稻研究中心 | 一种黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法 |
| US20130017966A1 (en) * | 2005-04-29 | 2013-01-17 | Affymetrix, Inc. | Methods for Genotyping with Selective Adaptor Ligation |
| CN103757014A (zh) * | 2014-01-08 | 2014-04-30 | 上海大学 | 富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及其富集方法 |
-
2017
- 2017-12-11 CN CN201711309403.4A patent/CN108103169A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130017966A1 (en) * | 2005-04-29 | 2013-01-17 | Affymetrix, Inc. | Methods for Genotyping with Selective Adaptor Ligation |
| CN101012482A (zh) * | 2007-02-12 | 2007-08-08 | 中国农业大学 | 一种筛选基因组dna中差异位点及其侧翼序列的方法 |
| CN101285084A (zh) * | 2008-06-02 | 2008-10-15 | 东北林业大学 | 一种克隆多拷贝t-dna旁侧植物dna序列的方法 |
| KR20110065228A (ko) * | 2009-12-09 | 2011-06-15 | 경희대학교 산학협력단 | 배추 속 식물의 유전체 기능 분석용 ｔａｉｌ ｐｃｒ 방법 |
| CN102559710A (zh) * | 2011-06-27 | 2012-07-11 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 等鞭金藻δ4-脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法 |
| CN102634506A (zh) * | 2012-04-06 | 2012-08-15 | 湖南杂交水稻研究中心 | 一种黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法 |
| CN103757014A (zh) * | 2014-01-08 | 2014-04-30 | 上海大学 | 富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及其富集方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| QUOCLINH TRINH等: ""An A-T linker adapter polymerase chain reaction method for chromosome"", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 * |
| 党双锁等: "《医学常用实验技术精编》", 30 June 2004, 世界图书出版西安公司 * |
| 张蕾 等: "《植物发育生物学实验指导》", 30 November 2010, 武汉大学出版社 * |
| 李远华等: "《茶叶生物技术》", 30 June 2017, 中国轻工业出版社 * |
| 蒲秀瑛等: "《抗衰老药物药理学概论》", 31 December 2015, 军事医学科学出版社 * |
| 陈明雄等: "《生物化学 供护理及相关医学专业用》", 31 August 2009, 中国医药科技出版社 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110331446A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-10-15 | 上海鹍远生物技术有限公司 | Dna甲基化标志物筛查试剂盒及方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2007087291A2 (en) | Asymmetrical adapters and methods of use thereof | |
| CN105986015B (zh) | 一种基于高通量测序的多样本的一个或多个靶序列的检测方法和试剂盒 | |
| WO1990010698A1 (en) | Directional cloning | |
| CN102604982A (zh) | 一种利用外切核酸酶活性的无痕克隆及重组方法 | |
| WO2023116681A1 (zh) | 靶序列随机sgRNA全覆盖组的制备方法 | |
| JP2023002557A (ja) | シングルプライマーからデュアルプライマーのアンプリコンへのスイッチング | |
| CN106282173A (zh) | 克隆转基因生物中外源基因整合位点处侧翼序列的方法 | |
| CN107058361A (zh) | 基于核糖核苷酸修饰引物的连接酶非依赖性基因克隆方法 | |
| CN103114102B (zh) | 一种多基因载体组装方法与应用 | |
| WO2017215517A1 (zh) | 测序文库构建中5'和3'接头连接副产物的去除方法 | |
| CN110699425A (zh) | 基因目标区域的富集方法及体系 | |
| CN108103169A (zh) | 一种基于热不对称反应的接头介导的pcr方法 | |
| CN102382851B (zh) | 克隆载体 | |
| CN104212827B (zh) | 不依赖生物工程酶的快速分子克隆方法 | |
| TW202039838A (zh) | 一種單鏈dna合成方法 | |
| WO2017217444A1 (ja) | 二本鎖ｄｎａ末端の加工方法 | |
| US20210355519A1 (en) | Demand synthesis of polynucleotide sequences | |
| CN114808148A (zh) | 一种dna文库构建试剂盒、文库构建方法和应用 | |
| CN110305861B (zh) | 构建多点突变核酸序列的方法 | |
| CN116135982A (zh) | 用于基因片段连接的应用方法和试剂盒 | |
| CN101177697A (zh) | 一种制备核酸分子量标的方法 | |
| JP7348197B2 (ja) | 鋳型切り換え機構を通じて核酸ライブラリを調製するためのシステムと方法 | |
| CN108103170A (zh) | 识别简并序列或四碱基序列的限制性内切酶在接头介导的pcr方法中的应用 | |
| CN113122616A (zh) | 扩增和确定目标核苷酸序列的方法 | |
| JP5129498B2 (ja) | 核酸クローニング法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180601 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |