CN113122616A - 扩增和确定目标核苷酸序列的方法 - Google Patents

扩增和确定目标核苷酸序列的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113122616A
CN113122616A CN202011576931.8A CN202011576931A CN113122616A CN 113122616 A CN113122616 A CN 113122616A CN 202011576931 A CN202011576931 A CN 202011576931A CN 113122616 A CN113122616 A CN 113122616A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
sequencing
complementary
nucleic acid
nucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011576931.8A
Other languages
English (en)
Inventor
江佩馨
范振业
简虹琪
林昱宇
林志龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Industrial Technology Research Institute ITRI
Original Assignee
Industrial Technology Research Institute ITRI
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Industrial Technology Research Institute ITRI filed Critical Industrial Technology Research Institute ITRI
Publication of CN113122616A publication Critical patent/CN113122616A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

提供一种扩增和确定目标核苷酸序列的方法。所述扩增目标核苷酸序列的方法包括：将第一接合器及第二接合器分别连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子的两端，以形成核酸模板，其中第一接合器包括Y型接合器或发夹型接合器，且第二接合器为发夹型接合器。接着，对核酸模板进行PCR扩增循环，以得到目标核苷酸序列的PCR扩增子。

Description

扩增和确定目标核苷酸序列的方法
技术领域
本发明是涉及一种基因体学的方法，且特别是涉及一种扩增和确定目标核苷酸序列的方法。
背景技术
经过十多年的技术发展，下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS) 的成本大幅降低，加上大数据分析能力的迅速演进，因此多国大量推动精准医疗，而使庞大商机逐渐成形。在精准医疗中，“及早发现疾病的变化”为诊断治疗的重要依据及指标。尤其在癌症的发展过程中，DNA突变可能造成抗药性等不利于病人的情况，因此若能在初期发生即能侦测之，即可帮助医疗团队做出对病人最好的处置措施。
举例来说，在人体约2万个基因中，有大约300多个基因与癌症有高度相关，患有同一种癌症的病友，基因突变点也不尽相同。因此，即使是同一个癌症期别，施以同种药物的效果也大相径庭。如果能利用类似「全方位癌症基因检测」(Comprehensive GenomicProfiling)的方法，不分癌别地，一次针对300个基因进行检测，将所有突变一次找出来，为病人配对合适的治疗方案，可预期将能有效节省宝贵的时间与金钱。此外，不再以癌症种类与期别区分，而是检视基因突变并给予治疗，这也是「精准医疗」的精神所在。
然而，传统NGS的错误率约为1％，在最佳情况下可低至0.1％，但仍无法满足「检测低量变异基因」的需求，因此，发展一更准确的NGS方法仍为精准医疗领域的重要课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种扩增目标核苷酸序列的方法，其所得到的扩增子在任一股中具有顺向目标核苷酸序列及反向目标核苷酸序列。
本发明的目的在于提供一种确定目标核苷酸序列的方法，其可得到互补两股DNA的序列信息。
为达上述目的，本发明提出一种扩增目标核苷酸序列的方法，其包括以下步骤。(a)将第一接合器及第二接合器分别连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子的两端，以形成核酸模板，其中目标核苷酸序列包含顺向股与反向股，第一接合器包括Y型接合器或发夹型(hair-pin)接合器，且第二接合器为发夹型接合器。(b)将核酸模板进行变性反应。(c)在足以对目标核苷酸序列进行聚合酶链反应(PCR)扩增的条件下，使第一引物、第二引物、DNA 聚合酶与核酸模板接触，其中第一引物包含特异性粘合(annealing)至靠近顺向股的第一接合器的第一序列，所述第二引物包含特异性粘合至靠近反向股的第一接合器的第二序列。(d)重复步骤(c)进行一个或多个PCR扩增循环，以得到目标核苷酸序列的PCR扩增子
本发明提出一种确定目标核苷酸序列的方法，其包括以下步骤。提供上述的扩增目标核苷酸序列的方法得到目标核苷酸序列的PCR扩增子。对目标核苷酸序列的PCR扩增子进行核酸测序，借此得到目标核苷酸序列的序列信息。
基于上述，本发明通过将发夹型的第二接合器与目标核苷酸序列的互补两股DNA(即顺向股及反向股)连接在一起并作为核酸模板，并使用位于第一接合器上的引物对核酸模板进行PCR扩增循环。因此，所得到的PCR扩增子的任一股皆具有顺向目标核苷酸序列以及反向目标核苷酸序列。此外，由于PCR扩增子的任一股皆包含顺向目标核苷酸序列以及反向目标核苷酸序列，因此在进行核酸测序分析时，自任一端进行测序皆可得到互补两股DNA区域的序列，且可将得到的互补两股DNA区域的序列互相比对，借此可提高原本目标核苷酸序列的准确度。此外，在本发明中是将互补两股DNA连接在一起进行测序及分析，因此可以降低测序的成本。
附图说明
图1为依照本发明的第一实施例的扩增目标核苷酸序列的方法的流程图。
图2为依照本发明的第二实施例的扩增目标核苷酸序列的方法的流程图。
图3为依照本发明的第三实施例的扩增目标核苷酸序列的方法的流程图。
图4为依照本发明的第四实施例的扩增目标核苷酸序列的方法的流程图。
图5为依照本发明的第五实施例的扩增目标核苷酸序列的方法的流程图。
图6显示发夹型建构体的示例性结构。
图7显示SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:9的核苷酸序列比对。
图8显示SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10的核苷酸序列比对。
图9显示所设计的发夹型建构体的顺向序列与其反向互补序列的序列比对。
图10显示硅中重亚硫酸转化的发夹型建构体的顺向序列与其反向互补序列的序列比对。
图11显示分析DNA甲基化的规则。
图12显示SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO: 14的序列比对。
具体实施方式
[术语定义]
在本实施例中，可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或者可以通过DNA或RNA聚合酶而掺入聚合物中的任何基质。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及其类似物。
在本实施例中，“寡核苷酸”通常是指较短的、单股的、合成的多核苷酸，其长度一般不超过约200个核苷酸，但本发明不限于此。在本实施例中，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并非相互排斥的。以上关于多核苷酸的描述同等地且完全适用于寡核苷酸。
术语「5’」与「3’」通常是指多核苷酸或寡核苷酸中位于同一多核苷酸或寡核苷酸的方向性的两端。一般而言，5’位于上游而3’位于下游，核苷酸in vivo 是以5’至3’方向合成。
在本实施例中，可互换使用的“杂交(hybridization)”以及“粘合(annealing)”，表示两核酸分子彼此间必须具有高度同构型(homology)，以通过核苷酸基团的碱基之间的氢键来稳定的复合物。在本实施例中，核酸分子的一部分可以与另一核酸分子上的互补序列特异性地杂交或粘合。举例来说，在核酸分子的5’端可以存在一段未杂交的核苷酸，而同一核酸分子的 3’端的一段序列则与另一核酸分子特异性地杂交或粘合。
在本实施例中，“核酸模板”是指作为目标富集和测序的起始材料的核酸样本中的多核苷酸。核酸模板可为单股或双股。
在本实施例中，“变性(denature)”是指对核酸模板进行处理，使得互补双股核酸分子被分成单股核酸分子，可用于粘合至寡核苷酸引物(例如第一引物及第二引物)等。
在本实施例中，“引物”通常是较短的单股多核苷酸，且通常具有游离的 3’-OH基团。引物通过与目标序列杂交而结合至所关注的目标，然后促进与目标互补的多核苷酸的聚合。
在本实施例中，“测序引物”为一寡核苷酸，可连接至核酸分子中适合引物连接及测序反应中延伸的位置，以产生序列信息。
在本实施例中，“接合器(adaptor)”是指可连接至多核苷酸片段的寡核苷酸。
“解链温度(melting temperature)”表示一半的核酸在溶液中为链解开状态，另一半核酸为链未解开状态时的温度。当接合器可形成发夹型(hairpin) 的情形时，解链温度为一半的接合器为部分自体杂交的“发夹型”时的温度。
当核酸接合器及核酸样本中没有其他插入的重复序列介于所述核酸接合器及核酸样本之间时，所述核酸接合器及核酸样本紧邻于彼此的上游或下游。在单股分子中，上游表示5’端方向，下游表示3’端方向。在双股分子中，此极性可自行决定或可根据具方向性的组成组件(例如启动子、编码序列等) 的极性来决定。举例来说，启动子的极性为RNA聚合酶开始合成的方向往下游延伸。编码序列的极性为从起始密码子向终止密码子的方向往下游延伸。
在本实施例中，“扩增(amplification)”是指产生期望序列的两个或更多个拷贝的过程。扩增反应的组分可包括引物、核酸模板、聚合酶、核苷酸、dNTP，但本发明不限于此。
“扩增的产物”、“扩增产物”或“扩增子(amplicon)”是指由PCR扩增反应产生的寡核苷酸，其为特定目标模板核酸和/或其互补序列的一部分的拷贝，其在核苷酸序列中对应于核酸模板序列和/或其互补序列。扩增产物更可包含对引物具有特异性的序列，并且所述序列侧接目标核酸的序列和/或其互补序列。如本文所述的扩增子通常是双股DNA，但也可以引用为其单股。
术语“富集(enrichment)”是指相对于在处理之前初始存在于所述样本中的整体核酸序列水平而言，增加样本中特定核酸序列的相对丰度的过程。因此，富集步骤提供了相对百分比或分数增加量，而不是直接增加量。在富集步骤之后，待分析的样本可以称为经富集的或经选择的多核苷酸。
本发明提供一种扩增目标核苷酸序列的方法，其能有效地对目标序列进行目标序列富集。具体来说，本发明提供一种在使用下一代测序技术确定目标核苷酸序列之前，富集所关注的目标核苷酸序列的方法。
本发明提供一种扩增目标核苷酸序列的方法，其包括以下步骤：(a)将第一接合器及第二接合器分别连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子的两端，以形成核酸模板，其中目标核苷酸序列包含顺向股与反向股，第一接合器包括Y型接合器或发夹型(hair-pin)接合器，且第二接合器为发夹型接合器；(b)将核酸模板进行变性反应；(c)对所述目标核苷酸序列进行PCR扩增，使第一引物、第二引物、DNA聚合酶与所述核酸模板接触，其中所述第一引物包含特异性粘合至靠近所述顺向股的所述第一接合器的第一序列，所述第二引物包含特异性粘合(annealing)至靠近所述反向股的所述第一接合器的第二序列；以及(d)重复步骤(c)，进行一个或多个PCR扩增循环，以得到所述目标核苷酸序列的PCR扩增子。
在本实施例中，目标核苷酸序列是指双股目标多核苷酸的序列，其可包含顺向股与反向股。
在本实施例中，所使用的接合器包括第一接合器及第二接合器，其中第一接合器包括Y型接合器或发夹型(hair-pin)接合器，而第二接合器为发夹型接合器。
在一实施例中，Y型接合器包括配对的双股部分以及未配对的单股部分。具体来说，Y型接合器在第一末端包含可连接的双股部分，且在第二末端包含非双股部分的寡核苷酸，其中双股部分可连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子。在一实施例中，Y型接合器包含单独的第一股及第二股，其中 Y型接合器的第一股是指其3’端位于Y型接合器的第一末端(即，可连接末端)的一股。Y型接合器的第二股是指其5’端位于Y型接合器的第一末端(即，可连接末端)的另一股。
在一实施例中，Y型接合器的第一股包含5’未配对部分及3’配对部分， Y型接合器的第二股具有3’未配对部分及5’配对部分。在一实施例中，Y型接合器的第一股及第二股的配对部分基本上互补并形成包含可连接的双股部分的第一末端，并且双股部分具有足够的长度以在粘合温度下保持双股形式。
在一实施例中，Y型接合器的非双股部分包括第一未配对股(例如第一股的5’未配对部分)及第二未配对股(第二股的3’未配对部分)。在一实施例中，Y型接合器的第一未配对股的长度可比第二未配对股的长度短、长或相等。
在一实施例中，Y型接合器的第一未配对股与第二未配对股基本上不互补。在一实施例中，Y型接合器的第二股的第二未配对股(即3’未配对部分) 在粘合温度(annealingtemperature)下不会特异性地粘合至第一股的第一未配对股(即5’未配对部分)。
在一实施例中，Y型接合器的双股部分的长度可为约10bp至30bp，例如可为约12bp至28bp、约15bp至25bp、约18bp、约20bp等，但不限于此。在一实施例中，Y型接合器的第一未配对股与第二未配对股的长度可为约10bp至60bp，例如可为约15bp至45bp、约20bp至40bp、约25bp、约30bp、约35bp等，但不限于此。在一实施例中，Y型接合器的解链温度可为约30℃至90℃，例如可为约35℃至90℃、约45℃至85℃、约50℃至80℃、约55℃至75℃、约60℃、约65℃、约70℃等，但不限于此。
在一实施例中，Y型接合器的第一未配对股及第二未配对股为引物的粘合区域。在一实施例中，引物包括用于扩增的引物以及用于核酸测序的引物。在一实施例中，Y型接合器的第一未配对股包括与用于扩增的引物(例如第一引物)互补的序列，且Y型接合器的第二未配对股包括与用于扩增的另一引物(例如第二引物)互补的序列。
在一实施例中，Y型接合器的第一未配对股及第二未配对股与引物粘合的温度范围可为约20℃至72℃，例如可为约25℃至70℃、约30℃至65℃、约35℃至60℃、约40℃至55℃、约52℃至70℃、约55℃至68℃、约 45℃、约58℃、约60℃、约62℃、约65℃等，但不限于此。
在一实施例中，发夹型接合器可部分自体杂交且形成发夹型(hairpin)。在一实施例中，发夹型接合器包括配对的双股部分(即茎区(stem region)) 以及未配对的单股部分(即环区(loop region))，其中双股部分可连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子，未配对的单股部分具有环(loop)结构。
在一实施例中，发夹型接合器的双股部分的长度可为约10bp至30bp，例如可为约12bp至28bp、约15bp至25bp、约18bp、约20bp等，但不限于此。发夹型接合器的双股部分的长度过长会抑制后续进行PCR反应所产生的PCR扩增子。在一实施例中，发夹型接合器的单股部分的长度可为约5bp 至50bp，例如可为约10bp至45bp、约15bp至40bp、约20bp至35bp、约25bp、约30bp等，但不限于此。在一实施例中，发夹型接合器的解链温度可为约30℃至90℃，例如可为约35℃至85℃、约40℃至80℃、约45℃至75℃、约35℃至65℃、约40℃至60℃、约45℃、约50℃、约55℃、约68℃、约72℃、约85℃等，但不限于此。
在一实施例中，发夹型接合器的单股部分为引物粘合区域。在一实施例中，引物包括用于扩增的引物以及用于核酸测序的引物。在一实施例中，发夹型接合器的单股部分包括与用于扩增的引物对(例如第一引物及第二引物) 的相同或互补的序列。
在一实施例中，发夹型接合器的单股部分与引物粘合的温度范围可为约 20℃至72℃，例如可为约25℃至70℃、约30℃至65℃、约35℃至60℃、约40℃至55℃、约52℃至70℃、约55℃至68℃、约26℃、约37℃、约 46℃、约58℃、约60℃、约62℃、约65℃等，但不限于此。
在一实施例中，发夹型接合器的单股部分包括至少一个尿嘧啶(U)碱基。在一实施例中，可通过尿嘧啶特异性酶切酵素在发夹型接合器的单股部分的尿嘧啶(U)碱基的位置处进行酶切，以形成两条单独的股(例如第一股及第二股)，其中第一股与第二股形成Y形。在一实施例中，可使用尿嘧啶特异性切除试剂(Uracil-Specific Excision Reagent，USER)酵素(可购自 New England Biolabs；NEB)对发夹型接合器的包括U碱基的单股部分进行酶切，以在尿嘧啶位置产生一个单核苷酸缺口。USER酵素为尿嘧啶-DNA糖基化酶(Uracil-DNA glycosylase，UDG)与DNA糖基化酶-裂解酶核酸内切酶 VIII(DNAglycosylase-lyase endonuclease VIII，endoVIII)的混合物。UDG 催化尿嘧啶碱基的移除，以形成一个无碱基位点(abasic site，AP site)(嘧啶二酮)，并同时使磷酸二酯主链保持完整。核酸内切酶VIII的裂解酶活性破坏了无碱基位点的3’及5’的磷酸二酯主链，进而释放了无碱基的脱氧核糖。在上述实施例中，是先将尿嘧啶-DNA糖基化酶与DNA糖基化酶-裂解酶核酸内切酶VIII混合后(如USER酵素)再对发夹型接合器的包括U碱基的单股部分进行酶切，但本发明不限于此。在另一实施例中，可先使发夹型接合器的包括U碱基的单股部分处理尿嘧啶-DNA糖基化酶，之后再处理DNA糖基化酶-裂解酶核酸内切酶VIII。在一实施例中，第一股包括与用于扩增的引物(例如第一引物)互补的序列，且第二股包括与用于扩增的另一引物(例如第二引物)互补的序列。
在一实施例中，引物的长度至少约10个核苷酸，但不超过约200个核苷酸。
在本实施例中，引物被设计成特异性地粘合至核酸模板中已知的核苷酸序列。在一实施例中，引物包含与核酸模板基本上互补的序列，因此引物可特异性地粘合至核酸模板。在一实施例中，引物中与核酸模板杂交的序列位于引物序列的3’端。引物及其互补物可以粘合以形成双股多核苷酸。
在本实施例中，第一引物包含可特异性粘合至靠近顺向股的第一接合器的第一序列，第二引物包含可特异性粘合至靠近反向股的第一接合器的第二序列。
在一实施例中，第一接合器为发夹型接合器，其中第一引物可特异性粘合至单股部分的靠近顺向股的区域，且第二引物可特异性粘合至单股部分的靠近反向股的区域。更具体来说，单股部分的靠近顺向股的区域包括与第一序列互补的序列，且单股部分的靠近反向股的区域包括与第二序列互补的序列。
在一实施例中，第一接合器为Y型接合器，其中第一引物特可异性粘合至靠近顺向股的第一未配对股，且第二引物可特异性粘合至靠近反向股的第二未配对股。更具体来说，靠近顺向股的第一未配对股包括与第一序列互补的序列，且靠近反向股的第二未配对股包括与第二序列互补的序列。
在一实施例中，第一接合器包含核酸标记物或分子条码(barcode)。在一实施例中，第一接合器的单股部分包含核酸标记物或分子条码。在一实施例中，第一接合器的双股部分包含核酸标记物或分子条码。可使用核酸标记物或分子条码来对来源于相同核酸模板的扩增子的测序读段(sequencing reads) 进行比对，从而允许校正由PCR扩增循环引起的错误。也就是说，核酸标记物或分子条码可以用来标记同一个初始核酸模板，因此可以降低分析的错误率。在一实施例中，分子条码是单股的。在一实施例中，Y形的第一接合器的第一股在未配对部分的3’端包含分子条码。在一实施例中，分子条码是双股的。
在本实施例中，第二接合器为发夹型接合器。在一实施例中，第一接合器为发夹型接合器，且第二接合器为不同于第一接合器的发夹型接合器。在一实施例中，在本实施例中，第二接合器与第一引物及第二引物子基本上不互补或基本上不相同。
在一实施例中，接合器与具有目标核苷酸序列的双股核酸分子的连接可以通过本领域已知的任何方法来完成，例如，平端(blunt-end)连接或粘性端(sticky-end)连接。
在一实施例中，可先将第一接合器连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子的一端，接着再将第二接合器连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子的另一端。在另一实施例中，可先将第二接合器连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子的一端，接着再将第一接合器连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子的另一端。
在一实施例中，变性反应是通过在足够高温度下加热核酸模板来实现。在一实施例中，足够高温度为约90℃至100℃，例如可为约92℃、约95℃、约98℃等，但不以此为限。在一实施例中，将核酸模板进行变性反应例如是对核酸模板进行重亚硫酸处理。重亚硫酸处理可将核酸模板中的胞嘧啶(C) 转换成尿嘧啶(U)，进而改变碱基配对特异性。具体来说，原本的胞嘧啶(C) 是与鸟嘌呤(G)进行配对(C-G配对)，然而经过重亚硫酸转换后，胞嘧啶转换成尿嘧啶(U)，尿嘧啶(U)与鸟嘌呤(G)形成了不互补的碱基配对(G-U 配对)，因此可使核酸模板产生变性而成单股。在一实施例中，重亚硫酸处理的转换率为60％以上。在一实施例中，重亚硫酸处理的转换率可为约70％至 100％，例如可为约75％、80％、85％、90％、95％等，但不以此为限。
在一实施例中，第一接合器为发夹型接合器，且在进行步骤(c)之前，可进一步对核酸模板进行扩增。在一实施例中，使用滚动循环扩增(Rolling circle amplification，RCA)对核酸模板进行扩增，以合成具有大量核酸模板序列的互补复制物。具体来说，第一接合器与第二接合器皆为发夹型接合器，因此经变性后的核酸模板为环状核酸分子(包括第一接合器序列、顺向股序列、第二接合器序列及反向股序列)，可使用此环状核酸分子作为滚动循环扩增的模板。在一实施例中，滚动循环扩增可合成至少2个核酸模板序列的核酸分子产物。
在一实施例中，使用至少一个互补引物进行滚动循环扩增。在一实施例中，互补引物与核酸模板的目标核苷酸序列互补。在一实施例中，互补引物与核酸模板的第一接合器及第二接合器中至少一者互补。在一实施例中，滚动循环扩增为多重引物滚动循环扩增。在本实施例中，使用本领域习知的方式进行滚动循环扩增，在此不再赘述。
在本实施例中，在足以对目标核苷酸序列进行PCR扩增的条件下，使用用于扩增的引物(即第一引物及第二引物)对上述核酸模板或互补复制物进行一个或多个聚合酶链反应(PCR)扩增循环。PCR扩增循环可按指数方式增加目标核苷酸序列的丰度。在一实施例中，所述方法包括至少2个或更多个PCR扩增循环，例如至少约5、10、15、20、25、30中的任一者或更多个反复的PCR扩增循环。在一实施例中，所述方法可包括约30个至50个PCR 扩增循环。每个PCR扩增循环包括以下步骤：1)股分离(例如热变性)；2) 将第一引物和第二引物粘合至核酸模板；以及3)经粘合的引物的DNA聚合酶延伸。本领域的技术人员可以设计出这些步骤中每个步骤所需的条件和时间。
在一实施例中，在以下示例性条件下进行PCR扩增循环。1)于95℃持续5分钟；2)接着进行10至25个循环，包括：在95℃下变性30秒，然后在56℃下粘合并在72℃下延伸1分钟；3)将完成的反应保持在4℃下。惟，本发明并不限于此，也可以使用其他适当的反应条件。
在一实施例中，在进行PCR扩增循环之后，可进一步纯化PCR扩增子。在一实施例中，可进一步对PCR扩增子进行分析，例如核酸测序、DNA微阵列分析(DNAmicroarrayanalysis)等，但本发明不限于此。在一实施例中，目标核苷酸序列的PCR扩增子可用于下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)。
在一实施例中，第一接合器包括与用于核酸测序的第一测序引物相同或互补的序列以及与用于核酸测序的第二测序引物相同或互补的序列。
在一实施例中，Y型的第一接合器的第一未配对股包括与用于核酸测序的第一测序引物相同或互补的序列，且第二未配对股包括与用于核酸测序的第二测序引物相同或互补的序列。
在一实施例中，发夹型的第一接合器的单股部分包括与用于进行测序的第一测序引物相同或互补的序列以及与用于进行测序的第二测序引物相同或互补的序列。
在一实施例中，经尿嘧啶-DNA糖基化酶与DNA糖基化酶-裂解酶核酸内切酶VIII(如USER酵素)酶切形成的第一股包括与用于进行测序的第一测序引物相同或互补的序列，且第二股包括与用于进行测序的第二测序引物相同或互补的序列。
在一实施例中，第一接合器为发夹型接合器，其中第一测序引物可特异性粘合至单股部分的靠近顺向股的区域，且第二测序引物可特异性粘合至单股部分的靠近反向股的区域。在一实施例中，单股部分的靠近顺向股的区域包括与第一测序引物相同或互补的序列，且单股部分的靠近反向股的区域包括与第二测序引物列相同或互补的序列。
在一实施例中，第一接合器为Y型接合器，其中第一测序引物特异性粘合至靠近顺向股的第一未配对股，且第二测序引物特异性粘合至靠近反向股的第二未配对股。
在一实施例中，第一接合器为发夹型接合器，其中单股部分的靠近顺向股的区域和/或第一引物可包含与第一测序引物的序列相同或互补的序列，且单股部分的靠近反向股的区域和/或第二引物可包含与第二测序引物的序列相同或互补的序列。
在一实施例中，第一接合器为Y型接合器，其中第一未配对股和/或第一引物可包含与第一测序引物的序列相同或互补的序列，且第二未配对股和/或第二引物可包含与第二测序引物的序列相同或互补的序列。
在一实施例中，第一引物包括与第一测序引物相同或互补的序列，第二引物包括与第二测序引物相同或互补的序列。在一实施例中，第一引物的5’端包括与第一测序引物相同或互补的序列，第二引物的5’端包括与第二测序引物相同或互补的序列。
在一实施例中，第一测序引物的测序方向与第二测序引物的测序方向相反。在一实施例中，第一测序引物及第二测序引物用于下一代测序。在一实施例中，第一测序引物及第二测序引物包含基于下一代测序技术的引物序列。
在一实施例中，第二接合器与第一测序引物及第二测序引物基本上不互补或基本上不相同。在一实施例中，第二接合器与第一引物、第二引物、第一测序引物及第二测序引物基本上不互补或基本上不相同。
在本实施例中，通过发夹型的第二接合器将目标核苷酸序列的互补两股 DNA(即顺向股及反向股)连接在一起并作为核酸模板，并使用位于第一接合器上的引物对核酸模板进行PCR扩增循环。因此，所得到的PCR扩增子的任一股皆具有顺向目标核苷酸序列、第二接合器序列、反向目标核苷酸序列以及位于两端的部分的第一接合器序列，其中第二接合器序列将顺向目标核苷酸序列及反向目标核苷酸序列连接在一起。由于PCR扩增子的任一股皆包含顺向目标核苷酸序列以及反向目标核苷酸序列，因此在后续进行核酸测序分析时，自任一端进行测序皆可得到互补两股DNA区域的序列，且可将得到的互补两股DNA区域的序列互相比对，借此可提高原本序列的准确度。此外，在本实施例中是将互补两股DNA连接在一起进行测序及分析，因此可以降低测序的成本。此外，本发明在目标核苷酸序列富集期间引入对核酸测序具有特异性的序列(例如在第一接合器上或第一引物及第二引物上的序列设计)，因此可通过上述设计来分辨测序得到的测序方向。
本发明亦提供一种确定目标核苷酸序列的方法，其包括以下步骤。首先，提供使用上述的扩增目标核苷酸序列的方法得到目标核苷酸序列的PCR扩增子。接着，对目标核苷酸序列的PCR扩增子进行核酸测序，借此得到目标核苷酸序列的序列信息。
在一实施例中，核酸测序为下一代测序。
在一实施例中，所述方法还包括在进行核酸测序之前，使用目标核苷酸序列的PCR扩增子制备测序DNA库。在一实施例中，所述方法包括对来自多个样本的目标核苷酸序列的PCR扩增子进行定量，并将目标核苷酸序列的 PCR扩增子合并在一起作为单个测序DNA库。在一实施例中，使目标核苷酸序列的PCR扩增子连接接合器，从而构建用于测序步骤的测序DNA库。在一实施例中，可将PCR扩增子进一步片段化。
本发明的上述方法可以用于多种应用，例如临床诊断或用作基因工程的工具，但本发明不限于此。在一实施例中，可使用上述方法来确定所关注基因座的目标核苷酸序列，并检测目标核苷酸序列中的序列变体。在一实施例中，序列变体为与疾病(例如遗传性疾病或癌症)相关的序列变体。
为了能彻底地了解本发明，将在以下详尽描述所述扩增目标核苷酸序列的步骤。然而，众所皆知的组成或制程步骤并未描述于细节中，以避免限制本发明。本发明的较佳实施例会详细描述如下，但本发明不限于此，本发明还可广泛地施行在其他的实施例中，且本发明的范围不受限定，以其后的专利范围为准。
图1为依照本发明的第一实施例的扩增目标核苷酸序列的方法的流程图。第一实施例的扩增目标核苷酸序列的方法包括以下步骤。
首先，进行步骤a)，将Y型的第一接合器101及发夹型的第二接合器102 分别连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子100的两端，以形成核酸模板10，其中目标核苷酸序列包含顺向股与反向股。Y型的第一接合器101具有未配对的Y5股105以及Y3股103。其中Y5股105与Y3股103可具有方向性，例如Y5股105可为Y型的第一接合器的5’端、Y3股103可为Y型的第一接合器的3’端，但不限于此。在本实施例中，核酸模板10为发夹型建构体(Hair-pin construct)。
接着，进行步骤b)，将核酸模板10进行变性反应，以将双股的核酸模板10解离成单股。在本实施例中，将核酸模板10进行变性反应例如是对核酸模板10进行重亚硫酸处理。
然后，进行步骤c)，使用位于第一接合器101的Y5股105上的第一引物106及位于第一接合器101的Y3股103上的第二引物104进行多次的PCR 扩增循环，以得到目标核苷酸序列的PCR扩增子20。在本实施例中，其中第一引物106包含特异性粘合至靠近顺向股的Y5股105的第一序列，第二引物104包含特异性粘合至靠近反向股的Y3股103的第二序列。在本实施例中，PCR扩增子20包含顺向目标核苷酸序列100a以及反向目标核苷酸序列 100b。
在本实施例中，第一引物106具有与可进行第一测序方向112的第一测序引物相同或互补的序列，及第二引物104具有与可进行第二测序方向114 的第二测序引物相同或互补的序列。
在本实施例中，可更进一步将PCR扩增子20进行核酸测序。在本实施例中，核酸测序例如是下一代测序。
在本实施例中，由于PCR扩增子20的任一股皆包含顺向目标核苷酸序列以及反向目标核苷酸序列，因此在进行核酸测序时，自任一端进行测序皆可得到顺向目标核苷酸序列以及反向目标核苷酸序列。此外，通过将得到的顺向目标核苷酸序列以及反向目标核苷酸序列互相比对，可提高还原原本序列的准确度。此外，在本实施例中是将互补两股DNA连接在一起进行测序及分析，因此可以降低测序的成本。
图2为依照本发明的第二实施例的扩增目标核苷酸序列的方法的流程图。下述实施例将沿用前述实施例的部分组件标号与部分内容，其中采用相同的标号来表示相同的组件，并且省略了相同技术内容的说明。第二实施例的扩增目标核苷酸序列的方法包括以下步骤。
首先，进行步骤a)，将发夹型的第一接合器101及发夹型的第二接合器 102分别连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子100的两端，以形成核酸模板10，其中目标核苷酸序列包含顺向股与反向股。在本实施例中，核酸模板10为圆型建构体(Circularconstruct)。在本实施例中，第一接合器101 的具有环结构的单股部分包括一个U碱基。
接着，进行步骤b)，通过尿嘧啶-DNA糖基化酶与DNA糖基化酶-裂解酶核酸内切酶VIII在具有环结构的单股部分的U碱基的位置处进行酶切，以形成两条单独的Y5股105以及Y3股103。在本步骤中，核酸模板10经酶切后形成发夹型建构体(Hair-pin construct)。
接着，进行步骤c)，将核酸模板10进行变性反应，以将双股的核酸模板 10解离成单股。在本实施例中，将核酸模板10进行变性反应例如是对核酸模板10进行重亚硫酸处理。
然后，进行步骤d)，使用位于第一接合器101的Y5股105上的第一引物106及位于第一接合器101的Y3股103上的第二引物104进行多次的PCR 扩增循环，以得到目标核苷酸序列的PCR扩增子20。在本实施例中，第一引物106具有与可进行第一测序方向112的第一测序引物相同或互补的序列，及第二引物104具有与可进行第二测序方向114的第二测序引物相同或互补的序列。在本实施例中，PCR扩增子20包含顺向目标核苷酸序列100a以及反向目标核苷酸序列100b。
在本实施例中，可更进一步将PCR扩增子20进行核酸测序。
图3为依照本发明的第三实施例的扩增目标核苷酸序列的方法的流程图。下述实施例将沿用前述实施例的部分组件标号与部分内容，其中采用相同的标号来表示相同的组件，并且省略了相同技术内容的说明。第三实施例的扩增目标核苷酸序列的方法包括以下步骤。
首先，进行步骤a)，将发夹型的第一接合器101及发夹型的第二接合器 102分别连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子100的两端，以形成核酸模板10，其中目标核苷酸序列包含顺向股与反向股。第一接合器101包括配对的双股部分以及未配对的单股部分。在本实施例中，核酸模板10为圆型建构体(Circular construct)。
接着，进行步骤b)，将核酸模板10进行变性反应，以将双股的核酸模板 10解离成单股环状分子。在本实施例中，将核酸模板10进行变性反应例如是对核酸模板10进行重亚硫酸处理。
然后，进行步骤c)，使用位于第一接合器101的靠近顺向股的区域上的第一引物106及位于第一接合器101的靠近反向股的区域上的的第二引物104 进行多次的PCR扩增循环，以得到目标核苷酸序列的PCR扩增子20。在本实施例中，其中第一引物106包含特异性粘合至单股部分的第一序列，第二引物104包含特异性粘合至单股部分的第二序列。在本实施例中，第一引物 106具有与可进行第一测序方向112的第一测序引物相同或互补的序列，及第二引物104具有与可进行第二测序方向114的第二测序引物相同或互补的序列。在本实施例中，PCR扩增子20包含顺向目标核苷酸序列100a以及反向目标核苷酸序列100b。
在本实施例中，可更进一步将PCR扩增子20进行核酸测序。
图4为依照本发明的第四实施例的扩增目标核苷酸序列的方法的流程图。下述实施例将沿用前述实施例的部分组件标号与部分内容，其中采用相同的标号来表示相同的组件，并且省略了相同技术内容的说明。第四实施例的扩增目标核苷酸序列的方法包括以下步骤。
首先，进行步骤a)，将发夹型的第一接合器101及发夹型的第二接合器 102分别连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子100的两端，以形成核酸模板10，其中目标核苷酸序列包含顺向股与反向股。在本实施例中，核酸模板10为圆型建构体(Circularconstruct)。
接着，进行步骤b)，将核酸模板10进行变性反应，以将双股的核酸模板 10解离成单股环状分子。在本实施例中，将核酸模板10进行变性反应例如是对核酸模板10进行重亚硫酸处理。
然后，进行步骤c)，使用位于目标核苷酸序列上的互补引物109对单股环状分子(核酸模板10)进行滚动循环扩增，以得到具有大量核酸模板序列的互补复制物110。在本实施例中，互补引物109是位于反向股上，但本发明不限于此。在另一实施例中，互补引物109是位于顺向股上。在本实施例中，互补反向股序列、互补第一接合器序列、互补顺向股序列及互补第二接合器序列会以此顺序重复存在互补复制物110中。
之后，进行步骤d)，使用位于互补第一接合器序列的靠近互补顺向股的区域上的第一引物106及位于互补第一接合器序列的靠近互补反向股的区域上的第二引物104进行多次的PCR扩增循环，以得到目标核苷酸序列的PCR 扩增子20。在本实施例中，其中第一引物106包含可特异性粘合至单股部分的第一序列，第二引物104包含可特异性粘合至单股部分的第二序列。在本实施例中，第一引物106具有与可进行第一测序方向112的第一测序引物相同或互补的序列，及第二引物104具有与可进行第二测序方向114的第二测序引物相同或互补的序列。在本实施例中，PCR扩增子20包含顺向目标核苷酸序列100a以及反向目标核苷酸序列100b。
在本实施例中，可更进一步将PCR扩增子20进行核酸测序。
图5为依照本发明的第四实施例的扩增目标核苷酸序列的方法的流程图。下述实施例将沿用前述实施例的部分组件标号与部分内容，其中采用相同的标号来表示相同的组件，并且省略了相同技术内容的说明。第五实施例的扩增目标核苷酸序列的方法包括以下步骤。
首先，进行步骤a)，将发夹型的第一接合器101及发夹型的第二接合器 102分别连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子100的两端，以形成核酸模板10，其中目标核苷酸序列包含顺向股与反向股。在本实施例中，核酸模板10为圆型建构体(Circularconstruct)。
接着，进行步骤b)，将核酸模板10进行变性反应，以将双股的核酸模板 10解离成单股环状分子。在本实施例中，将核酸模板10进行变性反应例如是对核酸模板10进行重亚硫酸处理。
然后，进行步骤c)，使用位于第一接合器101上的互补引物109对单股环状分子(核酸模板10)进行滚动循环扩增，以得到具有大量核酸模板序列的互补复制物110。在本实施例中，互补引物109是位于第一接合器101上，但本发明不限于此。在另一实施例中，互补引物109是位于第二接合器102 上。在本实施例中，互补第一接合器序列、互补顺向股序列、互补第二接合器序列及互补反向股序列会以此顺序重复存在互补复制物110中。
之后，进行步骤d)，使用位于互补第一接合器序列的靠近互补顺向股的区域上的第一引物106及位于互补第一接合器序列的靠近互补反向股的区域上的第二引物104进行多次的PCR扩增循环，以得到目标核苷酸序列的PCR 扩增子20。在本实施例中，其中第一引物106包含可特异性粘合至单股部分的第一序列，第二引物104包含可特异性粘合至单股部分的第二序列。在本实施例中，第一引物106具有与可进行第一测序方向112的第一测序引物相同或互补的序列，及第二引物104具有与可进行第二测序方向114的第二测序引物相同或互补的序列。在本实施例中，PCR扩增子20包含顺向目标核苷酸序列100a以及反向目标核苷酸序列100b。
在本实施例中，可更进一步将PCR扩增子20进行核酸测序。
以下，列举本发明的实验例以更具体证实本发明。然而，在不脱离本发明的精神，可适当地对以下的实验例中所示的材料、使用方法等进行变更。因此，本发明的范围不应以以下所示的实验例来限定解释。
实验例1：发夹型建构体的建构(Construction of Hair-pin construct)
图6显示发夹型建构体的示例性结构。在本实施例中，发夹型建构体包括三个部分：Y型建构体201、目标双股核酸分子202以及茎环(stem-loop) 建构体203，其中Y型建构体201来自Y型接合器，茎环建构体203来自发夹型接合器，且目标双股核酸分子203具有目标核苷酸序列。以下将详述此发夹型建构体的三个部分。
[Y型建构体的设计]
在本实施例中，Y型建构体201的茎部分(即配对的双股DNA部分)的长度为12bp，其包含2个具有6个碱基的限制酶切位(SacI及EcoRI)，即 gagctcgaattc(SEQ ID NO:1)。而Y型建构体201的未配对部分包括Y5股(5’端的未配对股)及Y3股(3’端的未配对股)，其各自长度为25bp。在本实施例中，Y5股及Y3股的序列对于人类基因组(human genome)而言为特定的序列(specific sequence)，且为适于PCR引物进行PCR的区域序列。
[茎环建构体的设计]
在本实施例中，茎环建构体203的茎部分(即配对的双股DNA部分)的长度为12bp，其包含2个具有6个碱基的限制酶切位(BamHI及XbaI)，即 ggatcctctaga(SEQ ID NO:2)。而茎环建构体203的环部分的长度为25bp。在本实施例中，茎环建构体203的环部分的序列对于人类基因组(human genome) 而言为特定的序列(specific sequence)，且为适于PCR引物进行PCR的区域序列。
[目标双股核酸分子的设计]
在本实施例中，目标双股核酸分子202的长度为100bp，其具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
[发夹型建构体的建构]
提供以下如表1的2个寡核苷酸(Oligo-186及Oligo-137)。
[表1]
Figure BDA0002864511100000191
寡核苷酸Oligo-186依序包含以下区域：Y5股、Y型建构体的茎部分(顺向)、目标双股核酸分子(顺向)、茎环建构体的茎部分(顺向)、Y型建构体的环部分及茎环建构体的茎部分(反向)。寡核苷酸Oligo-137依序包含以下区域：目标双股核酸分子(反向)、Y型建构体的茎部分(反向)以及Y3股。在本实施例中，iMe-dC代表经甲基化的胞嘧啶。寡核苷酸Oligo-186及寡核苷酸Oligo-137是由每得科技有限公司(Medclub Scientific Co.Ltd.,Taiwan，China)所合成。
将寡核苷酸Oligo-186及寡核苷酸Oligo-137进行粘合(annealing)反应。将10μL的寡核苷酸Oligo-137、10μL的寡核苷酸Oligo-186、3μL的10X T4 连接酶缓冲液(NewEngland Biolabs；NEB)以及7μL的双蒸水(ddH2O)混合，以得到总体积30μL的粘合混合溶液(如表2)。使粘合混合溶液在95℃下变性(denatured)5分钟。接着，在室温(约25℃)下缓慢降温，以进行粘合反应。
[表2]
Figure BDA0002864511100000201
将上述粘合混合溶液(30μL)加入2μL的10X T4连接酶缓冲液、2.5μL 的T4连接酶(New England Biolabs；NEB)及15.5μL的ddH2O，以得到总体积50μL的接合(ligation)混合溶液(如表3)。将接合混合溶液在室温(约 25℃)下进行接合反应30分钟，以形成作为核酸模板的发夹型建构体。至此，可得到如图1步骤a)以及图6的结构。
[表3]
Figure BDA0002864511100000202
Figure BDA0002864511100000211
实验例2：对发夹型建构体进行重亚硫酸处理
在本实施例中，使用凯杰生物科技有限公司(QIAGEN Taiwan Company Ltd，China)的EpiTect Fast Bisulfite Kit(10)(QIAGEN Cat No./ID:59802)对实验例1的发夹型建构体进行重亚硫酸处理。具体来说，将10μL的接合混合溶液(含19.9912ng的DNA)、10μL的无核酸酶水(RNase-free water)、 85μL的重亚硫酸溶液(Bisulfite Solution)以及10μL的DNA保护缓冲液 (DNA protect buffer)，以得到总体积140μL的重亚硫酸转化(Bisulfite conversion)溶液(如表4)。
[表4]
重亚硫酸转化溶液成份 体积(μL)
接合混合溶液 10
无核酸酶水 30
重亚硫酸溶液 85
DNA保护缓冲液 15
总体积 140
将上述重亚硫酸转化溶液在95℃下变性5分钟，接着在60℃下进行重亚硫酸转化反应10分钟。然后，在95℃下变性5分钟，接着在60℃下进行重亚硫酸转化反应10分钟。之后，将反应后的重亚硫酸转化溶液置于20℃下待用。至此，可得到如图1步骤b)的结构。
实验例3：侦测经重亚硫酸转化后的发夹型建构体的甲基化的模拟
[经重亚硫酸转化后的发夹型建构体的PCR反应]
在本实施例中，使用引物F(具有SEQ ID NO:6的核苷酸序列)及引物 R(具有SEQID NO:7的核苷酸序列)对经重亚硫酸转化后的发夹型建构体 (以下称为BS DNA)进行PCR反应，以得到目标核苷酸序列的PCR扩增子。引物F及引物R的序列如表5所示。所得到PCR扩增子的长度为320bp。
[表5]
名称 序列 序列识别号
引物F ATGAGAAAGAAAGAGTAGGCACAGA SEQ ID NO:6
引物R TATAGCCTTTGGCCAATTTTGGAAG SEQ ID NO:7
PCR反应溶液的各成分如以下表6所示。
PCR反应溶液成份 体积(μL)
BS DNA 3
KAPA PCR 2X试剂 25
引物F(100μM) 0.25
引物R(100μM) 0.25
ddH<sub>2</sub>O 21.5
总体积 50
将PCR反应溶液以下程序进行PCR反应：(1)在95℃下10分钟；(2)进行如下的40个循环[在95℃下20秒；在56℃下30秒；在72℃下40秒]； (2)在72℃下7分钟。
[以计算机仿真硅中重亚硫酸转化(in silico Bisulfite-conversion)及其序列比对]
在本实施例中，实验例1中所设计的发夹型建构体自Y5股开始进行测序可具有SEQID NO:8的核苷酸序列。而在实验例2中硅中重亚硫酸转化的发夹型建构体自Y5股开始进行测序可具有SEQ ID NO:9的核苷酸序列。
图7显示SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:9的核苷酸序列比对。如图7所示，所设计的发夹型建构体(SEQ ID NO:8)具有11个甲基化的胞嘧啶(▲标示处)，其中3个在目标核酸分子区域中，8个在引物区域(Y5股及Y3股)，而可以被重亚硫酸转化的胞嘧啶(即原本没有甲基化的胞嘧啶)共有71处。硅中重亚硫酸转化的发夹型建构体的序列(SEQ ID NO:9)则是模拟将序列中的没有甲基化的胞嘧啶(C)全部转换成尿嘧啶(U)/胸腺嘧啶(T)。
[亚硫酸转化率(BS-conversion rate)分析]
利用亚硫酸盐测序(Bisulfite sequencing)方法侦测甲基化原则上是将没有甲基化的胞嘧啶(C)全部转换成尿嘧啶(U)/胸腺嘧啶(T)，而有甲基化的胞嘧啶(C)则维持不变，进而分辨序列中胞嘧啶(C)的甲基化情况。因此，将全部的「原本没有甲基化的胞嘧啶(C)」转化成「尿嘧啶(U)/胸腺嘧啶(T)」是一个重要的步骤。
在本实施例中所用的估计方法是先将个别所得到的测序结果(序列)的「原本没有甲基化的C的位置」标示出来，然后计算其转换(C->T或C->C) 的比例。在本实施例中，用来比对的序列是以「双边测序(paired-end sequencing)」的方式整理。具体来说，自Y5股及Y3股对上述PCR扩增子进行顺向测序(forward sequencing)及反向测序(backwardsequencing)，并利用顺向序列与反向序列进行比对；或将反向序列转换成反向互补序列(reverse complementary sequence)后再与顺向序列进行比对。在本实施例中，将反向测序(使用反向引物进行测序)后的PCR扩增子的反向互补序列(SEQ ID NO:10)、所设计的发夹型建构体的序列(SEQ ID NO:8)及硅中重亚硫酸转化的发夹型建构体的序列(SEQ IDNO:9)进行比对，即可计算出亚硫酸转化率。
图8显示SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10的核苷酸序列比对。图8中的箭头处为甲基化的C的位置。表7显示计算后的顺向序列及反向互补序列(SEQ ID NO:10)的亚硫酸转化率。由表7的结果可知，顺向序列及反向互补序列的亚硫酸转化率皆为100％。
[表7]
Figure BDA0002864511100000231
Figure BDA0002864511100000241
[利用互补双边测序方式分析DNA甲基化的位置]
在本实施例中，利用以下的步骤来分析DNA甲基化的位置：
(1)将所设计的发夹型建构体的顺向序列(SEQ ID NO:8)与其反向互补序列(SEQID NO:11)进行序列比对；
(2)将硅中重亚硫酸转化的发夹型建构体的顺向序列(SEQ ID NO:9)与其反向互补序列(SEQ ID NO:12)进行序列比对；
(3)利用「互补双边测序」方式分析DNA甲基化的规则；
(4)利用上述规则来分析测序后PCR扩增子的序列，以回复原来的DNA 序列以及确定甲基化的C的位置。
[发夹型建构体的顺向序列与其反向互补序列的序列比对]
图9显示所设计的发夹型建构体的顺向序列与其反向互补序列的序列比对。在图9中，发夹型建构体的顺向序列(SEQ ID NO:8)代表「自Y5股开始进行的测序」，发夹型建构体的反向互补序列(SEQ ID NO:11)代表「自 Y3股开始进行的测序」。由图9可以看出，双股的DNA区域的序列(目标双股核酸分子以及茎区域)是相同的，单股的Y3股与单股的Y5股的DNA区域的序列是不相同的，其中单股的Y3股标示「自Y3股开始进行的测序」得到的序列，单股的Y5股标示「自Y5股开始进行的测序」得到的序列。
[硅中重亚硫酸转化的发夹型建构体的顺向序列与其反向互补序列的序列比对]
图10显示硅中重亚硫酸转化的发夹型建构体的顺向序列与其反向互补序列的序列比对。在图10中，硅中重亚硫酸转化的发夹型建构体的顺向序列 (SEQ ID NO:9)代表「自Y5股开始进行的测序」，硅中重亚硫酸转化的发夹型建构体的的反向互补序列(SEQ ID NO:12)代表「自Y3股开始进行的测序」。由图10可以看出，在双股的DNA区域的序列(目标双股核酸分子以及茎区域)中，有经过重亚硫酸转化的位置上的碱基是不相同的，单股的Y3 股与单股的Y5股的DNA区域的序列是不相同的，其中单股的Y3股标示「自 Y3股开始进行的测序」得到的序列，单股的Y5股标示「自Y5股开始进行的测序」得到的序列。
[利用「互补双边测序」方式分析DNA甲基化的规则]
经由图10中的序列比对数据，可以得到DNA甲基化分析的规则。图11 显示分析DNA甲基化的规则。图11的(a)表示序列中的C是经甲基化，因此属于不被重亚硫酸转化的碱基。因此无论经由Y5顺向引物或Y3反向引物进行测序，皆可得到5’-A-T-C-G-3’的序列。而图11的(b)表示序列中的C是未经甲基化，属于会被重亚硫酸转化的碱基。因此在经过重亚硫酸转化后，经由Y5顺向引物及Y3反向引物进行测序，会得到特定的碱基配对(即C-T及 G-A)。
[利用上述规则来分析测序后PCR扩增子的序列，以回复原来的DNA序列以及确定甲基化的C的位置]
将硅中重亚硫酸转化的发夹型建构体的顺向序列(SEQ ID NO:9)、硅中重亚硫酸转化的发夹型建构体的的反向互补序列(SEQ ID NO:12)、将顺向测序后的PCR扩增子的顺向序列(SEQ ID NO:13)及反向测序后的PCR扩增子的反向序列(SEQ ID NO:14)进行序列比对。图12显示SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14的序列比对。
通过上述分析DNA甲基化的规则，若在各个比对序列的各个碱基上具有特定的碱基配对(即C-T及G-A)的情形，则可依照规则回复到原始DNA 序列。而在各个比对序列的对应位置的碱基皆为一致，表示原始的DNA上的对应位置即为此一致的碱基。举例来说，若4条序列的对应位置的碱基皆为 A，则表示原始DNA的此对应位置的碱基则为A。因此，通过上述规则便可确定在发夹型建构体的目标核酸分子区域的甲基化的位置，即图12的方框表示的位置，共具有3个经甲基化的胞嘧啶。
综上所述，由于使用本发明扩增目标核苷酸序列的方法所得到的PCR 扩增子的任一股皆包含顺向目标核苷酸序列以及反向目标核苷酸序列，因此在进行核酸测序时，自任一端进行测序皆可得到顺向目标核苷酸序列以及反向目标核苷酸序列。此外，通过将得到的顺向目标核苷酸序列以及反向目标核苷酸序列互相比对，可提高还原原本序列的准确度。此外，在本实施例中是将互补两股DNA连接在一起进行测序及分析，因此可以降低测序的成本。
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与润饰，故本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。
【序列表】
<110> 财团法人工业技术研究院
<120> 扩增和确定目标核苷酸序列的方法
<130> 095379-CN-PA
<150> US 62/954,673
<151> 2019-12-30
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 限制酶切位
<400> 1
gagctcgaat tc 12
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 限制酶切位
<400> 2
ggatcctcta ga 12
<210> 3
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目标核酸分子序列
<400> 3
aaggtactcg tgctgtatct acaactgagg gagctgggtg ctgacacccc aaaaggccgc 60
acttttcccc ttaagagagt aaacttgttt cgaaggcaga 100
<210> 4
<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸Oligo-186序列
<400> 4
agatgagaaa gaaagagtag gcacagagct cgaattcaag gtactcgtgc tgtatctaca 60
actgagggag ctgggtgctg acaccccaaa aggccgcact tttcccctta agagagtaaa 120
cttgtttcga aggcagagga tcctctagag tctctcgcgc ccccttgcct catctctaga 180
ggatcc 186
<210> 5
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸Oligo-137序列
<400> 5
tctgccttcg aaacaagttt actctcttaa ggggaaaagt gcggcctttt ggggtgtcag 60
cacccagctc cctcagttgt agatacagca cgagtacctt gaattcgagc tcttccaaaa 120
ttggccaaag gctatag 137
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 6
atgagaaaga aagagtaggc acaga 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 7
tatagccttt ggccaatttt ggaag 25
<210> 8
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的法夹型建构体的顺向序列
<400> 8
agatgagaaa gaaagagtag gcacagagct cgaattcaag gtactcgtgc tgtatctaca 60
actgagggag ctgggtgctg acaccccaaa aggccgcact tttcccctta agagagtaaa 120
cttgtttcga aggcagagga tcctctagag tctctcgcgc ccccttgcct catctctaga 180
ggatcctctg ccttcgaaac aagtttactc tcttaagggg aaaagtgcgg ccttttgggg 240
tgtcagcacc cagctccctc agttgtagat acagcacgag taccttgaat tcgagctctt 300
ccaaaattgg ccaaaggcta tag 323
<210> 9
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 硅中重亚硫酸转化的法夹型建构体的顺向序列
<400> 9
agatgagaaa gaaagagtag gcacagagtt tgaatttaag gtattcgtgt tgtatttata 60
attgagggag ttgggtgttg atattttaaa aggtcgtatt ttttttttta agagagtaaa 120
tttgtttcga aggtagagga ttttttagag ttttttgtgt ttttttgttt tatttttaga 180
ggattttttg tttttgaaat aagtttattt ttttaagggg aaaagtgtgg ttttttgggg 240
tgttagtatt tagttttttt agttgtagat atagtatgag tattttgaat ttgagttctt 300
ccaaaattgg ccaaaggcta tag 323
<210> 10
<211> 296
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR扩增子的反向互补序列
<400> 10
tttttagaaa ggaagagtag gccccgagtt tgaatttaag gtattcgtgt tgtatttata 60
attgagggag ttgggtgttg atattttaaa aggtcgtatt ttttttttta agagagtaaa 120
tttgtttcga aggtagagga ttttttagag ttttttgtgt ttttttgttt tatttttaga 180
ggattttttg tttttgaaat aagtttattt ttttaagggg aaaagtgtgg ttttttgggg 240
tgttagtatt tagttttttt agttgtagat atagtatgag tatttgaatt tgctgt 296
<210> 11
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的法夹型建构体的反向互补序列
<400> 11
ctatagcctt tggccaattt tggaagagct cgaattcaag gtactcgtgc tgtatctaca 60
actgagggag ctgggtgctg acaccccaaa aggccgcact tttcccctta agagagtaaa 120
cttgtttcga aggcagagga tcctctagag atgaggcaag ggggcgcgag agactctaga 180
ggatcctctg ccttcgaaac aagtttactc tcttaagggg aaaagtgcgg ccttttgggg 240
tgtcagcacc cagctccctc agttgtagat acagcacgag taccttgaat tcgagctctg 300
tgcctactct ttctttctca tct 323
<210> 12
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 硅中重亚硫酸转化的法夹型建构体的反向互补序列
<400> 12
ctatagcctt tggccaattt tggaagaact caaattcaaa atactcatac tatatctaca 60
actaaaaaaa ctaaatacta acaccccaaa aaaccacact tttcccctta aaaaaataaa 120
cttatttcaa aaacaaaaaa tcctctaaaa ataaaacaaa aaaacacaaa aaactctaaa 180
aaatcctcta ccttcgaaac aaatttactc tcttaaaaaa aaaaatacga ccttttaaaa 240
tatcaacacc caactccctc aattataaat acaacacgaa taccttaaat tcaaactctg 300
tgcctactct ttctttctca tct 323
<210> 13
<211> 299
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR扩增子的顺向序列
<400> 13
gagggcttga tttaggtatt cgtgttgtat ttataattga gggagttggg tgttgatatt 60
ttaaaaggtc gtattttttt ttttaaaaaa gtaaatttgt ttcgaaggta aaggattttt 120
taaagttttt tgtgtttttt tgttttattt ttaaaggatt ttttgttttt gaaataattt 180
tattttttta agggaaaaag gggggttttt gggggggtta gtatttattt tttttagttg 240
aaaatataga atgagtattt tgaatttgat ttcttccaaa attggccaaa ggctaaaaa 299
<210> 14
<211> 296
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR扩增子的反向序列
<400> 14
acagcaaatt caaatactca tactatatct acaactaaaa aaactaaata ctaacacccc 60
aaaaaaccac acttttcccc ttaaaaaaat aaacttattt caaaaacaaa aaatcctcta 120
aaaataaaac aaaaaaacac aaaaaactct aaaaaatcct ctaccttcga aacaaattta 180
ctctcttaaa aaaaaaaata cgacctttta aaatatcaac acccaactcc ctcaattata 240
aatacaacac gaatacctta aattcaaact cggggcctac tcttcctttc taaaaa 296

Claims (20)

1.一种扩增目标核苷酸序列的方法，包括以下步骤：
(a)将第一接合器及第二接合器分别连接至具有目标核苷酸序列的双股核酸分子的两端，以形成核酸模板，其中所述目标核苷酸序列包含顺向股与反向股，所述第一接合器包括Y型接合器或发夹型接合器，且所述第二接合器为发夹型接合器；
(b)将所述核酸模板进行变性反应；
(c)对所述目标核苷酸序列进行聚合酶链反应扩增，使第一引物、第二引物、DNA聚合酶与所述核酸模板接触，其中所述第一引物包含特异性粘合至靠近所述顺向股的所述第一接合器的第一序列，所述第二引物包含特异性粘合至靠近所述反向股的所述第一接合器的第二序列；以及
(d)重复步骤(c)，进行一个或多个聚合酶链反应扩增循环，以得到所述目标核苷酸序列的聚合酶链反应扩增子。
2.根据权利要求1所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中将所述核酸模板进行所述变性反应包括对所述核酸模板进行重亚硫酸处理。
3.根据权利要求2所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中所述重亚硫酸处理的转换率为60％以上。
4.根据权利要求1所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中所述第一接合器为发夹型接合器，所述第一接合器包括配对的双股部分以及未配对的单股部分，
且其中所述单股部分包括与所述第一序列相同或互补的序列以及与所述第二序列相同或互补的序列。
5.根据权利要求1所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中所述第一接合器为Y型接合器，所述第一接合器包括配对的双股部分以及未配对的单股部分，且其中所述单股部分包括第一未配对股及第二未配对股，
又其中所述第一未配对股包括与所述第一序列互补的序列，且所述第二未配对股包括与所述第二序列互补的序列。
6.根据权利要求1所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中所述第一接合器为发夹型接合器，所述第一接合器包括配对的双股部分以及未配对的单股部分，其中所述单股部分包括至少一个U碱基，
其中在进行步骤(b)之前，以尿嘧啶-DNA糖基化酶与DNA糖基化酶-裂解酶核酸内切酶VIII在所述U碱基的位置处对所述单股部分进行酶切，以形成第一股及第二股，其中所述第一股包括与所述第一序列互补的序列，且所述第二股包括与所述第二序列互补的序列。
7.根据权利要求1所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中所述第一接合器为发夹型接合器，所述第一接合器包括配对的双股部分以及未配对的单股部分，
其中所述单股部分包括与所述第一序列互补的序列以及与所述第二序列互补的序列，
且在进行步骤(c)之前，还包括对所述核酸模板进行扩增。
8.根据权利要求7所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中所述扩增为滚动循环扩增。
9.根据权利要求8所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中所述滚动循环扩增为多重引物滚动循环扩增。
10.根据权利要求8所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中所述滚动循环扩增使用至少一个互补引物，其中所述互补引物与所述目标核苷酸序列互补。
11.根据权利要求8所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中所述滚动循环扩增使用至少一个互补引物，其中所述互补引物与所述第一接合器及所述第二接合器中至少一者互补。
12.根据权利要求1所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中所述目标核苷酸序列的所述聚合酶链反应扩增子用于核酸测序，
又其中所述第一接合器包括与用于所述核酸测序的第一测序引物相同或互补的序列以及与用于所述核酸测序的第二测序引物相同或互补的序列，或者
所述第一引物包括与所述第一测序引物相同或互补的序列，且所述第二引物包括与所述第二测序引物相同或互补的序列。
13.根据权利要求4所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中所述目标核苷酸序列的所述聚合酶链反应扩增子用于核酸测序，
又其中所述第一接合器的所述单股部分包括与用于所述核酸测序的第一测序引物相同或互补的序列以及与用于所述核酸测序的第二测序引物相同或互补的序列，或者
所述第一引物包括与所述第一测序引物相同或互补的序列，且所述第二引物包括与所述第二测序引物相同或互补的序列。
14.根据权利要求5所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中所述目标核苷酸序列的所述聚合酶链反应扩增子用于核酸测序，
又其中所述第一未配对股包括与用于所述核酸测序的第一测序引物相同或互补的序列，且所述第二未配对股包括与用于所述核酸测序的第二测序引物相同或互补的序列，或者
所述第一引物包括与所述第一测序引物相同或互补的序列，且所述第二引物包括与所述第二测序引物相同或互补的序列。
15.根据权利要求6所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中所述目标核苷酸序列的所述聚合酶链反应扩增子用于核酸测序，
又其中所述第一股包括与用于所述核酸测序的第一测序引物相同或互补的序列，且所述第二股包括与用于所述核酸测序的第二测序引物相同或互补的序列，或者
所述第一引物包括与所述第一测序引物相同或互补的序列，且所述第二引物包括与所述第二测序引物相同或互补的序列。
16.根据权利要求7所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中所述目标核苷酸序列的所述聚合酶链反应扩增子用于核酸测序，
又其中所述第一接合器的所述单股部分包括与用于所述核酸测序的第一测序引物相同或互补的序列以及与用于所述核酸测序的第二测序引物相同或互补的序列，或者
所述第一引物包括与所述第一测序引物相同或互补的序列，且所述第二引物包括与所述第二测序引物相同或互补的序列。
17.根据权利要求1所述的扩增目标核苷酸序列的方法，其中所述第一接合器包含核酸标记物或条码。
18.一种确定目标核苷酸序列的方法，包括：
提供使用如权利要求1到17中任一项所述的扩增目标核苷酸序列的方法得到所述目标核苷酸序列的所述聚合酶链反应扩增子；
对所述目标核苷酸序列的所述聚合酶链反应扩增子进行核酸测序，以得到所述目标核苷酸序列的序列信息。
19.根据权利要求18所述的确定目标核苷酸序列的方法，还包括在进行所述核酸测序之前，使用所述目标核苷酸序列的所述聚合酶链反应扩增子制备测序DNA库。
20.根据权利要求18所述的确定目标核苷酸序列的方法，其中所述核酸测序为下一代测序。
CN202011576931.8A 2019-12-30 2020-12-28 扩增和确定目标核苷酸序列的方法 Pending CN113122616A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962954673P 2019-12-30 2019-12-30
US62/954,673 2019-12-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113122616A true CN113122616A (zh) 2021-07-16

Family

ID=74673000

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011576931.8A Pending CN113122616A (zh) 2019-12-30 2020-12-28 扩增和确定目标核苷酸序列的方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11920190B2 (zh)
EP (1) EP3845667A1 (zh)
JP (1) JP7104770B2 (zh)
CN (1) CN113122616A (zh)
TW (1) TWI771847B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2021319150A1 (en) 2020-07-30 2023-03-02 Cambridge Epigenetix Limited Compositions and methods for nucleic acid analysis

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106103743A (zh) * 2014-01-07 2016-11-09 Imppc私人基金会 用于产生双链dna文库的方法和用于鉴定甲基化胞嘧啶的测序方法
CN106192019A (zh) * 2015-05-29 2016-12-07 分子克隆研究室有限公司 用于制备测序文库的组合物和方法
WO2018104908A2 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 Boreal Genomics, Inc. Linked ligation
WO2019183640A1 (en) * 2018-03-23 2019-09-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Efficient sequencing of dsdna with extremely low level of errors
WO2019209946A1 (en) * 2018-04-25 2019-10-31 Qiagen Sciences Llc Sequential paired-end sequencing

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11111514B2 (en) 2008-09-05 2021-09-07 Washington University Method for multiplexed nucleic acid patch polymerase chain reaction
US8486630B2 (en) 2008-11-07 2013-07-16 Industrial Technology Research Institute Methods for accurate sequence data and modified base position determination
US9476095B2 (en) 2011-04-15 2016-10-25 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
US9909173B2 (en) 2013-02-08 2018-03-06 Cornell University Biomolecular processing platform and uses thereof
US11661597B2 (en) 2015-04-15 2023-05-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Robust quantification of single molecules in next-generation sequencing using non-random combinatorial oligonucleotide barcodes
US10385387B2 (en) 2015-04-20 2019-08-20 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods for selectively amplifying and tagging nucleic acids
US11046999B2 (en) 2015-09-16 2021-06-29 PetaOmics, Inc. Methods and compositions for genomic target enrichment and selective DNA sequencing
EP3545106B1 (en) 2017-08-01 2022-01-19 Helitec Limited Methods of enriching and determining target nucleotide sequences
GB2619466B (en) * 2019-08-16 2024-06-12 Univ Hong Kong Chinese Determination of base modifications of nucleic acids

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106103743A (zh) * 2014-01-07 2016-11-09 Imppc私人基金会 用于产生双链dna文库的方法和用于鉴定甲基化胞嘧啶的测序方法
CN106192019A (zh) * 2015-05-29 2016-12-07 分子克隆研究室有限公司 用于制备测序文库的组合物和方法
WO2018104908A2 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 Boreal Genomics, Inc. Linked ligation
WO2019183640A1 (en) * 2018-03-23 2019-09-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Efficient sequencing of dsdna with extremely low level of errors
WO2019209946A1 (en) * 2018-04-25 2019-10-31 Qiagen Sciences Llc Sequential paired-end sequencing

Also Published As

Publication number Publication date
EP3845667A1 (en) 2021-07-07
US11920190B2 (en) 2024-03-05
TWI771847B (zh) 2022-07-21
JP7104770B2 (ja) 2022-07-21
JP2021108659A (ja) 2021-08-02
US20210214780A1 (en) 2021-07-15
TW202124727A (zh) 2021-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110734908B (zh) 高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒
US20220033901A1 (en) Universal sanger sequencing from next-gen sequencing amplicons
CN110036117B (zh) 通过多联短dna片段增加单分子测序的处理量的方法
US11339431B2 (en) Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides
CN109844137B (zh) 用于鉴定嵌合产物的条形码化环状文库构建
CN110546272B (zh) 将衔接子附接至样品核酸的方法
CN111936635B (zh) 用于单分子测序的单链环状dna模板的产生
CA2468754A1 (en) Annealing control primer and its uses
US20210180050A1 (en) Methods and Compositions for Enrichment of Target Polynucleotides
JP7539770B2 (ja) ゲノム再編成検出のための配列決定方法
CN110603326B (zh) 扩增靶核酸的方法
CN111801427B (zh) 用于单分子的单链环状dna模板的产生
US20240117343A1 (en) Methods and compositions for preparing nucleic acid sequencing libraries
EP3491147B1 (en) Methods for removal of adaptor dimers from nucleic acid sequencing preparations
CN113122616A (zh) 扩增和确定目标核苷酸序列的方法
CN107406891B (zh) Pcr方法
JP2022535029A (ja) 標的遺伝子領域の柔軟かつハイスループット配列決定
WO2022144003A1 (zh) 一种用于高通量靶向测序的多重pcr文库构建方法
JPWO2021163546A5 (zh)
KR20220122095A (ko) 분자 바코딩 효율을 향상시키기 위한 조성물 및 이의 용도
CN111373042A (zh) 用于选择性扩增核酸的寡核苷酸
CN117568447A (zh) 一种构建多重pcr靶向测序文库的方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination