CN110603326B - 扩增靶核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了扩增靶核酸的方法和用于所述方法的试剂盒，其中所述方法包括：(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：(i)包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品，(ii)多个引物对，其中每种类型引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每个引物对具有至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团，(iii)核酸聚合酶，和(iv)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过使用所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；和(b)在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物。本公开还提供了对靶核酸进行测序的方法和用于所述方法的试剂盒。

Description

扩增靶核酸的方法
背景技术
无论是新生的人遗传突变还是体细胞的人遗传突变，它们都是了解人类遗传疾病(Ku,C.S.et al,A new era in the discovery of de novo mutations underlyinghuman genetic disease,Hum Genomics 6,27,2012)、癌症生物学(Helleday,T.et al,Mechanisms underlying mutational signatures in human cancers,Nat Rev Genet15,585-598,2014)和潜在的抗癌疗法的重要信息。长期以来已知新生突变会导致遗传性疾病，并且它还在罕见和常见形式的神经发育疾病(包括智力残疾、自闭症和精神分裂症)中发挥重要作用(Veltman,J.A.et al,De novo mutations in human genetic disease,NatRev Genet 13,565-575,2012)。癌症基因组中的体细胞突变已经得到了广泛的研究并且被认为在了解癌症的起源、风险和发现用于治疗用途的潜在生物标志物方面具有关键作用。检测这些基因突变对于疾病的诊断和患者的治疗至关重要。
由于基因组测序技术的局限性，过去对人类基因组中新生突变或体细胞突变的研究非常困难。然而，高通量下一代测序(NGS)技术的发展极大地促进了对这种突变的研究。现在可以在亲代和后代核心家族上进行全基因组测序(WGS)和全外显子组测序(WES)，以分别识别整个基因组中的或蛋白质编码区内的新生点突变。
WGS和WES是用于遗传突变研究的很好的工具，但它们对于常规的临床使用来说仍然成本过高。在某些情况下，如果已知只有一组遗传突变与某些疾病或特定的药物反应相关，那么对这些基因进行遗传分析会比较高效且有成本效益。为了对一组基因(panel ofgenes)进行有限的重新测序，需要在进行NGS之前捕获这些基因。捕获过程可以使用杂交或扩增子方法实现。对于杂交捕获方法，首先gDNA被物理片段化或酶促消化，然后合成的寡核苷酸被杂交至溶液中的目标区域以捕获预期的序列。基于扩增子的方法则是通过PCR引物扩增直接捕获预期区域。杂交捕获方法可以规模化至大量的基因，但杂交步骤通常需要过夜进行，整个过程需要多天。它还需要至少1至2μg的gDNA材料输入。基于扩增子的方法花费的时间较少，而且仅需要10至50ng的gDNA输入，因此它适合在来自临床样本的DNA输入量有限的情况下进行。然而，多重PCR引物也会产生非特异性扩增产物，尤其是当PCR引物数量增加时更是如此。事实上，当引物数接近数百时，大多数PCR产物为非特异性扩增子。因此，基于扩增子的方法通常使用酶消化步骤来减少非特异性扩增产物，然后进行额外的连接步骤或使用多个清洁步骤以减少那些非特异性产物。那些非特异性扩增产物不仅在测序文库生成期间需要多个步骤，而且还会引入测序数据错误。
最近，对低频突变的检测在基础和临床研究中具有重要的应用，因此它已经成为了一个快速发展的感兴趣的领域。一种罕见的突变，来自人血浆的循环无细胞DNA(cfDNA)，被用于产前筛选(Chiu,R.W.et al,Noninvasive prenatal diagnosis empowered byhigh-throughput sequencing,Prenat Diagn 32,401-406,2012)，而循环肿瘤DNA(ctDNA)已被证实含有癌细胞的标志性突变。ctDNA有可能成为一种新型的非侵入性生物标志物，其促进在手术可治愈阶段的早期癌症检测，减少重复组织活检的必要性，并检测疾病的早期复发，从而能提高靶向治疗的功效。对于通常在晚期检测到的癌症(包括肺癌、胰腺癌和卵巢癌等)，具有高灵敏度的ctDNA检测可用作重要的筛选试验，用于在较早期的潜在可治愈阶段检测典型的(typically)末期转移期癌症。通过对患者血液进行连续的ctDNA监测，ctDNA的组成和量的变化可被用于实时监测癌症的进展，提高患者的安全性并避免与重复的组织活检相关的费用。
遗憾的是，ctDNA的检测依然困难重重，因为它的存在量(尤其是在早期癌症患者中的存在量)相对较低。到目前为止，已经开发出了几种可用于检测ctDNA的可用技术，包括BEAMing、数字PCR和下一代测序法。所有这些方法都可以通过逐个评估单个分子来检测低频突变。NGS优于传统方法的地方在于可以以自动的方式容易地获得大量的测序信息。然而，NGS通常不能用来检测罕见突变，因为其具有高错误率，这个高的错误率与NGS文库的生成和测序过程有关。这些错误中的一些可能是由引入的突变引起的，这些突变的引入可发生在模板制备期间、文库制备所需的预扩增步骤期间以及进一步在仪器自身上进行的固相扩增期间。其他错误可归因于测序期间的碱基错误掺入和碱基识别(base-calling)错误。
因此，仍然持续需要一种能消除多重PCR反应期间的非特异性扩增产物的新方法，从而能直接产生测序文库而无需额外的消化和连接步骤，以及一种能降低错误率的新方法，使得可以通过使用当前的NGS仪器可靠地检测罕见突变。
发明内容
本发明的一个方面提供了扩增靶核酸的方法，其中所述方法包括：(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：(i)包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品，(ii)至少20种不同类型的引物对，其中每种类型引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每个引物对具有至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团，(iii)核酸聚合酶，和(iv)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；和(b)在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物。
在一些实施方案中，所述封闭基团位于每个封闭引物的3'末端处或其附近。在一些实施方案中，所述封闭基团是2',3'-双脱氧核苷酸、核糖核苷酸残基、2',3'SH核苷酸或2'-O-PO3核苷酸。
在一些实施方案中，所述封闭引物与所述靶核酸的一部分互补。在一些实施方案中，所述封闭引物被进一步修饰以减少不需要的核酸的扩增。在一些实施方案中，所述修饰是在所述引物中引入至少一个错配的核苷酸。在一些实施方案中，所述错配的核苷酸与具有所述封闭基团的核苷酸相距2-18bp。在一些实施方案中，其中所述错配的核苷酸与具有所述封闭基团的核苷酸相距3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17bp。在一些实施方案中，所述错配的核苷酸碱基位于具有所述封闭基团的核苷酸的5'侧。在一些实施方案中，所述修饰是这样的修饰：其用以减小所述封闭引物和所述不需要的核酸之间的Tm。在一些实施方案中，所述修饰是这样的修饰：其用以提升所述封闭引物和所述靶核酸之间的Tm。在一些实施方案中，其中所述修饰是这样的修饰：其用以形成额外桥，所述额外桥连接所述封闭引物的至少一个核苷酸的2'氧和4'碳。
在一些实施方案中，在任何两个引物之间存在不超过20个互补的核苷酸配对和不超过50％的序列互补性。在一些实施方案中，在任何两个引物之间存在不超过19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个互补的核苷酸配对。
在一些实施方案中，所述反应混合物包含至少30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000种不同类型的引物对。
在一些实施方案中，所述引物中的每一个的长度均为8至100个核苷酸。
在一些实施方案中，所述不同类型的引物对可以互补地结合不同的靶核酸或同一个靶核酸中的不同序列。
在一些实施方案中，其中所述去封闭剂是CS5 DNA聚合酶、具有F667Y突变的ampliTaq或KlenTaq聚合酶、焦磷酸盐或RNase H2，所述CS5 DNA聚合酶具有选自G46E、L329A、Q601R、D640G、I669F、S671F、E678G的突变或这些突变的组合。
在一些实施方案中，所述靶核酸是单链或双链DNA。
在一些实施方案中，所述靶核酸是连有单或双接头标签的双链DNA或连有单接头标签的单链DNA。
在一些实施方案中，所述反应混合物还包含至少一种与所述接头标签全部或部分互补的引物。
在一些实施方案中，所述靶核酸是包含单或双分子索引标签的双链DNA或包含单分子索引标签的单链DNA。在一些实施方案中，所述分子索引标签包括唯一标识符核酸序列和接头标签。
在一些实施方案中，所述引物在所述引物的5'末端处或附近具有共同的拖尾序列。在一些实施方案中，所述共同拖尾序列可用作分子索引标签、样本索引标签或接头标签或所有三种标签的组合。
在一些实施方案中，所述反应混合物还包含高保真聚合酶。在一些实施方案中，所述高保真聚合酶是PFU DNA聚合酶。
在一些实施方案中，“在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物”的所述步骤(b)包括以下步骤：使所述靶核酸变性；使所述引物与所述靶核酸退火，以允许形成核酸-引物杂合体；以及孵育所述核酸-引物杂合体以允许所述核酸聚合酶扩增所述靶核酸。
在一些实施方案中，所述核酸-引物杂合体的形成导致通过去封闭剂使所述引物中的封闭基团去封闭。
在一些实施方案中，将以下步骤重复至少1次、5次、10次、15次、20次、25次、30次、35次、40次或50次：使所述靶核酸变性；使所述引物与所述靶核酸退火，以允许形成核酸-引物杂合体；以及孵育所述核酸-引物杂合体以允许所述核酸聚合酶扩增所述靶核酸。在一些实施方案中，将所述步骤(b)重复约20次至约50次。
在一些实施方案中，所述核酸样品包含所述靶核酸。在一些实施方案中，所述核酸样品中的所述靶核酸不超过1个拷贝、2个拷贝、5个拷贝、8个拷贝、10个拷贝、20个拷贝、30个拷贝、50个拷贝、80个拷贝或100个拷贝。在一些实施方案中，所述核酸样品中靶核酸的摩尔百分比小于50％、20％、10％、5％、3％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％或0.001％。
在一些实施方案中，除所述靶核酸之外的核酸基本上不在步骤(b)中扩增。在一些实施方案中，从步骤(b)获得的反应产物中不需要的核酸的摩尔百分比小于20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％。
在一些实施方案中，所述方法用于选择性富集样品中的突变核酸，所述样品包含野生型核酸。在一些实施方案中，其中至少一种封闭引物与所述突变核酸在所述突变残基处互补，并且所述封闭引物的对应于突变残基的核苷酸具有所述封闭基团。
本公开的另一个方面提供了测序靶核酸的方法，其中所述方法包括：(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：(i)包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品，(ii)至少20种不同类型的引物对，其中每种类型引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每个引物对具有至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团，(iii)核酸聚合酶，和(iv)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；(b)在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物；和(c)确定从步骤(b)获得的反应产物的序列。
在一些实施方案中，所述方法用于通过毛细管电泳、PCR或高通量测序进行测序。在一些实施方案中，所述封闭引物被进一步修饰以减少不需要的核酸的扩增。
在一些实施方案中，所述反应混合物还包含高保真聚合酶。
本公开的又一个方面提供了测序靶核酸的方法，其中所述方法包括：(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：(i)包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品，(ii)至少20种不同类型的引物对，其中每种类型引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每个引物对具有至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团，(iii)核酸聚合酶，和(iv)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；(b)在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物；(c)加入接头标签、分子索引标签和/或样品索引标签到从步骤(b)获得的反应产物中；和(d)确定从步骤(c)获得的反应产物的序列。
在一些实施方案中，所述方法用于通过毛细管电泳、PCR或高通量测序进行测序。
在一些实施方案中，其中所述封闭引物被修饰以减少不需要的核酸的扩增。
在一些实施方案中，其中所述反应混合物还包含高保真聚合酶。
本公开的又一个方面提供了用于扩增靶核酸的试剂盒，其中所述试剂盒包含：(i)至少20种不同类型的引物对，其中每种类型引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每个引物对具有至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团，(ii)核酸聚合酶，和(iii)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合。
在一些实施方案中，所述封闭引物被修饰以减少不需要的核酸的扩增。
在一些实施方案中，所述反应混合物还包含高保真聚合酶。
本公开的又一个方面提供了扩增靶核酸的方法，其中所述方法包括：(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：(i)包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品，(ii)至少一种类型的引物，其与所述靶核酸的一部分互补，并且每种类型的引物具有至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团，其中所述封闭引物被修饰以减少不需要的核酸的扩增，(iii)核酸聚合酶，和(iv)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；和(b)在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物。
在一些实施方案中，所述修饰是在所述引物中引入至少一个错配的核苷酸。
在一些实施方案中，所述错配的核苷酸与具有所述封闭基团的核苷酸相距2-18bp。
在一些实施方案中，所述错配的核苷酸与具有封闭基团的核苷酸相距3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17bp。
在一些实施方案中，所述错配的核苷酸位于所述封闭基团的5'侧。
在一些实施方案中，所述修饰是这样的修饰：其用以减小所述封闭引物和所述靶核酸之间的亲和力。
在一些实施方案中，所述修饰是这样的修饰：其用以形成额外桥，所述额外桥连接所述封闭引物的至少一个核苷酸的2'氧和4'碳。
在一些实施方案中，所述方法用于选择性富集样品中的突变核酸，所述样品包含野生型核酸。
在一些实施方案中，封闭引物与所述靶核酸的一部分互补。在一些实施方案中，所述封闭引物与所述突变核酸在所述突变残基处互补，并且所述封闭引物的对应于突变残基的核苷酸具有所述封闭基团。
本公开的又一个方面提供了用于扩增靶核酸的试剂盒，其中所述试剂盒包含：(i)至少一种类型的引物，其与所述靶核酸的一部分互补，并且每种类型的引物具有至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团，其中所述封闭引物被修饰以减少不需要的核酸的扩增，(ii)核酸聚合酶，和(iii)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合
在一些实施方案中，所述封闭引物被修饰以减小所述封闭引物和所述靶核酸之间的亲和力。
附图说明
图1：通过多重PCR对基因组DNA进行NGS文库构建。
图2：通过多重PCR对片段化DNA进行NGS文库构建。
图3：通过多重PCR对具有单链分子索引标签的片段化DNA进行NGS文库构建。
图4：通过多重PCR对具有双链分子索引标签的片段化DNA进行NGS文库构建。
图5：通过多重PCR对基因组DNA中的突变序列进行选择性扩增。
图6：通过多重PCR对片段化DNA进行突变体富集的NGS文库构建。
图7：通过多重PCR对具有单链分子索引标签的片段化DNA进行突变体富集的NGS文库构建。
图8：通过多重PCR对具有双链分子索引标签的片段化DNA进行NGS文库构建。
图9.实施例1中，在基因组DNA样品上进行196重反应，共有六次单独的反应，然后在MiSeq测序仪上进行测序，最后得到的每个扩增子的标准化读数。
图10.实施例1中，在基因组DNA样品上进行196重反应，共有六次单独的反应，然后在MiSeq测序仪上进行测序，最后得到的每个扩增子的标准化读数和扩增子GC百分比的关系。
图11.多重PCR反应的测定设计和NGS数据分析的一般工作流程。
图12.实施例2中多重PCR反应之后选择性富集的不同突变核酸的电泳图。
图13.实施例3中多重PCR反应之后选择性富集的突变核酸的电泳图。
图14.实施例4中多重PCR反应之后选择性富集的突变核酸的电泳图。
图15.实施例1中多重PCR和文库构建的示意图。
具体实施方式
本发明的一个方面提供了扩增靶核酸的方法，其中所述方法包括：(a)提供反应混合物；和(b)在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物。
提供反应混合物
在一些实施方案中，用于检测本公开所述靶核酸的反应混合物包含：(i)包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品，(ii)至少20种不同类型的引物对，其中每种类型引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每个引物对具有至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团，(iii)核酸聚合酶，和(iv)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合
核酸样品
本公开中使用的术语“核酸”是指核苷酸碱基的生物聚合物，并且可以包括但不限于脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、微小RNA(miRNA)，以及肽核酸(PNA)、修饰的寡核苷酸(例如，包含对生物RNA或DNA来说不常规的核苷酸的寡核苷酸，如2'-O-甲基化寡核苷酸)等。所述核苷酸可以是天然的或非天然的，取代的或未取代的，修饰的或未修饰的。所述核苷酸可以通过磷酸二酯键连接，或通过硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、硼烷磷酸酯键等连接。所述多核苷酸可另外包含非核苷酸元件如标签、猝灭剂、封闭基团等。所述核酸可以是例如单链或双链的。
本公开中使用的术语“DNA”是指脱氧核糖核酸，其是形成遗传指令的长链聚合物生物大分子。DNA的亚基是核苷酸。DNA中的每个核苷酸由含氮碱基、五碳糖(2-脱氧核糖)和磷酸基团组成。相邻的核苷酸通过由脱氧核糖和磷酸形成的二酯键连接，从而形成长链框架。通常，DNA核苷酸中有四种类型的含氮碱基，即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)。两条DNA长链上的碱基经由氢键配对，其中腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)配对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。
本公开中使用的术语“核酸样品”是指含有核酸的任何样品，包括但不限于细胞、组织和体液等。在一些实施方案中，所述核酸样品是组织，例如，活检组织或石蜡包埋的组织。在一些实施方案中，所述核酸样品是细菌或者动物或植物的细胞。在一些其他实施方案中，所述核酸样品是体液，例如，血液、血浆、血清、唾液、羊膜穿刺液、胸腔积液、腹腔积液等。在一些实施方案中，所述核酸样品是血液、血清或血浆。
在一些实施方案中，所述核酸样品包含或疑似包含所述靶核酸。
本公开中使用的术语“靶核酸”或“靶区域”是指有意要扩增的核酸的任何区域或序列。
在一些具体实施方案中，所述靶核酸是DNA、RNA或杂合体或其混合物。在一些具体实施方案中，所述靶核酸是基因组DNA。在一些具体实施方案中，所述靶核酸是无细胞DNA(cfDNA)。在一些具体实施方案中，所述靶核酸是循环肿瘤DNA(ctDNA)。
本公开中使用的“无细胞DNA”是指从细胞释放并存在于循环系统(例如血液)中的DNA，其来源通常被认为是在细胞凋亡中释放的基因组DNA。
本公开中使用的“循环肿瘤DNA”是指源自肿瘤细胞的无细胞DNA。在人体中，肿瘤细胞由于诸如细胞凋亡和免疫应答等原因，会将其基因组DNA释放到血液中。由于正常细胞也可以将其基因组DNA释放到血液中，因此循环肿瘤DNA通常仅占无细胞DNA中的很小一部分。
在一些实施方案中，所述靶核酸是单链或双链DNA。在一些实施方案中，所述靶核酸是选自以下的一种或多种基因的全部或部分：ABL1、AKT1、ALK、APC、ATM、BRAF、CDH1、CDKN2A、CSF1R、CTNNB1、EGFR、ERBB2、ERBB4、EZH2、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、GNA11、GNAQ、GNAS、HNF1A、HRAS、IDH1、IDH2、JAK2、JAK3、KDR、KIT、KRAS、MET、MLH1、MPL、NOTCH1、NPM1、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PTEN、PTPN11、RB1、RET、SMAD4、SMARCB1、SMO、SRC、STK11、TP53和VHL。
在一些实施方案中，所述核酸样品中靶核酸的量不超过1个拷贝，2个拷贝，3个拷贝、4个拷贝、5个拷贝、6个拷贝、7个拷贝、8个拷贝、9个拷贝、10个拷贝、12个拷贝、15个拷贝、18个拷贝、20个拷贝、30个拷贝、50个拷贝、80个拷贝或100个拷贝。在一些实施方案中，所述核酸样品中靶核酸的摩尔百分比(摩尔/摩尔)小于50％、20％、10％、8％、6％、5％、3％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％或0.001％。在一些实施方案中，所述核酸样品中靶核酸的摩尔数与非靶核酸的摩尔数的比小于50％、20％、10％、8％、6％、5％、3％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％或0.001％。
在一些实施方案中，所述靶核酸是DNA片段。在一些实施方案中，所述靶核酸的大小为0.01-5kb、0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-1kb、0.1-0.5kb、0.01-0.5kb、0.01-0.4kb、0.01-0.3kb、0.01-0.25kb、0.02-0.25kb、0.05-0.3kb或0.05-0.25kb。所述DNA片段可以通过本领域的常规技术获得(例如，物理破坏，使用特异性限制性内切核酸酶切割等)。
在一些实施方案中，所述靶核酸是与单接头标签或双接头标签连接的双链DNA或与单接头标签连接的单链DNA。
本公开中使用的术语“接头标签”是指根据需要附着于核酸(单链或双链核酸)的一端或两端的特定DNA序列，并且所述接头的长度通常在5-50bp内。所述接头标签可用于促进所述靶核酸的扩增和/或对所述扩增的靶核酸进行测序。在一些实施方案中，所述接头标签用于促进测序用标签的连接(例如，用于Illumina MiSeq测序仪的P5和P7标签的连接)。在一些实施方案中，所述接头标签仅附着于单链核酸的3'末端或5'末端的一端。在一些实施方案中，所述接头标签附着于单链核酸的两个末端。在一些实施方案中，一个接头标签附着于双链核酸中的每条链的3'末端或5'末端。例如，一个接头标签附着于双链核酸中的一条链的3'末端，并且一个接头标签附着于双链核酸中的另一条链的5'末端，并且所述两个接头标签彼此相同或互补。在一些实施方案中，两个接头标签附着于双链核酸中每条链的两端。
可以通过本领域的常规技术将所述接头标签附着到所述核酸上。在一些实施方案中，当所述靶核酸是双链DNA时，可以通过以下步骤将所述接头标签附着到所述核酸上：(a)提供接头连接核酸，其被设计成含有将要与DNA的一条链的末端连接的序列(例如，所述接头连接核酸含有杂交互补区，或随机杂交短序列如poly-T)；(b)所述接头连接核酸与所述DNA的所述链杂交；和(c)在所述杂交后加入聚合酶(例如逆转录酶)以延伸所述接头连接核酸，从而将所述接头标签连接到所述靶DNA片段的所述末端。为了使另一个接头附着于所述同一链的另一端或所述DNA的另一条链，可以根据需要设计接头连接核酸并可以重复步骤(b)-(c)。在一些其他实施方案中，当所述DNA片段是双链的并且所述DNA片段的末端是粘性末端时，可以通过以下步骤使所述接头标签附着于所述核酸：(a)将所述接头连接核酸设计成包含将要与所述粘性末端连接的序列；(b)使所述接头连接核酸与所述粘性末端互补退火；(c)用连接酶将所述接头连接核酸连接到所述靶DNA的双链上，从而达到将所述接头附着于所述DNA片段的所述末端的目的。
在一些实施方案中，所述靶核酸是包含单或双分子索引标签的双链DNA或包含单分子索引标签的单链DNA。在一些实施方案中，所述分子索引标签包含唯一标识符核酸序列和接头标签。在一些实施方案中，所述接头标签位于所述靶核酸的一端。
本公开中使用的术语“分子索引标签”是指被用作标签的核酸序列，其可以连接至或存在于DNA片段的5'末端、3'末端或两端。在DNA测序中，特别是在高通量测序技术中，其中的分子索引标签用于标记特定的DNA分子。在扩增和测序后，其中所述分子索引序列的计数用于标记特定的DNA分子并可作为确定所述被标记基因的表达量的基础，或用于追踪从同样的原始分子扩增出的DNA分子的信息，从而纠正在扩增和测序过程中DNA序列的随机错误。
在一些实施方案中，所述分子索引标签是外源性的，其通过PCR(例如，如MoCloskey M.L.et al,Encoding PCR products with batch-stamps andbarcodes.Biochem Genet 45:761-767,2014或Parameswaran P,et al.,Apyrosequencing-tailored nucleotide barcode design unveils opportunities forlarge-scale sample multiplexing.Nucleic Acids Res 35:e130,2017中的描述)或连接(例如，如Craig D W,et al.,Identification of genetic variants using bar-codedmultiplexed sequencing.Nat Methods 5:887-893,2008或Miner B E,et al.,Molecularbarcodes detect redundancy and contamination in hairpin-bisulfite PCR.NucleicAcids Res 32:e135,2004中的描述)附着于所述靶核酸。在一些实施方案中，所述分子索引标签或其中的唯一标识符核酸序列可以是随机序列(即，由随机排列的A/T/C/G形成)。
在一些实施方案中，所述分子索引标签或其中的所述唯一标识符核酸序列是内源性的，其是随机剪切片段的两端的序列。
有关分子索引标签的更多信息可以在美国专利号20140227705和美国专利号20150044687中找到。
引物
本公开中使用的术语“引物”是指寡核苷酸，所述寡核苷酸当被放置在引发引物延伸的条件下时能够充当合成起始点。引物可以包含天然核糖核酸、脱氧核糖核酸或其他形式的天然核酸。引物还可包含非天然核酸(例如，LNA、ZNA等)。
引物可以通过使用任何合适的方法制得，例如磷酸三酯和磷酸二酯法或其自动化实施方案。在一个这样的自动化实施方案中，将二乙基亚磷酰胺用作原料并且其可以如Beaucage et al.,Tetrahedron Letters,22:1859-1862(1981)所述进行合成。美国专利号4,458,006中描述了一种在改性固体载体上合成引物的方法。还可以使用已经从生物来源分离出的引物，例如限制性内切核酸酶消化物。在一些实施方案中，可以用末端转移酶(Gibco BRL)合成在3'末端具有封闭核苷酸的引物(Nuc Aci Res 2002,30(2))。
本公开中使用的术语“引物对”是指由正向引物和反向引物组成的一对引物，其分别与待扩增序列的一部分互补，其中所述正向引物定义所述扩增序列的起始点并且所述反向引物定义所述扩增序列的终止点。当用于描述引物和待扩增序列之间的关系时，术语“互补的”是指所述引物与所述待扩增序列互补或与所述待扩增序列的互补序列互补。
可以基于靶核酸的序列设计引物对。在一些实施方案中，每种类型的引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补。在一些实施方案中，当所述靶序列(假设它是双链DNA)具有接头标签时，引物对的一个引物可以与所述靶序列的一部分(在一条链上的一部分)互补而另一个引物可以与所述接头标签(在另一条链上的接头标签)互补。
在一些实施方案中，每个引物对具有至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团。在一些实施方案中，每个引物对中的两个引物都是包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团的封闭引物。
本公开中使用的术语“封闭引物”是指具有封闭基团的引物。
本公开中使用的术语“封闭基团”是指在核酸链中共价连接并且能够阻断聚合酶延伸的任何化学基团。在一些实施方案中，具有封闭基团的所述核苷酸是在每个封闭引物的3'末端处或附近的修饰的核苷酸。在一些实施方案中，具有封闭基团的所述核苷酸与所述每个封闭引物的3'末端相距不超过6bp、5bp、4bp、3bp、2bp或1bp。在一些实施方案中，当本公开所述方法用于选择性富集包含野生型核酸的样品中的突变核酸时，所述封闭基团位于与所述突变核酸的相应突变核苷酸互补的核苷酸处，但是不与野生型核酸的相应核苷酸互补。
在一些实施方案中，所述封闭基团为2’,3’-双脱氧核苷酸、核糖核苷酸残基、2’,3’SH核苷酸或2’-O-PO3核苷酸。当所述封闭基团是核糖核苷酸残基时，所述封闭引物是这样的引物：其具有一个核糖核苷酸残基且其他残基都是脱氧核糖核苷酸残基。
关于封闭基团和封闭引物的更多信息可在美国专利号9,133,491、美国专利号6,534,269以及Joseph R.D.et al.,RNase H-dependent PCR(rhPCR):improvedspecificity and single nucleotide polymorphism detection using blockedcleavable primers,BMC Biotechnology 11:80,2011中找到。
在一些实施方案中，所述封闭引物与所述靶核酸的一部分互补。
在一些实施方案中，所述引物的长度为5至100个核苷酸。在一些实施方案中，所述引物的长度为至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个核苷酸。在一些实施方案中，所述引物的长度不超过100、90、80、70、60、50、40、35、30、25或20个核苷酸。
在一些实施方案中，引物包含与所述靶序列互补的互补区和位于所述引物的5'末端处或附近的共同拖尾序列。在一些实施方案中，所述共同拖尾序列可用作分子索引标签、接头标签或样品索引标签或所有所述三种标签的组合。
本公开中使用的术语“样品索引标签”是指一系列唯一核苷酸(即，每个样品索引标签都是唯一的)，并且可用于实现样品多重化，从而使得每个样品可以基于其样品索引标签得到确认。在一些实施方案中，对于一组样品中的每个样品，存在唯一样品索引标签，并且在测序期间将所述样品进行合并。例如，如果将12个样品合并到单个测序反应中，则存在至少12个唯一样品索引标签，使得每个样品以唯一的方式被标记。
在一些实施方案中，所述封闭引物被修饰以进一步减少不需要的核酸的扩增。
在一些实施方案中，所述修饰是在所述引物中引入至少一个错配的核苷酸。在一些实施方案中，所述错配的核苷酸碱基位于具有所述封闭基团的核苷酸的5'侧。
本公开中使用的术语“错配的核苷酸”是指第一核酸(例如，引物)的核苷酸，当所述第一核酸和第二核酸(例如，靶核酸)比对时，所述核苷酸不能与所述第二核酸的相应位置处的核苷酸配对。
可以通过常规技术确定所述错配核苷酸的优选的或可接受的位置。例如，将所述错配的核苷酸引入所述封闭引物中的不同位置，并且将那些封闭引物分别用于扩增靶核酸，然后可以基于扩增结果确定所述靶核酸的所述错配核苷酸的优选或可接受的位置(例如，能减少不需要的核酸的扩增或假阳性结果的位置是优选的或可接受的位置)。所述错配核苷酸的位置可随所述靶核酸的变化或所述封闭引物的结构而变化。在一些实施方案中，所述错配的核苷酸与具有封闭基团的所述核苷酸相距2-18bp。在一些实施方案中，所述错配的核苷酸与具有封闭基团的所述核苷酸相距3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17bp。在一些实施方案中，所述错配的核苷酸与具有封闭基团的所述核苷酸相距不少于2、3、4、5、6、7、8、9或10bp。在一些实施方案中，所述错配的核苷酸与含有封闭基团的所述核苷酸相距不超过17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2bp。
在一些实施方案中，所述修饰是用以增加所述封闭引物和所述靶核酸之间的解链温度(Tm)的修饰。在一些实施方案中，所述修饰是用以降低所述封闭引物和所述不需要的核酸之间的解链温度(Tm)的修饰,所述不需要的核酸可以是在选择性富集样品中的突变核酸的方法中的野生型核酸。在一些实施方案中，其中所述修饰是用以形成额外桥的修饰(例如锁核酸(LNA))，所述额外桥连接所述封闭引物的至少一个核苷酸的2'氧和4'碳，参见，例如，Karkare S et al.,Promising nucleic acid analogs and mimics:characteristicfeatures and applications of PNA,LNA,and morpholino.Appl Microbiol Biotechnol71(5):575-586,2006和Vester B et al.,LNA(locked nucleic acid):high-affinitytargeting of complementary RNA and DNA.Biochemistry 43(42):13233-13241,2004。
在一些实施方案中，所述反应混合物包含至少20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000种不同类型的引物对。在一些实施方案中，所述不同类型的引物对与不同的靶核酸片段互补或与同一靶核酸片段中的不同序列互补。
本公开的发明人进行了模拟实验以评估随机产生的具有一定长度的引物之间形成引物对的概率。发明人随机产生了长度为20bp的10至490个引物对用以形成不同的引物池，并且对于每个池，检查了同一池中任何一个引物和其他引物之间形成引物二聚体的情况。可以看出，形成引物二聚体(例如，由不同引物之间的互补性产生的引物二聚体)的概率随引物数目的增加而增加。
表1：引物数和二聚体长度之间的关系。
对于表1中的数据，100％表示引物池中的每个引物与同一引物池中的至少一个其他引物形成二聚体，并且所述二聚体的长度不短于所示的数目；20％表示引物池中有20％的引物在所示引物池中形成二聚体，并且所述二聚体的长度不短于所示的数目。
表2：引物数目与引物3'末端中二聚体长度之间的关系
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对于表2中的数据，100％表示引物池中的每个引物从其3'末端开始与同一引物池中的至少一个其他引物形成二聚体，并且所述二聚体的长度不短于所示数目；10％表示引物池中有10％的引物在所示引物池中形成二聚体，并且所述二聚体的长度不短于所示数目。
在一些实施方案中，在任何两个引物之间有不超过20个互补的核苷酸对。在一些实施方案中，在任何两个引物之间存在不超过19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个互补的核苷酸配对。在一些实施方案中，任何两个引物之间存在不超过20个连续的互补核苷酸对。在一些实施方案中，在任何两个引物之间存在不超过19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个连续的互补核苷酸对。在一些实施方案中，上述互补的核苷酸配对位于引物3'末端处第1个核苷酸至离所述引物3'末端的第20、第19、第18、第17、第16、第15、第14、第13、第12、第11、第10、第9或第8个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，在引物3'末端处第1个核苷酸至离所述引物3'末端的第20、第19、第18、第17、第16、第15、第14、第13、第12、第11、第10、第9或第8个核苷酸的区域内存在不超过7、6或5个连续的互补核苷酸配对。在一些实施方案中，当计算两个引物之间的配对数目时，不计入共同拖尾序列。
在一些实施方案中，在任何两个引物之间存在不超过20个互补的核苷酸配对和不超过50％的序列互补性。在一些实施方案中，在任何两个引物之间存在不超过19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个互补的核苷酸配对和不超过45％、40％、35％、30％、25％或20％的序列互补性。在一些实施方案中，当计算两个引物间的互补百分比时，不计入共同拖尾序列。
本公开中当提及核苷酸时所使用的术语“核苷酸互补性”或“互补性”是指核酸链上的能够与另一核酸链上的另一核苷酸发生碱基配对的核苷酸。例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互补，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)互补。又例如，在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)互补，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)互补。
本公开中使用的术语“互补百分比”是指，当一个核酸分子与另一个核酸分子退火时，在该核酸分子中与所述另一个核酸分子的核苷酸残基具有互补性的核苷酸残基的百分比。通过将所述第一核酸中与所述第二核酸中相应位置处的核苷酸互补的核苷酸的数目除以所述第一核酸的总长度来计算互补百分比。
还可以常规地使用BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和本领域已知的PowerBLAST程序(Altschul等)确定核酸的互补百分比或核酸中与另一个核酸互补的核苷酸的数目(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,215,403-410,1990；Zhang and Madden,GenomeRes.,7,649-656,1997)。
例如，在以下情况下引物1将具有90％的序列互补性：所述引物1的20个核苷酸中有18个与引物2的18个核苷酸具有互补性。在这个例子中，所述互补的核苷酸可以彼此邻接或与非互补性核苷酸穿插(interspersed)。
本公开中使用的术语“x个核苷酸配对”是指核酸分子中核苷酸残基的数目，当所述核酸分子与另一个核酸分子退火时，所述核苷酸残基与所述另一个核酸分子中的相应核苷酸互补。例如，“18个核苷酸配对”是指第一核酸分子的18个核苷酸残基与第二个核酸分子的18个核苷酸残基具有互补性。在这个例子中，所述互补的核苷酸可以彼此邻接或与非互补性核苷酸穿插。
核酸聚合酶
在一些实施方案中，所述核酸聚合酶可以选自DNA聚合酶家族如大肠杆菌DNA聚合酶I(例如大肠杆菌DNA聚合酶I、Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、TfI DNA聚合酶等)。该聚合酶可含有天然存在的野生型序列或其修饰变体及其片段。
在一些实施方案中，所述核酸聚合酶可以选自DNA聚合酶家族(例如大肠杆菌DNA聚合酶I)的修饰的DNA聚合酶，例如N-末端缺失的DNA聚合酶(如大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段)、N-末端缺失的Taq聚合酶(包括Taq DNA聚合酶的Stoffel片段、Klentaq-235和Klentaq-278)等。
在一些实施方案中，所述核酸聚合酶包括，但不限于，热稳定DNA聚合酶。热稳定DNA聚合酶的实例包括，但不限于：Tth DNA聚合酶、TfI DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、N-末端缺失的Taq聚合酶(例如，DNA聚合酶的Stoffel片段、Klentaq-235和Klentaq-278)。其他DNA聚合酶包括KlenTaqi、TaquenaseTM(Amersham)、Ad-vanTaqTM(Clontech)、GoTaq、GoTaqFlexi(Promega)和KlenTaq-S DNA聚合酶。
在一些实施方案中，核酸聚合酶可以是市售的DNA聚合酶混合物，包括但不限于，TaqLA、TthLA或Expand High Fidelitypius Enzyme Blend(Roche)；TthXL Klen TaqLA(Perkin-Elmer)；(Takara Shuzo)；/>(Life Technologies)；AdvantageTMKlenTaq，AdvantageTM Tth和Advantage2TM(Clontech)；TaqExtenderTM(Stratagene)；ExpandTM Long Template和ExpandTM High Fidelity(Boehringer Mannheim)；以及TripleMasterTM Enzyme Mix(Eppendorf)。
为了进一步减少不需要的核酸的扩增，可以将一种或多种其它聚合酶添加到反应混合物中。在一些实施方案中，所述反应混合物包含高保真聚合酶。在一些实施方案中，所述高保真聚合酶是PFU DNA聚合酶、Klentaq-1、Vent或Deep Vent。
去封闭剂
可以根据封闭引物中包含的封闭基团来选择去封闭剂。去封闭剂可以是任何这样的试剂：当封闭引物中具有封闭基团的核苷酸与靶核酸中相应的核苷酸互补时，其在扩增所述靶核酸的条件下可以导致所述封闭引物中的封闭基团的去封闭。在一些实施方案中，所述去封闭剂是焦磷酸盐、CS5 DNA聚合酶，所述CS5 DNA聚合酶具有选自G46E、L329A、Q601R、D640G、I669F、S671F、E678G的突变或其组合。在一些实施方案中，所述去封闭剂是具有F667Y突变的ampliTaq或KlenTaq聚合酶，或RNase H2。
在一些实施方案中，当所述封闭基团是2’,3’-双脱氧核苷酸时，所述去封闭剂是焦磷酸盐。在一些实施方案中，当所述封闭基团是2’-O-PO3核苷酸时，所述去封闭剂是CS5DNA聚合酶，所述CS5 DNA聚合酶具有选自G46E、L329A、Q601R、D640G、I669F、S671F、E678G的突变或其组合(例如，美国专利号20070154914中显示的DNA聚合酶)。在一些实施方案中，当所述封闭基团是2'-O-PO3核苷酸时，所述去封闭剂是具有F667Y突变的ampliTaq或KlenTaq聚合酶。在一些实施方案中，当所述封闭基团是核糖核苷酸残基时，所述去封闭剂是RNaseH2。
在扩增靶核酸的条件下孵育反应混合物的步骤
本发明所述反应混合物的孵育可以在多循环过程中进行，所述多循环过程采用几个交替的加热和冷却步骤来扩增DNA(参见美国专利号4,683,202和美国专利号4,683,195)。在一些实施方案中，所述孵育包括以下步骤：使靶核酸变性；使引物与靶核酸退火，以允许形成靶核酸-引物杂合体；并且孵育所述靶核酸-引物杂合体以允许核酸聚合酶扩增所述靶核酸。
以下简要描述扩增过程的实例。首先，将反应混合物加热至足以使双链靶DNA变性为其两条单链的温度。然后降低反应混合物的温度以使特定的单链引物与它们各自的互补性单链靶DNA退火。在退火步骤之后，将温度维持或调节至所用DNA聚合酶的最佳温度，这允许在所述退火的寡核苷酸引物的3'末端掺入互补的核苷酸，从而重建双链靶DNA。通过使用热稳定的DNA聚合酶，可以根据需要将由变性、退火和延伸组成的循环重复多次以产生所需产物，并且在每次热变性后不添加聚合酶(参见“Current Protocols in MolecularBiology”,F.M.Ausubel et al.,John Wiley and Sons,Inc.,1998)。
在一些实施方案中，在约90℃-100℃下进行约10秒至10分钟(优选对于第一次循环进行约1至8分钟)的靶核酸变性。在一些实施方案中，在约5℃-60℃下进行约3秒至10分钟的引物与靶核酸的退火。在一些实施方案中，孵育核酸-引物杂合体，使得在约60℃-90℃下进行约1分钟至15分钟的核酸聚合酶对靶核酸的扩增。
在一些实施方案中，所述孵育步骤重复至少1次、5次、10次、15次、20次、25次、30次、35次或40次。在一些实施方案中，所述孵育步骤重复约20次至约50次。
在一些实施方案中，基本上不在步骤(b)中扩增除所述靶核酸以外的核酸。在一些实施方案中，在所述孵育步骤后获得的产物中不需要的核酸的摩尔百分比小于20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％。
本公开所述扩增方法可用于构建DNA测序文库。在一些实施方案中，从所述孵育步骤获得的产物可以直接用作DNA测序文库而无需进行用于减少不需要的扩增产物的酶消化。在一些实施方案中，从所述孵育步骤获得的产物可以在与接头标签连接后用作DNA测序文库，而无需进行用于减少不需要的扩增产物的酶消化。
本公开中所述的“DNA测序文库”是指DNA片段的集合，所述DNA片段具有可被测序的量，其中所述DNA片段的集合中的每个片段的一端或两端包含与测序中使用的引物部分或完全互补的特定序列，从而可以直接用于随后的DNA测序。
构建DNA测序文库的一些实例示于图1-4和6-7中。
在一些实施方案中，所述方法用于选择性富集样品中的突变核酸，所述样品包含野生型和突变型核酸。
选择性富集突变核酸的一些实例示于图5-7中。
本公开的另一个方面提供了测序靶核酸的方法，其中所述方法包括：(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：(i)核酸样品，(ii)至少20种不同的引物对，其中每个引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补且包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团(“封闭引物”)，(iii)核酸聚合酶，和(iv)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述核酸聚合酶进行聚合；(b)在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物；(c)确定从步骤(b)获得的产物的序列。
本公开中使用的术语“测序”是指可用于确定一个或多个DNA分子中核苷酸碱基(包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)的身份和顺序的任何以及所有生物化学方法。在一些实施方案中，所述方法用于通过毛细管电泳、PCR或高通量测序(例如，下一代测序(NGS))进行测序。
本公开的又一个方面提供了测序靶核酸的方法，其中所述方法包括：(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：(i)核酸样品，(ii)至少20种不同的引物对，其中每个引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补且包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团(“封闭引物”)，(iii)核酸聚合酶，和(iv)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述核酸聚合酶进行聚合；(b)在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物；(c)加入接头标签、分子索引标签和/或样品索引标签到从步骤(b)获得的反应产物中；(d)确定从步骤(c)获得的产物的序列。
在一些实施方案中，在步骤(c)中，将接头标签、分子索引标签和/或样品索引标签附着于从步骤(b)获得的靶核酸。可以根据上述方法附着所述接头标签、分子索引标签和/或样品索引标签。
本公开的又一个方面提供了扩增靶核酸的试剂盒，其中所述试剂盒包含：(i)至少20种不同的引物对，其中每个引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补且包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团，(ii)核酸聚合酶，和(iii)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述核酸聚合酶进行聚合。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含一种或多种选自下组的试剂：dNTPs、Mg2+(例如MgCl2)、牛血清白蛋白、pH缓冲液(例如Tris HCL)、甘油、DNase抑制剂、RNA酶、SO42-、Cl-、K+、Ca2+、Na+和(NH4)+。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含说明书，所述说明书示出了如何进行所述靶核酸的扩增(例如示出了本公开所述的方法)。
本公开的又一个方面提供了扩增靶核酸的方法，其中所述方法包括：(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：(i)核酸样品，(ii)至少一种引物，所述引物与所述靶核酸的一部分互补且包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团(“封闭引物”)，其中所述封闭引物被修饰以减少不需要的核酸的扩增，(iii)核酸聚合酶，和(iv)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述核酸聚合酶进行聚合；(b)在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物。
本公开的又一个方面提供了扩增靶核酸的试剂盒，其中所述试剂盒包括：(i)至少一种引物，所述引物与所述靶核酸的一部分互补且包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团(“封闭引物”)，其中所述封闭引物被修饰以减少不需要的核酸的扩增，(ii)核酸聚合酶，和(iii)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述核酸聚合酶进行聚合。
遵循本公开的任何方面的任何实施方案都可应用于本公开的其他方面，只要所得到的实施方案对于本领域技术人员而言是可能的或合理的。
应当理解，如本文和所附权利要求中所用的那样，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，当提及“桥探针(bridgeprobe)”时，也就是指一个或多个桥探针，并且包括本领域技术人员已知的它的等同物等。
本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用整体并入本文。
实施例
参考以下实施例将更容易理解本发明，这些实施例不应以任何方式解释为限制本发明的范围。以下描述的所有具体的组合物、材料和方法全部或部分地落入本发明的范围内。这些具体的组合物、材料和方法并非为了限制本发明，而仅仅是为了说明落入本发明范围内的具体实施方案。本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围的情况下无需使用创造力开发出等同的组合物、材料和方法。应当理解，可以在本文所述的程序中进行许多变化，同时这些变化仍然在本发明的范围内。发明人的意图是将这些变化包括在本发明的范围内。
实施例1.基因组DNA靶标的多重PCR扩增
执行了多重聚合酶链式反应以选择性地扩增人基因组DNA的196个扩增子(从靶核酸区扩增出的产物)。每个引物对含有两个引物且可以选择性地与靶核酸杂交，所述引物在其3'末端具有双脱氧核苷终止。每个引物对的序列示于表3中。每个引物中的灰色阴影序列是用于下一步文库构建的序列并且每个引物中的其他序列是用于选择性地与靶核酸杂交的序列。
表3：扩增子和相应的引物对
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靶核酸区域的扩增。将含有196个扩增子引物对的且每种引物浓度为50nM的池加入到含有50ng人基因组DNA(GenBank号：NA12878)和10μL扩增反应混合物的单个PCR管中，加入不含DNA酶/RNA酶的水至20μL终体积，所述扩增反应混合物含有3％甘油、0.2nM dNTP、50nM焦磷酸盐和2个单位的KlenTaq-S DNA聚合酶。将PCR管置于热循环仪上并运行以下温度曲线以获得扩增的扩增子文库。在98℃下进行2分钟的初始保持阶段，然后在98℃下15秒，55℃下8分钟，进行17个循环。循环后，将所述反应物在72℃下保持5分钟，然后保持在4℃直至进行珠粒纯化步骤以除去过量的引物。小心地除去管盖，并将24μL的AgencourtXP试剂(Beckman Coulter，CA)加入到所述反应混合物中以纯化所述DNA。将所述反应混合物涡旋混合并在室温下孵育5分钟。将所述管置于磁架中并孵育直至溶液澄清。小心地取出并弃去上清液同时不干扰沉淀，然后加入150μL新鲜制备的70％乙醇。将所述反应混合物涡旋以充分混合，脉冲旋转，并孵育直至溶液澄清。小心地取出并弃去上清液同时不干扰沉淀。加入另一剂(potion)150μL新鲜制备的70％乙醇。将所述反应混合物涡旋以充分混合，脉冲旋转，并孵育直至溶液澄清。小心地取出并弃去上清液同时不干扰沉淀。将管子开盖蒸发约2分钟。管中剩余的珠粒沉淀含有纯化的DNA。
库的构建。然后将50μL PCR SuperMix高保真DNA聚合酶(ThermoFisher，目录号12532016)和2μL文库扩增条形码引物混合物(每种引物浓度为10μM)加入到珠粒中。每种引物的序列示于表4中。将PCR管置于热循环仪上并运行以下温度曲线以获得扩增的扩增子文库。在98℃下进行2分钟的初始保持阶段，然后在98℃下15秒，60℃下1分钟，进行5个循环。循环后，将所述反应物在72℃下保持5分钟，然后保持在4℃直至进行纯化。小心地除去管盖，并将44μL的Agencourt />XP试剂(Beckman Coulter，CA)加入到所述反应混合物中以纯化所述产物。将所述反应物涡旋混合并在室温下孵育5分钟。将所述管置于磁架中并孵育直至溶液澄清。小心地取出并弃去上清液同时不干扰沉淀。然后向所述沉淀加入150μL新鲜制备的70％乙醇；将所述反应混合物涡旋以充分混合，脉冲旋转，并孵育直至溶液澄清；小心地取出并弃去上清液同时不干扰沉淀；将上述洗涤步骤重复一次。在洗涤后，将管子开盖蒸发约2分钟。然后加入50μL的低TE缓冲液并将溶液彻底涡旋。将所述管子置于磁体中直至溶液澄清。将含有文库的上清液收集到单独的干净的管中。使用2.0荧光计(Life Technologies，CA)和Bioanalyzer(Agilent Technologies，CA)，根据制造商的方案对所述文库进行定量。
表4：用于构建文库的引物
根据制造商的程序在Illumina MiSeq测序仪上对文库进行测序。
数据处理
使用bowtie2软件(从https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.2.1.1下载得到)用默认的设置将测序读数与GRC37/hg19参考基因组进行比对，所述GRC37/hg19参考基因组从ucsc基因组浏览器网页(http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/)上下载得到。基于R1和R2读数在基因组中的位置与设计的测定的正向和反向引物的位置之间的匹配情况，将比对后的读数进一步分配至扩增子。初步结果表明癌症的热点组具有以下表现：(1)69.7％的读数比对至基因组；(2)95.5％的读数比对至设计的目标区域；(3)98.1％的测定中扩增子读数覆盖度在平均均值的5倍以内。
实施例2.用于测序的突变核酸的多重富集
在20μL PCR反应溶液中，将含有8个引物对(每个引物在其3'末端含有双脱氧核苷酸且引物浓度为0.5μM)的两个池(参见表5)与2μL 10X PCR缓冲液、3mM MgCl2、0.2mMdNTP、0.2mM dNTP、50nM焦磷酸盐、2个单位的AmpliTaq DNA聚合酶FS和1％、0.1％或0.01％的突变核酸(Horizon discovery，Cambridge，United Kingdomin)、30ng人基因组DNA(GenBank编号：NA12878)一起加入。将PCR管装载到热循环仪上并运行以下温度曲线：95℃2分钟；95℃ 15秒，65℃ 120秒，40个循环；保持在4℃。将5μL ExoSAP-ITTM溶液(Affymetrix，CA)加入所述管中，并将所述反应物在37℃下孵育15分钟，在80℃下孵育10分钟，保持在4℃。使用2μL反应溶液用BigDyeTM Terminator v3.1循环测序试剂盒(LifeTechnologies，CA)执行循环测序，并根据制造商的方案纯化得到的DNA。根据制造商推荐的方案，在ABI Prism 3730 DNA分析仪上进行纯化样品的电泳。图12中的电泳图显示了在扩增反应后，从野生型背景中的1％、0.1％或0.01％(Mol/Mol)突变体进行的突变核酸(图12中的EGFR COSMIC6240突变、EGFR COSMIC6252突变、COSMIC6241突变、COSMIC6224突变、COSMIC6223突变和COSMIC6213突变)富集实例。
表5：用于富集突变核酸的引物
实施例3.通过错配的PAP引物富集突变核酸用于测序
在20μL PCR反应溶液中，将一对引物(一个引物是SMDCR0166，且另一个引物选自SMDMF0166、SMDMF0166G3、SMDMF0166G6、SMDMF0166C9、SMDMF0166C12、SMDMF0166G15中的一个)(参见表6)与2μL 10X PCR缓冲液一起加入，所述每个引物在其3'末端含有双脱氧核苷酸且浓度为0.5μM，所述缓冲液具有以下终浓度：3mM MgCl2、0.2mM dNTP、90μM焦磷酸盐和2个单位的KlenTaq-S。还向所述PCR反应混合物中加入30ng的100％野生型人基因组DNA(参见表6)或掺入了0.1％突变基因组DNA(EGFR T790M，参见表6)的野生型人基因组DNA。将PCR管装载到热循环仪上并运行以下温度曲线：95℃ 2分钟；95℃ 15秒，65℃ 120秒，40个循环；保持在4℃。将5μL ExoSAP-ITTM溶液(Affymetrix，CA)加入所述管中，并将所述反应物在37℃下孵育15分钟，在80℃下孵育10分钟，保持在4℃。使用2μL处理过的反应溶液用BigDyeTMTerminator v3.1循环测序试剂盒(Life Technologies，CA)执行循环测序，并根据制造商的方案进行纯化。根据制造商推荐的方案，在ABI Prism 3730DNA分析仪上进行纯化样品的电泳。结果显示在图13中。可以看出错配的核苷酸有助于减少假阳性结果。
表6：用于检测EGFR T790M的引物和模板序列
实施例4.通过PAP引物和校对(proof-reading)PFU酶富集突变核酸用于测序
在20μL PCR反应溶液中，将正向和反向引物对(参见表7)与2μL的10X PCR缓冲液一起加入所述反应混合物中，每个引物在其3'端含有双脱氧核苷酸且引物浓度为0.5μM，所述PCT缓冲液具有以下终浓度：3mM MgCl2、0.2mM dNTP、90μM焦磷酸盐，2个单位的KlenTaq-S，以及带有或不带有2个单位的Pfu DNA聚合酶(Promega,WI)。还向所述PCR反应混合物中加入30ng的100％野生型人基因组DNA(NA12878)(参见表7)或掺入了0.1％突变基因组DNA(EGFR G719S，参见表7)的野生型人基因组DNA(NA12878)。将PCR管装载到热循环仪上并运行以下温度曲线：95℃ 2分钟；95℃ 15秒，65℃ 120秒，40个循环；保持在4℃。将5μLExoSAP-ITTM溶液(Affymetrix，CA)加入所述管中，并将所述反应物在37℃下孵育15分钟，在80℃下孵育10分钟，保持在4℃。使用2μL处理过的反应溶液用BigDyeTM Terminator v3.1循环测序试剂盒(Life Technologies，CA)执行循环测序，并根据制造商的方案进行纯化。根据制造商推荐的方案，在ABI Prism 3730DNA分析仪上进行纯化样品的电泳。结果显示在图14中。可以看出校对PFU酶有助于减少假阳性结果。
表7：用于检测EGFR G719S的引物和模板序列
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序列表
<110> 风可生物科技(上海)有限公司
风可生物科学公司
<120> 扩增靶核酸的方法
<130> 068481-8001WO02
<160> 435
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<223> 合成的
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<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> n是a, c, g或t
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gt 62
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctactatg tgtcgaaagg cagtgta 57
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcagatc ctgttccagg cctat 55
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t 61
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaccat tccactgcag aagaaat 57
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<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 369
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttcctca aaagagaaat cacgcat 57
<210> 370
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 370
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaatat gtactacgaa aattcctatg 60
cc 62
<210> 371
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 371
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaagatca tctgctggcc gt 52
<210> 372
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 372
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccagcc tctcgggtac at 52
<210> 373
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 373
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctagaggca agcagaggct g 51
<210> 374
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 374
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacctag gagataacac aggcc 55
<210> 375
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 375
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctagagaac gcggaattgg tct 53
<210> 376
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 376
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagccat tcatacctct caggaa 56
<210> 377
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 377
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcttttty cttcctaagg ttgcaca 57
<210> 378
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 378
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcgtgca cctggagatg ct 52
<210> 379
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 379
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttcttgta tctcctcagg gaacag 56
<210> 380
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 380
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagacaa gaagagaacc ttcccc 56
<210> 381
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 381
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttacatgg gtgcttccca ttc 53
<210> 382
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 382
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggggca aggttaggtg aag 53
<210> 383
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 383
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttacaaag tggttctgga ttagctg 57
<210> 384
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 384
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcgagc cacatctaca gtacttta 58
<210> 385
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 385
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcatgtct ttgcagccga gg 52
<210> 386
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 386
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccaaga aaggcctggg ct 52
<210> 387
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 387
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggtgatc tatttttccc tttctccc 58
<210> 388
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 388
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagaaac aggctgagtt ttggtc 56
<210> 389
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 389
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttagacaa ggtcttcctt ccactt 56
<210> 390
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 390
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcctcc tccatacagg aaacag 56
<210> 391
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 391
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttctcaa tgatgcttgg ctc 53
<210> 392
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 392
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttggctg gacaacaaaa atgga 55
<210> 393
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 393
caagcagaag acggcatacg agatcgcgac tgaagtgact ggagttcaga cgtgt 55
<210> 394
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 394
caagcagaag acggcatacg agatagcatc gatagtgact ggagttcaga cgtgt 55
<210> 395
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 395
caagcagaag acggcatacg agatcgacac atgggtgact ggagttcaga cgtgt 55
<210> 396
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 396
caagcagaag acggcatacg agatcgacta cgcagtgact ggagttcaga cgtgt 55
<210> 397
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 397
caagcagaag acggcatacg agatcactgc tgaggtgact ggagttcaga cgtgt 55
<210> 398
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 398
caagcagaag acggcatacg agattcgctg tacagtgact ggagttcaga cgtgt 55
<210> 399
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 399
caagcagaag acggcatacg agatcgctgc agtagtgact ggagttcaga cgtgt 55
<210> 400
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 400
caagcagaag acggcatacg agatagactt gcaggtgact ggagttcaga cgtgt 55
<210> 401
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 401
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgac 45
<210> 402
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 402
caggaaacag ctatgaccgt ggagaagctc ccaaccaagc 40
<210> 403
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 403
tgtaaaacga cggccagtcg aacgcaccgg agct 34
<210> 404
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 404
tgtaaaacga cggccagtga aagttaaaat tcccgtcgct atcaaa 46
<210> 405
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 405
caggaaacag ctatgaccgg cctgaggttc agagccatg 39
<210> 406
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 406
caggaaacag ctatgaccga agccacactg acgtgcctct 40
<210> 407
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 407
tgtaaaacga cggccagtgg cacgtggggg ttgtccacga 40
<210> 408
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 408
caggaaacag ctatgaccca gccaggaacg tactggtgaa 40
<210> 409
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 409
tgtaaaacga cggccagtgc acccagcagt ttggccc 37
<210> 410
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 410
caggaaacag ctatgaccgt ggagaagctc ccaaccaagc 40
<210> 411
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 411
tgtaaaacga cggccagttg ccgaacgcac cggagca 37
<210> 412
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 412
tgtaaaacga cggccagtga aagttaaaat tcccgtcgct atcaaga 47
<210> 413
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 413
caggaaacag ctatgaccgg cctgaggttc agagccatg 39
<210> 414
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 414
tgtaaaacga cggccagtca ccgtgcagct catcat 36
<210> 415
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 415
caggaaacag ctatgaccgt tgagcaggta ctgggagcca 40
<210> 416
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 416
caggaaacag ctatgaccca gccaggaacg tactggtgaa 40
<210> 417
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 417
tgtaaaacga cggccagtct ttctcttccg cacccagct 39
<210> 418
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 双脱氧核苷酸
<400> 418
ctccaccgtg cagctcatca t 21
<210> 419
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 双脱氧核苷酸
<400> 419
ctccaccgtg cagctcatga t 21
<210> 420
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 双脱氧核苷酸
<400> 420
ctccaccgtg cagctgatca t 21
<210> 421
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 双脱氧核苷酸
<400> 421
ctccaccgtg cacctcatca t 21
<210> 422
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 双脱氧核苷酸
<400> 422
ctccaccgtc cagctcatca t 21
<210> 423
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 双脱氧核苷酸
<400> 423
ctccacggtg cagctcatca t 21
<210> 424
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> 双脱氧核苷酸
<400> 424
gttgagcagg tactgggagc ca 22
<210> 425
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人
<400> 425
gaggtggcac gtcgagtagt gcgtcgagta cgggaagccg acggaggacc tgatacaggc 60
<210> 426
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人
<400> 426
gaggtggcac gtcgagtagt acgtcgagta cgggaagccg acggaggacc tgatacaggc 60
<210> 427
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 双脱氧核苷酸
<400> 427
ctccaccgtg cagctcatca t 21
<210> 428
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 双脱氧核苷酸
<400> 428
ctccaccgtg cagctcatga t 21
<210> 429
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 双脱氧核苷酸
<400> 429
ctccaccgtg cagctgatca t 21
<210> 430
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 双脱氧核苷酸
<400> 430
ctccaccgtg cacctcatca t 21
<210> 431
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 双脱氧核苷酸
<400> 431
ctccaccgtc cagctcatca t 21
<210> 432
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 双脱氧核苷酸
<400> 432
ctccacggtg cagctcatca t 21
<210> 433
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> 双脱氧核苷酸
<400> 433
gttgagcagg tactgggagc ca 22
<210> 434
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人
<400> 434
gaggtggcac gtcgagtagt gcgtcgagta cgggaagccg acggaggacc tgatacaggc 60
<210> 435
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人
<400> 435
gaggtggcac gtcgagtagt acgtcgagta cgggaagccg acggaggacc tgatacaggc 60

Claims (53)

1.扩增靶核酸的方法，其中所述方法包括：
（a）提供反应混合物，所述反应混合物包含：（i）包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品，（ii）至少20种不同类型的引物对，其中每种类型引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每个引物对中的两个引物都是封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团，其中所述封闭基团是2',3'-双脱氧核苷酸且位于每个封闭引物的3'末端处，（iii）核酸聚合酶，和（iv）去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合，所述去封闭剂是具有F667Y突变的ampliTaq DNA聚合酶与焦磷酸盐和/或具有F667Y突变的KlenTaq DNA聚合酶与焦磷酸盐；和
（b）在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述封闭引物被修饰以减少不需要的核酸的扩增，所述修饰是在所述引物中引入至少一个错配的核苷酸。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述错配的核苷酸与具有所述封闭基团的核苷酸相距2-18 bp。
4. 根据权利要求2所述的方法，其中所述错配的核苷酸与具有所述封闭基团的核苷酸相距3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17 bp。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述错配的核苷酸碱基位于具有所述封闭基团的核苷酸的5'侧。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸聚合酶选自由以下组成的组：Tth DNA聚合酶、TfI DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸聚合酶是N-末端缺失的Taq聚合酶。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸聚合酶选自由以下组成的组：KlenTaqi、TaquenaseTM、Ad-vanTaqTM、GoTaq、GoTaq Flexi、AmpliTaq DNA聚合酶FS和KlenTaq-S DNA聚合酶。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在任何两个引物之间存在不超过20个互补的核苷酸配对和不超过50%的序列互补性。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在两种不同类型的引物对的任何两个引物之间存在不超过10个互补的核苷酸配对。
11.根据权利要求9所述的方法，其中在两种不同类型的引物对的任何两个引物之间存在不超过9个互补的核苷酸配对。
12.根据权利要求9所述的方法，其中在两种不同类型的引物对的任何两个引物之间存在不超过8个互补的核苷酸配对。
13.根据权利要求9所述的方法，其中在两种不同类型的引物对的任何两个引物之间存在不超过7个互补的核苷酸配对。
14.根据权利要求9所述的方法，其中在两种不同类型的引物对的任何两个引物之间存在不超过6个互补的核苷酸配对。
15.根据权利要求9所述的方法，其中在两种不同类型的引物对的任何两个引物之间存在不超过5个互补的核苷酸配对。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物中的每一个的长度均为8至100个核苷酸。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述不同类型的引物对可以互补地结合不同的靶核酸或同一个靶核酸中的不同序列。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是单链或双链DNA。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是连有单或双接头标签的双链DNA或连有单接头标签的单链DNA。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述反应混合物还包含至少一种与所述接头标签全部或部分互补的引物。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是包含单或双分子索引标签的双链DNA或包含单分子索引标签的单链DNA。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述分子索引标签包括唯一标识符核酸序列和接头标签。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述反应混合物还包含至少一种与所述接头标签全部或部分互补的引物。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物在所述引物的5'末端处具有共同的拖尾序列。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述共同拖尾序列可用作分子索引标签、样本索引标签或接头标签或三种标签的组合。
26.根据权利要求1所述的方法，其中反应混合物还包含高保真聚合酶。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述高保真聚合酶是PFU DNA聚合酶。
28.根据权利要求1所述的方法，其中在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物的所述步骤（b）包括以下步骤：使所述靶核酸变性；使所述引物与所述靶核酸退火，以允许形成核酸-引物杂合体；以及孵育所述核酸-引物杂合体以允许所述核酸聚合酶扩增所述靶核酸。
29.根据权利要求1所述的方法，其中将以下步骤重复至少1次：使所述靶核酸变性；使所述引物与所述靶核酸退火，以允许形成核酸-引物杂合体；以及孵育所述核酸-引物杂合体以允许所述核酸聚合酶扩增所述靶核酸。
30.根据权利要求1所述的方法，其中将以下步骤重复至少5次：使所述靶核酸变性；使所述引物与所述靶核酸退火，以允许形成核酸-引物杂合体；以及孵育所述核酸-引物杂合体以允许所述核酸聚合酶扩增所述靶核酸。
31.根据权利要求1所述的方法，其中将以下步骤重复至少10次：使所述靶核酸变性；使所述引物与所述靶核酸退火，以允许形成核酸-引物杂合体；以及孵育所述核酸-引物杂合体以允许所述核酸聚合酶扩增所述靶核酸。
32.根据权利要求1所述的方法，其中将所述步骤（b）重复20次至50次。
33.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法用于选择性富集样品中的突变核酸，所述样品包含野生型核酸。
34.根据权利要求33所述的方法，其中至少一种封闭引物与所述突变核酸在所述突变残基处互补，并且所述封闭引物的对应于突变残基的核苷酸具有所述封闭基团。
35.测序靶核酸的方法，其中所述方法包括：
（a）提供反应混合物，所述反应混合物包含：（i）包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品，（ii）至少20种不同类型的引物对，其中每种类型引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每个引物对中的两个引物都是封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团，其中所述封闭基团是2',3'-双脱氧核苷酸且位于每个封闭引物的3'末端处，（iii）核酸聚合酶，和（iv）去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合，所述去封闭剂是具有F667Y突变的ampliTaq DNA聚合酶与焦磷酸盐和/或具有F667Y突变的KlenTaq DNA聚合酶与焦磷酸盐；
（b）在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物；和
（c）确定从步骤（b）获得的反应产物的序列。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述方法用于通过毛细管电泳、PCR或高通量测序进行测序。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述封闭引物被修饰以减少不需要的核酸的扩增，所述修饰是在所述引物中引入至少一个错配的核苷酸。
38. 根据权利要求35所述的方法，其中所述核酸聚合酶选自由以下组成的组：Tth DNA聚合酶、TfI DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶。
39.根据权利要求35所述的方法，其中所述核酸聚合酶是N-末端缺失的Taq聚合酶。
40. 根据权利要求35所述的方法，其中所述核酸聚合酶选自由以下组成的组：KlenTaqi、TaquenaseTM、Ad-vanTaqTM、GoTaq、GoTaq Flexi、AmpliTaq DNA聚合酶FS和KlenTaq-S DNA聚合酶。
41.根据权利要求35所述的方法，其中所述反应混合物还包含高保真聚合酶。
42.测序靶核酸的方法，其中所述方法包括：
（a）提供反应混合物，所述反应混合物包含：（i）包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品，（ii）至少20种不同类型的引物对，其中每种类型引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每个引物对中的两个引物都是封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团，其中所述封闭基团是2',3'-双脱氧核苷酸且位于每个封闭引物的3'末端处，（iii）核酸聚合酶，和（iv）去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合，所述去封闭剂是具有F667Y突变的ampliTaq DNA聚合酶与焦磷酸盐和/或具有F667Y突变的KlenTaq DNA聚合酶与焦磷酸盐；
（b）在用于扩增所述靶核酸的条件下孵育所述反应混合物；
（c）加入接头标签、分子索引标签和/或样品索引标签到从步骤（b）获得的反应产物中；和
（d）确定从步骤（c）获得的反应产物的序列。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述方法用于通过毛细管电泳、PCR或高通量测序进行测序。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述封闭引物被修饰以减少不需要的核酸的扩增，所述修饰是在所述引物中引入至少一个错配的核苷酸。
45. 根据权利要求42所述的方法，其中所述核酸聚合酶选自由以下组成的组：Tth DNA聚合酶、TfI DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶。
46.根据权利要求42所述的方法，其中所述核酸聚合酶是N-末端缺失的Taq聚合酶。
47. 根据权利要求42所述的方法，其中所述核酸聚合酶选自由以下组成的组：KlenTaqi、TaquenaseTM、Ad-vanTaqTM、GoTaq、GoTaq Flexi、AmpliTaq DNA聚合酶FS和KlenTaq-S DNA聚合酶。
48.根据权利要求42所述的方法，其中所述反应混合物还包含高保真聚合酶。
49. 用于扩增靶核酸的试剂盒，其中所述试剂盒包含：（i）至少20种不同类型的引物对，其中每种类型引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每个引物对中的两个引物都是封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团，其中所述封闭基团是2',3'-双脱氧核苷酸且位于每个封闭引物的3'末端处，（ii）核酸聚合酶，和（iii）去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合，所述去封闭剂是具有F667Y突变的ampliTaq DNA聚合酶与焦磷酸盐和/或具有F667Y突变的KlenTaq DNA聚合酶与焦磷酸盐。
50. 根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述核酸聚合酶选自由以下组成的组：TthDNA聚合酶、TfI DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶。
51.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述核酸聚合酶是N-末端缺失的Taq聚合酶。
52. 根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述核酸聚合酶选自由以下组成的组：KlenTaqi、TaquenaseTM、Ad-vanTaqTM、GoTaq、GoTaq Flexi、AmpliTaq DNA聚合酶FS和KlenTaq-S DNA聚合酶。
53.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含高保真聚合酶。
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