CN105368924A - Idh1/2基因突变检测体系及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒，包括引物、探针和扩增阻断引物，引物包括质控正向引物、检测正向引物和通用反向引物；所述检测正向引物包括针对IDH1基因C394T突变位点的检测正向引物、针对IDH1基因G395A突变位点的检测正向引物、针对IDH2基因G419A突变位点的检测正向引物、针对IDH2基因G515A突变位点的检测正向引物；探针序列的5’端设有一种荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3’端设有另一种荧光标记；扩增阻断引物的核苷酸序列的3’端设有磷酸化修饰。本发明的IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒，可对IDH1基因的C394T/G395A突变位点和IDH2基因的G419A/G515A突变位点进行检测，灵敏度高、特异性强、快捷方便。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因突变的检测产品以及该产品所用到的引物、探针、检测体系，属于生物技术领域。
背景技术
异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase，IDH)是一类在三羧酸循环中起重要作用的酶家族，不仅在能量代谢、氨基酸和维生素合成中扮演重要角色，而且对该酶的活性调节将直接影响IDH或IDH底物参与不同的生物途径、发挥不同的生物功能。在哺乳动物细胞中,IDH同工酶有三种形式：依赖NAD的线粒体IDH,依赖NADP的线粒体IDH,依赖NADP的胞质IDH。
编码依赖NADP的人异柠檬酸脱氢酶1(isocitratedehydrogenase1，IDH1)的基因位于染色体2q33.3，其转录mRNA长2339bp，含有10个外显子，编码由414个氨基酸残基组成的异柠檬酸脱氢酶1，主要定位于细胞浆和过氧化物酶体。IDH1作用于一个称为柠檬酸周期的能量生成途径。细胞溶质的IDH1突变是原发性人体脑瘤主要亚型的共同特点。研究表明癌症相关的IDH1突变使该酶具有新的作用，当精氨酸132突变为组氨酸时，活性部位残基所产生的结构变化倾向于减少IDH1对异柠檬酸盐的氧化脱羧作用；催化NADPH依赖性的还原反应,把α-酮戊二酸还原成2-羟基戊二酸(2HG)。2HG作为异柠檬酸脱氢突变后生成并累及的代谢废物，一般在人体细胞中含量很低，如果大量累积，就会导致正常细胞向恶性转化。2HG通过对DNA、组蛋白甲基化、缺氧诱导因子1α(hypoxiainduciblefactor-1,HIF1α)和HIF2α的作用改变了基因的转录；2HG过多累积会直接抑制包括人体内“组蛋白去甲基化酶”与DNA去甲基化酶在内的多个重要双加氧酶的活力，双加氧酶的活力降低，改变细胞的增殖和生长方式，进而诱发肿瘤。已证实2HG的过度蓄积将导致患有先天性2HG代谢异常的患者出现恶性脑瘤风险升高。同样，在人体恶性神经胶质瘤部位，研究发现2HG水平显著升高。
另一方面，Chan等人发现IDH1突变会释放他们称为的“表观遗传混乱(epigeneticchaos)”而干扰一种能调控DNA甲基基团积累的酶的作用。这种“甲基化”能开启和关闭基因表达。IDH1突变的脑癌具有改变了的DNA甲基化模式；同时他们还发现表达突变IDH1的星形胶质细胞发育出一个与DNA甲基化相呼应的像干细胞一样的表型，表明突变IDH1可能防止了分化。复旦大学的研究人员曾发现肿瘤衍生的IDH1突变会破坏酶的亲和力，导致酶与底物结合能力降低，并且突变的IDH1还能与野生型IDH1竞争底物，突变的IDH1与底物结合形成二聚体，进一阻断IDH1的活性；据此提出IDH1具有肿瘤抑制子的作用，一旦IDH1发生突变失活则导致HIF-1通路发生改变促进肿瘤发生。
编码依赖NADP的线粒体IDH2酶的IDH2基因位于染色体15q26.1。其转录mRNA长1740bp，编码由452个氨基酸残基组成的异柠檬酸脱氢酶2.其与IDH1基因具有较高的同源性，其突变同样与脑胶质瘤的发生发展相关。
研究表明，在12％的人脑胶质瘤中存在IDH1基因Arg132位点的突变。在II、III和IV胶质瘤中，这种突变率更是达到了71.37％，64.31％和76.42％。Yan等研究显示，17.1％的胶质瘤患者携带有IDH1基因R132突变，1％患者携带IDH2基因R172突变。另据mycancergenome网站的统计数据表明，神经胶质瘤中IDH1基因突变发生的频率为33.0％，IDH2基因突变发生的频率为1.7％，其中IDH1基因突变中87.6％为c.395G>A(R132H)，2.9％为c.394C>T(R132C)；其中IDH2基因突变中58.2％为c.515G>A(R172K)。IDH1/2的体细胞突变与神经胶质瘤病理亚型、遗传图谱和临床特征紧密相关，已成为神经胶质瘤最重要的分子标记之一。
另一方面的研究还显示IDH1和IDH2都参与了细胞内氧化损伤的防御机制,但IDH1在脂质的代谢机制中起了重要作用。通过全基因组测序发现IDH1和IDH2突变存在于急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)及骨髓增殖性疾病(MPD)中,在慢性粒细胞白血病(CML)中尚未检测到突变。2012年Patel等人的研究显示，带有正常核型和核磷蛋白(Nueleophosmin,NPM1)基因突变的病人中，IDH2基因突变与急性髓系白血病(AML)预后良好相关。文献报道IDH1和IDH2突变在原发性正常核型急性粒细胞白血病(CN-AML)患者中的发生率分别为5.5～9.6％和3～11％,并认为具有IDH1和IDH2突变的AML患者具有较低的CR,较高的RR和较短得OS。另据mycancergenome网站的统计数据表明，在AML中，IDH2基因突变发生的频率为6.4％，IDH2基因突变发生的频率为9.1％，其中IDH1基因突变中34.5％为c.394C>T(R132C)，24.5％为c.395G>A(R132H)；IDH2基因突变中74.8％为c.419G>A(R140Q)，20.9％为c.515G>A(R172K)。
IDH1/2基因突变检测对于胶质瘤和血液病患者意义重大，可辅助肿瘤病理正确诊断、分型及分级，判断肿瘤预后，指导临床治疗。同时该检测对肿瘤发病机制的研究具有重要意义，也有利于针对IDH1/2基因不同突变型的相关治疗药物开发。
由于临床上的需求，目前已有针对检测IDH1/2基因突变的商业化应用，如广州好芝生物科技有限公司开发的“人类IDH1/IDH2基因突变检测试剂盒”，其基于荧光PCR-HRM法，可检测1～5％的基因突变。开发一种检测IDH1/2基因热点突变的产品，以实现更高灵敏度、更低成本、更方便快捷的IDH1/2基因突变检测是非常有必要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以覆盖多突变位点检测，模板量低，且快速、准确、高灵敏度的IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种IDH1/2基因突变检测体系，包括引物、探针和扩增阻断引物；
所述引物包括质控正向引物、检测正向引物和通用反向引物；
所述质控正向引物包括针对IDH1基因C394T/G395A位点核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的质控正向引物和针对IDH2基因G419A/G515A位点核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的质控正向引物；
所述检测正向引物包括针对IDH1基因C394T突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的检测正向引物、针对IDH1基因G395A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的检测正向引物、针对IDH2基因G419A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的检测正向引物、针对IDH2基因G515A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的检测正向引物；
所述通用反向引物作为检测反向引物和质控反向引物使用，包括针对IDH1基因C394T/G395A位点核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的通用反向引物和针对IDH2基因G419A/G515A位点核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的通用反向引物；
所述探针包括针对IDH1基因C394T/G395A位点的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示的探针、针对IDH2基因G419A位点核苷酸序列如SEQIDNo.10所示的探针和针对IDH2基因G515A位点核苷酸序列如SEQIDNo.11所示的探针，所述探针序列的5’端设有一种荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3’端设有另一种荧光标记；
所述扩增阻断引物是针对IDH2基因G419A位点核苷酸序列如SEQIDNo.12所示的扩增阻断引物，所述扩增阻断引物的核苷酸序列的3’端设有磷酸化修饰。
本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种IDH1/2基因突变检测体系，包括引物、探针和扩增阻断引物；
所述引物包括质控正向引物、检测正向引物和通用反向引物；
所述质控正向引物包括针对IDH1基因C394T/G395A位点核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的质控正向引物和针对IDH2基因G419A/G515A位点核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的质控正向引物；
所述检测正向引物包括针对IDH1基因C394T突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.13所示的检测正向引物、针对IDH1基因G395A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.14所示的检测正向引物、针对IDH2基因G419A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.15所示的检测正向引物、针对IDH2基因G515A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.16所示的检测正向引物；
所述通用反向引物作为检测反向引物和质控反向引物使用，包括针对IDH1基因C394T/G395A位点核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的通用反向引物和针对IDH2基因G419A/G515A位点核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的通用反向引物；
所述探针包括针对IDH1基因C394T/G395A位点的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示的探针、针对IDH2基因G419A位点核苷酸序列如SEQIDNo.10所示的探针和针对IDH2基因G515A位点核苷酸序列如SEQIDNo.11所示的探针，所述探针序列的5’端设有一种荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3’端设有另一种荧光标记；
所述扩增阻断引物是针对IDH2基因G419A位点核苷酸序列如SEQIDNo.17所示的扩增阻断引物，所述扩增阻断引物的核苷酸序列的3’端设有磷酸化修饰。
上述探针序列的5’端设有FAM荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3’端设有BHQ1荧光标记。
上述IDH1/2基因突变检测体系还包括阳性对照和阴性对照；
所述阳性对照包括含IDH1基因C394T突变型质粒的IDH1基因394位点野生型质粒溶液、含IDH1基因G395A突变型质粒的IDH1基因395位点野生型质粒溶液、含IDH2基因G419A突变型质粒的IDH2基因419位点野生型质粒溶液和含IDH2基因G515A突变型质粒的IDH2基因515位点野生型质粒溶液；
所述阴性对照包括IDH1基因394/395位点野生型质粒溶液和IDH2基因419/515位点野生型质粒溶液。
上述阳性对照和阴性对照中的野生型质粒溶液的浓度为10ng/μl，所述阳性对照中的突变型质粒在野生型质粒溶液中的含量是1％或0.5％。
上述体系的体积为10μl或20μl，所述质控正向引物、检测正向引物和通用反向引物的终浓度为0.4μM，所述探针的终浓度为0.2～0.4μM，所述扩增阻断引物的终浓度为0.8μM，所述阳性对照和阴性对照的终浓度为1～5ng/μl。
上述IDH1/2基因突变检测体系还包括空白对照；所述空白对照是超纯水。
上述IDH1/2基因突变检测体系还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、2.5mM的dNTPs和5U/μl的TaqDNA聚合酶；所述PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl、500mM的KCl和15mM的MgCl2，用于配置所述PCR缓冲液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8.3；所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述检测体系的IDH1/2基因突变检测试剂盒。
本发明具有积极的效果：
(1)本发明的IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒，采用特异引物组合，避开3'端昂贵的锁核酸修饰而引入末端磷酸化的扩增阻断核酸序列，极大地提高了检出率，具有高的灵敏度，灵敏度可达到0.5％～1％。
(2)本发明的IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒检测时间检测时间短，方便快捷，且通量更高。
(3)本发明的IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒检测结果无杂峰，且检测结果以与质控检测结果比较的相对CT值(△CT)作为判断标准，具有高特异性和准确性。
(4)本发明的IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒无需设计复杂的双环探针、同管的内控指标等，且同批次进行多样本相同突变位点检测时阳性对照、阴性对照及空白对照的检测反应及质控反应只需分别做一次，且无论检测反应还是质控反应所耗引物及探针量均较少，成本极低。
附图说明
图1是本发明实施例1的试剂盒检测IDH1基因C394T位点时1％阳性对照a在采用Ct3、Ct4对应反应体系反应后和阴性对照e在采用Ct5、Ct6对应反应体系反应后的扩增曲线图；
图2是本发明实施例1的试剂盒检测IDH1基因C394T位点时18个血液DNA样本在采用Ct1、Ct2对应反应体系反应后的扩增曲线图；
图3是本发明实施例1的试剂盒检测IDH1基因G395A位点时1％阳性对照b在采用Ct3、Ct4对应反应体系反应后和阴性对照e在采用Ct5、Ct6对应反应体系反应后的扩增曲线图；
图4是本发明实施例1的试剂盒检测IDH1基因G395A位点时18个血液DNA样本在采用Ct1、Ct2对应反应体系反应后的扩增曲线图；
图5是本发明实施例2的试剂盒检测IDH2基因G419A位点时1％阳性对照c在采用Ct3、Ct4对应反应体系反应后和阴性对照f在采用Ct5、Ct6对应反应体系反应后的扩增曲线图；
图6是本发明实施例2的试剂盒检测IDH2基因G419A位点时0.5％阳性对照c在采用Ct3、Ct4对应反应体系反应后和阴性对照f在采用Ct5、Ct6对应反应体系反应后的扩增曲线图；
图7是本发明实施例2的试剂盒检测IDH2基因G419A位点时18个血液DNA样本在采用Ct1、Ct2对应反应体系反应后的扩增曲线图；
图8是本发明实施例2的试剂盒检测IDH2基因G515A位点时1％阳性对照d在采用Ct3、Ct4对应反应体系扩增后和阴性对照f在采用Ct5、Ct6对应反应体系反应后的扩增曲线图；
图9是本发明实施例2的试剂盒检测IDH2基因G515A位点时18个血液DNA样本在采用Ct1、Ct2对应反应体系反应后的扩增曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1
一、试剂盒的组成。
本实施例的IDH1/2基因突变检测试剂盒包括：PCR反应液、质控正向引物、检测正向引物、通用反向引物、探针(probe)、扩增阻断引物(blocker)、阳性对照、阴性对照及空白对照，如表1所示。
表1试剂盒组成表
上述表1中试剂盒各组分的说明如下：
PCR反应液由10×PCR缓冲液、dNTPs和热启动酶配制而成。10×PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl、500mM的KCl和15mM的MgCl2，用于配置PCR缓冲液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8.3。dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP，在反应体系中终浓度为0.2mM。热启动酶是使用浓度为5U/μl的TaqDNA聚合酶，在反应体系中终浓度0.05U/μl。10×PCR缓冲液、dNTPs和热启动酶均来自Takara(货号：R007A)。
质控正向引物包括针对IDH1基因C394T/G395A位点质控正向引物和针对IDH2基因G419A/G515A位点质控正向引物。
检测正向引物包括针对IDH1基因C394T突变位点检测正向arms引物、针对IDH1基因G395A突变位点检测正向arms引物、针对IDH2基因G419A突变位点检测正向arms引物和针对IDH2基因G515A突变位点检测正向arms引物。
通用反向引物包括针对IDH1基因C394T/G395A位点通用反向引物和针对IDH2基因G419A/G515A位点通用反向引物。通用反向引物既可作为检测反向引物使用又可作为质控反向引物使用。
探针包括针对IDH1基因C394T/G395A位点探针、针对IDH2基因G419A位点探针和针对IDH2基因G515A位点探针。
扩增阻断引物是针对IDH2基因G419A位点扩增阻断引物。
阳性对照液是浓度为10ng/μl的野生型质粒溶液，含1％(或者0.5％)相应突变质粒。
阴性对照液是浓度为10ng/μl相应野生型质粒溶液。
野生型质粒的获取为野生型质粒常规构建步骤：设计位于突变位点两侧的引物，扩增含对应位点的野生型产物，构建入质粒，挑选并测序验证。
突变型质粒的获取为突变型质粒常规构建步骤：设计一条覆盖相应突变位点并将突变碱基引入到引物序列中的特异引物，与相对应的上游或下游野生型引物配对，扩增含相应突变点的目的片段产物，构建入质粒，挑选并测序验证。
空白对照液为超纯水。
表1中质控正向引物、检测正向引物、通用反向引物、探针和扩增阻断引物的核苷酸序列如表2所示。
表2引物、探针、blocker特征表
引物、探针及blocker均由上海生工生物工程有限公司合成。IDH1/2基因探针的核苷酸序列5’端设有FAM荧光标记，3’端设有BHQ1荧光标记。IDH2基因G419A位点扩增阻断引物的核苷酸序列3’端磷酸化(-PO4)修饰。
二、试剂盒的使用方法。
本实施例的IDH1/2基因突变检测试剂盒的具体检测步骤如下：
1、样本DNA提取。
采用试剂盒(AxygenMultisourceGenomicDNAMiniprepKit)提取样本(样本可以是新鲜病理组织、石蜡包埋病理组织或血液)，具体的操作参见试剂盒产品说明书。
2、样本DNA质量检测。
获得样本DNA后，通过测定浓度和OD260/OD280的比值控制样本质量，最终加入反应体系中的样本，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间的可获得最优反应结果，浓度稀释为20～150ng/μl。
3、PCR反应。
采用本实施例的IDH1/2基因突变检测试剂盒试进行检测，反应体系的体积为10μl，试剂盒各组分的使用浓度及在反应体系中的终浓度详见表1。(反应体系的体积还可以是20μl，在配制时将10μl反应体系中的组分翻倍即可)。
1)配制10μl质控PCR反应体系：
针对IDH1/2基因C394T/G395A/G419A/G515A位点，分别配制10μl体系于每管中。
取10×PCRBuffer1μl，2.5mMdNTPsmixture0.8μl，5U/μlHotStartEnzyme0.1μl，10μM针对IDH1/2基因C394T/G395A/G419A/G515A位点的质控正向引物0.4μl，10μM针对IDH1/2基因C394T/G395A/G419A/G515A位点的通用反向引物0.4μl，10μM针对IDH1/2基因C394T/G395A/G419A/G515A位点的探针0.2μl，模板DNA1μl，H2O6.1μl。
2)配制10μl检测PCR反应体系：
(1)针对IDH1/2基因C394T/G395A/G515A位点，分别配制10μl体系于每管中：
取10×PCRBuffer1μl，2.5mMdNTPsmixture0.8μl，5U/μlHotStartEnzyme0.1μl，10μM针对IDH1/2基因C394T/G395A/G515A位点的检测正向引物0.4μl，10μM针对IDH1/2基因C394T/G395A/G515A突变位点的通用反向引物0.4μl，10μM针对IDH1/2基因C394T/G395A/G515A位点的探针0.2μl，模板DNA1μl，H2O6.1μl。
(2)针对IDH2基因G419A位点，配制10μl体系于管中：
取10×PCRBuffer1μl，2.5mMdNTPmixture0.8μl，5U/μlHotStartEnzyme0.1μl，10μM针对IDH2基因G419A位点检测正向引物0.4μl，10μM针对IDH2基因G419A突变位点通用反向引物0.4μl，10μM针对IDH2基因G419A位点探针0.2μl，10μM针对IDH2基因G419A位点扩增阻断引物0.8μl，模板DNA1μl，H2O5.3μl。
各反应体系详见表3至表6，表3至表6中加入量的单位为μl。反应体系中的模板(表3至表6中的template)分别指对应的样本，阳性对照，阴性对照，空白对照H2O；样本、阳性、阴性对照液加入量控制在20～150ng。
表3检测样本IDH1基因C394T的质控及PCR反应体系
表4检测样本IDH1基因G395A的质控及PCR反应体系
表5检测样本IDH2基因G419A的质控及PCR反应体系
表6检测样本IDH2基因G515A的质控及PCR反应体系
上述各反应中，进行C394T/G395A/G419A/G515A位点检测时，Ct3～Ct8通道的反应只需分别做一管，即可作为不同样本的对照(不同样本对应不同的Ct1或Ct2值)。
3)PCR反应程序。
各反应体系在ABI实时荧光定量PCR仪(Steponeplus荧光定量PCR仪)上进行实时荧光PCR反应，最优反应程序如表7所示。
表7PCR反应程序表
4、PCR结果判定。
各CT值的定义详见表3至表6。
1)试剂盒有效性的判定。
阳性对照有效：若△CT＝Ct4-Ct3<12,判断为阳性对照有效；
阴性对照有效：若Ct5所指向的扩增曲线有明显的指数增长期，且Ct6所指向的扩增曲线无明显的指数增长期或Ct6≥40，可判断为阴性对照有效；或△CT＝Ct6-Ct5≥12,判断为阴性对照有效；
空白对照有效：Ct7和Ct8所指向的扩增曲线无明显的指数增长期，可判断为空白对照有效；或Ct7≥40且Ct8≥40，判断为空白对照有效。
2)检测样本突变结果的判定。
A.对C394T位点或G419A位点的检测：
若△CT＝Ct2-Ct1<10,判断为检测样本的所检测基因型为突变型；
若△CT＝Ct2-Ct1≥10，判断为检测样本的所检测基因型为野生型。
B.对G395A位点的检测：
若△CT＝Ct2-Ct1<8,判断为检测样本的所检测基因型为突变型；
若△CT＝Ct2-Ct1≥8，判断为检测样本的所检测基因型为野生型。
C.对G515A位点的检测：
若△CT＝Ct2-Ct1<9,判断为检测样本的所检测基因型为突变型；
若△CT＝Ct2-Ct1≥9，判断为检测样本的所检测基因型为野生型。
图1是本实施例的试剂盒检测IDH1基因C394T位点时1％阳性对照a在采用Ct3、Ct4对应反应体系反应后和阴性对照e在采用Ct5、Ct6对应反应体系反应后的扩增曲线图。说明采用本实施例的试剂盒检测IDH1基因C394T位点突变情况时，阳性对照和阴性对照均判定为有效。
图2是本实施例的试剂盒检测IDH1基因C394T位点时18个血液DNA样本在采用Ct1、Ct2对应反应体系反应后的扩增曲线图。△CT＝Ct2-Ct1≥10，均判定为IDH1基因C394T位点野生型。说明采用本实施例的试剂盒检测IDH1基因C394T位点突变情况时，突变情况的判定结果与测序结果一致。
图3是本实施例的试剂盒检测IDH1基因G395A位点时1％阳性对照b在采用Ct3、Ct4对应反应体系反应后和阴性对照e在采用Ct5、Ct6对应反应体系反应后的扩增曲线图。说明采用本实施例的试剂盒检测IDH1基因G395A位点突变情况时，阳性对照和阴性对照均判定为有效。
图4是本实施例的试剂盒检测IDH1基因G395A位点时18个血液DNA样本在采用Ct1、Ct2对应反应体系反应后的扩增曲线图。依据对应的△CT＝Ct2-Ct1的判断公式进行判断，说明采用本实施例的试剂盒检测IDH1基因G395A位点突变情况时，突变情况的判定结果与测序结果一致。
另外，检测IDH2基因的G419A位点和G515A位点，测序检测结果与采用本试剂盒的检测结果完全一致。
灵敏度分析：采用本实施例的试剂盒检测10ng/μl的IDH1/2基因各位点野生型质粒溶液(含0.5％IDH1/2基因对应位点突变型质粒)，均可检出，灵敏度达到0.5％。
重复性分析：上述检测反应均采用复孔，每次重复五次，其间的CT值相差不超过0.3个循环。
实施例2
一、试剂盒的组成。
本实施例的IDH1/2基因突变检测试剂盒包括：PCR反应液、质控正向引物、检测正向引物、通用反向引物、探针(probe)、扩增阻断引物(blocker)、阳性对照、阴性对照及空白对照，如表8所示。
表8试剂盒组成表
上述表8中试剂盒各组分的说明如下：
PCR反应液由10×PCR缓冲液、dNTPs和热启动酶配制而成。10×PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl、500mM的KCl和15mM的MgCl2，用于配置PCR缓冲液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8.3。dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP，在反应体系中终浓度为0.2mM。热启动酶是使用浓度为5U/μl的TaqDNA聚合酶，在反应体系中终浓度0.05U/μl。10×PCR缓冲液、dNTPs和热启动酶均来自Takara(货号：R007A)。
质控正向引物包括针对IDH1基因C394T/G395A位点质控正向引物和针对IDH2基因G419A/G515A位点质控正向引物。
检测正向引物包括针对IDH1基因C394T突变位点检测正向arms引物、针对IDH1基因G395A突变位点检测正向arms引物、针对IDH2基因G419A突变位点检测正向arms引物和针对IDH2基因G515A突变位点检测正向arms引物。
通用反向引物包括针对IDH1基因C394T/G395A位点通用反向引物和针对IDH2基因G419A/G515A位点通用反向引物。通用反向引物既可作为检测反向引物使用又可作为质控反向引物使用。
探针包括针对IDH1基因C394T/G395A位点探针、针对IDH2基因G419A位点探针和针对IDH2基因G515A位点探针。
扩增阻断引物是针对IDH2基因G419A位点扩增阻断引物。
阳性对照液是浓度为10ng/μl的野生型质粒溶液，含1％(或者0.5％)相应突变质粒。
阴性对照液是浓度为10ng/μl相应野生型质粒溶液。
野生型质粒的获取为野生型质粒常规构建步骤：设计位于突变位点两侧的引物，扩增含对应位点的野生型产物，构建入质粒，挑选并测序验证。
突变型质粒的获取为突变型质粒常规构建步骤：设计一条覆盖相应突变位点并将突变碱基引入到引物序列中的特异引物，与相对应的上游或下游野生型引物配对，扩增含相应突变点的目的片段产物，构建入质粒，挑选并测序验证。
空白对照液为超纯水。
表8中质控正向引物、检测正向引物、通用反向引物、探针和扩增阻断引物的核苷酸序列如表9所示。
表9引物、探针、blocker特征表
引物、探针及blocker均由上海生工生物工程有限公司合成。IDH1/2基因探针的核苷酸序列5’端设有FAM荧光标记，3’端设有BHQ1荧光标记。IDH2基因G419A位点扩增阻断引物的核苷酸序列3’端磷酸化(-PO4)修饰。
二、试剂盒的使用方法。
本实施例的IDH1/2基因突变检测试剂盒的具体检测步骤如下：
1、样本DNA提取。
采用试剂盒(AxygenMultisourceGenomicDNAMiniprepKit)提取样本(样本可以是新鲜病理组织、石蜡包埋病理组织或血液)，具体的操作参见试剂盒产品说明书。
2、样本DNA质量检测。
获得样本DNA后，通过测定浓度和OD260/OD280的比值控制样本质量，最终加入反应体系中的样本，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间的可获得最优反应结果，浓度稀释为20～150ng/μl。
3、PCR反应。
采用本实施例的IDH1/2基因突变检测试剂盒试进行检测，反应体系的体积为10μl，试剂盒各组分的使用浓度及在反应体系中的终浓度详见表8。(反应体系的体积还可以是20μl，在配制时将10μl反应体系中的组分翻倍即可)。
1)配制10μl质控PCR反应体系：
针对IDH1/2基因C394T/G395A/G419A/G515A位点，分别配制10μl体系于每管中。
取10×PCRBuffer1μl，2.5mMdNTPsmixture0.8μl，5U/μlHotStartEnzyme0.1μl，10μM针对IDH1/2基因C394T/G395A/G419A/G515A位点的质控正向引物0.4μl，10μM针对IDH1/2基因C394T/G395A/G419A/G515A位点的通用反向引物0.4μl，10μM针对IDH1/2基因C394T/G395A/G419A/G515A位点的探针0.2μl，模板DNA1μl，H2O6.1μl。
2)配制10μl检测PCR反应体系：
(1)针对IDH1/2基因C394T/G395A/G515A位点，分别配制10μl体系于每管中：
取10×PCRBuffer1μl，2.5mMdNTPsmixture0.8μl，5U/μlHotStartEnzyme0.1μl，10μM针对IDH1/2基因C394T/G395A/G515A位点的检测正向引物0.4μl，10μM针对IDH1/2基因C394T/G395A/G515A突变位点的通用反向引物0.4μl，10μM针对IDH1/2基因C394T/G395A/G515A位点的探针0.2μl，模板DNA1μl，H2O6.1μl。
(2)针对IDH2基因G419A位点，配制10μl体系于管中：
取10×PCRBuffer1μl，2.5mMdNTPmixture0.8μl，5U/μlHotStartEnzyme0.1μl，10μM针对IDH2基因G419A位点检测正向引物0.4μl，10μM针对IDH2基因G419A突变位点通用反向引物0.4μl，10μM针对IDH2基因G419A位点探针0.2μl，10μM针对IDH2基因G419A位点扩增阻断引物0.8μl，模板DNA1μl，H2O5.3μl。
各反应体系详见表10至表13，表10至表13中加入量的单位为μl。反应体系中的模板(表10至表13中的template)分别指对应的样本，阳性对照，阴性对照，空白对照H2O；样本、阳性、阴性对照液加入量控制在20～150ng。
表10检测样本IDH1基因C394T的质控及PCR反应体系
表11检测样本IDH1基因G395A的质控及PCR反应体系
表12检测样本IDH2基因G419A的质控及PCR反应体系
表13检测样本IDH2基因G515A的质控及PCR反应体系
上述各反应中，进行C394T/G395A/G419A/G515A位点检测时，Ct3～Ct8通道的反应只需分别做一管，即可作为不同样本的对照(不同样本对应不同的Ct1或Ct2值)。
3)PCR反应程序。
各反应体系在ABI实时荧光定量PCR仪(Steponeplus荧光定量PCR仪)上进行实时荧光PCR反应，最优反应程序如表14所示。
表14PCR反应程序表
4、PCR结果判定。
各CT值的定义详见表10至表14。
1)试剂盒有效性的判定。
阳性对照有效：若△CT＝Ct4-Ct3<12,判断为阳性对照有效；
阴性对照有效：若Ct5所指向的扩增曲线有明显的指数增长期，且Ct6所指向的扩增曲线无明显的指数增长期或Ct6≥40，可判断为阴性对照有效；或△CT＝Ct6-Ct5≥12,判断为阴性对照有效；
空白对照有效：Ct7和Ct8所指向的扩增曲线无明显的指数增长期，可判断为空白对照有效；Ct7≥40且Ct8≥40，判断为空白对照有效。
2)检测样本突变结果的判定。
A.对C394T位点或G419A位点的检测：
若△CT＝Ct2-Ct1<10,判断为检测样本的所检测基因型为突变型；
若△CT＝Ct2-Ct1≥10，判断为检测样本的所检测基因型为野生型。
B.对G395A位点的检测：
若△CT＝Ct2-Ct1<8,判断为检测样本的所检测基因型为突变型；
若△CT＝Ct2-Ct1≥8，判断为检测样本的所检测基因型为野生型。
C.对G515A位点的检测：
若△CT＝Ct2-Ct1<9,判断为检测样本的所检测基因型为突变型；
若△CT＝Ct2-Ct1≥9，判断为检测样本的所检测基因型为野生型。
图5是本实施例的试剂盒检测IDH2基因G419A位点时1％阳性对照c在采用Ct3、Ct4对应反应体系反应后和阴性对照f在采用Ct5、Ct6对应反应体系反应后的扩增曲线图。图6是本实施例的试剂盒检测IDH2基因G419A位点时0.5％阳性对照c在采用Ct3、Ct4对应反应体系反应后和阴性对照f在采用Ct5、Ct6对应反应体系反应后的扩增曲线图。说明采用本实施例的试剂盒检测IDH2基因G419A位点突变情况时，阳性对照和阴性对照均判定为有效。
图7是本实施例的试剂盒检测IDH2基因G419A位点时18个血液DNA样本在采用Ct1、Ct2对应反应体系反应后的扩增曲线图。依据对应的△CT＝Ct2-Ct1的判断公式进行判断，采用本实施例的试剂盒检测IDH2基因G419A位点突变情况时，突变情况的判定结果与测序结果一致。
图8是本实施例的试剂盒检测IDH2基因G515A位点时1％阳性对照d在采用Ct3、Ct4对应反应体系扩增后和阴性对照f在采用Ct5、Ct6对应反应体系反应后的扩增曲线图。说明采用本实施例的试剂盒检测IDH2基因G515A位点突变情况时，阳性对照和阴性对照均判定为有效。
图9是本实施例的试剂盒检测IDH2基因G515A位点时18个血液DNA样本在采用Ct1、Ct2对应反应体系反应后的扩增曲线图。依据对应的△CT＝Ct2-Ct1的判断公式进行判断，采用本实施例的试剂盒检测IDH2基因G515A位点突变情况时，突变情况的判定结果与测序结果一致。
另外，检测IDH1基因的C394T位点和G395A位点，测序检测结果与采用本试剂盒的检测结果完全一致。
灵敏度分析：采用本实施例的试剂盒检测10ng/μl的IDH1/2基因各位点野生型质粒溶液(含0.5％IDH1/2基因对应位点突变型质粒)，均可检出，灵敏度达到0.5％。
重复性分析：上述检测反应均采用复孔，每次重复五次，其间的CT值相差不超过0.3个循环。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种IDH1/2基因突变检测体系，包括引物、探针和扩增阻断引物，其特征在于：
所述引物包括质控正向引物、检测正向引物和通用反向引物；
所述质控正向引物包括针对IDH1基因C394T/G395A位点核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的质控正向引物和针对IDH2基因G419A/G515A位点核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的质控正向引物；
所述检测正向引物包括针对IDH1基因C394T突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的检测正向引物、针对IDH1基因G395A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的检测正向引物、针对IDH2基因G419A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的检测正向引物、针对IDH2基因G515A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的检测正向引物；
所述通用反向引物作为检测反向引物和质控反向引物使用，包括针对IDH1基因C394T/G395A位点核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的通用反向引物和针对IDH2基因G419A/G515A位点核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的通用反向引物；
所述探针包括针对IDH1基因C394T/G395A位点的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示的探针、针对IDH2基因G419A位点核苷酸序列如SEQIDNo.10所示的探针和针对IDH2基因G515A位点核苷酸序列如SEQIDNo.11所示的探针，所述探针序列的5’端设有一种荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3’端设有另一种荧光标记；
所述扩增阻断引物是针对IDH2基因G419A位点核苷酸序列如SEQIDNo.12所示的扩增阻断引物，所述扩增阻断引物的核苷酸序列的3’端设有磷酸化修饰。
2.一种IDH1/2基因突变检测体系，包括引物、探针和扩增阻断引物，其特征在于：
所述引物包括质控正向引物、检测正向引物和通用反向引物；
所述质控正向引物包括针对IDH1基因C394T/G395A位点核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的质控正向引物和针对IDH2基因G419A/G515A位点核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的质控正向引物；
所述检测正向引物包括针对IDH1基因C394T突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.13所示的检测正向引物、针对IDH1基因G395A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.14所示的检测正向引物、针对IDH2基因G419A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.15所示的检测正向引物、针对IDH2基因G515A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.16所示的检测正向引物；
所述通用反向引物作为检测反向引物和质控反向引物使用，包括针对IDH1基因C394T/G395A位点核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的通用反向引物和针对IDH2基因G419A/G515A位点核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的通用反向引物；
所述探针包括针对IDH1基因C394T/G395A位点的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示的探针、针对IDH2基因G419A位点核苷酸序列如SEQIDNo.10所示的探针和针对IDH2基因G515A位点核苷酸序列如SEQIDNo.11所示的探针，所述探针序列的5’端设有一种荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3’端设有另一种荧光标记；
所述扩增阻断引物是针对IDH2基因G419A位点核苷酸序列如SEQIDNo.17所示的扩增阻断引物，所述扩增阻断引物的核苷酸序列的3’端设有磷酸化修饰。
3.根据权利要求1或2所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述探针序列的5’端设有FAM荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3’端设有BHQ1荧光标记。
4.根据权利要求1或2所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：还包括阳性对照和阴性对照；
阳性对照包括含IDH1基因C394T突变型质粒的IDH1基因394位点野生型质粒溶液、含IDH1基因G395A突变型质粒的IDH1基因395位点野生型质粒溶液、含IDH2基因G419A突变型质粒的IDH2基因419位点野生型质粒溶液和含IDH2基因G515A突变型质粒的IDH2基因515位点野生型质粒溶液；
所述阴性对照包括IDH1基因394/395位点野生型质粒溶液和IDH2基因419/515位点野生型质粒溶液。
5.根据权利要求4所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述阳性对照和阴性对照中的野生型质粒溶液的浓度为10ng/μl，所述阳性对照中的突变型质粒在野生型质粒溶液中的含量是1%或0.5%。
6.根据权利要求5所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述体系的体积为10μl或20μl，所述质控正向引物、检测正向引物和通用反向引物的终浓度为0.4μM，所述探针的终浓度为0.2～0.4μM，所述扩增阻断引物的终浓度为0.8μM，所述阳性对照和阴性对照的终浓度为1～5ng/μl。
7.根据权利要求1或2所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：还包括空白对照；所述空白对照是超纯水。
8.根据权利要求1或2所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、2.5mM的dNTPs和5U/μl的TaqDNA聚合酶；所述PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl、500mM的KCl和15mM的MgCl2，用于配置所述PCR缓冲液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8.3；所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
9.一种采用如权利要求1或2所述的检测体系的IDH1/2基因突变检测试剂盒。
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