CN103436613A

CN103436613A - Idh1/idh2基因突变的荧光pcr检测试剂盒及其用途

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Publication number: CN103436613A
Application number: CN2013103659054A
Authority: CN
Inventors: 董艳; 韩晞; 盛平
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2013-08-21
Filing date: 2013-08-21
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2033-08-21
Also published as: CN103436613B

Abstract

本发明涉及IDH1/IDH2基因突变的荧光PCR检测试剂盒及其用途，具体提供了用于检测IDH1/IDH2基因突变的核苷酸序列、包含该核苷酸序列的试剂盒及其在检测IDH1/IDH2基因突变中的用途，所述的核苷酸序列包含特异性ARMS引物、突变检测通用TaqMan探针、核酸扩增阻滞引物等。本发明的试剂盒可用于高通量、低成本快速检测IDH1/IDH2基因突变，其灵敏度高、特异性强、污染少、操作快速安全，可适用于临床常见样本如新鲜冰冻组织、石蜡组织，尤其提供了除病理组织之外的非创伤性血清或血浆样本中微量突变的高灵敏度检测。

Description

IDH1/IDH2基因突变的荧光PCR检测试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及分子生物学诊断技术领域，具体地说，涉及一种IDH1/IDH2基因突变的荧光PCR检测试剂盒及其用途。

背景技术

哺乳动物细胞中的IDH（异柠檬酸脱氢酶）家族包括3个成员：IDH1、IDH2和IDH3。IDH1存在于细胞质和过氧化物酶体中，IDH2与IDH3存在于线粒体中。这三种酶都催化异柠檬酸盐（isocitrate，ICT）氧化脱羧产生CO₂和α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）。这些反应需要二价离子（Mg²⁺或Mn²⁺）参与，并且需要辅助因子NADP⁺（IDH1和IDH2）或者NAD⁺（IDH3）作为电子受体，分别产生NADPH或者NADH。IDH1和IDH2是结构相似的同工异构酶，而IDH3与IDH1和IDH2不同，其酶结构是一个包括两个IDH3A亚基、一个IDH3B亚基和一个IDH3G亚基的异四倍体蛋白质。

IDH1基因定位于2q33.3。IDH突变超过90%是IDH1突变，几乎都是发生在酶的底物结合位点之一的残基R132的精氨酸。大约90%为精氨酸被组氨酸替代（R132H），其他少见类型突变也都发生在R132残基，包括半胱氨酸（R132C；3.6%—4.6%）、丝氨酸（R132S；0.8%—2.5%）、甘氨酸（R132G；0.6%—3.8%）或亮氨酸（R132L；0.5%—4.3%）替代精氨酸。其中IDH1 R132C突变与星形细胞瘤密切相关。有研究者分析了Li-Fraumeni综合征家族（TP53种系突变）中星形细胞瘤患者的IDH1突变，发现所有肿瘤的IDH1突变都发生在R132C，表明已经携带TP53突变的前体细胞可以产生这个相对稀有的IDH突变。IDH1酶底物结合位点中还有另外两个保守的精氨酸残基（8100和8109），仅有一篇报道称在两例间变性少突胶质细胞瘤（WHO III级）和一例星形细胞瘤（WHO II级）中存在R100Q突变。

IDH2基因定位于15q26.1。所有IDH突变中IDH2突变仅占3%—5%，甚至更少。突变影响IDH2保守的精氨酸残基R172，导致精氨酸被赖氨酸（R172K）、甲硫氨酸（R172M）、甘氨酸（R172G）或色氨酸（R172W）所替代。另外，IDH2突变仅在没有IDH1突变的胶质瘤中被检出，且IDH2突变主要发生在少突胶质细胞瘤。

迄今为止，还没有任何IDH3与癌症相关的报道。

IDH1/IDH2基因突变发生在肿瘤的早期，并且原发灶和转移灶的IDH1/IDH2基因高度保持一致。一般认为，IDH1/IDH2基因状态不会因治疗而发生变化。IDH1/IDH2基因在多种肿瘤中发生了突变，其发生率在结直肠癌约为40%，胰腺癌为90%以上，肺癌约为15%。IDH1/IDH2基因突变主要集中发生在第2外显子的12和13密码子（≥90%），这些突变破坏了IDH1/IDH2蛋白内在的GTPase活性，从而使得IDH1/IDH2蛋白处于持续活性状态。

带有IDH突变的弥漫性胶质瘤患者与带有野生型IDH的相比，具有较长的生存期。这一规律在WHO II—III级的星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和WHO IV级的胶质母细胞瘤中也相继被证实。IDH突变肿瘤发生于年轻患者，年龄是胶质瘤一个已知的预后因素。实验中发现，IDH1突变是患者总生存率最有力的单一预后因素，其后才是年龄、肿瘤类型和MGMT甲基化状态。预后改善的原因之一可能是突变IDH的生物学结果。突变IDH1 R132H可能阻碍稳定转染的胶质瘤细胞系的生长和转移。现在对于胶质母细胞瘤和WHO II—III级星形细胞瘤来说，IDH突变状态被认为是独立的正性预后因素。因此，在临床实践中检测是否存在IDH突变有重要临床意义。同时，在胶质瘤分类和分级诊断中应该考虑到IDH具体突变情况，以便临床进行分层治疗和判断预后。

以往胶质瘤诊断及其分级主要依赖组织病理学，但仅靠组织形态学，特别是立体定向取材小标本，组织缺乏典型病变，常常不能根据肿瘤的密度、异型性、血管增生、坏死等进行分级。当取材为肿瘤边缘，尤其低级别胶质瘤，或肿瘤治疗后判断是否存在复发情况，区分这些胶质细胞是肿瘤还是反应性增生显得十分困难。直接测序法检测基因突变则存在步骤繁琐、工序复杂、费时费力的不足。

扩增阻碍突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）于1989年建立，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计突变特异性ARMS引物，其3’末端碱基与待检测突变型的突变碱基匹配，用于特异性扩增突变模板。ARMS的检测灵敏度依赖于ARMS引物的特异性和反应条件如酶、镁离子浓度等的优化。为了增加引物的特异性，减少引物与靶DNA发生错配时的错配延伸，可通过在引物3’端的第2-3个碱基引入另外一个或者两个错配碱基，使之与模板之间形成多重错配以阻止错误延伸。相比于组织病理学诊断方法，应用ARMS将显著提高IDH1/IDH2基因突变检测的效率、灵敏度及特异性。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于检测IDH1/IDH2基因突变的核苷酸序列。

本发明的再一的目的是，提供上述核苷酸序列的用途。

本发明的另一的目的是，提供一种IDH1/IDH2基因突变的荧光PCR检测试剂盒。

本发明的第四个目的是，提供上述试剂盒的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于检测IDH1/IDH2基因突变的核苷酸序列，所述的核苷酸序列选自下列中的任一组：

a）特异性ARMS引物，其序列选自SEQ ID NO.6至SEQ ID NO.9任一种或几种；突变检测通用TaqMan探针，其序列为SEQ ID NO.3；核酸扩增阻滞引物，其序列为SEQ ID NO.1，

b）特异性ARMS引物，其序列选自SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.12任一种或几种；突变检测通用TaqMan探针，其序列为SEQ ID NO.4；核酸扩增阻滞引物，其序列为SEQ ID NO.2，

c）特异性ARMS引物I，其序列选自SEQ ID NO.6至SEQ ID NO.9任一种或几种；特异性ARMS引物II，其序列选自SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.12任一种或几种；突变检测通用TaqMan探针，其序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；核酸扩增阻滞引物，其序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

优选的，所述的核苷酸序列还包括能够扩增IDH1野生型及突变型基因组DNA和/或能够扩增IDH2野生型及突变型基因组DNA的上游引物。更优选的，所述的上游引物序列为SEQ ID NO.5。

优选的，所述的核苷酸序列还包括通用下游引物。更优选的，所述的通用下游引物序列为SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述的核苷酸序列在制备检测IDH1/IDH2基因突变的试剂中的用途。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种IDH1/IDH2基因突变的荧光PCR检测试剂盒，所述的试剂盒包含如上任一所述的核苷酸序列。

优选的，所述的试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂溶液、EXtaq酶或阳性对照样品。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的试剂盒在制备检测IDH1/IDH2基因突变的试剂中的用途。

需要说明的是，所述的核酸扩增阻滞引物与野生模板完全匹配，其末端磷酸化，从而抑制IDH1/IDH2基因突变区野生型DNA扩增；所述的ARMS引物共7种，分别用于检测IDH1基因R132H、R132C、R132S、R132G这4种突变型及IDH2基因R172K、R172M、R172G这3种突变类型；7条ARMS引物分别在3’末端碱基与待检测突变型的突变碱基匹配，同时在其3’末端倒数2-3位增加一个或者两个碱基错配，以增加其特异性；所述的阳性对照样品是分别包含IDH1基因第132号密码子4种突变类型及IDH2基因第172密码子3种碱基置换突变类型的质粒基因组DNA。

本发明优点在于：

本发明将核酸扩增阻滞引物和ARMS突变特异性引物相结合，用于检测IDH1/IDH2基因突变，实验结果证实本发明的试剂盒具备以下优点：

1.特异性强：设计的ARMS引物分别针对IDH1基因第132和IDH2基因第172密码子的七种特异突变序列，能特异性扩增相应突变模板DNA；在ARMS引物的3’末端倒数2-3位增加一个或者两个碱基错配，可以增加ARMS引物的特异性；在PCR反应体系中加入野生型IDH基因特异性的核酸扩增阻滞引物，通过抑制野生型基因组DNA扩增从而富集突变型DNA的扩增，进一步提高了检测的特异性。

2.敏感性高：在PCR反应液中加入野生型IDH基因特异性的核酸扩增阻滞引物，通过特异性地抑制野生型模板的扩增，从而达到对微量突变模板的富集作用，提高检测敏感性，检测IDH基因突变敏感度达0.1-1%（即突变基因组DNA达到基因总DNA的0.1-1%即可检出），而直接测序法检测IDH突变的敏感度约为10%（即突变基因组DNA达到基因总DNA的10%才能检出）。

3.检测过程为闭管反应，显著降低了污染及结果偏差的可能性。

4.操作简单快速，从标本送检到得出结果可在三个小时以内完成。而直接测序法检测步骤繁琐：送检标本—提取DNA—PCR扩增—验证PCR产物（电泳）—纯化PCR产物—直接测序，且其经历两个PCR产物的电泳过程，污染机会大，不适合在医院大规模开展。

5.结果判读明确、客观，若需要亦可对结果进行定量分析。

6.高通量，一次最多可检测12例。

7.安全：整个体系中不包含有毒有害物质，无需PCR产物的后处理，对操作员和环境都无危害。

附图说明

图1为用本发明所述荧光PCR检测试剂盒检测间变性胶质细胞瘤阳性样本的IDH突变的扩增曲线图，该样本经测序证实为IDH1第132密码子CGT—GAT突变阳性。

图2为用本发明所述荧光PCR检测试剂盒检测弥漫性星形胶质细胞瘤阳性样本的IDH突变的扩增曲线图，该样本经测序证实为IDH1第132密码子CGT—TGT突变阳性。

图3为用本发明所述荧光PCR检测试剂盒检测少突胶质细胞瘤阳性样本的IDH突变的扩增曲线图，该样本经测序证实为IDH1第132密码子CGT－GGT突变阳性。

图4为用本发明所述荧光PCR检测试剂盒检测继发性胶质母细胞瘤阳性样本的IDH突变的扩增曲线图，该样本经测序证实为IDH1第132密码子CGT－AGT突变阳性。

图5为用本发明所述荧光PCR检测试剂盒检测少突胶质细胞瘤阳性样本的IDH基因突变的扩增曲线图；该样本经测序证实为IDH2第172密码子AGG—AAG突变阳性。

图6为用本发明所述荧光PCR检测试剂盒检测少突胶质细胞瘤阳性样本的IDH突变的扩增曲线图；该样本经测序证实为IDH2第172密码子AGG—ATG突变阳性。

图7为用本发明所述荧光PCR检测试剂盒检测阳性对照样本IDH2基因第172密码子AGG—GGG碱基置换突变的扩增曲线图，该突变形式在中国胶质瘤患者人群中比较少见。

图8为用本发明所述荧光PCR检测试剂盒检测间变性胶质细胞瘤阳性样本的IDH1基因野生型的扩增曲线图。

图9为用本发明所述荧光PCR检测试剂盒检测少突胶质细胞瘤阳性样本的IDH2基因野生型的扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1 引物、探针的设计及验证

1 实验方法

1.1模板DNA的收集

收集临床病理诊断为脑胶质细胞瘤的50例患者的石蜡包埋组织切片或冰冻组织块，从组织中提取基因组DNA供以下的实验应用。用荧光PCR方法检测IDH1基因第132、IDH2基因172密码子常见7种碱基置换突变。

1.2引物设计

设计并筛选能特异性检测上述7种碱基置换突变的特异性ARMS引物各一条及参照引物一条，设计通用下游引物一条，设计并筛选通用TaqMan探针一条，设计并筛选核酸扩增阻滞引物一条，各探针、引物序列分别具体如下：

IDH1核酸扩增阻滞引物的序列如SEQ ID NO.1所示：5’-TTACTTGATCCCCATAAGCATAACG -PO4-3'

IDH2核酸扩增阻滞引物的序列如SEQ ID NO.2所示：5’-cgccatgggcgtgcc -PO4-3'

IDH1突变检测通用TaqMan探针的序列如SEQ ID NO.3所示：5’-FAM-AATGTGCCACTATCACTCCTGATGAGAAGAG -BHQ1-3’

IDH2突变检测通用TaqMan探针的序列如SEQ ID NO.4所示：5’-FAM-AAACATCCCACGCCTAGTCCCTG -BHQ1-3’

IDH1参照引物的序列如SEQ ID NO.5所示：5’-AGCTATAAAGAAGCATAATGTTGGC -3’

针对IDH1基因132号密码子CGT－CAT的特异性ARMS引物序列如SEQ ID NO.6所示：5’-CTTACTTGATCCCCATAAGCATGCT-3’

针对IDH1基因132号密码子CGT－TGT的特异性ARMS引物序列如SEQ ID NO.7所示：5’-CTTACTTGATCCCCATAAGCATGAGA-3’

针对IDH1基因132号密码子CGT－GGT的特异性ARMS引物序列如SEQ ID NO.8所示：5’-CTTACTTGATCCCCATAAGCATAAGC-3'

针对IDH1基因132号密码子CGT－AGT的特异性ARMS引物序列如SEQ ID NO.9所示：5’-CTTACTTGATCCCCATAAGCATGGCT -3’

针对IDH2基因172号密码子AGG－AAG的特异性ARMS引物序列如SEQ ID NO.10所示：5’-TcgccatgggcgtgCAT -3'

针对IDH2基因172号密码子AGG－ATG的特异性ARMS引物序列如SEQ ID NO.11所示：5’- cgccatgggcgtgCGT -3'

针对IDH2基因172号密码子AGG－GGG的特异性ARMS引物序列如SEQ ID NO.12所示：5’-TcgccatgggcgtACAC -3'

另检测IDH1的通用下游引物的序列如SEQ ID NO.13所示: 5’- TTATTGCCAACATGACTTACTTGA-3'

检测IDH2的通用下游引物的序列如SEQ ID NO.14所示: 5’- CTGGTCGCCATGGGCGT-3'。

1.3反应体系的优化

（1）引物浓度的优化：在反应体系其它条件相同的情况下，将引物浓度分别从0.1μM至1.6μM作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较定最佳引物浓度是0.3μM。

（2）探针浓度的优化：在反应体系其他条件相同的情况下，将探针浓度分别从0.05μM至0.5μM作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度是0.1μM。

（3）退火温度的优化：在反应体系其它条件相同的情况下，进行梯度PCR （54－62℃退火温度），通过对试验结果的分析比较，确定最佳退火温度是57℃。

（4）酶的优化：在反应体系中加入各种酶，通过对试验结果的分析比较，确定最佳酶是EXtaq酶。

经优化，反应体系为25μL，包括：qPCR混合反应液19.75μL、通用下游引物各0.75μL（终浓度0.3μM）、参照引物或者突变特异性ARMS引物各0.75μL（终浓度0.3μM）、通用TaqMan探针0.25μL（终浓度0.1μM）、核酸扩增阻滞引物1.5μL（终浓度0.6μM）、模板DNA 2.0μL（终浓度1~300ng/μL）。所述qPCR混合反应液组分及其终浓度为：

PCR buffer终浓度为1× ；

dNTPs终浓度为0.2mM；

EXtaq酶终浓度为0.05U/μl；

MgCl₂终浓度为4mM。

1.4实时荧光定量PCR扩增

每个样本的突变检测在两管中进行，分别为参照管和突变管。每管均加入qPCR混合反应液和模板DNA，参照管中加入参照引物和IDH1通用TaqMan探针，突变管中加入7种ARMS引物和两种通用TaqMan探针（IDH1通用TaqMan探针和IDH2通用TaqMan探针）进行IDH1/IDH2基因突变的荧光PCR检测。PCR反应条件为：95℃预变性10分钟，95℃ 10秒，56℃ 45秒，扩增反应40循环，在56℃ 45秒阶段收集荧光。

2 实验结果

在临床病理诊断的50例脑胶质细胞瘤样本中共检测出24例IDH突变阳性样本，经测序验证，15例样本发生IDH1基因第132密码子CGT－CAT突变，2例样本发生IDH1基因第132密码子CGT－TGT突变，2例样本发生IDH1基因第132密码子CGT－GGT突变，1例样本发生IDH1基因第132密码子CGT－AGT突变，1例样本发生IDH2基因第172密码子AGG－AAG突变，1例样本发生IDH2基因第172密码子突变，1例样本发生IDH2基因第172密码子AGG－ATG突变。另外1例样本IDH1/IDH2基因分型荧光PCR检测判读为IDH1第132密码子CGT—CAT突变阳性，该样本经测序显示为突变阴性，经T-A克隆证实CGT—CAT突变阳性，阳性克隆率约为6%。其余检测结果与直接测序结果均相符合。

上述结果表明应用本发明的引物、探针检测肿瘤组织IDH1/IDH2基因突变灵敏度高，可检测临床样本中的微量突变模板（＜10%）；结果可靠，与突变检测“金标准”直接测序法的结果符合率＞95%。此外该方法检测速度快，操作简单，结果判读客观，闭管反应污染少，非常适合于在临床中大规模开展。

实施例2 试剂盒一

试剂盒中含有下列试剂和材料：

引物溶液：(1)IDH1核酸扩增阻滞引物，序列SEQ ID NO.1，5μmol/L；(2) ARMS引物，序列为SEQ ID NO.6-9中任一种或几种，5μmol/L；(3) IDH1突变检测通用TaqMan探针，序列SEQ ID NO.3，5μmol/L；(4)参照引物，序列SEQ ID NO.5，5μmol/L。

实施例3 试剂盒二

试剂盒中含有下列试剂和材料：

引物溶液：(1)IDH2核酸扩增阻滞引物，序列SEQ ID NO.2，5μmol/L；(2) ARMS引物，序列为SEQ ID NO.10-12中任一种或几种，5μmol/L；(3) IDH2突变检测通用TaqMan探针，序列SEQ ID NO.4，5μmol/L。

实施例4 试剂盒三

试剂盒中含有下列试剂和材料：

引物溶液：(1)IDH1核酸扩增阻滞引物，序列SEQ ID NO.1，5μmol/L；(2)IDH2核酸扩增阻滞引物，序列SEQ ID NO.2，5μmol/L；(3) ARMS引物，包含SEQ ID NO.6-9中的任一种或几种以及SEQ ID NO.10-12中的任一种或几种，每管5μmol/L；(3)PCR通用下游引物，一种序列为SEQ ID NO.13，5μmol/L，另一种序列为SEQ ID NO.14，5μmol/L；(4) IDH1突变检测通用TaqMan探针，序列SEQ ID NO.3，5μmol/L；(5) IDH2突变检测通用TaqMan探针，序列SEQ ID NO.4，5μmol/L；(6)参照引物，序列SEQ ID NO.5，5μmol/L。

实施例5 试剂盒四

1、引物溶液：(1)IDH1核酸扩增阻滞引物，序列SEQ ID NO.1，5μmol/L；(2)IDH2核酸扩增阻滞引物，序列SEQ ID NO.2，5μmol/L；(3) ARMS引物，包含SEQ ID NO.6-9中的任一种或几种以及SEQ ID NO.10-12中的任一种或几种，每管5μmol/L；(3)PCR通用下游引物，一种序列为SEQ ID NO.13，5μmol/L，另一种序列为SEQ ID NO.14，5μmol/L；(4) IDH1突变检测通用TaqMan探针，序列SEQ ID NO.3，5μmol/L；(5) IDH2突变检测通用TaqMan探针，序列SEQ ID NO.4，5μmol/L；(6)参照引物，序列SEQ ID NO.5，5μmol/L；

2、10×PCR缓冲液；

3、dNTPs，2.5mol/L；

4、MgCl₂溶液，1M；

5、EXtaq酶，5U；

6、阳性对照样品，为IDH1基因第132密码子4种碱基置换突变（CGT－CAT，CGT－TGT，CGT－GGT，CGT－AGT）中的任一种质粒基因组DNA，或者为IDH2基因第172密码子3种碱基置换突变（AGG－AAG，AGG－ATG，AGG－GGG）中的任一种质粒基因组DNA。

实施例6 试剂盒的使用方法

具体包括以下步骤：

(1)设计并筛选可检测包含IDH1基因第132号密码子序列的通用TaqMan探针、核酸扩增阻滞引物及4种ARMS引物；设计并筛选可检测包含IDH2基因第172号密码子序列的通用TaqMan探针、核酸扩增阻滞引物及3种ARMS引物；设计并筛选可检测某保守基因片段的TaqMan探针、1种上游引物和下游引物。

1、从非细胞体系或细胞体系中提取的基因组DNA作为模板DNA；

2、进行实时荧光定量PCR扩增：每个样本的突变检测在两管中完成进行，每管加入qPCR混合反应液和模板DNA，参照管中加入参照引物和对应的通用TaqMan探针，突变管中加入所需的ARMS引物和对应的通用TaqMan探针，并加入对应的核酸扩增阻滞引物，进行IDH1/IDH2基因突变的荧光PCR检测；

3、结果判读：

参照孔扩增曲线阳性，突变孔均无扩增曲线或者其与参照孔的扩增曲线△Ct＞12，该样本结果判断为野生型；

参照孔扩增曲线阳性，相应突变孔扩增曲线阳性，且其与参照孔的扩增曲线△Ct＜10，该样本结果判读为突变型；

参照孔扩增曲线阳性，相应突变孔扩增曲线阳性，且其与参照孔的扩增曲线10＜△Ct≤12，该样本结果判读为可疑突变型；如重复检测一次均显示扩增曲线阳性，且△Ct＜12，则该样本结果判读为突变型；

参照孔扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新提取DNA核酸。

其中，步骤1中的模板DNA可以选择自新鲜冰冻或者石蜡包埋的肿瘤组织、外周血细胞、体液的脱落细胞中提取；步骤2中进行PCR扩增反应的条件为：92～96℃预变性10～15min；92～97℃变性10～15s；58～62℃退火40s；40～45个循环。

实施例7 试剂盒临床应用一

1、方法：收集临床病理诊断为脑胶质细胞瘤的20例患者的石蜡包埋组织切片或冰冻组织块，从组织中提取基因组DNA，使用实施例2的试剂盒（其中ARMS引物序列为SEQ ID NO.6）检测这20例有无IDH1基因132号密码子CGT－CAT突变。

PCR反应体系：

（1）突变管：PCR缓冲液为1×；dNTPs为1.0mM；MgCl₂为3mM；EXtaq酶为0.05U/μL；PCR通用下游引物为lμM；IDH1突变检测通用TaqMan探针为0.5μM；IDH1核酸扩增阻滞引物为0.9μM；ARMS引物为0.3μM；待检测DNA模板100ng/μL；

（2）参照管：基本同突变管，用参照引物替代ARMS引物，DNA模板为阳性对照样品，具体为IDH1基因132号密码子CGT－CAT突变的质粒基因组DNA。

PCR反应条件：96℃预变性10min；95℃变性12s；60℃退火40s；40个循环。

2、结果：在临床病理诊断的20例脑胶质细胞瘤样本中共检测出9例IDH1基因132号密码子CGT－CAT突变阳性样本，经测序验证，结果一致。

实施例8 试剂盒临床应用二

1、方法：收集临床病理诊断为脑胶质细胞瘤的20例患者的石蜡包埋组织切片或冰冻组织块，从组织中提取基因组DNA，使用实施例3的试剂盒（其中ARMS引物包含两种，序列分别为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11）检测这20例有无IDH2基因172号密码子AGG－AAG及IDH2基因172号密码子AGG－ATG突变。

PCR反应体系：

（1）突变管：PCR缓冲液为1×；dNTPs为0.5mM；MgCl₂为2mM；EXtaq酶为0.05U/μL；PCR通用下游引物为0.5μM；IDH2突变检测通用TaqMan探针为0.5μM；IDH2核酸扩增阻滞引物为0.9μM；ARMS引物各为0.3μM；待检测DNA模板50ng/μL；

（2）参照管：基本同突变管，用参照引物替代ARMS引物，DNA模板为阳性对照样品，具体为IDH2基因172号密码子AGG－AAG突变的质粒基因组DNA。

2、结果：在临床病理诊断的20例脑胶质细胞瘤样本中共检测出5例IDH2基因172号密码子AGG－AAG突变阳性样本、5例IDH2基因172号密码子AGG－ATG突变阳性样本，经测序验证，结果一致。

实施例9 试剂盒临床应用三

1、方法：收集临床病理诊断为脑胶质细胞瘤的40例患者的石蜡包埋组织切片或冰冻组织块，从组织中提取基因组DNA，使用实施例5的试剂盒（其中ARMS引物包含四种，序列分别为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.12）检测这20例有无IDH1基因132号密码子CGT－CAT突变、IDH1基因132号密码子CGT－AGT突变、IDH2基因172号密码子AGG－AAG突变及IDH2基因172号密码子AGG－GGG突变。

PCR反应体系：

（1）突变管：PCR缓冲液为1×；dNTPs为0.5mM；MgCl₂为2mM；EXtaq酶为0.05U/μL；PCR通用下游引物为0.5μM；IDH1突变检测通用TaqMan探针为0.5μM；IDH2突变检测通用TaqMan探针为0.5μM；IDH1核酸扩增阻滞引物为0.9μM；IDH2核酸扩增阻滞引物为0.9μM；ARMS引物各为0.3μM；待检测DNA模板50ng/μL；

2、结果：在临床病理诊断的40例脑胶质细胞瘤样本中共检测出8例IDH1基因132号密码子CGT－CAT突变阳性样本、4例IDH1基因132号密码子CGT－AGT突变阳性样本、3例IDH2基因172号密码子AGG－AAG突变阳性样本、4例IDH2基因172号密码子AGG－GGG突变阳性样本。经测序验证，结果一致。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军第二军医大学

<120> IDH1/IDH2基因突变的荧光PCR检测试剂盒及其用途

<130> /

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttacttgatc cccataagca taacg 25

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgccatgggc gtgcc 15

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aatgtgccac tatcactcct gatgagaaga g 31

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaacatccca cgcctagtcc ctg 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agctataaag aagcataatg ttggc 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cttacttgat ccccataagc atgct 25

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cttacttgat ccccataagc atgaga 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cttacttgat ccccataagc ataagc 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cttacttgat ccccataagc atggct 26

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcgccatggg cgtgcat 17

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgccatgggc gtgcgt 16

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcgccatggg cgtacac 17

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttattgccaa catgacttac ttga 24

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctggtcgcca tgggcgt 17

Claims

1.一种用于检测IDH1/IDH2基因突变的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列选自下列中的任一组：

2.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列还包括能够扩增IDH1野生型及突变型基因组DNA和/或能够扩增IDH2野生型及突变型基因组DNA的上游引物。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的上游引物序列为SEQ ID NO.5。

4.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列还包括通用下游引物。

5.根据权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的通用下游引物序列为SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14。

6.权利要求1-5任一所述的核苷酸序列在制备检测IDH1/IDH2基因突变的试剂中的用途。

7.一种IDH1/IDH2基因突变的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1-5任一所述的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂溶液、EXtaq酶或阳性对照样品。

9.权利要求7或8所述的试剂盒在制备检测IDH1/IDH2基因突变的试剂中的用途。