CN105441533A - Pik3ca基因突变检测体系及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PIK3CA基因突变检测体系及其试剂盒，包括引物、探针和扩增阻断引物，引物包括通用正向引物、检测反向引物和质控反向引物；检测反向引物包括针对PIK3CA基因E542K突变位点的检测反向引物、针对PIK3CA基因E545K突变位点的检测反向引物、针对PIK3CA基因H1047R突变位点的检测反向引物、针对PIK3CA基因H1047L突变位点的检测反向引物；探针序列的5’端设有一种荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3’端设有另一种荧光标记；扩增阻断引物的核苷酸序列的3’端设有磷酸化修饰。本发明的PIK3CA基因突变检测体系及其试剂盒，可对PIK3CA基因的E542K、E545K、H1047R或H1047L突变位点进行检测，灵敏度高、特异性强、快捷方便。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因突变的检测产品以及该产品所用到的引物、探针、检测体系，属于生物技术领域。
背景技术
癌症研究新近的观点认为，癌症依赖于驱动基因(drivergenes)来维持癌症，这些驱动基因是治疗的最好靶点。驱动基因是癌症发生发展相关的重要基因，是决定了癌症的最主要的原因；当驱动基因突变后，就会把癌细胞“驱动”起来。目前，针对组织学类型和吸烟状态对非小细胞肺癌患者驱动基因分析显示肺癌驱动基因包括EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA和EML4-ALK，肿瘤的产生及进展与这些基因有关；其中，越来越多的研究发现驱动基因突变存在于肺鱗癌，并且可能与肺鱗癌的靶向治疗疗效相关，这些基因包括FGFR1，DDR2和PIK3CA等。研究显示PIK3CA的驱动型突变发生在多种肿瘤中。
PIK3CA是由Volinia在1994年利用原位杂交技术检测到的，其定位于3q26.3，长34kb，包含2O个外显子，编码1068种氨基酸，该组氨基酸产生一组长124kD的蛋白，是磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylino-sitol3-kinases,PI3Ks)信号通路的关键因子。PI3Ks是使磷酯酰肌醇(PI)肌醇环的3位羟基磷酸化的酶，其所调节的信号通路涉及细胞增殖、粘附、生存及能动性等，PI3K/AKT信号通路的活化会导致异常的细胞增生，在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。PIK3CA编码I型PI3K的p110α催化亚基，可以激活PI3K通路的下游AKT通路，促进生长因子独立生长，增加细胞的浸润和转移；PIK3CA是一种脂质激酶编码基因，对细胞的生长、形状变化和运动等能够发挥指导作用。
PIK3CA基因突变可能会导致脂质激酶活性增强,引发一系列细胞变化,使正常细胞的生长失去控制而产生癌变，为体细胞突变癌基因。研究显示PIK3CA基因突变主要发生在肿瘤即将侵入其他组织的时候，主要是发生基因的扩增、缺失、插入和体细胞错义突变。大量数据表明PIK3CA的突变约4/5发生在螺旋区(exon9)和激酶区(exon20)这两个热点区域，其突变不仅可以减少细胞的凋亡还可以促进肿瘤的浸润、提高其下游激酶PI3Ks的活性。PIK3CA常见的突变包括H1047R(3140A>G)、H1047L(3140A>T)、E542K(1624G>A)、E545K(1633G>A)等。
目前已发现PIK3CA基因突变发生于结直肠癌，乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等多种癌症中。研究证实PIK3CA基因突变是最常见的乳腺癌基因变异；约25％乳腺癌在PIK3CA激酶区、螺旋区发生错义突变。PIK3CA基因突变的乳癌患者对ErbB1/ErbB2双重酪氨酸激酶受体抑制剂拉帕替尼(TYKERB，商品名Tykerb)在内的常规HER2靶向治疗耐药。SJIsakoff等还发现PIK3CA基因突变与乳腺表皮细胞的紫杉醇耐药性相关。2013年圣安东尼奥乳腺癌研讨会上来自德国新伊森堡的德国乳腺协会的SibylleLoibl教授指出携带PIK3CA基因突变的HER2阳性和激素受体阳性乳腺癌女性，在接受新辅助治疗(紫杉醇+脂质体阿霉素)后很少会有病理完全缓解，因此需要将乳腺癌PIK3CA突变分析整合到日常操作规程中，以便可以确保患者针对她们的肿瘤类型接受最适合的新辅助治疗。最近研究还证实PIK3CA基因突变可引起乳腺癌患者对Her2靶向药物注射用曲妥珠单抗(Trastuzumab，商品名Herceptin/赫赛汀)的治疗耐药，从而导致疗效欠佳。美国研究人员发现基因PIK3CA产生突变与结肠癌等多种癌症发病存在相关性,发现32％的结肠癌患者体内基因PIK3CA存在突变；研究发现PIK3CA的突变的结直肠癌患者对针对EGFR为靶点的单克隆抗体西妥昔单抗(Cetuximab，商品名Erbitux/尔必得舒)产生耐药。PIK3CA基因检测可为乳腺癌及结直肠癌患者的预后评估及合理用药提供参考依据。
研究表明PIK3CA基因突变也成为肺癌个性化治疗的一种重要的生物标记，有研究发现4％肺癌患者均伴随着PIK3CA突变，发生突变的患者与TKIs类药物耐药相关。研究还发现在成胶质细胞瘤和胃癌中,PIK3CA基因存在突变的比例分别为27％、25％。另2010年欧洲肿瘤内科学会(EMSO)大会上公布的一项表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂EGFR-TKI在治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的预后及疗效预测的研究提示，应将KRAS和PIK3CA突变纳入EGFR-TKI治疗耐药及生存预测标志中，以减轻毒副作用及不必要的医疗花费。
研究显示PIK3CA基因突变还与结直肠癌的死亡率相关。MJhawer等研究发现PIK3CA基因突变或PI3K抑制因子PTEN蛋白表达缺失均比PIK3CA野生型及PTEN蛋白表达的细胞株对于西妥昔单抗耐药(P＝0.008)，提示了PIK3CA基因突变检测对于抗EGFR单克隆抗体的有效性的预测作用。
PIK3CA基因的突变状态，对于指导肿瘤个性化治疗方案及预后评估具有重要意义，已成为一个癌症治疗标志物，对于其两个热点突变区的三个突变位点，即第542、545和1047核苷酸的突变检测，更有利于进行疗效及预后等辅助判别。另外，随着越来越多PI3K信号通路靶向抑制剂的开发，对于PIK3CA基因突变的检测也变得越来越重要。
所以临床上准确快速判断患者是否存在PIK3CA基因的突变对于用药及防治策略选择具有重要意义。因此，开发一种检测PIK3CA基因热点突变的产品，以实现高灵敏度、低成本、方便快捷的PIK3CA基因突变检测是非常有必要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以覆盖多突变位点检测，模板量低，且快速、准确、高灵敏度的PIK3CA基因突变检测体系及其试剂盒。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种PIK3CA基因突变检测体系，包括引物、探针和扩增阻断引物；
所述引物包括通用正向引物、检测反向引物和质控反向引物。
所述通用正向引物作为检测正向引物和质控正向引物使用，包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的通用正向引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的通用正向引物；
所述检测反向引物包括针对PIK3CA基因E542K突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的检测反向引物、针对PIK3CA基因E545K突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的检测反向引物、针对PIK3CA基因H1047R突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的检测反向引物、针对PIK3CA基因H1047L突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的检测反向引物；
所述质控反向引物包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的质控反向引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的质控反向引物；
所述探针包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示的探针和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点核苷酸序列如SEQIDNo.10所示的探针，所述探针序列的5’端设有一种荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3’端设有另一种荧光标记；
所述扩增阻断引物包括针对PIK3CA基因E542K位点的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示的扩增阻断引物、针对PIK3CA基因E545K位点的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示的扩增阻断引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示的扩增阻断引物，所述扩增阻断引物的核苷酸序列的3’端设有磷酸化修饰。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种PIK3CA基因突变检测体系，包括引物、探针和扩增阻断引物，
所述引物包括通用正向引物、检测反向引物和质控反向引物；
所述通用正向引物作为检测正向引物和质控正向引物使用，包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的通用正向引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的通用正向引物；
所述检测反向引物包括针对PIK3CA基因E542K突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.14所示的检测反向引物、针对PIK3CA基因E545K突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.15所示的检测反向引物、针对PIK3CA基因H1047R突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.16所示的检测反向引物、针对PIK3CA基因H1047L突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.17所示的检测反向引物；
所述质控反向引物包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的质控反向引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的质控反向引物；
所述探针包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点的核苷酸序列如SEQIDNo.18所示的探针和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点核苷酸序列如SEQIDNo.19所示的探针，所述探针序列的5’端设有一种荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3’端设有另一种荧光标记；
所述扩增阻断引物包括针对PIK3CA基因E542K位点的核苷酸序列如SEQIDNo.20所示的扩增阻断引物、针对PIK3CA基因E545K位点的核苷酸序列如SEQIDNo.21所示的扩增阻断引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点的核苷酸序列如SEQIDNo.22所示的扩增阻断引物，所述扩增阻断引物的核苷酸序列的3’端设有磷酸化修饰。
上述探针序列的5’端设有FAM荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3’端设有BHQ1荧光标记。
上述PIK3CA基因突变检测体系还包括阳性对照和阴性对照；
所述阳性对照包括含PIK3CA基因E542K突变型质粒的PIK3CA基因542位点野生型质粒溶液、含PIK3CA基因E545K突变型质粒的PIK3CA基因545位点野生型质粒溶液、含PIK3CA基因H1047R突变型质粒的PIK3CA基因1047位点野生型质粒溶液和含PIK3CA基因H1047L突变型质粒的PIK3CA基因1047位点野生型质粒溶液；
所述阴性对照包括PIK3CA基因542/545位点野生型质粒溶液和PIK3CA基因1047位点野生型质粒溶液。
上述阳性对照和阴性对照中的野生型质粒溶液的浓度为10ng/μl，所述阳性对照中的突变型质粒在野生型质粒溶液中的含量是1％、0.5％或0.1％。
上述体系的体积为10μl或20μl，所述通用正向引物、检测反向引物和质控反向引物的终浓度为0.4μM，所述探针的终浓度为0.2～0.4μM，所述扩增阻断引物的终浓度为0.8μM，所述阳性对照和阴性对照的终浓度为1～5ng/μl。
上述PIK3CA基因突变检测体系还包括空白对照；所述空白对照是超纯水。
上述PIK3CA基因突变检测体系还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、2.5mM的dNTPs和5U/μl的TaqDNA聚合酶；所述PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl、500mM的KCl和15mM的MgCl2，用于配置所述PCR缓冲液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8.3；所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述检测体系的PIK3CA基因突变检测试剂盒。
本发明具有积极的效果：
(1)本发明的PIK3CA基因突变检测体系及其试剂盒，采用特异引物组合，避开3'端昂贵的锁核酸修饰而引入末端磷酸化的扩增阻断核酸序列(blocker)，极大地提高了检出率，具有高的灵敏度，灵敏度可达到0.1％～1％。
(2)本发明的PIK3CA基因突变检测体系及其试剂盒检测时间检测时间短，方便快捷，且通量更高。
(3)本发明的PIK3CA基因突变检测体系及其试剂盒检测结果无杂峰，且检测结果以与质控检测结果比较的相对CT值(△CT)作为判断标准，具有高特异性和准确性。
(4)本发明的PIK3CA基因突变检测体系及其试剂盒无需设计复杂的双环探针、同管的内控指标等，且同批次进行多样本相同突变位点检测时阳性对照、阴性对照及空白对照的检测反应及质控反应只需分别做一次，且无论检测反应还是质控反应所耗引物及探针量均较少，成本极低。
附图说明
图1是本发明实施例1的试剂盒检测PIK3CA基因的E542K位点突变情况时4个浓度在20～50ng/μl的血液DNA样本在采用Ct1、Ct2对应反应体系反应后的扩增曲线图。
图2是本发明实施例1的试剂盒检测PIK3CA基因的H1047R位点突变情况时16个浓度在20～50ng/μl的血液样本采用Ct2所对应的反应体系反应后的扩增曲线。
图3是本发明实施例1的试剂盒检测PIK3CA基因的H1047R位点突变情况时16个浓度在20～50ng/μl的血液样本采用Ct1所对应的反应体系反应后的扩增曲线。
图4是本发明实施例2的试剂盒检测PIK3CA基因E545K位点突变情况时4个浓度在20～50ng/μl的血液DNA样本在采用Ct1、Ct2对应反应体系反应后的扩增曲线图。
图5是本发明实施例2的试剂盒检测PIK3CA基因的H1047L位点突变情况时16个浓度在20～50ng/μl的血液样本采用Ct2所对应的反应体系反应后的扩增曲线。
图6是本发明实施例2的试剂盒检测PIK3CA基因的H1047L位点突变情况时16个浓度在20～50ng/μl的血液样本采用Ct1所对应的反应体系反应后的扩增曲线。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1
一、试剂盒的组成。
本实施例的PIK3CA基因突变检测试剂盒包括：PCR反应液、通用正向引物、质控反向引物、检测反向引物、探针(probe)、扩增阻断引物(blocker)、阳性对照、阴性对照及空白对照，如表1所示。
表1试剂盒组成表
上述表1中试剂盒各组分的说明如下：
PCR反应液由10×PCR缓冲液、dNTPs和热启动酶配制而成。10×PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl、500mM的KCl和15mM的MgCl2，用于配置PCR缓冲液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8.3。dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP，在反应体系中终浓度为0.2mM。热启动酶是使用浓度为5U/μl的TaqDNA聚合酶，在反应体系中终浓度0.05U/μl。10×PCR缓冲液、dNTPs和热启动酶均来自Takara(货号：R007A)。
通用正向引物包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点通用正向引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点通用正向引物。通用正向引物既可作为检测正向引物使用又可作为质控正向引物使用。
质控反向引物包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点质控反向引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点质控反向引物。
检测反向引物包括针对PIK3CA基因E542K突变位点检测反向arms引物、针对PIK3CA基因E545K突变位点检测反向arms引物、针对PIK3CA基因H1047R突变位点检测反向arms引物，和针对PIK3CA基因H1047L突变位点检测反向arms引物。
探针包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点探针和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点探针。
扩增阻断引物包括针对PIK3CA基因E542K位点扩增阻断引物、针对PIK3CA基因E545K位点扩增阻断引物、针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点扩增阻断引物。
阳性对照液是浓度为10ng/μl的野生型质粒溶液，含1％(或者0.5％，或者0.1％)相应突变质粒。
阴性对照液是浓度为10ng/μl相应野生型质粒溶液。
野生型质粒的获取为野生型质粒常规构建步骤：设计位于突变位点两侧的引物，扩增含对应位点的野生型产物，构建入质粒，挑选并测序验证。
突变型质粒的获取为突变型质粒常规构建步骤：设计一条覆盖相应突变位点并将突变碱基引入到引物序列中的特异引物，与相对应的上游或下游野生型引物配对，扩增含相应突变点的目的片段产物，构建入质粒，挑选并测序验证。
空白对照液为超纯水。
表1中通用正向引物、质控反向引物、检测反向引物、探针和扩增阻断引物的核苷酸序列如表2所示。
表2引物、探针、blockers特征表
引物、探针及blocker均由上海生工生物工程有限公司合成。PIK3CA基因探针的核苷酸序列5’端设有FAM荧光标记，3’端设有BHQ1荧光标记。PIK3CA基因扩增阻断引物的核苷酸序列3’端磷酸化(-PO4)修饰。
二、试剂盒的使用方法。
本实施例的PIK3CA基因突变检测试剂盒的具体检测步骤如下：
1、样本DNA提取。
采用试剂盒(AxygenMultisourceGenomicDNAMiniprepKit)提取样本(样本可以是新鲜病理组织、石蜡包埋病理组织或血液)，具体的操作参见试剂盒产品说明书。
2、样本DNA质量检测。
获得样本DNA后，通过测定浓度和OD260/OD280的比值控制样本质量，最终加入反应体系中的样本，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间的可获得最优反应结果，浓度稀释为10～50ng/μl。
3、PCR反应。
采用本实施例的PIK3CA基因突变检测试剂盒试进行检测，反应体系的体积为10μl，试剂盒各组分的使用浓度及在反应体系中的终浓度详见表1。(反应体系的体积还可以是20μl，在配制时将10μl反应体系中的组分翻倍即可)。
1)配制10μl质控PCR反应体系：
取10×PCRBuffer1μl，2.5mMdNTPsmixture0.8μl，5U/μlHotStartEnzyme0.1μl，10μM针对PIK3CA基因E542K/E545K/H1047R/H1047L位点的通用正向引物0.4μl，10μM针对PIK3CA基因E542K/E545K/H1047R/H1047L位点的质控反向引物0.4μl，10μM针对PIK3CA基因E542K/E545K/H1047R/H1047L位点的探针0.2μl，模板DNA1μl，H2O6.1μl。
2)配制10μl检测PCR反应体系：
取10×PCRBuffer1μl，2.5mMdNTPsmixture0.8μl，5U/μlHotStartEnzyme0.1μl，10μM针对PIK3CA基因E542K/E545K/H1047R/H1047L位点的通用正向引物0.4μl，10μM针对PIK3CA基因E542K/E545K/H1047R/H1047L突变位点的检测反向引物0.4μl，10μM针对PIK3CA基因E542K/E545K/H1047R/H1047L位点的探针0.2μl，10μM针对PIK3CA基因E542K/E545K/H1047R/H1047L位点的扩增阻断引物0.8μl，模板DNA1μl，H2O5.3μl。
各反应体系详见表3至表6，表3至表6中加入量的单位为μl。反应体系中的模板(表3至表6中的template)分别指对应的样本，阳性对照，阴性对照，空白对照H2O；样本、阳性、阴性对照液加入量控制在10～50ng。
表3检测样本PIK3CA基因E542K的质控及PCR反应体系
表4检测样本PIK3CA基因E545K的质控及PCR反应体系
表5检测样本PIK3CA基因H1047R的质控及PCR反应体系
表6检测样本PIK3CA基因H1047L的质控及PCR反应体系
上述各反应中，进行E542K/E545K/H1047R/H1047L位点检测时，Ct3～Ct8通道的反应只需分别做一管，即可作为不同样本的对照(不同样本对应不同的Ct1或Ct2值)。
3)PCR反应程序。
各反应体系在ABI实时荧光定量PCR仪(Steponeplus荧光定量PCR仪)上进行实时荧光PCR反应，最优反应程序如表7所示。
表7PCR反应程序表
4、PCR结果判定。
各CT值的定义详见表3至表6。
1)试剂盒有效性的判定。
阳性对照有效：若△CT＝Ct4-Ct3<12,判断为阳性对照有效；
阴性对照有效：若Ct5所指向的扩增曲线有明显的指数增长期，且Ct6所指向的扩增曲线无明显的指数增长期或Ct6≥40，可判断为阴性对照有效；或△CT＝Ct6-Ct5≥12,判断为阴性对照有效；
空白对照有效：Ct7和Ct8所指向的扩增曲线无明显的指数增长期，可判断为空白对照有效；或Ct7≥40且Ct8≥40，判断为空白对照有效。
2)检测样本突变结果的判定。
A.对PIK3CA基因的E545K位点或H1047L位点的检测：
若△CT＝Ct2-Ct1<12,判断为检测样本的所检测基因型为突变型；
若△CT＝Ct2-Ct1≥12，判断为检测样本的所检测基因型为野生型。
B.对PIK3CA基因的E542K位点的检测：
若△CT＝Ct2-Ct1<10,判断为检测样本的所检测基因型为突变型；
若△CT＝Ct2-Ct1≥10，判断为检测样本的所检测基因型为野生型。
C.对PIK3CA基因的H1047R位点的检测：
若△CT＝Ct2-Ct1<11,判断为检测样本的所检测基因型为突变型；
若△CT＝Ct2-Ct1≥11，判断为检测样本的所检测基因型为野生型。
图1是本实施例的试剂盒检测PIK3CA基因E542K位点时4个浓度在20～50ng/μl的血液DNA样本在采用Ct1、Ct2对应反应体系反应后的扩增曲线图。依据对应的△CT＝Ct2-Ct1的判断公式进行判断，说明采用本实施例的试剂盒检测PIK3CA基因E542K位点时突变情况时，突变情况的判定结果与测序结果一致。
图2是本实施例的试剂盒检测PIK3CA基因的H1047R位点突变时16个浓度在20～50ng/μl的血液样本采用Ct2所对应的反应体系反应后的扩增曲线。图3是本实施例的试剂盒检测PIK3CA基因的H1047R位点突变时16个浓度在20～50ng/μl的血液样本采用Ct1所对应的反应体系反应后的扩增曲线。依据对应的△CT＝Ct2-Ct1的判断公式进行判断，采用本实施例的试剂盒检测PIK3CA基因的H1047R位点突变情况的判定结果与测序结果一致。
另外，检测PIK3CA基因的E545K位点和H1047L位点，测序检测结果与采用本试剂盒的检测结果完全一致。
灵敏度分析：采用本实施例的试剂盒检测10ng/μl的PIK3CA基因各位点野生型质粒溶液(含0.1％PIK3CA基因对应位点突变型质粒)，均可检出，灵敏度达到0.1％。
重复性分析：上述检测反应均采用复孔，每次重复三次，其间的CT值相差不超过0.2个循环。
实施例2
一、试剂盒的组成。
本实施例的PIK3CA基因突变检测试剂盒包括：PCR反应液、通用正向引物、质控反向引物、检测反向引物、探针(probe)、扩增阻断引物(blocker)、阳性对照、阴性对照及空白对照，如表8所示。
表8试剂盒组成表
上述表8中试剂盒各组分的说明如下：
PCR反应液由10×PCR缓冲液、dNTPs和热启动酶配制而成。10×PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl、500mM的KCl和15mM的MgCl2，用于配置PCR缓冲液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8.3。dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP，在反应体系中终浓度为0.2mM。热启动酶是使用浓度为5U/μl的TaqDNA聚合酶，在反应体系中终浓度0.05U/μl。10×PCR缓冲液、dNTPs和热启动酶均来自Takara(货号：R007A)。
通用正向引物包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点通用正向引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点通用正向引物。通用正向引物既可作为检测正向引物使用又可作为质控正向引物使用。
质控反向引物包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点质控反向引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点质控反向引物。
检测反向引物包括针对PIK3CA基因E542K突变位点检测反向arms引物、针对PIK3CA基因E545K突变位点检测反向arms引物、针对PIK3CA基因H1047R突变位点检测反向arms引物，和针对PIK3CA基因H1047L突变位点检测反向arms引物。
探针包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点探针和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点探针。
扩增阻断引物包括针对PIK3CA基因E542K位点扩增阻断引物、针对PIK3CA基因E545K位点扩增阻断引物、针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点扩增阻断引物。
阳性对照液是浓度为10ng/μl的野生型质粒溶液，含1％(或者0.5％，或者0.1％)相应突变质粒。
阴性对照液是浓度为10ng/μl相应野生型质粒溶液。
野生型质粒的获取为野生型质粒常规构建步骤：设计位于突变位点两侧的引物，扩增含对应位点的野生型产物，构建入质粒，挑选并测序验证。
突变型质粒的获取为突变型质粒常规构建步骤：设计一条覆盖相应突变位点并将突变碱基引入到引物序列中的特异引物，与相对应的上游或下游野生型引物配对，扩增含相应突变点的目的片段产物，构建入质粒，挑选并测序验证。
空白对照液为超纯水。
表8中通用正向引物、质控反向引物、检测反向引物、探针和扩增阻断引物的核苷酸序列如表9所示。
表9引物、探针、blockers特征表
引物、探针及blocker均由上海生工生物工程有限公司合成。PIK3CA基因探针的核苷酸序列5’端设有FAM荧光标记，3’端设有BHQ1荧光标记。PIK3CA基因扩增阻断引物的核苷酸序列3’端磷酸化(-PO4)修饰。
二、试剂盒的使用方法。
本实施例的PIK3CA基因突变检测试剂盒的具体检测步骤如下：
1、样本DNA提取。
采用试剂盒(AxygenMultisourceGenomicDNAMiniprepKit)提取样本(样本可以是新鲜病理组织、石蜡包埋病理组织或血液)，具体的操作参见试剂盒产品说明书。
2、样本DNA质量检测。
获得样本DNA后，通过测定浓度和OD260/OD280的比值控制样本质量，最终加入反应体系中的样本，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间的可获得最优反应结果，浓度稀释为10～50ng/μl。
3、PCR反应。
采用本实施例的PIK3CA基因突变检测试剂盒试进行检测，反应体系的体积为10μl，试剂盒各组分的使用浓度及在反应体系中的终浓度详见表8。(反应体系的体积还可以是20μl，在配制时将10μl反应体系中的组分翻倍即可)。
1)配制10μl质控PCR反应体系：
取10×PCRBuffer1μl，2.5mMdNTPsmixture0.8μl，5U/μlHotStartEnzyme0.1μl，10μM针对PIK3CA基因E542K/E545K/H1047R/H1047L位点的通用正向引物0.4μl，10μM针对PIK3CA基因E542K/E545K/H1047R/H1047L位点的质控反向引物0.4μl，10μM针对PIK3CA基因E542K/E545K/H1047R/H1047L位点的探针0.2μl，模板DNA1μl，H2O6.1μl。
2)配制10μl检测PCR反应体系：
取10×PCRBuffer1μl，2.5mMdNTPsmixture0.8μl，5U/μlHotStartEnzyme0.1μl，10μM针对PIK3CA基因E542K/E545K/H1047R/H1047L位点的通用正向引物0.4μl，10μM针对PIK3CA基因E542K/E545K/H1047R/H1047L突变位点的检测反向引物0.4μl，10μM针对PIK3CA基因E542K/E545K/H1047R/H1047L位点的探针0.2μl，10μM针对PIK3CA基因E542K/E545K/H1047R/H1047L位点的扩增阻断引物0.8μl，模板DNA1μl，H2O5.3μl。
各反应体系详见表10至表13，表10至表13中加入量的单位为μl。反应体系中的模板(表10至表13中的template)分别指对应的样本，阳性对照，阴性对照，空白对照H2O；样本、阳性、阴性对照液加入量控制在10～50ng。
表10检测样本PIK3CA基因E542K的质控及PCR反应体系
表11检测样本PIK3CA基因E545K的质控及PCR反应体系
表12检测样本PIK3CA基因H1047R的质控及PCR反应体系
表13检测样本PIK3CA基因H1047L的质控及PCR反应体系
上述各反应中，进行E542K/E545K/H1047R/H1047L位点检测时，Ct3～Ct8通道的反应只需分别做一管，即可作为不同样本的对照(不同样本对应不同的Ct1或Ct2值)。
3)PCR反应程序。
各反应体系在ABI实时荧光定量PCR仪(Steponeplus荧光定量PCR仪)上进行实时荧光PCR反应，最优反应程序如表14所示。
表14PCR反应程序表
4、PCR结果判定。
各CT值的定义详见表10至表13。
1)试剂盒有效性的判定。
阳性对照有效：若△CT＝Ct4-Ct3<12,判断为阳性对照有效；
阴性对照有效：若Ct5所指向的扩增曲线有明显的指数增长期，且Ct6所指向的扩增曲线无明显的指数增长期或Ct6≥40，可判断为阴性对照有效；或△CT＝Ct6-Ct5≥12,判断为阴性对照有效；
空白对照有效：Ct7和Ct8所指向的扩增曲线无明显的指数增长期，可判断为空白对照有效；或Ct7≥40且Ct8≥40，判断为空白对照有效。
2)检测样本突变结果的判定。
A.对PIK3CA基因的E545K位点或H1047L位点的检测：
若△CT＝Ct2-Ct1<12,判断为检测样本的所检测基因型为突变型；
若△CT＝Ct2-Ct1≥12，判断为检测样本的所检测基因型为野生型。
B.对PIK3CA基因的E542K位点的检测：
若△CT＝Ct2-Ct1<10,判断为检测样本的所检测基因型为突变型；
若△CT＝Ct2-Ct1≥10，判断为检测样本的所检测基因型为野生型。
C.对PIK3CA基因的H1047R位点的检测：
若△CT＝Ct2-Ct1<11,判断为检测样本的所检测基因型为突变型；
若△CT＝Ct2-Ct1≥11，判断为检测样本的所检测基因型为野生型。
图4是本实施例的试剂盒检测PIK3CA基因E545K位点时4个浓度在20～50ng/μl的血液DNA样本在采用Ct1、Ct2对应反应体系反应后的扩增曲线图。依据对应的△CT＝Ct2-Ct1的判断公式进行判断，说明采用本实施例的试剂盒检测PIK3CA基因E545K位点时突变情况时，突变情况的判定结果与测序结果一致。
图5是本实施例的试剂盒检测PIK3CA基因的H1047L位点突变时16个浓度在20～50ng/μl的血液样本采用Ct2所对应的反应体系反应后的扩增曲线。图6是本实施例的试剂盒检测PIK3CA基因的H1047L位点突变时16个浓度在20～50ng/μl的血液样本采用Ct1所对应的反应体系反应后的扩增曲线。依据对应的△CT＝Ct2-Ct1的判断公式进行判断，采用本实施例的试剂盒检测PIK3CA基因的H1047L位点突变情况的判定结果与测序结果一致。
另外，检测PIK3CA基因的E542K位点和H1047R位点，测序检测结果与采用本试剂盒的检测结果完全一致。
灵敏度分析：采用本实施例的试剂盒检测10ng/μl的PIK3CA基因各位点野生型质粒溶液(含0.1％PIK3CA基因对应位点突变型质粒)，均可检出，灵敏度达到0.1％。
重复性分析：上述检测反应均采用复孔，每次重复三次，其间的CT值相差不超过0.2个循环。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种PIK3CA基因突变检测体系，包括引物、探针和扩增阻断引物，其特征在于：
所述引物包括通用正向引物、检测反向引物和质控反向引物；
所述通用正向引物作为检测正向引物和质控正向引物使用，包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的通用正向引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的通用正向引物；
所述检测反向引物包括针对PIK3CA基因E542K突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的检测反向引物、针对PIK3CA基因E545K突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的检测反向引物、针对PIK3CA基因H1047R突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的检测反向引物、针对PIK3CA基因H1047L突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的检测反向引物；
所述质控反向引物包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的质控反向引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的质控反向引物；
所述探针包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示的探针和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点核苷酸序列如SEQIDNo.10所示的探针，所述探针序列的5’端设有一种荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3’端设有另一种荧光标记；
所述扩增阻断引物包括针对PIK3CA基因E542K位点的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示的扩增阻断引物、针对PIK3CA基因E545K位点的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示的扩增阻断引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示的扩增阻断引物，所述扩增阻断引物的核苷酸序列的3’端设有磷酸化修饰。
2.一种PIK3CA基因突变检测体系，包括引物、探针和扩增阻断引物，其特征在于：
所述引物包括通用正向引物、检测反向引物和质控反向引物；
所述通用正向引物作为检测正向引物和质控正向引物使用，包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的通用正向引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的通用正向引物；
所述检测反向引物包括针对PIK3CA基因E542K突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.14所示的检测反向引物、针对PIK3CA基因E545K突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.15所示的检测反向引物、针对PIK3CA基因H1047R突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.16所示的检测反向引物、针对PIK3CA基因H1047L突变位点核苷酸序列如SEQIDNo.17所示的检测反向引物；
所述质控反向引物包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的质控反向引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的质控反向引物；
所述探针包括针对PIK3CA基因E542K/E545K位点的核苷酸序列如SEQIDNo.18所示的探针和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点核苷酸序列如SEQIDNo.19所示的探针，所述探针序列的5’端设有一种荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3’端设有另一种荧光标记；
所述扩增阻断引物包括针对PIK3CA基因E542K位点的核苷酸序列如SEQIDNo.20所示的扩增阻断引物、针对PIK3CA基因E545K位点的核苷酸序列如SEQIDNo.21所示的扩增阻断引物和针对PIK3CA基因H1047R/H1047L位点的核苷酸序列如SEQIDNo.22所示的扩增阻断引物，所述扩增阻断引物的核苷酸序列的3’端设有磷酸化修饰。
3.根据权利要求1或2所述的PIK3CA基因突变检测体系，其特征在于：所述探针序列的5’端设有FAM荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3’端设有BHQ1荧光标记。
4.根据权利要求1或2所述的PIK3CA基因突变检测体系，其特征在于：还包括阳性对照和阴性对照；
所述阳性对照包括含PIK3CA基因E542K突变型质粒的PIK3CA基因542位点野生型质粒溶液、含PIK3CA基因E545K突变型质粒的PIK3CA基因545位点野生型质粒溶液、含PIK3CA基因H1047R突变型质粒的PIK3CA基因1047位点野生型质粒溶液和含PIK3CA基因H1047L突变型质粒的PIK3CA基因1047位点野生型质粒溶液；
所述阴性对照包括PIK3CA基因542/545位点野生型质粒溶液和PIK3CA基因1047位点野生型质粒溶液。
5.根据权利要求4所述的PIK3CA基因突变检测体系，其特征在于：所述阳性对照和阴性对照中的野生型质粒溶液的浓度为10ng/μl，所述阳性对照中的突变型质粒在野生型质粒溶液中的含量是1%、0.5%或0.1%。
6.根据权利要求5所述的PIK3CA基因突变检测体系，其特征在于：所述体系的体积为10μl或20μl，所述通用正向引物、检测反向引物和质控反向引物的终浓度为0.4μM，所述探针的终浓度为0.2～0.4μM，所述扩增阻断引物的终浓度为0.8μM，所述阳性对照和阴性对照的终浓度为1～5ng/μl。
7.根据权利要求1或2所述的PIK3CA基因突变检测体系，其特征在于：还包括空白对照；所述空白对照是超纯水。
8.根据权利要求1或2所述的PIK3CA基因突变检测体系，其特征在于：还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、2.5mM的dNTPs和5U/μl的TaqDNA聚合酶；所述PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl、500mM的KCl和15mM的MgCl2，用于配置所述PCR缓冲液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8.3；所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
9.一种采用如权利要求1或2所述的检测体系的PIK3CA基因突变检测试剂盒。
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| GR01 | Patent grant | ||
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