CN110029171B - 一种利用茎环引物检测pik3ca基因突变位点的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种使用茎环引物检测PIK3CA基因突变位点的试剂盒，该试剂盒包括：一组茎环引物，其上游引物为如SEQ ID NO.1所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.8所示序列；以及两条如SEQ ID NO.9‑10所示的MGB荧光探针。本发明能克服现有一代测序技术低通量，二代测序技术耗时长，荧光定量PCR检测能力有限等缺点，且具有灵敏度强、特异性好、快速、通量高等优点。

Description

一种利用茎环引物检测PIK3CA基因突变位点的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测PIK3CA基因（H1047R）位点突变的试剂盒，尤其涉及一种利用茎环引物检测PIK3CA基因突变位点的试剂盒。本试剂盒用于石蜡包埋病理组织样本中对人类PIK3CA基因H1047R位点突变的定性检测。

背景技术

PIK3CA基因在人体正常脑、肺、乳腺、胃肠、宫颈、卵巢等组织中均有表达，具有调控机体细胞增殖、存活、死亡、分化等重要生理功能，生理情况下多以非激活态形式存在，通常不易被检测到。但多种肿瘤组织中可检测到PIK3CA基因突变，突变的PIK3CA异常激活PI3K-AKT信号通路，导致细胞周期异常、细胞黏附性下降、细胞凋亡下调及新生血管形成等，促进肿瘤发生发展。研究表明PIK3CA基因突变与乳腺癌、结直肠癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌等的发生、发展、分化、转移及耐药密切相关，有望癌症的早期诊断、基因筛查、治疗方案制定、复发随访等方面提供一定的临床证据。

目前，PIK3CA基因突变检测技术主要有测序技术和荧光定量PCR（qPCR）技术两大类：测序技术中包含一代测序即sanger测序技术和新一代测序技术也称为二代测序技术。其中一代测序技术一般一次只能检测一个位点一个样本，检测通量低且耗时长，并且一代测序只能准确检测某个基因位点纯合或杂合突变；二代测序技术，检测通量高，但是检测前有复杂的样本处理及测序文库构建过程，检测后有复杂的生物信息学分析过程，整个检测周期很长，且一般5%-10%以下的突变比例检测如果测序深度不够，会影响检测结果准确性，如果加大测序深度，则二代测序成本会提高很多。 qPCR技术可以对突变进行快速，高通量的检测。但对于低浓度，低突变频率的样本qPCR无法得到准确的检测结果，且无法对样本进行突变频率的计算。

中国发明专利申请CN 201410232729公开了PIK3CA基因突变检测试剂盒，

其使用qPCR的方法，因此存在以下缺陷：对于低浓度，低突变频率的样本qPCR无法得到准确的检测结果，且无法对样本进行突变频率的计算。

茎环引物（Stem loop primer）是一条可以自身形成茎环结构的核苷酸序列，约30-50bp，由特异性目的基因序列，通用序列，与目的基因特异性互补序列3部分构成，通用序列是可以成环的与待测目的序列基因组DNA无任何互补的核苷酸片段。茎环引物在高温条件下发生解链，避免了非特异性扩增和引物二聚体的发生，可以有效提高PCR检测的特异性。

中国发明专利CN201410067044公开了一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法。其公开的是一种针对RNA作为模板的逆转录茎环引物，用于检测基因表达，本专利针对的是DNA做模板的荧光定量PCR茎环引物，用于基因突变检测，两种引物检测模板不同，作用不同。专利CN201410067044茎环引物在逆转录阶段通过延长逆转录产物的长度，便于后续过程中qPCR 引物设计，以利于PCR 产物扩增。本专利茎环引物的作用在于减少引物之间的非特异性结合，两种引物所要达到的作用和效果不同。

目前尚未有将茎环引物应用于基因突变位点检测的相关报道，更没有利用茎环引物检测PIK3CA基因突变位点的方法及其试剂盒的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用茎环引物检测PIK3CA基因突变位点的试剂盒。该试剂盒是基于优选扩增反应茎环引物、MGB荧光探针和ddPCR系统的高灵敏度，高特异性试剂盒，其能克服现有一代测序技术低通量、耗时长、检测能力有限的问题，也可以克服二代测序操作繁琐、分析复杂、成本高等缺点。由于PIK3CA基因突变位点与野生型仅有一个碱基差异，易造成检出假阳性以及位点之间的交叉反应，本试剂盒采用微滴式的独立反应系统，具有高效、快速、准确性高、特异性强、灵敏度高等优点。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种利用茎环引物检测PIK3CA基因突变位点的试剂盒，该试剂盒包括：一组茎环引物，其上游引物为如SEQ ID NO.1所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.8所示序列；以及两条如SEQ ID NO.9-10所示的MGB荧光探针。

作为本发明优选的技术方案，所述试剂盒还包括：阳性标准品，阴性标准品。

作为本发明优选的技术方案，所述试剂盒还包括：用于探针法的2 × ddPCR缓冲液（即2 × ddPCR supermix for Probes）。

作为本发明优选的技术方案，所述试剂盒检测PIK3CA基因的突变位点为H1047R位点，采用该试剂盒进行PIK3CA基因突变位点检测的方法包括以下步骤：

1）提取样本DNA，将其作为DNA模板；

2）针对突变位点设计合成一组茎环引物，两条如SEQ ID NO.9-10所示的MGB荧光探针；所述一组茎环引物的上游引物为如SEQ ID NO.1所示序列，其下游引物为如SEQ IDNO.8所示序列；

3）将步骤2）中的引物和探针与数字PCR试剂混合，加入步骤1）中提取的DNA，放入微滴发生器中制备微滴；

4）将步骤3）中生成的微滴放入PCR仪器进行PCR扩增反应（即进行PCR扩增突变基因序列）；

5）将步骤4）扩增好的PCR产物连同反应板一起放入微滴分析仪中进行检测，通过软件分析读取结果。

作为本发明优选的技术方案，所述步骤1）中，所述样本包括：新鲜组织样本、石蜡包埋组织切片样本、血浆样本等。

作为本发明优选的技术方案，所述步骤2）中，所述茎环引物的5’端和3’端互补配对，中间序列成环，形成茎环结构；所述MGB荧光探针的5’端和3’端分别连接有荧光基团和淬灭基团；其中，5’端的荧光基团选自FAM、VIC、HEX、CY5和ROX中的任意一种，优选为FAM或VIC；3’端的淬灭基团可选自MGB、BHQ（如BHQ 1等）、Eclipse 和TAMRA中的任意一种，优选为MGB。

作为本发明优选的技术方案，所述步骤4）中，所述PCR扩增的总体积为20 μL的反应体系如下：

2 × ddPCR supermix for probes 10μL

各条引物 0.005～1.0μmol

探针 0.001～1.0μmol

10ng/μL DNA模板 0.1～1.0μL

水 补足至20μL；

其中，所述荧光PCR扩增中的2 × ddPCR supermix for probes来自Bio-Rad公司，水来自LIFE TECH公司。

作为本发明优选的技术方案，所述步骤4）中，所述荧光PCR扩增的反应条件如下：

95℃预变性10分钟，45个循环，94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟， 98℃酶灭活10分钟，检测微滴荧光信号。

作为本发明优选的技术方案，所述步骤4）中，还包括：利用如SEQ ID NO.1所示正向茎环引物和SEQ ID NO.8所示反向引物，及SEQ ID NO.9-10所示的MGB探针对标准品DNA进行PCR扩增。

作为本发明优选的技术方案，所述步骤5）中，所述通过软件分析读取结果，分析判断PIK3CA基因H1047R突变位点的突变标准为：

微滴分析仪检测到PCR扩增反应中有微滴荧光信号，以标准品微滴荧光信号达到设定的标准时，表明反应体系及反应条件可靠；样本有突变型片段的扩增，即有FAM荧光信号微滴出现，判断为阳性，无FAM荧光信号微滴，判断为阴性。

本发明中，根据PIK3CA基因H1047R突变位点野生型基因序列和相应突变基因序列，设计一组茎环引物和两个特异性MGB荧光探针，并配制ddPCR扩增突变位点基因序列的反应体系，以及用上述茎环引物和MGB荧光探针同时扩增待测的基因序列，利用MGB荧光探针与扩增产物的杂交，检测反应体系的微滴荧光信号，从而最终进行PIK3CA基因H1047R突变位点的检测。

通过分析，本试剂盒中检测最常见的PIK3CA基因突变位点H1047R为单碱基突变，因此准确地检测区分这个位点，优化筛选出可以单独特异地准确区分这个位点，不与野生型位点发生交叉反应，是一个很重要的技术关键点。针对这个技术关键点，本发明设计使用茎环引物和低荧光背景干扰的MGB探针，茎环引物在高温条件下发生解链，避免了非特异性扩增和引物二聚体的发生，可以有效提高PCR检测的特异性。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明能克服现有一代测序技术低通量、二代测序技术耗时长、荧光定量PCR检测能力有限等缺点，且具有快速、通量高、灵敏度高、特异性好等优点。

1）通量高：本发明采用的ddPCR(数字PCR)技术，可以实现一个样本多位点同时检测，并且一次检测可以多个样本同时操作，可一次性分析96个样本H1047R突变位点，克服了传统采用qPCR的方法的缺陷；数字PCR技术作为第三代PCR技术，是在传统PCR方法基础上采用微滴反应的方式进行核酸分子的定量，无需制作标准曲线，具有更高的精确度和灵敏度。微滴数字PCR将一份样本分成20000个纳升级的微滴，每个微滴独立地进行PCR反应。最后使用微滴检测器对微滴荧光信号进行检测，根据软件读取结果。数字PCR可以检测低至0.1%的突变，且可以检测qPCR无法检测的微量样本。数字PCR可以直接对样本进行绝对定量，计算样本的突变频率。

2）灵敏度高：1-10ng基因组DNA即可完成精准分析；ddPCR的检测灵敏度可以达到0.1%；

3）特异性好，独立的微滴反应体系，精度高，无交叉反应，检测成功率100%；

4）污染少：检测过程为闭管检测，减少污染的可能性；

5）经对比实验验证，本发明茎环引物的特异性和准确度比普通引物更优，本发明采用茎环引物的阳性检出率能达到100%，远远超过普通引物的阳性检出率，达到了预料不到的技术效果。

6）本发明首次将茎环引物应用于基因突变位点检测，本发明中茎环引物的作用在于减少引物之间的非特异性结合，与传统的茎环引物用于检测基因表达，利于PCR 产物扩增的作用是不同的。因此，现有技术中没有相关技术启示，本发明具有突出的实质性特点和显著的进步。

附图说明

图1是本发明中茎环引物的结构示意图。

图2a是本发明实施例1中引物探针组1加入野生型质粒模板的结果图。

图2b是本发明实施例1中引物探针组1加入突变型质粒模板的结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。

本实施例以基因工程构建的突变质粒和野生质粒为模板，构建人类PIK3CA基因H1047R突变位点ddPCR检测体系，以微滴荧光信号为检测对象，通过特异茎环引物和MGB探针的优化组合进行检测体系优化，从而实现快速准确、简单地，通量化检测。

检测人类PIK3CA基因H1047R突变位点的方法，包括以下步骤：

1.针对突变位点设计合成茎环引物和MGB探针

根据人类PIK3CA基因H1047R突变位点的序列，针对突变位点设计多个茎环引物组合和探针，通过实验优化，实现高灵敏和特异性检测。突变位点信息详见表2中的带下划线的碱基。所述茎环引物的5’端和3’端互补配对，中间序列成环，形成茎环结构，见图1。

针对突变位点序列，应用primer 5.0引物设计软件设计多对茎环引物组合和MGB探针，引物和探针序列如表1所示。

表1 引物和探针序列

2、待测样本制备和提取

采用商业化的DNA提取试剂盒提取样本DNA，具体操作参考试剂盒说明书。

3、建立扩增反应体系，微滴生成

将步骤2中得到的DNA样本（即DNA模板），经紫外分光光度计检测并读取其含量。将DNA模板稀释至10 ng/μL。

按照如下扩增体系配制PCR反应体系（总体积20 μL）：

2 × ddPCR supermix for probes 10μL

各条引物 0.005～1.0μmol

探针 0.001～1.0μmol

10ng/μL DNA模板 0.1～1.0μL

水 补足至20μL；

其中，所述PCR扩增体系中的2 × ddPCR supermix for probes来自Bio-Rad公司，水来自LIFE TECH公司。

放入Bio-Rad微滴发生器进行微滴生成反应；

4、PCR扩增

反应条件为：95℃预变性10分钟，45个循环，94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟，98℃酶灭活10分钟；

5、检测微滴荧光信号，具体如下：

微滴分析仪检测到PCR扩增反应中有微滴荧光信号，以标准品微滴荧光信号达到设定的标准时，表明反应体系及反应条件可靠；样本有突变型片段的扩增，即有FAM荧光信号微滴出现，判断为阳性，无FAM荧光信号微滴，判断为阴性。

实施例1

运用含人类PIK3CA基因H1047R突变位点的质粒模板（与各待测位点对应），利用表1中引物和探针，分别进行qPCR以优化选择最佳的茎环引物和MGB探针。

其中，对于下述表格中涉及的野生型质粒及突变型质粒均可按照常规的质粒构建方法并利用PCR克隆方法制备得到。

1）质粒处理和抽提：

质粒的提取采用TIANGEN（HighPure Plasmid Kit，DP116）的质粒提取试剂盒进行，具体操作步骤详见产品说明书。所提DNA溶解于Tris-HCl中（10 mmol/L，pH8.0），紫外分光光度计检测样本质量并测定浓度。然后，将样本稀释至1000 copies/uL。取1µL进行ddPCR反应。

2）按照如下扩增体系配制PCR反应体系（总体积20μL）

2 × ddPCR supermix for probes 10μL

各条引物 0.005～1.0μmol

探针 0.001～1.0μmol

10ng/μL DNA模板 0.1～1.0μL

水 补足至20μL；

其中，所述荧光PCR扩增中的2 × ddPCR supermix for probes来自Bio-Rad公司，水来自LIFE TECH公司。

3）将2）所配制体系放入Bio-Rad微滴发生器进行微滴生成反应。

4）PCR扩增

反应条件为95℃预变性10分钟，45个循环，94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟，98℃酶灭活10分钟。

5）检测微滴荧光信号，根据FAM荧光信号微滴判断结果（参考上述）。

6）优化茎环引物和MGB探针，将表1中引物分为14组（见表2）。

表2 引物探针组

下游引物均为PIK3CA-H1047R-Rv，野生型探针均为PIK3CA-H1047R-Probe-wt，组内上游引物同下游引物配对检测相应突变位点。其他PCR体系中成分固定不变，经对比实验结果证明，表2中引物探针组1结果最佳，达到了表2中其它引物探针组达不到的技术效果，结果如图2a，图2b所示，引物探针组1无非特异性扩增，目的信号与背景信号区别明显，结果易于判读。

检测结果表明，本发明的检测体系选择最优的茎环引物对和MGB探针（即SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.8所示的引物及SEQ ID NO.9-10所示的探针），可准确识别突变位点。

实施例2

运用本发明检测突变细胞系DNA样本，培养含人类PIK3CA 基因H1047R突变位点的细胞，抽提DNA，利用本发明中特异茎环引物和MGB探针对其检测，并同时进行突变检测最低检测限测定。

步骤如下：

1）样本处理和DNA提取：

采用商业化的DNA提取试剂盒提取样本DNA，具体操作参考试剂盒说明书。

样本稀释至10ng/µL。

2）按照如下扩增体系进行PCR扩增（总体积20 μL）

2 × ddPCR supermix for Probes 10μl

各条引物 0.005～1.0μmol

探针 0.001～1.0μmol

10ng/μL DNA模板 0.1～1.0μL

水 补足至20μL；

其中，上述PCR扩增中的引物为如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.8所示的引物，探针为如SEQ ID NO.9-10所示的探针。

另外，PCR扩增中的2 × ddPCR supermix for Probes来自Bio-Rad公司，水来自LIFE TECH公司。

3）上述PCR反应体系配制完成后放入Bio-Rad微滴发生器进行微滴生成反应。

4）PCR扩增

反应条件为：95℃预变性10分钟，45个循环，94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟，98℃酶灭活10分钟。

5）检测微滴荧光信号，根据FAM荧光信号微滴判断结果（参考上述）。

6）本发明的最低检测限，具体如下：

扩增反应终体系特定核酸浓度下，检测突变比例最低检测限，结果如表3。

扩增反应终体系特定突变比例下，检测核酸上样量最低检测限，结果如表4。

表3 突变比例最低检测限实验结果

表4 核酸浓度最低检测限实验结果

6）本结果表明本发明的最低检测限为2ng上样量中可检测到0.5%的突变，10ng上样量中可检测到0.1%的突变。

实施例3

运用本发明的茎环引物和普通引物（表5）分别检测质粒样本和突变细胞系DNA样本，样本获取和具体实施步骤如实施例1和实施例2，所得数据如表6。

表5 普通引物序列

表6 茎环引物与普通引物数据对比

本结果表明本发明茎环引物的特异性和准确度比普通引物更优，如表6所示，本发明采用茎环引物的阳性检出率能达到100%，远远超过普通引物的阳性检出率，达到了预料不到的技术效果。茎环结构引物在设计时，使其茎部碱基互补配对，自身形成茎环结构，不与模板结合。PCR过程中温度上升达到茎环引物解链温度时，茎部双链结构打开，与模板结合，这样可以有效降低引物与模板及引物之间的非特异性结合，使检测结果特异性更强，准确度更高。但茎环结构的设计需要把握其解链温度，否则可能造成引物自身茎环结构可能无法打开，而无法进行正常扩增，茎环解链温度过低则达不到理想的效果，与普通引物无异。这是本发明设计茎环引物的技术难点和技术障碍。本发明实施例1从不同的茎环引物中优化筛选出一组可用茎环引物，本实施例中与普通引物的对比数据显示茎环引物组的特异性及灵敏度均优于普通引物，因此可以有效提高低浓度，如部分降解样本，及低突变频率，如血浆DNA等样本的阳性检出率。

实施例4

根据上述实施例中的检测方法，为了更加简便和快捷地用来检测待测样品（如组织切片），将本发明的检测方法中所用到的试剂制备成一种试剂盒。

该试剂盒的组分为一组茎环引物，其上游引物为SEQ ID NO.1所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.8所示序列；两条如SEQ ID NO.9-10所示的MGB荧光探针。

另外，根据需要，该试剂盒还可包括：阳性标准品和阴性标准品。

进一步地，所述试剂盒还可包括：ddPCR反应所需要的试剂，如2 × ddPCRsupermix for probes。

序列表

<110>上海伯豪生物技术有限公司

<120>一种利用茎环引物检测PIK3CA基因突变位点的试剂盒

<130> WH-NP-19-100181

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 53

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 1

ggctagggtc tttaattctg taaagccaat gatacattcg aaagacccta gcc 53

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 2

gaatgtatgc aataattctg taaagccaat gttgatgaca ttgcatacat tc 52

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 3

ggtctttcga atgaattctg taaagccaat ggacattgca tacattcgaa agacc 55

<210> 4

<211> 53

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 4

aaagattgta gttaattctg taaagccaat ggaatgccag aactacaatc ttt 53

<210> 5

<211> 56

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 5

tgtatgcaat gtaattctgt aaagccaatg acaatctttt gatgacattg cataca 56

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 6

tcttgctcag ttaattctgt aaagccaatg ccttagataa aactgagcaa ga 52

<210> 7

<211> 53

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 7

tactccaaag cctaattctg taaagccaat gctgagcaag aggctttgga gta 53

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 8

attgtgtgga agatccaatc c 21

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（未知）

<400> 9

ccaccatgat gtgcatc 17

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（未知）

<400> 10

ccaccatgac gtgcatc 17

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列（未知）

<400> 11

atgatgcacg tcatgg 16

Claims (9)

1.一种利用茎环引物检测PIK3CA基因突变位点的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：一组茎环引物，其上游引物为如SEQ ID NO.1所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.8所示序列；以及两条如SEQ ID NO.9-10所示的MGB荧光探针。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阳性标准品，阴性标准品。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：用于探针法的数字PCR试剂。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒检测PIK3CA基因的突变位点为H1047R位点，采用该试剂盒进行PIK3CA基因突变位点检测的方法包括以下步骤：

1）提取样本DNA，将其作为DNA模板；

2）针对突变位点设计合成一组茎环引物、两条如SEQ ID NO.9-10所示的MGB荧光探针；所述一组茎环引物的上游引物为如SEQ ID NO.1所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.8所示序列；

3）将步骤2）中的引物和探针与数字PCR试剂混合，加入步骤1）中提取的DNA，放入微滴发生器中制备微滴；

4）将步骤3）中生成的微滴放入PCR仪器进行PCR扩增反应；

5）将步骤4）扩增好的PCR产物连同反应板一起放入微滴分析仪中进行检测，通过软件分析读取结果。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：步骤1）中，所述样本包括：新鲜组织样本、石蜡包埋组织切片样本、血浆样本；

步骤2）中，所述茎环引物的5’端和3’端互补配对，中间序列成环，形成茎环结构，MGB荧光探针的5’端和3’端分别连接有荧光基团和淬灭基团；其中，荧光基团选自FAM、VIC、HEX、CY5和ROX中的任意一种；淬灭基团为MGB。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光基团为FAM或VIC，所述淬灭基团为MGB。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：步骤4）中，所述PCR扩增的总体积为20 μl的反应体系如下：

数字PCR试剂 10μl

各条引物 0.005～1.0μmol

探针 0.001～1.0μmol

10ng/μl DNA模板 0.1～1.0μl

水 补足至20μl。

8.如权利要求4或7所述的试剂盒，其特征在于：步骤4）中，所述PCR扩增的反应条件如下：

95℃预变性10分钟，45个循环，94℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟，98℃酶灭活10分钟。

9.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：步骤5）中，所述通过软件分析读取结果，分析判断PIK3CA基因H1047R突变位点突变的标准为：

微滴分析仪检测到PCR扩增反应中有微滴荧光信号，以标准品微滴荧光信号达到设定的标准时，表明反应体系及反应条件可靠；样本有突变型片段的扩增，即有FAM荧光信号微滴出现，判断为阳性，无FAM荧光信号微滴，判断为阴性。