CN110241200A - Flt3-itd突变高灵敏度检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种FLT3‑ITD突变高灵敏度检测方法及试剂盒，该试剂盒包括上游引物和下游引物，所述上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，该引物所扩增的核苷酸序列覆盖整个14和15号外显子，从而提高了FLT3‑ITD突变检出率。利用该试剂盒得到的PCR产物，采用毛细管电泳检测突变检测灵敏度达0.01%，使用一步法扩增体系毛细管电泳技术检测FLT3‑ITD突变达到国外检测灵敏度水平，因此，本发明所述FLT3‑ITD突变检测方法是一种以DNA为样本来源的快速、方便、准确、低成本的检测方法，其在FLT3‑ITD突变检测中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种FLT3-ITD突变高灵敏度检测方法及试剂盒。
背景技术
FLT3基因内部串联重复（FLT3-ITD）突变在急性髓系白血病（AML）中发生率约为20-30%。2017年欧洲血液病网络AML预后分层指南提示AML患者预后评估需要依靠FLT3-ITD突变检测结果和突变比例。随着近几年精准医疗靶向药物的研发，最新临床资料显示FLT3-ITD突变AML患者对FLT3抑制剂治疗收益。目前FDA已经批准的FLT3相关靶向治疗药物包括Sorafinib、midostaurin及正在申请的Quizartinib等等，其中部分药物已经在国内获批或即将获批。最新研究表明，FLT3-ITD突变AML患者治疗后监测FLT3-ITD突变，是评估患者化疗后复发重要指标。因此，FLT3-ITD突变高灵敏度检测具有重要的临床应用意义。
FLT3-ITD突变主要发生在FLT3基因13-15号外显子区域，重排断裂末端位置主要在14-15号外显子（PMID: 22674490）。目前国内外常规FLT3-ITD突变检测主要以脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）为检测对象，利用毛细管电泳方法进行检测。利用RNA为检测对象，引物设计思路以覆盖范围全即包括FLT3基因13-15号外显子。该方法局限性主要包括：1. RNA在抽提过程中不能100%避免DNA污染，影响监测灵敏度，去除DNA增加实验步骤、试剂和人力成本；2. RNA在逆转过程中效率较低，且逆转cDNA产物直接作为模板进行PCR扩增，cDNA模板量有限且逆转反应体系会影响PCR扩增效率。因此，以RNA为模板进行FLT3-ITD突变检测灵敏度只能达到3%左右（PMID: 22674490）。利用DNA为检测对象，引物设计的思路以覆盖FLT3-ITD突变末尾位点区域即14-15号外显子为主（上游引物5’-gCAATTTAggTATgAAAgCCAgC-3’ 下游引物5’-CTTTCAgCATTTTgACggCAACC-3’），扩增效率和特异性优先，但是这种方法并不能检测FLT3基因13-15号外显子所有FLT3-ITD突变（PMID:11535508）。上述两种方法以检测FLT3-ITD突变并评估FLT3-ITD突变比例为主，采用金牌taq酶扩增，PCR循环次数25次左右，FLT3-ITD检测灵敏度约1-3%左右。2013和2015年，Ming等人发表了FLT3-ITD突变高灵敏度检测方法，引物设计原理是在FLT3-ITD突变主要末尾14号外显子利用deltaPCR方法原理设计6对PCR引物，250ngDNA上样量，金牌taq酶扩增40个循环，测序仪进样时间调整到10-25秒，检测灵敏度可以达10-3（后进一步优化到细胞株检测灵敏度达10-5）水平，该方法没有公开引物序列并且根据引物设计位置，仅能够检测14号外显子FLT3-ITD突变（PMID：23846441，26446915）。2015年，Jean等人公开采用传统公认引物（同上，上游引物5’-gCAATTTAggTATgAAAgCCAgC-3’，下游引物5’-CTTTCAgCATTTTgACggCAACC-3’） 使用Start High Fidelity PCR system反应体系扩增FLT3-ITD并利用高通量测序进行突变检测，反应条件：95℃10分钟；95°C 30秒, 63°C 30秒, 72°C 30秒，10个循环； 95°C30秒, 58°C 30秒, 72°C 30秒，20个循环。检测灵敏度达10-4到10-5水平（PMID: 26078355；blood 2018 132:2778；DOI：https://doi.org/10.1182/blood-2018-99-113382），该方法的局限性仍然是并不能检测所有FLT3-ITD突变。并且上述所有方法引物设计的时候均没有考虑引物位置是否存在单核苷酸多态性影响引物结合效率和突变检出率情况。
发明内容
为了解决以上现有技术存在的问题，本发明的目的是建立一种以DNA为样本来源快速、方便、更准确的利用毛细管电泳技术检测FLT3-ITD突变的方法和试剂盒，并且利用本试剂盒得到的PCR产物，采用毛细管电泳检测突变检出率为0.01%，使用一步法扩增体系毛细管电泳技术检测FLT3-ITD突变超过国外检测灵敏度。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
FLT3-ITD突变高灵敏度检测试剂盒，该试剂盒包括上游引物和下游引物，所述上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
进一步的，该试剂盒还包括Hotstartaq酶。
进一步的，该试剂盒还包括荧光染料、PCR缓冲液和dNTP。
进一步的，该试剂盒的PCR反应条件为：95°C 5分钟；95°C 30秒，58°C 30秒，72°C40秒，35个循环；72°C 10分钟。
进一步的，该试剂盒的扩增产物使用毛细管电泳进行检测。
本发明所述试剂盒按照以下步骤进行设计，其设计流程图如图1所示：
步骤1：引物设计，于Ensemble网站检索FLT3基因，设置隐藏正常人群中单核苷酸多态性变异频率低于0.01%，结果如以下序列所示，其中大写字母所代表的序列为13-15号外显子序列，小写字母所代表的序列为内含子序列，单个字母标记的核苷酸提示该位点在人群中变异发生比例高于0.01%。
。
传统上游引物5’-gCAATTTAggTATgAAAgCCAgC-3’ 位置包含rs189166547位点，下游引物5’-CTTTCAgCATTTTgACggCAACC-3’包含rs544651635位点。我们将上述序列采用本申请专利引物设计原理，找到最优引物序列：上游引物序列5'-AAGCAATTTAGGTATGAAAGCCA-3'和下游引物序列5' -CTTTGTTGCTGTCCTTCCACTAT-3'，PCR产物361bp。本试剂盒引物设计方法不是传统引物的进一步优化，利用现有引物设计原理，不可能得到本发明中引物序列。并且利用本发明引物设计原理，不可能得到现有任何已报道FLT3-ITD扩增引物，本发明是一种针对FLT3-ITD突变全新的引物设计思路。
最优引物所扩增的核苷酸序列覆盖整个14和15号外显子，范围较传统引物所扩增的核苷酸序列的范围更全，但是PCR产物长32bp，可能导致PCR扩增效率下降。因此为了保证该引用具有更高的扩增效率，根据该引物特点，对PCRmix进行优化，使该引物能够达到国际检测水平。
步骤2：基于最低dNTP浓度的PCRmix优化
1. 根据现有公开文献报道，FLT-ITD突变检测DNA上样量为250ng，申请人前期实验发现FLT3-ITD患者缓解期标本DNA很容易获得总量500ng以上DNA。因此，申请人提高DNA模板上样量至500ng。
2. 公开的PCR扩增体系为Start High Fidelity PCR system反应体系，价格较高且没有进一步优化。本申请采用扩增效率更高的Hotstartaq酶，扩增效率更高，特异性好，成本更低。采用Hotstartaq推荐体系，本发明引物在35个PCR反应循环以内特异性好。
3. PCR产物增加到1.5μL上样量，能增加荧光信号检测强度。
4. 固定3500测序仪毛细管电泳10秒进样时间。
5. 根据上述参数确定最低dNTP浓度，dNTP浓度优化流程图如图2所示，使用500ng含量以上不同浓度DNA模板经过本PCRmix扩增35个循环后都达到PCR产物平台期，直接吸取PCR产物进行3500测序仪毛细管电泳检测，无需另外进行PCR产物浓缩，大大提高FLT3-ITD突变检测步骤、时间和效率，且保证检出率。
申请人根据上述考虑条件，得到适合本发明引物的PCRmix优化反应体系，采用成本更低的Hotstartaq酶反应体系，35个PCR循环以内扩增特异性好， dNTP浓度最低，使PCR产物在35个循环以内达到平台期，且能够达到3500测序仪最低检测信号强度，无需对PCR产物进一步浓缩。
PCRmix优化后反应体系（PCRmix1）如下所示：
10μM 带FAM荧光标记的上游引物0.5μL
10μM下游引物0.5μL
10×PCR buffer 2μL
MgCl2 1μL
ddH2O 5.75μL
25mM dNTP 0.1μL
Hotstartaq 0.15μL；
PCR产物上机检测Mix如下所示：
HiDi 8.4μL
Liz500 0.1μL。
采用本发明的试剂盒进行FLT3-ITD突变检测的步骤如下：
1. 10μL DNA模板至少包括500ng DNA总量（DNA溶解于ddH2O，不能使用缓冲液溶解）加入到10μL PCRmix1中。
2. PCR反应条件：95℃ 5分钟；95°C 30秒, 58°C 30秒, 72°C 40秒，35个循环；72°C 10分钟。
3. 吸取PCR产物1.5μL加入8.5μL上机Mix，95°C 5分钟，然后上3500测序仪，测序仪进样时间调整至10秒。
以上PCR扩增反应采用扩增效率更高成本更低的Hotstartaq酶，PCR扩增的延伸时间为40秒，扩增循环次数从40个循环优化到35个循环，缩短PCR扩增时间，增加了重排长度200bp以上片段的扩增效率时间。
有益效果：本发明提供了一种FLT3-ITD突变高灵敏度检测方法及试剂盒，该试剂盒所包含的引物扩增的核苷酸序列范围较传统引物所扩增的核苷酸序列的范围更全，使用该试剂盒对FLT3-ITD突变进行检测，降低了FLT3-ITD突变的检测成本，提高了FLT3-ITD突变检出率，让更多FLT3-ITD突变患者能够适用FLT3靶向药物治疗从而受益，提高我国血液肿瘤精准医疗水平；国内FLT3靶向药物上市，能够进一步带动FLT3-ITD突变检测及试剂盒的市场和经济效益；通过优化的反应体系，该试剂盒具有更高的检测灵敏度，能够使得FLT3-ITD的突变检测达到国际先进水平。
附图说明
图1 为本发明所述试剂盒的设计流程图。
图2 为dNTP浓度优化流程图。
图3 为实施例1的检测结果图。
图4 为实施例2的检测结果图。
图5 为实施例3的检测结果图。
图6 为实施例4的检测结果图。
图7 为实施例5的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
标本信息：患者骨髓标本，患者含有rs544651635；500ng DNA上样量；DNA标本采用正常基因组DNA稀释至FLT3-ITD突变0.1%浓度。
实验步骤：采用本发明所述方法对样本进行检测。
PCRmix优化后反应体系（PCRmix1）如下所示：
10μM带FAM荧光染料标记的上游引物0.5μL
10μM下游引物0.5μL
10×PCR buffer 2μL
MgCl2 1μL
25mM dNTP 0.1μL
Hotstartaq 0.15μL
ddH2O 5.75μL
500ngDNA模板 10μL
PCR反应条件：95℃ 5分钟；95°C 30秒, 58°C 30秒, 72°C 40秒，35个循环；72°C 10分钟。
检测仪器：Thermofisher 3500测序仪。
利用本发明试剂盒PCRmix1反应体系的检测结果如图3所示。
实施例2
标本信息：患者骨髓标本，患者含有rs544651635且FLT3-ITD突变阳性；500ng DNA上样量；DNA标本采用患者基因组DNA稀释至FLT3-ITD突变0.1%浓度。
实验步骤：采用文献报道方法（PMID：23846441，26446915）。
检测仪器：Thermofisher 3500测序仪。
实施例2的检测结果如图4所示。
实施例3
标本信息：患者骨髓标本，500ng DNA上样量；DNA标本采用正常基因组DNA稀释至FLT3-ITD突变0.01%浓度
实验步骤：与实施例1相同。
检测仪器：Thermofisher 3500测序仪。
利用本发明试剂盒PCRmix1反应体系的检测结果如图5所示。
实施例4
标本信息：FLT3-ITD突变阳性细胞株与阴性细胞株按照1:1000比例稀释，DNA标本抽提自上述混合细胞，500ng DNA上样量。
实验步骤：与实施例1相同。
检测仪器：Thermofisher 3500测序仪。
利用本发明试剂盒PCRmix1反应体系的检测结果如图6所示。
实施例5
标本信息：细胞株标本，600ng DNA上样量；DNA标本同实施例4。
实验步骤：与实施例1相同。
检测仪器：Thermofisher 3500测序仪。
利用本发明试剂盒PCRmix1反应体系检测结果如图7所示。
比较实施例1和2得知，本发明设计的引物检出范围较传统引物序列检出范围更广，当在已公布引物位置发生rs544651635变异，影响引物结合效率导致假阴性，阳性比例在0.1%就会产生假阴性结果。
比较实施例3和4得知，本方法对细胞株和患者标本都具备0.01%检测灵敏度。
比较实施例4和5得知，DNA模板高于500ng以上，PCR产物不用浓缩或稀释，都能得到有效检出率。
序列表
<110> 苏州大学附属第一医院
<120> FLT3-ITD突变高灵敏度检测方法及试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 1
aagcaattta ggtatgaaag cca 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 2
ctttgttgct gtccttccac tat 23
Claims (6)
1. FLT3-ITD突变高灵敏度检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括上游引物和下游引物，所述上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种FLT3-ITD突变高灵敏度检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括Hotstartaq酶。
3.根据权利要求1所述的一种FLT3-ITD突变高灵敏度检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括荧光染料、PCR缓冲液和dNTP。
4. 根据权利要求1所述的一种FLT3-ITD突变高灵敏度检测试剂盒，其特征在于，PCR反应条件为：95℃ 5分钟；95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 40秒，35个循环；72℃ 10分钟。
5.根据权利要求1所述的一种FLT3-ITD突变高灵敏度检测试剂盒，其特征在于，扩增产物使用毛细管电泳进行检测。
6.使用权利要求1-5任一项所述的试剂盒进行FLT3-ITD突变检测的方法。
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