CN108396060A - 基于实时荧光定量pcr技术的脊肌萎缩症致病基因smn1拷贝数检测试剂盒及方法 - Google Patents

基于实时荧光定量pcr技术的脊肌萎缩症致病基因smn1拷贝数检测试剂盒及方法 Download PDF

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CN108396060A CN201810192911.7A CN201810192911A CN108396060A CN 108396060 A CN108396060 A CN 108396060A CN 201810192911 A CN201810192911 A CN 201810192911A CN 108396060 A CN108396060 A CN 108396060A
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种基于实时荧光定量PCR技术的脊肌萎缩症致病基因SMN1拷贝数检测试剂盒及方法，其中包括一对目的基因SMN1基因7号外显子锁核酸修饰的特异引物SMN1‑F(SEQ ID NO.1)和SMN1‑R(SEQ ID NO.2)、SMN1检测探针(SEQ ID NO.3)、SMN‑P锁核酸修饰以及3’端C3Spacer修饰的SMN2基因封闭探针SMN2‑B(SEQ ID NO.4)、内参基因ALB基因引物ALB‑F(SEQ ID NO.5)和ALB‑R(SEQ ID NO.6)、ALB检测探针ALB‑P(SEQ ID NO.7)。通过锁核酸修饰增强SMN1基因扩增特异性及扩增效率，运用多重PCR原理，通过优化反应体系和条件，建立目的基因、内参基因双重扩增的稳定反应体系，可保证SMN1拷贝数定量的精确性和可靠性，重复性好，可操作性强。

Description

基于实时荧光定量PCR技术的脊肌萎缩症致病基因SMN1拷贝 数检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于体外核酸检测技术领域，具体为一种基于实时荧光定量PCR技术的脊肌萎缩症致病基因SMN1拷贝数检测试剂盒及方法。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)是一种以脊髓前角运动神经元和脑干运动神经元核变性为特征的常染色体隐性遗传的神经肌肉病，是第二大常见致死性常染色体隐性遗传病，发病率约为1/6000-1/10000左右，在人群中的携带率约为1/35-1/50左右。
研究表明，位于5号染色体上的运动神经元存活基因(Survival of MotorNeuron,SMN)，包括端粒端的SMN1和着丝粒端的SMN2，与SMA的发生发展密切相关。其中SMN1的基因缺陷是导致脊肌萎缩症的主要原因，81％～95％的脊肌萎缩症患者是由SMN1基因7号外显子纯合缺失所致。因此，对SMN1基因7号外显子拷贝数进行检测，对SMA患者诊断以及人群携带者筛查具有重要指导意义。但由于SMN1基因与假基因SMN2高度同源，两者间只有五个核苷酸的差异，其中仅一个位于编码区7号外显子(c.840C)，另外四个位6内含子(c.835-44g)，7号含子以及非编码区的8号外显子中，常规方法对于SMN1的检测还存在一些问题。
目前临床上用于SMA辅助检测主要有：限制性片段长度多态性聚合酶链式反应技术(PCR-RFLP)、变性高效液相色谱分析(PCR-DHPLC)、多重连接探针扩增技术(MLPA)、实时荧光定量PCR等。PCR-RFLP法可用于SMN1基因7号外显子纯合缺失患者进行定性分析，但不能检测杂合缺失型的携带者，也有可能存在酶切不彻底造成漏诊或误诊。PCR-DHPLC法、MLPA法可用于检测纯合缺失型患者以及杂合缺失型携带者，但操作复杂、通量低、耗时长、需特定的仪器、且价格较贵，不能用于单细胞检测。早期已有使用实时荧光定量PCR技术来检测SMN1基因7号外显子拷贝数，主要分为两种策略方法：一是直接将引物3’端设计在SMN1基因特异位点c.835-44g或c.840C处，检测探针为SMN探针，但这种常规引物设计并不能完全排除假基因SMN2的非特异扩增，而使相对定量的结果出现偏差。另一种方法为将探针设计在SMN1基因特异位点c.840C处，使用非特异引物进行扩增，当引物进行扩增时，SMN1、SMN2基因同时扩增，而在人群中SMN2基因拷贝数可达2-8个，当SMN1/SMN2拷贝数比值过小时，假基因SMN2的优势扩增将会影响目的基因SMN1的扩增导致结果误差，且探针特异性无法保证。近年来，也有学者，在实时定量PCR技术的基础上，对其进行改进，通过引入公用引物、封闭探针、公用对照品等方式增加SMN1扩增的特异性，但是其操作性相对复杂，成本高。
上面已经表明现有的检测技术限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术(PCR-RFLP)、变性高效液相色谱分析(PCR-DHPLC)、多重连接探针扩增技术(MLPA)、实时荧光定量PCR都存在一定的弊端。PCR-RFLP技术运用PCR之后根据不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带原理来区别，属定性分析，因此只能区分目的基因SMN1和假基因SMN2，从而只能达到检测SMN1纯合缺失型，而无法对单拷贝携带者进行诊断，酶切过程也有可能存在酶切不彻底漏诊误诊。PCR-DHPLC技术通量大、精确度高，但受仪器限制较大。MLPA技术基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。实验过程复杂，反应对污染物敏感，可能产生无法解释的结果。且试剂盒产于国外，通量低，价格较贵，属半定量分析，不能用于单细胞检测，即不能用于植入前产前诊断。
相对以上的方法，实时荧光定量PCR技术具有高灵敏度(5个拷贝以内)，可适用于检测如单细胞等小样本、有适当的内部标准和计算公式，平均变异系数低，允许重复、速度快、封闭反应，避免交叉污染等优势。然而，与MLPA类似，目前大多实时荧光定量PCR技术都只针对SMN1基因特异位点c.840C设计引物或探针，而仅有一个特异位点对于扩增产物或指示探针的特异性无法保证，通用引物因目的基因SMN1和假基因SMN2或内参基因的拷贝数差异较大时或第一次PCR反应的各产物量差异较大时，可能存在优势扩增而使目的基因SMN1或内参基因扩增效率产生较大差异引起结果异常。
因此，急需开发一种特异性高、可靠性强、简单经济的检测方法和试剂盒，以用于检测SMN1的拷贝数。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种一种基于实时荧光定量PCR技术的脊肌萎缩症致病基因SMN1拷贝数检测试剂盒及方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
基于实时荧光定量PCR技术的脊肌萎缩症致病基因SMN1拷贝数检测试剂盒中包括如下引物和探针：
引物：SMN1-F:ATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTAT/LNA_G/(SEQ ID NO.1)；
引物：SMN1-R:CCTTCTTTTTGATTTTGTCT/LNA_G/(SEQ ID NO.2)；
探针：SMN-P:FAM-ACCCTGTAAGGAAAATAAAGGAAGT-MGB(SEQ ID NO.3)；
封闭探针：SMN2-B:TTCTTTTTGATTTTGTC/LNA_T//LNA_A/AAACCC-C3 Spacer(SEQID NO.4)；
引物：ALB-F:CCCAGGTTCAAGCCATTCTC(SEQ ID NO.5)；
引物：ALB-R:GACTCTGTCACTTACTGGCGTTT(SEQ ID NO.6)；
探针：ALB-P:CY5-CCTGTTCTTTAGCTATCCGTG-MGB(SEQ ID NO.7)。
基于实时荧光定量PCR技术的脊肌萎缩症致病基因SMN1拷贝数检测方法包括如下步骤：
(1)制备PCR反应引物和探针混合液，各引物和探针为上述引物和探针，引物和探针的工作浓度为:
引物SMN1-F/SMN1-R/ALB-F/ALB-R:0.25μmol/L
探针SMN-P/ALB-P:0.1μmol/L
封闭探针SMN2-B:0.05μmol/L；
(2)提取人类基因组DNA，紫外分光光度计测量最终浓度为10-30ng/μl；
(3)将包含目的基因SMN1和内参基因ALB扩增片段构进T克隆载体，两者的拷贝数比例为1:1(防止跨片段串联扩增)，标准品浓度为1pg/μl；在进行PCR反应之前，将标准品稀释10倍、100倍、1000倍工作浓度，用于标准曲线定量；
(4)进行PCR，PCR反应体系为20μl，各反应组分如下：
阴性对照对照反应中，则将DNA换成ddH2O；
PCR反应条件如下：
(5)结果分析：标准曲线相关系数R2应大于0.98，目的基因SMN1和内参基因ALB的扩增效率均应在90—105％之间，且相差不超过10％；根据待测样本的Ct值在目的基因SMN1和内参基因ALB标准品的双标准曲线所对应的拷贝数的量，对待测样本在目的基因SMN1和内参基因ALB拷贝数进行定量，计算目的基因SMN1和内参基因ALB拷贝数比值R；根据R值的大小确定目的基因原始拷贝数如下：
R≤0.1时，SMN1基因7号外显子拷贝数为0；
0.35≤R≤0.65时，SMN1基因7号外显子拷贝数为1；
0.80≤R≤1.20时，SMN1基因7号外显子拷贝数为2；
R≥1.35时，SMN1基因7号外显子拷贝数为3以上。
下面对本发明作进一步说明：
针对目前实时荧光定量PCR存在的问题，我们对目的基因SMN1引物进行优化。利用AS-PCR设计原理，在原有的一个特异引物基础上，增加另一个特异引物，即以目的基因SMN1的c.835-44g特异位点和c.840C特异位点作为引物3’端分别设计上、下游引物，同时上述两个位点均引入锁核酸修饰，一方面增加上游引物(A/T含量较高且重复)的TM值，解决了以往AS-PCR所设计的双端引物TM值不匹配的问题；另一方面可同时提高上下游引物的特异性及扩增效率。另外，在假基因SMN2的c.840T处设计封闭探针，探针内部也引入锁核酸修饰提高结合效率，并通过3’端引入C3 Spacer终止修饰将假基因封闭，避免其非特异扩增，使检测结果更为精确可靠。运用多重PCR原理，通过优化反应体系和条件，建立目的基因、内参基因双重扩增效率一致的稳定反应体系，可实现同一PCR反应管内同时进行目的基因SMN1和内参基因ALB的双重PCR反应，避免因通用引物存在的引物竞争问题。
具体来说，本发明分别设计了目的基因SMN1和内参基因ALB的特异性引物和探针，以及假基因SMN2的封闭探针。其中针对目的基因SMN1，利用等位基因特异PCR(allelespecific PCR,AS-PCR)设计原理，以c.835-44g特异位点作为3’末端设计上游引物，以c.840C特异位点作为3’末端设计下游引物，同时在上下游引物3’末端特异碱基均引入锁核酸修饰，并在扩增产物之间设计荧光检测探针。同时在假基因SMN2 c.840T处设计带有3’端C3 Spacer终止修饰、锁核酸中间修饰的封闭探针，进一步降低假基因SMN2的干扰。通过上述策略的实施，可基本消除同源性极高的假基因SMN2对SMN1特异性扩增的影响。再针对内参基因ALB，特异性设计相应的引物和荧光检测探针，利用实时荧光定量PCR技术，优化体系，在同一PCR反应体系中同时扩增目的基因SMN1和内参基因ALB，经双标准曲线法对目的基因SMN1和内参基因ALB进行定量并计算比值，在已知内参基因ALB拷贝数的情况下，通过比值可得出脊肌萎缩症致病基因SMN1的原始拷贝数。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)以目的基因SMN1的7号外显子中c.835-44g特异位点为引物3’端设计上游引物，以6号内含子中c.840C特异位点为引物3’端设计下游引物；同时在上述两个位点均引入锁核酸修饰，一方面增加上游引物(A/T含量较高且重复)的TM值，解决了以往根据AS-PCR所设计的双端引物TM值不匹配的问题；另一方面可同时提高上下游引物的特异性及扩增效率。通过这两种增加SMN1扩增特异性策略的实施，可基本消除SMN2对SMN1第7号外显子拷贝数定量的影响。
2)在假基因SMN2的c.840T处设计封闭探针，探针内部也引入锁核酸修饰提高结合效率，并通过3’端引入C3 Spacer终止修饰将假基因封闭，避免其非特异扩增，使检测结果更为精确可靠。
3)运用多重PCR原理，通过优化反应体系和条件，建立目的基因、内参基因双重扩增效率一致的稳定反应体系，可实现同一PCR反应管内同时进行目的基因SMN1和内参基因ALB的双重PCR反应，避免因通用引物存在的引物竞争问题。
4)使用双标准曲线法进行定量分析，可避免因每次实验操作的误差导致目的基因和内参基因扩增效率不一致导致的结果偏差。
总之，本发明首次在AS-PCR的原理上，引入锁核酸修饰策略对SMN1扩增引物进行特异性修饰，从而对SMN1扩增的特异性进行双重加持，再利用实时荧光定量PCR技术实现SMN1拷贝数的检测。本检测方法操作简单，速度快且实验结果重复性强，精确度和灵敏度均得到保证。
具体实施方式
1)样本DNA浓度稀释
将152个经其他方法已验证的DNA样本进行稀释，稀释最终浓度为10-30ng/μl。样本包括39个SMN1双拷贝正常人，73个单拷贝携带者，40个纯合缺失患者。
2)标准品质粒DNA浓度稀释
将标准品以1:10:100:1000比例进行稀释，用于制作标准曲线。
3)PCR反应体系配置
PCR反应体系为20μl，各反应组分如下：
阴性对照对照反应中DNA换成ddH2O。
引物和探针如下：
引物：SMN1-F:ATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTAT/LNA_G/(SEQ ID NO.1)；
引物：SMN1-R:CCTTCTTTTTGATTTTGTCT/LNA_G/(SEQ ID NO.2)；
探针：SMN-P:FAM-ACCCTGTAAGGAAAATAAAGGAAGT-MGB(SEQ ID NO.3)；
封闭探针：SMN2-B:TTCTTTTTGATTTTGTC/LNA_T//LNA_A/AAACCC-C3 Spacer(SEQID NO.4)；
引物：ALB-F:CCCAGGTTCAAGCCATTCTC(SEQ ID NO.5)；
引物：ALB-R:GACTCTGTCACTTACTGGCGTTT(SEQ ID NO.6)；
探针：ALB-P:CY5-CCTGTTCTTTAGCTATCCGTG-MGB(SEQ ID NO.7)。
4)PCR反应
每个样本重复三个孔位。
实时荧光PCR仪进行PCR反应，反应条件如表1：
表1
5)结果分析
标准品1:10:100:1000稀释度的浓度设置为1000/100/10/1，标准曲线线性关系R值大于0.99。根据标准曲线分别对SMN1和ALB拷贝数进行决定定量，计算每一个PCR孔的SMN1拷贝数和ALB拷贝数比值SMN1/ALB，计算三个重复孔的SMN1/ALB平均值。结果显示，39个SMN1双拷贝正常人，73个单拷贝携带者，40个纯合缺失患者SMN1/ALB平均值均在参考范围值内，检测结果与MLPA结果一致。
SEQUENCE LISTING
<110> 中南大学
<120> 基于实时荧光定量PCR技术的脊肌萎缩症致病基因SMN1拷贝数检测试剂盒及方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
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<222> （1）…（29）
<223> SMN1基因上游修饰引物，3，端第一位碱基为锁核酸修饰碱基
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> （1）…（21）
<223> SMN1基因下游修饰引物，3，端第一位碱基为锁核酸修饰碱基
<400> 2
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<210> 3
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<220>
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<222> （1）…（25）
<223> SMN1基因检测探针，5’端FAM标记，3’端MGB标记
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<222> （1）…（25）
<223> SMN2基因封闭探针，5’第18和19位碱基为锁核酸修饰碱基， 3’端C3 Spacer修饰
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> （1）…（20）
<223> ALB基因上游引物
<400> 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> （1）…（23）
<223> ALB基因下游引物
<400> 6
gactctgtca cttactggcg ttt 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> （1）…（21）
<223> ALB基因检测探针，5’端CY5标记，3’端MGB标记
<400> 7
cctgttcttt agctatccgt g 21
<210> 8
<211> 2600
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> （1）…（2600）
<223> 标准品，SMN1基因第7号外显子与ALB基因拷贝数之比为1：1
<400> 8
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ａａａｇｔｃａｔａｃ　ａｔｔｇａｃｔｔｔｔ　ａａｔｇｇｔｇａｃｔ　ｇｇｃａｔｔｃｔｔａ　ａｔａｃａｔｇａｔｔ　　１４５０
ａｔｔａｔａｔａｔｔ　ａｇｇｔａｃｃａｔｇ　ｔｃａｇａｔｔａａｔ　ｔａｔａａｔａｃｔｔ　ｔａｃｔａｃｔｔｔｔ　　１５００
ａａｔｔｔａａｃｃｃ　ｔｔｇａａｃｔａｔｃ　ｃｃｔａｔｔｇａｇｔ　ｃａｇａｔａｔａｔｔ　ｔｃｃｔｔｃｃａｔｔ　　１５５０
ｔｔｃｔａｃｔｔｇｔ　ａｔｃｔｔｔｃａａｇ　ｔｔｔａｇｃａｔａｔ　ｇｃｔｇａｔａｃａｔ　ａｔｇａａｇｃｔｃｔ　　１６００
ｃｔｃｃａｇｇｔｔｔ　ｔａｔｔｇａａａｇａ　ａｇａａａｔｔａａｔ　ａａａｔｔｔａｔｔａ　ａｔｇｔｃａｃｔｇａ　　１６５０
ａｔｔａｇｇｃａａｃ　ｔｃａｃｔｔｔｃｃｃ　ａａｇａｔｔａｔｇｃ　ａａｇｔｇｇｔａｃａ　ｇｇｔｇｇａａｃｔｃ　　１７００
ａａａｇｃｃａａｇｔ　ｔｔａａｃｔａｇｔｔ　ｇｔｔｃａｇｇａｇａ　ａｔｇｔｔｔｔｃｔａ　ｃｃｃｔｃｃａｃｔａ　　１７５０
ａｃｃｃａｃｔａｃｔ　ｃｔｇｃａｇａｔｇｇ　ａｇａｔａａｔａｔｇ　ａｔｇａａｔｇｇａａ　ｃａｔａｇｃａａｃａ　　１８００
ｔｃｔｔａｇｔｔｇａ　ｔｔｃｃｇｇｃｃａａ　ｇｔｇｔｔｃｔｃｔｇ　ｔｔｔｔａｔｃｔａｃ　ｔａｔｇｔｔａｇａｃ　　１８５０
ａｇｔｔｔｃｔｔｇｃ　ｃｔｔｇｃｔｇａａａ　ａｃａｃａｔｇａｃｔ　ｔｃｔｔｔｔｔｔｔｃ　ａｇｇｃｔａｔｔａｇ　　１９００
ｔｔｃｇｔｔａｃａｃ　ｃａａｇａａａｇｔａ　ｃｃｃｃａａｇｔｇｔ　ｃａａｃｔｃｃａａｃ　ｔｃｔｔｇｔａｇａｇ　　１９５０
ｇｔｃｔｃａａｇａａ　ａｃｃｔａｇｇａａａ　ａｇｔｇｇｇｃａｇｃ　ａａａｔｇｔｔｇｔａ　ａａｃａｔｃｃｔｇａ　　２０００
ａｇｃａａａａａｇａ　ａｔｇｃｃｃｔｇｔｇ　ｃａｇａａｇａｃｔａ　ｔｇｔｇａｇｔｃｔｔ　ｔａａａａａａａｔａ　　２０５０
ｔａａｔａａａｔｔａ　ａｔａａｔｇａａａａ　ａａｔｔｔｔａｃｃｔ　ｔｔａｇａｔａｔｔｇ　ａｔａａｔｇｃｔａｇ　　２１００
ｃｔｔｔｃａｔａａｇ　ｃａｇａａｇｇａａｇ　ｔａａｔｇｔｇｔｇｔ　ｇｔｇｔｇｃａｔｇｔ　ｔｔｇｔｇｔｇｃａｔ　　２１５０
ｇｔｇｔｇｔｇｔｇｃ　ａｔｇｃａｃｇｔｇｔ　ｇｔｇｔａｔｇｔｇｔ　ｇａｔａｔｔｇｇｃａ　ｇｔｃａａｇｇｃｃｃ　　２２００
ｃｇａｇｇａｔｇａｔ　ａａｔｔｔｔｔｔｔｔ　ｔｔｔｔｔｔｔｔｇａ　ｇａｃｇｇａｇｔｃｔ　ｃｇｃｔｔｔｇｔｔｇ　　２２５０
ｔｃｃａｇｇｃｔｇｇ　ａｇｔｇｃａｇｔｇｇ　ｔｇｃｃａｔｃｔｃｇ　ｇｃｔｃａｃｔｇｃａ　ａｃｃｔｃｃｇｃｃｔ　　２３００
ｃｃｃａｇｇｔｔｃａ　ａｇｃｃａｔｔｃｔｃ　ｃｔｇｃｃｔｃａｇｃ　ｃｔｃｃｃａａｇｔａ　ｇｃｔｇｇｇａｃｔａ　　２３５０
ｃａｇｇｔｇｃａｔｇ　ｃｃａｃｃａｔｇｃｃ　ｔｇｇｃｔａａｔｔｔ　ｔｔｔｇｔａｔｔｔｔ　ｔａｇｔａｇａａａａ　　２４００
ｔｔｔｔｃａｇｃｔｔ　ｃａｃｃｔｃｔｔｔｔ　ｇａａｔｔｔｃｔｇｃ　ｔｃｔｃｃｔｇｃｃｔ　ｇｔｔｃｔｔｔａｇｃ　　２４５０
ｔａｔｃｃｇｔｇｇｔ　ｃｃｔｇａａｃｃａｇ　ｔｔａｔｇｔｇｔｇｔ　ｔｇｃａｔｇａｇａａ　ａａｃｇｃｃａｇｔａ　　２５００
ａｇｔｇａｃａｇａｇ　ｔｃａｃｃａａａｔｇ　ｃｔｇｃａｃａｇａａ　ｔｃｃｔｔｇｇｔｇａ　ａｃａｇｇｃｇａｃｃ　　２５５０
ａｔｇｃｔｔｔｔｃａ　ｇｃｔｃｔｇｇａａｇ　ｔｃｇａｔｇａａａｃ　ａｔａｃｇｔｔｃｃｃ　ａａａｇａｇｔｔｔａ２６００

Claims (2)

1.基于实时荧光定量PCR技术的脊肌萎缩症致病基因SMN1拷贝数检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如下引物和探针：
引物：SMN1-F:ATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTAT/LNA_G/；
引物：SMN1-R:CCTTCTTTTTGATTTTGTCT/LNA_G/；
探针：SMN-P:FAM-ACCCTGTAAGGAAAATAAAGGAAGT-MGB；
封闭探针：SMN2-B:TTCTTTTTGATTTTGTC/LNA_T//LNA_A/AAACCC-C3Spacer；
引物：ALB-F:CCCAGGTTCAAGCCATTCTC；
引物：ALB-R:GACTCTGTCACTTACTGGCGTTT；
探针：ALB-P:CY5-CCTGTTCTTTAGCTATCCGTG-MGB。
其中，SMN1上游引物SMN1-F序列3’端第一位碱基G为锁核酸修饰碱基；SMN1下游引物SMN1-R序列3’端第一位碱基G为锁核酸修饰碱基；SMN2封闭探针SMN2-B3’端第七位A、第八位碱基T为锁核酸修饰碱基，3’端C3Spacer修饰。
2.基于实时荧光定量PCR技术的脊肌萎缩症致病基因SMN1拷贝数检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备PCR反应引物和探针混合液，各引物和探针为权利要求1所述的引物和探针，引物和探针的工作浓度为:
引物SMN1-F/SMN1-R/ALB-F/ALB-R:0.25μmol/L
探针SMN-P/ALB-P:0.1μmol/L
封闭探针SMN2-B:0.05μmol/L；
(2)提取人类基因组DNA，紫外分光光度计测量最终浓度为10-30ng/μl；
(3)将包含目的基因SMN1和内参基因ALB扩增片段构进T克隆载体，两者的拷贝数比例为1:1，标准品浓度为1pg/μl；在进行PCR反应之前，将标准品稀释10倍、100倍、1000倍工作浓度，用于标准曲线定量；
(4)进行PCR，PCR反应体系为20μl，各反应组分如下：
阴性对照对照反应中，则将DNA换成ddH2O；
PCR反应条件如下：
(5)结果分析：标准曲线相关系数R2应大于0.98，目的基因SMN1和内参基因ALB的扩增效率均应在90—105％之间，且相差不超过10％；根据待测样本的Ct值在目的基因SMN1和内参基因ALB标准品的双标准曲线所对应的拷贝数的量，对待测样本在目的基因SMN1和内参基因ALB拷贝数进行定量，计算目的基因SMN1和内参基因ALB拷贝数比值R；根据R值的大小确定目的基因原始拷贝数如下：
R≤0.1时，SMN1基因7号外显子拷贝数为0；
0.35≤R≤0.65时，SMN1基因7号外显子拷贝数为1；
0.80≤R≤1.20时，SMN1基因7号外显子拷贝数为2；
R≥1.35时，SMN1基因7号外显子拷贝数为3以上。
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