CN113930436A - 双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒及其在定量检测狂犬病毒中的用途 - Google Patents

双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒及其在定量检测狂犬病毒中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒及其在定量检测狂犬病毒中的用途。该阳性标准品质粒的构建方法包括：分别以鼠源GAPDH基因以及狂犬病毒株的基因组为模板进行PCR扩增得到鼠源GAPDH基因片段以及狂犬病毒基因片段；将扩增的两种基因片段分别与pMD18‑T载体可操作性的连接，即得。本发明进一步公开了采用所构建的双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒建立双标准曲线荧光定量RT‑qPCR方法，该方法可以对样品狂犬病毒的表达量进行准确检测，能够在狂犬病毒复制的任意时间检测鼠源细胞的复制或小鼠中狂犬病毒的表达情况，具有耗时短、特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。

Description

双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒及其在定量检测狂犬病 毒中的用途
技术领域
本发明涉及阳性标准品质粒，尤其涉及双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒及其构建方法，本发明进一步涉及采用该双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒在定性或定量检测狂犬病毒中的用途，属于病毒阳性标准品质粒及其应用领域。
背景技术
狂犬病毒(Rabies virus,RV)是一种由单股负链的RNA病毒，属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)。如今，狂犬病毒在世界范围内都有发现，其可引起多种宿主的致命性病毒性脑炎。在各种狂犬病感染的宿主中，家犬对全球公共健康的威胁是最大的。由狗造成的狂犬病每年估计造成59,000人死亡(95％CI 25,000–159,000)。尽管控制人畜共患疾病仍旧非常复杂，但历史经验表明，消除狗介导的狂犬病病毒是可行且具有效的。高收入国家通过狗用疫苗和人口管理方案，狗介导的狂犬病已经从几乎在这些国家中消失。低收入和中等收入国家的通过犬狂犬病控制工作，估计每年可预防290万的人类狂犬病死亡。在狂犬病毒疫苗的研发过程中需要精确的测定狂犬病毒的含量，最经典的方法仍旧是检测病毒的滴度。但随着检测技术的更新，病毒滴度的检测具有耗时长、存在人为误差等缺点。
实时荧光定量PCR(real-time PCR)自1990年发展起来之后，其已成为一种便捷、快速、准确的核酸检测技术。其反应的主要原理是在PCR反应体系中加入一种可与双链DNA结合的荧光化学物质，并且对每一轮循环后对反应体系进行荧光强度的测定，进而得到一条由发光强度构成的曲线，最后与已知的标准品进行比较、换算进而确定未知样品中模板的初始浓度，其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点,成为了分子生物学检测中的重要工具。由于样品在前期准备过程中可能存在不同样品含量不同，或在反转录过程中由于试剂添加条件不同进而导致后期检测过程中不能准确反映样品的真实数据。
相比之下，双标准曲线荧光定量RT-qPCR检测方法具有耗时短，相对与单标准曲线的荧光定量方法具有更高的灵敏度等优点。双标准曲线荧光定量RT-qPCR技术需在之前的基础上增加一条内参基因的标准曲线，进一步的消除不同样品间可能存在的误差。同时无需像比较Ct法那样对试验进行严格的优化,基因扩增效率不要求达到100％这种理想状态,也不要求目的基因和看家基因有相同的扩增效率，从而在放宽实验操作条件的同时进一步的加检测方法的可靠性。
因此，建立一种双标准曲线荧光定量RT-qPCR检测狂犬病毒的方法，有利于提高检测的灵敏度、可靠性和检测效率。
发明内容
本发明的目的之一是构建一种用于荧光定量RT-qPCR检测狂犬病毒表达量的双标准曲线阳性标准品质粒；
本发明的目的之二是将所构建的双标准曲线阳性标准品质粒建立一种检测狂犬病毒的双标准曲线荧光定量RT-qPCR检测方法，所述的检测方法能可准确的测定BHK-21细胞和小鼠组织中狂犬病毒的表达量，同时具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。
本发明的上述目的主要是通过以下技术方案来实现的：
本发明的一方面是提供了一种双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒，其构建方法包括：
(1)以鼠源GAPDH基因为模板进行PCR扩增得到鼠源GAPDH基因片段；(2)以狂犬病毒株的基因组为模板进行PCR扩增得到狂犬病毒基因片段；(3)将扩增的鼠源GAPDH基因片段以及狂犬病毒基因片段分别与pMD18-T载体可操作性的连接，即得双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒。
作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(1)中以鼠源GAPDH基因为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为扩增引物进行PCR扩增得到鼠源GAPDH基因片段。
作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(2)中以狂犬病毒株的基因组为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为扩增引物进行PCR扩增得到狂犬病毒基因片段。
本发明的另一方面是提供了所构建的双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒在狂犬病毒定性或定量检测中的应用。
作为本发明的一种优选的具体实施方案，本发明所构建的双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒能够应用于检测鼠源细胞中狂犬病毒的复制或检测动物模型中狂犬病毒的表达量；譬如，可以用所构建的双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒建立一种双标准曲线荧光定量RT-qPCR方法实现鼠源细胞中狂犬病毒的复制或感染狂犬病毒的动物模型的狂犬病毒表达量的准确检测，具体的，所述的双标准曲线荧光定量RT-qPCR方法包括：
(1)将构建的双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒进行梯度稀释后为模板进行荧光定量PCR扩增，分别得到狂犬病毒的基因扩增的标准曲线和鼠源GAPDH基因扩增的标准曲线：
(2)提取样品的总RNA后反转录为cDNA，以样品cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增，收集荧光信号进行荧光强度的测定得到由发光强度构成的曲线；将该曲线与步骤(1)的狂犬病毒的基因扩增的标准曲线进行比较、换算进而确定样品中狂犬病毒的初始浓度。
作为一种优选的具体实施方案，步骤(1)中所述的梯度稀释是将将构建的双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒稀释至101copies/μL、102copies/μL、103copies/μL、104copies/μL、105copies/μL、106copies/μL。
作为一种优选的具体实施方案，步骤(1)中所述的荧光定量PCR扩增的反应体系是：SYBR Green I荧光染料12.5μL,上、下游引物各1μL,双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒模板1μL,补ddH2O至25μL；所述上、下游引物的核苷酸序列为表1所示。
表1 qPCR引物序列
Figure BDA0003326894350000041
作为一种优选的具体实施方案，步骤(1)中所述的荧光定量PCR扩增的条件是：95℃变性10s，60℃退火30s，循环次数为40次；从60℃连续递增到95℃。
作为一种优选的具体实施方案，步骤(2)中所述的荧光定量PCR扩增的反应体系是：SYBR Green I荧光染料12.5μL,上、下游引物各1μL,样品cDNA模板1μL,补ddH2O至25μL；所述上、下游引物的核苷酸序列为表2所示。
表2 qPCR引物序列
Figure BDA0003326894350000042
作为一种优选的具体实施方案，步骤(2)中所述的荧光定量PCR扩增的条件是：95℃变性10s，60℃退火30s，循环次数为40次；从60℃连续递增到95℃。
作为一种优选的具体实施方案，所述的待检测样品是感染狂犬病毒的鼠源细胞或感染狂犬病毒的动物模型，其中所述的鼠源细胞优选为BHK-21细胞，所述感染狂犬病毒的动物模型是小鼠。
本发明整体技术方案简述
本发明首先分别使用狂犬病毒的基因与鼠源GAPDH基因引物通过普通PCR获得目的片段，之后将其连入pMD18-T载体中构建得到双标准曲线阳性标准品质粒。该双标准曲线阳性质粒经过测序正确，普通PCR无其他杂带，位置大小正确，通过质粒小提试剂盒获得的双标准曲线阳性标准品质粒浓度约为321ng/μL。
进一步的，本发明使用荧光定量PCR仪发现该双标准曲线阳性阳性标准品质粒中狂犬病毒的基因和鼠源GAPDH的基因的扩增效率较好，溶解曲线无单峰，说明无其他非特异性条带出现。
在此基础上，本发明应用该双标准曲线阳性标准品质粒建立的双标准曲线狂犬病毒荧光定量RT-qPCR检测方法能够在狂犬病毒感染BHK-21细胞8小时后即可检测到其基因的表达量显著升高，而普通病毒滴度的检测在12小时后才能检出狂犬病毒滴度的显著增高。进一步的，应用所构建的双标准曲线狂犬病毒荧光定量RT-qPCR检测方法发现狂犬病毒在感染ICR小鼠1天后其基因的表达量显著升高，且随着时间的延长其基因组复制逐渐增多。
本发明将所构建的双标准曲线阳性标准品质粒分别保存于4℃和冻存于-20℃环境中，经检测发现狂犬病毒的基因与鼠源GAPDH基因表达量差异不显著证明该双标准曲线阳性标准品质粒具有良好的稳定性。
本发明的主要有益效果包括：
1.本发明建立的双标准曲线狂犬病毒的荧光定量RT-qPCR检测方法，以扩增狂犬病毒CVS-11株的基因和扩增鼠源GAPDH基因为基础，通过该方法评估狂犬病毒的扩增效果，该方法能在BHK-21细胞中准确的检测狂犬病毒复制，其检测方式是通过荧光定量RT-qPCR检测，能够在狂犬病毒复制的任意时间检测鼠源细胞或以小鼠为动物模型中狂犬病毒的复制情况，具有耗时短，相对与单标准曲线的荧光定量方法具有更高的灵敏度等优点。
2.本发明建立的双标准曲线狂犬病毒的荧光定量RT-qPCR检测方法可特异的扩增狂犬病毒的基因和扩增鼠源GAPDH基因，其在狂犬病毒疫苗生产过程中能够实现对病毒毒价更加精确的测定，相比于常规病毒滴度的检测和单标准曲线荧光定量RT-qPCR检测方法,本发明构建的双标准曲线狂犬病毒的荧光定量RT-qPCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。
3.本发明的双标准曲线狂犬病毒的荧光定量RT-qPCR检测方法基于所制备的包含两种目的基因的标准品质粒所建立，当BHK-21细胞在感染1MOI狂犬病毒CVS-11株后，本发明的检测方法可在病毒感染的所有时间点准确的检测病毒的复制情况，相较与普通病毒滴度的检测其检测后的趋势与病毒滴度检测的趋势基本相同，但在病毒复制的前期阶段具有更强的灵敏度。在小鼠感染狂犬病毒CVS-11株后可在病毒感染后12h检测到小鼠脑组织中的病毒显著扩增，普通病毒滴度的检测可在病毒感染后24h检测到小鼠脑组织中的病毒显著扩增，与其相比，本发明建立的双标准曲线狂犬病毒的荧光定量RT-qPCR检测方法检测灵敏度更高。
4.本发明所构建的双标准曲线狂犬病毒荧光定量RT-qPCR方法在试验操作上更有优势，如对PCR体系和扩增效率的要求不那么严格，试验中的各种人为误差可以在结果处理时消除一部分，得到的试验结果比较可靠,是一种经济实用,准确合理的试验方法，该方法的建立将为后续狂犬病疫苗的实际过程中毒价的稳定性的检测提供技术和理论条件。
附图说明
图1是本发明建立的检测方法中狂犬病毒的基因和鼠源GAPDH基因普通PCR结果图；
图2是本发明建立的检测方法中狂犬病毒的基因和鼠源GAPDH基因连接到pMD18-T载体后普通琼脂糖凝胶电泳图；
图3是本发明建立的检测方法中狂犬病毒的基因扩增的标准曲线图；
图4是本发明建立的检测方法中狂犬病毒的基因扩增的的溶解曲线图；
图5是本发明建立的检测方法中鼠源GAPDH基因扩增的标准曲线图；
图6是本发明建立的检测方法中鼠源GAPDH基因扩增的的溶解曲线图；
图7是本发明建立的检测方法对BHK-21细胞中感染不同时间狂犬病毒的检测图；
图8是本发明建立的检测方法对BHK-21细胞中感染不同时间狂犬病毒病毒滴度的检测图；
图9是本发明建立的检测方法对小鼠感染不同时间狂犬病毒的检测图；
图10是本发明构建的标准品质粒保存在不同温度环境下稳定性检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验材料
细胞及载体来源：BHK-21细胞及狂犬病毒CVS-11株保存自吉林正业生物制品股份有限公司，pMD18-T载体购自TaKaRa公司(试剂编号：D101A)。
生化试剂：DMEM、PBS、FBS购自Gibco公司。DMSO购自Sigma公司。Simply P总RNA提取试剂盒购自Bioer公司。RNA反转录试剂、
Figure BDA0003326894350000081
Prime-ScriptTM RT-PCR Kit购自宝生生物。DH5α购自TaKaRa公司。质粒小提试剂盒购自康为世纪公司(试剂编号：CW0511)。
qPCR引物序列：
狂犬病毒：5′-TTGACGTGACGAGTCTTCCT-3′；5′-GCCAGCGTCTGCATTTGTC-3′；
GAPDH：5′-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3′；5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。
实施例1双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒的构建
首先使用普通PCR分别扩增了狂犬病毒与鼠源GAPDH的基因序列，并将其连入pMD18-T载体中，具体操作步骤如下：
将1MOI狂犬病毒CVS-11株接种到长至单层的BHK-21细胞中，24h后将其反复冻融两次。之后使用RNA提取试剂盒提取病毒和细胞的总RNA，并使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，保存与-20℃并用于后续实验。将设计合成的引物序列(SEQ ID No.1-SEQ IDNo.4)稀释至试验所需的浓度后以cDNA为模板在普通PCR仪中扩增目的序列。
所获得的两个序列通过胶回收后连入pMD18-T载体，之后将连接的载体转入大肠杆菌感受态DH5α中，挑取阳性菌落并送公司测序，待测序正确后摇菌并使用质粒小提试剂盒进行阳性质粒的提取。通过普通琼脂糖凝胶电泳检测阳性质粒正确后，用于后续实验。
由图1可知狂犬病毒基因通过目的基因扩增后其目的片段大小为251bp，鼠源GAPDH基因扩增后其目的片段大小为138bp且目的基因与鼠源GAPDH基因较为完整，无其他杂带。
由图2可知在两个目的基因已成功连入pMD18-T载体，并且质粒大小符合预期，证明双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒构建成功可用于后续实验。之后通过紫外吸光光度计分析发现，通过质粒小提试剂盒提取的质粒浓度约为321ng/μL。
试验例1双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒扩增效率及特异性检验
将实施例1所构建的阳性标准品质粒稀释后，通过计算将其分别稀释至101copies/μL、102copies/μL、103copies/μL、104copies/μL、105copies/μL、106copies/μL，作为模板进行后续荧光定量RT-qPCR检测。
为进一步确定荧光定量PCR可准确扩增目的基因，后续使用荧光定量PCR仪并按照荧光PCR反应体系:SYBR Green I荧光染料12.5μL,上、下游引物各1μL,模板1μL,补ddH2O至25μL。荧光定量PCR反应条件:95℃10min；95℃10s,60℃30s,40个循环；从60℃连续递增到95℃,收集荧光信号获取熔解曲线,以确定PCR反应的特异性。每一个浓度梯度的标准品均在同一个八连管中做3次技术重复，且使用无菌的双蒸水作为阴性对照。
由图3可知实施例构建的阳性标准品质粒中狂犬病毒的基因扩增的标准曲线拟合较好，其在101copies/μL-106copies/μL中具有良好的线性关系。其中引物的扩增效率为97.003％，线性相关系数为0.999。
由图4可知阳性标准品质粒中狂犬病毒的基因的扩增效率较好，溶解曲线无单峰，说明无其他非特异性条带出现，其结果与实施例1中普通PCR验证结果一致。
由图5可知阳性标准品质粒中鼠源GAPDH的基因扩增的标准曲线拟合较好，其在101copies/μL-106copies/μL中具有良好的线性关系。其中引物的扩增效率为106.33％，线性相关系数为0.996。
由图6可知阳性标准品质粒中鼠源GAPDH的基因的扩增效率较好，溶解曲线无单峰，说明无其他非特异性条带出现，其结果与实施例1中普通PCR验证结果一致。
综上所述，实施例1所构建的双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒可分别扩增出狂犬病毒的基因与鼠源GAPDH的基因。
试验例2应用双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒进行样品的荧光定量RT-qPCR检测试验
将1MOI的狂犬病毒CVS-11株接种到长至单层的BHK-21细胞中，分别在0小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时将感染病毒的细胞反复冻融两次。之后使用RNA提取试剂盒提取病毒和细胞的总RNA，并使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，保存与-20℃并用于后续实验。之后按照试验例1中所述浓度梯度稀释双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒。后续使用荧光定量PCR仪并按照荧光PCR反应体系:SYBR Green I荧光染料12.5μL,上、下游引物各1μL,模板1μL,补ddH2O至25μL。荧光定量PCR反应条件:95℃10min；95℃10s,60℃30s,40个循环；从60℃连续递增到95℃,收集荧光信号，并计算样品中狂犬病毒的基因表达量。同时将所述样品按照经典的病毒滴度TCID50检测方法进行检测。简而言之，将检测的样品连续稀释10倍，将每种浓度的溶液以每孔100μL的浓度添加到每个柱中，每种浓度重复8次，然后添加100μL的2％DMEM。将对照建立在无病毒的培养基中，并在37℃的5％CO2培养箱中培养。使用Reed和Muench公式计算病毒TCID50。最后结果通过Graphpad Prism8统计分析。
由图7可知狂犬病毒在感染BHK-21细胞8小时后其基因的表达量显著升高，且随着时间的延长其基因组复制逐渐增多。结果表示为狂犬病毒基因与GAPDH基因表达量的比值。表明狂犬病毒在感染BHK-21细胞8h后应用该方法即可检测到病毒基因组的复制。
由图8可知狂犬病毒在感染BHK-21细胞12小时后其病毒滴度显著增强，且随着时间的延长其基因组复制逐渐增高。结果表示为狂犬病毒TCID50以10为低的对数。表明狂犬病毒在感染BHK-21细胞12h后应用该方法即可检测到病毒滴度的增高。由此说明，应用双标准曲线狂犬病毒荧光定量RT-qPCR方法可在8h检测到狂犬病毒在细胞中的复制情况。
试验例3应用双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒建立的荧光定量RT-qPCR方法检测感染狂犬病病毒小鼠组织中病毒的表达情况试验
为进一步的比较改方法与实际生产中的应用，将狂犬病毒CVS-11株稀释至6.5LD50，并通过脑部接种10g-13gICR小鼠。分别在0天、1天、2天、3天、4天采取小鼠的脑组织，通过液氮组织研磨后。加入两倍研磨组织体积的PBS溶液，之后在4℃离心机中12000rmp离心1min，取溶液的上清使用RNA提取试剂盒提取组织的总RNA，并使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，保存与-20℃并用于后续实验。之后按照试验例1中所述浓度梯度稀释双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒。后续使用荧光定量PCR仪并按照荧光PCR反应体系:SYBR Green I荧光染料12.5μL,上、下游引物各1μL,模板1μL,补ddH2O至25μL。荧光定量PCR反应条件:95℃10min；95℃10s,60℃30s,40个循环；从60℃连续递增到95℃,收集荧光信号，并计算样品中狂犬病毒的基因表达量。
结果如图9所示，狂犬病毒在感染ICR小鼠1天后其基因的表达量显著升高，且随着时间的延长其基因组复制逐渐增多。结果表示为狂犬病毒基因与GAPDH基因表达量的比值，表明狂犬病毒在感染ICR小鼠1天后应用该方法即可检测到病毒基因组的复制。
试验例4双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒不同保存温度下质粒稳定性的检测试验
将实施例1中所提取的同一阳性标准品质粒分为6份并分为两组，其中一组3份放于4℃保存，另一组3份放于-20℃保存。并于一周后取出，作为待测样品。按照实施例1中所述步骤重提阳性标准品质粒并按照实施例2中相同的稀释步骤稀释。之后后续使用荧光定量PCR仪并按照荧光PCR反应体系:SYBR Green I荧光染料12.5μL,上、下游引物各1μL,模板1μL,补ddH2O至25μL。荧光定量PCR反应条件:95℃10min；95℃10s,60℃30s,40个循环；从60℃连续递增到95℃,收集荧光信号，并分别统计样品中狂犬病毒的基因与鼠源GAPDH基因表达量。
结果如图10所示，所构建的标准品质粒保存于4℃和冻存于-20℃冰箱中一周后狂犬病毒的基因与鼠源GAPDH基因表达量差异不显著。因此该标准品质粒在一周内4℃和-20℃保存环境对标准品质粒无影响，证明实施例1所构建的双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒具有良好的稳定性。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林正业生物制品股份有限公司
<120> 双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒及其在定量检测狂犬病毒中的用途
<130> JL-3002-210608A
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<170> PatentIn version 3.5
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gccagtagag gcagggatga tgttc 25
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<400> 8
gccagcgtct gcatttgtc 19

Claims (10)

1.一种双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒，其特征在于，其构建方法包括：
(1)以鼠源GAPDH基因为模板进行PCR扩增得到鼠源GAPDH基因片段；(2)以狂犬病毒株的基因组为模板进行PCR扩增得到狂犬病毒基因片段；(3)将扩增的鼠源GAPDH基因片段以及狂犬病毒基因片段分别与pMD18-T载体可操作性的连接，即得。
2.按照权利要求1所述的双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒，其特征在于，步骤(1)中以鼠源GAPDH基因为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸为扩增引物进行PCR扩增得到鼠源GAPDH基因片段。
3.按照权利要求1所述的双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒，其特征在于，步骤(2)中以狂犬病毒株的基因组为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸为扩增引物进行PCR扩增得到狂犬病毒基因片段。
4.权利要求1-3任何一项所述的双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒在制备定性或定量检测狂犬病毒试剂中的应用。
5.一种非诊断或治疗目的的检测样品中狂犬病毒复制或表达量的双标准曲线荧光定量RT-qPCR方法，其特征在于，包括
(1)将权利要求1-3任何一项所述的双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒进行梯度稀释后为模板进行荧光定量PCR扩增，分别得到狂犬病毒的基因的标准曲线和鼠源GAPDH基因的标准曲线：
(2)提取待检测样品的总RNA后反转录为cDNA，以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增，收集荧光信号进行荧光强度的测定得到由发光强度构成的曲线；将该曲线与步骤(1)的标准曲线进行比较、换算进而确定样品中狂犬病毒的初始浓度。
6.按照权利要求5所述的双标准曲线荧光定量RT-qPCR方法，其特征在于，步骤(1)中所述的梯度稀释是将构建的双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒稀释至101copies/μL、102copies/μL、103copies/μL、104copies/μL、105copies/μL、106copies/μL。
7.按照权利要求5所述的双标准曲线荧光定量RT-qPCR方法，其特征在于，步骤(1)中所述的荧光定量PCR扩增的反应体系是：SYBR Green I荧光染料12.5μL,上、下游引物各1μL,双标准曲线狂犬病毒阳性标准品质粒模板1μL,补ddH2O至25μL；所述的上、下游引物的核苷酸序列份为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；
步骤(1)中所述的荧光定量PCR扩增的条件是：95℃变性10s，60℃退火30s，循环次数为40次；从60℃连续递增到95℃。
8.按照权利要求5所述的双标准曲线荧光定量RT-qPCR方法，其特征在于，步骤(2)中所述的荧光定量PCR扩增的反应体系是：SYBR Green I荧光染料12.5μL,上、下游引物各1μL,样品cDNA模板1μL,补ddH2O至25μL；所述的上、下游引物的核苷酸序列份为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；
步骤(2)中所述的荧光定量PCR扩增的条件是：95℃变性10s，60℃退火30s，循环次数为40次；从60℃连续递增到95℃。
9.按照权利要求5所述的双标准曲线荧光定量RT-qPCR方法，其特征在于，所述的待检测样品是感染狂犬病毒的鼠源细胞或感染狂犬病毒的动物模型。
10.按照权利要求9所述的双标准曲线荧光定量RT-qPCR方法，其特征在于，所述的鼠源细胞为BHK-21细胞，所述感染狂犬病毒的动物模型是小鼠。
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