CN112501288A - 一种肺肿瘤组织dna中shox2基因甲基化检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法。包括以下步骤：1)对待检测肺肿瘤组织DNA样本进行亚硫酸盐修饰处理；2)亚硫酸盐处理后的肺肿瘤组织DNA、20％，40％，60％，80％，100％甲基化标准品DNA、SHOX2特异性PCR检测引物、SHOX2特异性探针、内参基因引物和内参基因探针进行qRT‑PCR反应；3)测量肺肿瘤组织DNA、20％，40％，60％，80％，100％甲基化标准品在SHOX2基因的的Ct值。该肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法可以精确并且有效的区分SHOX2基因的甲基化状态，合理选择特异性的引物，可以进一步增加检测的灵敏度和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及需要对肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化进行检测的科研及临床领域，具体是一种肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法。
背景技术
DNA甲基化是一种人体内常见的表观遗传学修饰方式，其可以调控被修饰基因的表达情况，因此被认为与肿瘤的发生有密切关系。通过检测肿瘤相关基因的甲基化状态可完成对肿瘤的早期筛查，辅助诊断，治疗，预后。目前对DNA甲基化状态的检测主要是利用亚硫酸盐预处理，从而将DNA样本中的未被甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而被甲基化的胞嘧啶(C)则无法被转化而保持原始状态，随后通过PCR或者杂交芯片对其相关基因的甲基化状态进行检测。
目前通过PCR对肿瘤组织DNA中相关基因进行甲基化状态检测的方法主要为甲基化特异PCR(methylation-specific PCR，MSP)，其是一种快速，实用的甲基化分析手段。但MSP的灵敏度与特异性较差，无法对微小的DNA甲基化状态变化进行检测，从而阻碍了其在肿瘤相关基因甲基化调控方面的应用。此外基于PCR方法的甲基化荧光法检测技术，例如专利CN103732759，CN106480210A虽提高了检测的灵敏度，但均存在操作繁琐，成本高昂，并且检测周期长的缺点。
本发明提供了在肺肿瘤组织DNA中对SHOX2基因进行甲基化检测的引物，探针，以及检测方法。该方法具有灵敏度高，特异性强，重复性好，操作简单，检测快速，安全等优点，对肺癌的诊断有一定的辅助作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法，包括以下步骤：
1)对待检测肺肿瘤组织DNA样本进行亚硫酸盐修饰处理；
2)亚硫酸盐处理后的DNA、20％，40％，60％，80％，100％甲基化标准品DNA，特异性SHOX2 的PCR检测引物、SHOX2特异性探针、内参基因引物和内参基因探针进行qRT-PCR反应；
3)测量肺肿瘤组织DNA、20％，40％，60％，80％，100％甲基化标准品DNA的Ct值。
作为本发明进一步的方案：所述特异性PCR检测引物的S-M-F的核苷酸序列如SEQID NO：1所示；所述内参基因特异性PCR检测引物的A-M-F的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
作为本发明再进一步的方案：所述特异性PCR检测引物的S-M-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述内参基因特异性PCR检测引物的A-M-R的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。
作为本发明再进一步的方案：所述特异性探针的S-M-P的核苷酸序列如SEQ IDNO：5 所示；所述内参基因特异性探针的A-M-P的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示。
作为本发明再进一步的方案：所述RT-PCR反应的反应方法，包括以下步骤：
1)在95℃下保持3分钟；
2)降温至58℃，保持20秒；
3)升温至72℃，保持30秒；
4)将步骤2)和步骤3)进行50次循环；
5)在72℃下保持1分钟。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
该肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法可以精确并且有效的区分检测位点的甲基化状态，合理选择特异性的引物，可以进一步增加检测的灵敏度和特异性，使其能够检测到低至1％的SHOX2基因甲基化状态。此外相对其他DNA甲基化检测方法，该发明较其他甲基化检测方法在成本和操作时间上有着显著的下降。
附图说明
图1为利用该肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因的甲基化检测方法区分20％，40％，60％，80％，100％甲基化标准品DNA中SHOX2基因的不同甲基化状态。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
一种肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法，包括以下步骤：
1)对待检测肺癌肿瘤组织DNA样本进行亚硫酸盐修饰处理；
2)亚硫酸盐处理后的DNA、SHOX2特异性PCR检测引物、特异性探针、特异性内参基因引物和内参基因探针进行RT-PCR反应；
3)测量肺肿瘤组织DNA、20％，40％，60％，80％，100％甲基化标准品DNA的Ct值。
所述特异性PCR检测引物的序列如下：
S-M-F(序列表中序列1)：GATAGTTAGGTAATTTTCGTTTCG
S-M-R(序列表中序列2)：CCTTCTAACCCGACTTAAACGACG
A-M-F(序列表中序列3)：GGGTGGTGATGGAGGAGGTT
A-M-R(序列表中序列4)：TAACCACCACCCAACACACAAT
所述特异性探针的序列如下：
S-M-P(序列表中序列5)：FAM-GTACGACCCCGATCG-MGB
A-M-P(序列表中序列6)：VIC-TGGATTGTGAATTTGTG-MGB所述RT-PCR反应的反应方法，包括以下步骤：
1)在95℃下保持3分钟；
2)降温至58℃，保持20秒；
3)升温至72℃，保持30秒；
4)将步骤2)和步骤3)进行50次循环；
5)在72℃下保持1分钟。
实施方案
利用SHOX2基因甲基化特异性引物，SHOX2基因甲基化特异性探针与内参基因的特异的引物和探针组成qRT-PCR反应，利用qRT-PCR对被检测甲基化位置的甲基化状态进行检测。
方案1
对不同已知浓度的甲基化标准品进行检测，验证该发明方法的可靠性。
方案2
对不同肺肿瘤组织DNA与癌旁组织DNA进行特定基因的甲基化状态检测，验证该发明方法对癌症组织DNA甲基化检测的可靠性，检测结果如图1所示。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
序列表
<110> 申请人名称
<120> 一种肿瘤组织DNA甲基化检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
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<210> 2
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
ccttctaacc cgacttaaac gacg 24
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
gtacgacccc gatcg 15
Claims (5)
1.一种肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对待检测肺癌肿瘤组织DNA样本进行亚硫酸盐修饰处理；
2)亚硫酸盐处理后的DNA、20％，40％，60％，80％，100％甲基化标准品DNA、SHOX2特异性PCR检测引物、SHOX2特异性探针、内参基因引物和内参基因探针进行RT-PCR反应；
3)测量肺肿瘤组织DNA、20％，40％，60％，80％，100％甲基化标准品DNA的Ct值。
2.根据权利要求1所述的肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法，其特征在于，所述SHOX2特异性PCR检测引物的S-M-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述内参基因特异性PCR检测引物的A-M-F的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
3.根据权利要求2所述的肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法，其特征在于，所述SHOX2特异性PCR检测引物的S-M-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述内参基因特异性PCR检测引物的A-M-R的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。
4.根据权利要求3所述的肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法，其特征在于，所述SHOX2特异性探针的S-M-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述内参基因特异性探针的A-M-P的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示。
5.根据权利要求4所述的肺肿瘤组织DNA中SHOX2基因甲基化检测方法，其特征在于，所述qRT-PCR反应的反应方法，包括以下步骤：
1)在95℃下保持3分钟；
2)降温至58℃，保持20秒；
3)升温至72℃，保持30秒；
4)将步骤2)和步骤3)进行50次循环；
5)在72℃下保持1分钟。
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