CN106011292A

CN106011292A - 一种检测肺癌相关基因shox2甲基化的试剂盒

Info

Publication number: CN106011292A
Application number: CN201610602854.6A
Authority: CN
Inventors: 刘沛; 王林海
Original assignee: BEIJING SINO-MDGENE TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING SINO-MDGENE TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2016-07-27
Filing date: 2016-07-27
Publication date: 2016-10-12

Abstract

本发明公开了一种检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒，以游离DNA中目的基因甲基化位点进行检测，包括三个甲基化的目的基因对应的引物及1个内参基因引物，优选还包括三个目的基因甲基化位点对应的MGB探针及内参基因对应的MGB探针，和三个甲基化目的基因对应的MGB探针。检测位点不仅包括基因的启动子区，还包括基因的编码区，多区域检测有利于提高SHOX2甲基化的准确性以及特异性。优选的通过MGB探针与甲基化序列特异性结合，对甲基化位点进行更精确的检测。操作简便、易于判读，对仪器的要求不高，整个PCR过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，结果更加精准。试剂盒检测的高灵敏性适用于肺癌的早期筛查。

Description

一种检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒

技术领域

本发明涉及肺癌早期筛查检测技术领域，特别是一种以cfDNA检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒。

背景技术

据最新的数据显示，肺癌、乳腺癌分别位居男、女性恶性肿瘤发病首位，男女恶性肿瘤死亡人数很高的均为肺癌。肿瘤专家指出，近年来在我国癌症发病的可能呈明显上升趋势，但得到规范治疗的患者却不足一半。肺癌在我国是常见的恶性肿瘤之一，我国的肺癌发病及死亡年龄自40岁以后迅速上升，70岁达到高峰，75岁以后略有下降。女性和男性年龄发病的可能和死亡人数的变化趋势基本一致。但在肺癌死亡人数迅速上升的同时，不同时期的肺癌死亡人数年龄曲线显示，肺癌死亡人数高峰出现前移。也就是说，我国肺癌的发病及死亡年龄有年轻化的趋向。

在肺癌的早期阶段，所表现出来的病症与一般呼吸系统疾病类似，并没有的明显的临床症状，待出现相关临床症状时，已是肺癌的中晚期。并且临床数据表明肺癌发展到中晚期时，只有15.8％的患者生存期能达到五年以上。因此，早期发现、早期诊断、早期治疗是降低肺癌死亡人数的重要措施。目前，对于肺癌早期筛查的方法有多种，比如低剂量CT诊断、组织细胞层面的肺癌诊断、基因层面的肺癌诊断等。低剂量CT检测存在较多的假阳性，并且检测成本高；组织层面的肺癌诊断在取样方面会给患者带来较大痛苦。而对于基因层面的诊断，随着目前分子生物学以及基因检测技术的快速发展，肿瘤特异性分子标志物检测可作为肺癌早期诊断的一种手段。多个临床实验结果表明，肿瘤发生过程中某些基因甲基化程度的不同可作为肿瘤诊断的一种分子标志，并且这种改变是肿瘤所特有的。DNA甲基化是在肿瘤发生的早期阶段，在肿瘤形成初期能够利用基因检测手段提前发现，为之后的预防、治疗、疾病监控以及预后提供一个直观的潜在指标。

人矮小同源盒基因SHOX2(short stature homebox2)是同源盒基因家族的一员，其表达于中胚层和外胚层，对骨骼、心脏和神经系统的发育起到重要的作用。有研究发现，96％的肺癌患者SHOX2发生高度甲基化，并且与基因拷贝数明显相关。并且最新的研究表明，SHOX2基因的甲基化与肺癌密切相关，这也提示了SHOX2基因的甲基化可能成为肺癌的早期筛查指标。并且有相关研究表明在-800bp到-900bp、-1550bp到-1650bp和+2700bp到+2800bp等几个位点SHOX2基因发生甲基化的概率较高。

DNA异常甲基化是人类肿瘤常见的改变。发生在启动子区以及基因内部的CpG岛异常甲基化是基因失活的最常见机制。目前检测DNA甲基化检测方法有：甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)、亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)、高分辨率熔解曲线法(HighResolution Melting，HRM)和高通量测序方法等。相对于其他的检测方法而言，亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)是DNA甲基化检测中的“金标准”，检测较为精准，但其检测灵敏度相对较低，且操作较繁琐、成本高。高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM)在PCR扩增中通过观察熔解曲线的变化来判断DNA是否发生甲基化，此类方法结果分析相对复杂。高通量测序检测方法主要是涉及到的成本太高，不利于临床上的推广。对于甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)检测方法，操作简便、耗时较短，结果易于分析。

组织活检对于患者而言除了具有较大的创伤，也会因为肿瘤具有异质性，容易产生假阴性结果。肿瘤液体活检是现在比较流行的检测方法，样本是血浆，相对组织较易获得，且对患者无创。但血浆中肿瘤循环DNA的量较少，且易发生降解。因此，检测血浆中基因的甲基化难度相对较大，不仅需要得到高质量的肿瘤循环DNA以及高质量的重亚硫酸盐转化后DNA，而且需要将基因的甲基化高灵敏度、高准确度地检测出来。因此，对于此类检测试剂盒的开发需要具备两个方面的要求：高特异性以及高灵敏度。

发明内容

针对现有技术中肺癌检测产品灵敏度和特异性不佳的问题，本发明的目的是提供一种通过检测患者血液中的游离DNA的SNOX2基因启动区和基因编码区域中三个目标位点甲基化情况来判断患病状态的试剂盒，达到辅助肺癌早期筛查的目的。上述三个目标位点对应的基因片段或者DNA片段即本发明技术方案中所述的三个目的基因。

本发明提供的检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒，针对待检样品中三个目的基因的甲基化位点进行检测，其特征在于，包括已经甲基化的三个目的基因对应的引物及内参基因引物，具体引物序列如下：

目的基因1正向引物F：TGATGTTTTTTTGTCGGAG(SEQ ID NO.1)，

目的基因1反向引物R：TCAAAACAAAAAACCGC(SEQ ID NO.2)；

目的基因2正向引物F：GTTTGTATTTTTTTCGAT(SEQ ID NO.3)，

目的基因2反向引物R：CACGAATAATAAAACGAAT(SEQ ID NO.4)；

目的基因3正向引物F：TTTTTTGGGTAGTTAATATGG(SEQ ID NO.5)，

目的基因3反向引物R：CCAAATAATCTCCGTCC(SEQ ID NO.6)；

内参基因(β-actin)正向引物F：GTGATGGAGGAGGTTTAG(SEQ IDNO.7)，

内参基因(β-actin)反向引物R：AAATTACAAAAACCACAA(SEQ IDNO.8)。

本发明为了增加肺癌早期筛查的可靠性，通过选择与肺癌早期筛查密切相关的三个甲基化位点，采用特殊的引物设计方法，得出上述四对引物，提高了SHOX2甲基化检测的灵敏度以及特异性，避免了假阳性和假阴性结果的出现，使得整个试剂盒的检测准确性明显得到提升。

优选地，上述检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒，还包括三个目的基因甲基化位点对应的MGB探针以及内参基因对应的MGB探针，具体核苷酸序列如下：

目的基因1探针：FAM-AGCGACGTTGCGT-MGB-BHQ1(SEQ IDNO.9)；

目的基因2探针：FAM-TTCGGTTCGTAGGT-MGB-BHQ1(SEQ IDNO.10)；

目的基因3探针：FAM-TGCGATTTCGGTCG-MGB-BHQ1(SEQ IDNO.11)；

内参基因(β-actin)探针：

VIC-CACCACCCAACACACAAT-MGB-BHQ1(SEQ ID NO.12)。

上述三种探针序列，核苷酸序列5’端标记荧光报告基团(FAM或VIC)，3’端标记荧光淬灭基团(BHQ1)。利用MGB探针设计手段，采取相对较短的探针序列，更有利于甲基化位点的识别，进一步提高检测的特异性和灵敏度。

优选地，上述检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒，还包括三个非甲基化目的基因对应的MGB探针，具体核苷酸序列如下：

Blocker1引物：AGTGATGTTGTGT-CY3(SEQ ID NO.13)；

Blocker2引物：TTTGGTTTGTAGGT-CY3(SEQ ID NO.14)；

Blocker3引物：TGTGATTTTGGTTG-CY3(SEQ ID NO.15)。

在PCR扩增过程中，目的片段的引物容易与未发生甲基化的基因片段结合，并发生突破扩增，从而产生非特异性条带，影响扩增效果。因此，作为优选方案，本试剂盒在每个扩增体系中额外增加了一条Blocker引物(Blocker1-3分别为目的基因1-3的Blocker引物)，引物5’端进行CY3修饰后可以阻止扩增，目的是这条引物特异性地与非甲基化基因片段结合，进而摒弃非甲基化片段的扩增，使目的引物只与甲基化片段结合，进一步提高PCR扩增效率以及扩增的特异性。

优选地，上述检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、dNTPs和Mg²⁺。

本发明提供的检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒，具有如下有益效果：

本发明试剂盒检测SHOX2甲基化的位点不仅包括基因的启动子区域，还包括基因的编码区域，这样进行多区域检测有利于提高SHOX2甲基化的准确性以及特异性，进一步提高SHOX2的检出率。该试剂盒在分子水平上对于肺癌早期筛查具有很强针对性，具有检测特异性、高灵敏度、准确性高等优点，这样对于早期可能的肺癌患者及早的进行预防以及采取相应的治疗措施。

本发明试剂盒主要采用Taqman-MGB探针检测的手段，通过探针与甲基化序列特异性结合,进而将甲基化位点精确检测。对比于用PCR特异性引物进行检测的方法，利用探针对甲基化位点进行识别，具有更高的灵敏度、精准性。本发明采用这种技术进行相关基因的甲基化检测，操作简便、易于判读，对仪器的要求不高，并且整个PCR过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，使结果更加精准。试剂盒检测的高灵敏性适用于肺癌的早期筛查。

附图说明

图1为实施例1检测结果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

实施例1检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒的检测试验

试剂盒组分如下表：

选取经过已知型别的10个肿瘤血浆样本：5个鉴定为SHOX2甲基化阳性，均为肺癌样本；5个为SHOX2甲基化阴性，为非肺癌的肿瘤样本。

1、对上述10例血浆样本进行提取游离DNA，游离DNA提取试剂盒来自天根生化科技有限公司。

2、游离DNA提取完成，对提取好的DNA进行重亚硫酸盐转化，未甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶(C)不变。得到纯化好的DNA，转化试剂盒来自天根生化科技有限公司。

3、配制PCR反应液：DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺、10×DNA聚合酶buffer、目的基因1引物探针、目的基因2引物探针、目的基因3引物探针、内参基因引物探针。

4、PCR反应条件为：37℃UDG酶反应2min；95℃预变性3min；94℃变性15s，60退火延伸35s，45个循环；

5、PCR反应体系的配置

DNA PCR扩增MIX

组分	一人份加入量(μL)
		DNA聚合酶	0.25
dNTPs	2
		Mg²⁺	3-3.5
10×DNA聚合酶buffer	2.5
		UDG酶	0.1
dUTP	0.01

PCR扩增反应体系

组分	一人份加入量(μl)
		DNA PCR扩增MIX	12.5
目的基因1/2/3-F(10μM)	0.5
		目的基因1/2/3-R(10μM)	0.5
目的基因1/2/3-FP(10μM)	0.2
		Blocker1/2/3(20μM)	0.2
内参基因-F(10μM)	0.3
		内参基因-R(10μM)	0.3
内参基因-FP(10μM)	0.2
		纯化水	8.3
模板	2

PCR扩增程序如下：

第一扩增阶段：37℃UDG酶反应2min；

第二扩增阶段：95℃预变性3min；

第三扩增阶段：94℃变性15s，60℃退火延伸35s，45个循环；

信号收集，第三阶段60℃收集FAM，VIC信号。

6、检测结果分析

利用上述反应体系对10例样本进行检测，检测结果如图1所示。显示本发明试剂盒能够准确检出5例阳性样本，目的基因1/2/3ct值与内参基因Ct值之差均小于8，说明SHOX2发生甲基化。对剩下的5例阴性样本没有扩增曲线，目的基因1/2/3ct值与内参基因Ct值之差均大于8，说明SHOX2没有发生甲基化。(如表1)

表1结果判读参考

实施案例2：

收集来自浙江肿瘤医院的105例肺癌血浆样本和15例正常血浆样本，对这120例血浆样本进行SHOX2基因甲基化的检测，具体操作步骤如实施案例1所述。15例正常血浆样本检测结果目的基因1/2/3ct值与内参基因Ct值之差均大于8；而对于105个肺癌血浆样本，检测出90例样本结果目的基因1/2/3ct值与内参基因Ct值之差均小于8，其敏感性达到85.7％，特异性达到98％。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司

<120> 一种检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒

<130> P20160106

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgatgttttt ttgtcggag 19

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcaaaacaaa aaaccgc 17

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtttgtattt ttttcgat 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cacgaataat aaaacgaat 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttttttgggt agttaatatg g 21

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccaaataatc tccgtcc 17

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtgatggagg aggtttag 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaattacaaa aaccacaa 18

<210> 9

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agcgacgttg cgt 13

<210> 10

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttcggttcgt aggt 14

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgcgatttcg gtcg 14

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caccacccaa cacacaat 18

<210> 13

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

agtgatgttg tgt 13

<210> 14

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tttggtttgt aggt 14

<210> 15

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgtgattttg gttg 14

Claims

1.一种检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒，用于针对待检样品中三个目的基因的甲基化位点进行检测，其特征在于，包括已经甲基化的三个目的基因对应的引物及内参基因引物，具体引物序列如下：

目的基因1正向引物F：TGATGTTTTTTTGTCGGAG，

目的基因1反向引物R：TCAAAACAAAAAACCGC；

目的基因2正向引物F：GTTTGTATTTTTTTCGAT，

目的基因2反向引物R：CACGAATAATAAAACGAAT；

目的基因3正向引物F：TTTTTTGGGTAGTTAATATGG，

目的基因3反向引物R：CCAAATAATCTCCGTCC；

内参基因(β-actin)正向引物F：GTGATGGAGGAGGTTTAG，

内参基因(β-actin)反向引物R：AAATTACAAAAACCACAA。

2.根据权利要求1所述的检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒，其特征在于，还包括三个目的基因甲基化位点对应的MGB探针以及内参基因对应的MGB探针，具体核苷酸序列如下：

目的基因1探针：FAM-AGCGACGTTGCGT-MGB-BHQ1；

目的基因2探针：FAM-TTCGGTTCGTAGGT-MGB-BHQ1；

目的基因3探针：FAM-TGCGATTTCGGTCG-MGB-BHQ1；

内参基因(β-actin)探针：

VIC-CACCACCCAACACACAAT-MGB-BHQ1。

3.根据权利要求1所述的检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒，其特征在于，还包括三个非甲基化目的基因对应的MGB探针，具体核苷酸序列如下：

Blocker1引物：AGTGATGTTGTGT-CY3；

Blocker2引物：TTTGGTTTGTAGGT-CY3；

Blocker3引物：TGTGATTTTGGTTG-CY3。

4.根据权利要求1所述的检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液、重亚硫酸盐和UDG酶。

5.根据权利要求4所述的检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、dNTPs和Mg²⁺。