CN112522407A - 一种用于血浆游离dna基因甲基化检测的超灵敏检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于血浆游离DNA基因甲基化检测的超灵敏检测方法，包括设计目标基因甲基化检测引物，目标基因检测探针和封闭引物，并利用引物和探针对DNA样品进行扩增检测，其中，目标基因甲基化引物包括正向引物和反向引物，每个引物均分布2‑3个CpG位点；目标基因检测探针增加MGB修饰，且探针与甲基化目标基因的结合自由能和与非甲基化目标基因的结合自由能差值为20～25kcal mol‑1；封闭引物与野生目标基因的结合自由能ΔGWT，大于与突变型目标基因的结合自由能ΔGVar。上述引物和探针能够相互协同作用达到严格控制非特异性条带扩增的效果，使检测灵敏度更高、特异性更好，操作简单，结果易于判读。

Description

一种用于血浆游离DNA基因甲基化检测的超灵敏检测方法
技术领域
本发明涉及CtDNA基因甲基化检测技术领域，具体涉及一种具有高灵敏度的应用于CtDNA基因甲基化检测的引物组合物。
背景技术
被称为“生命健康第一杀手”的癌症令人闻之色变，每年，无数人的生命被癌症夺走。如果能在癌症早期阶段就做出准确的诊断，将帮助患者赢得更多的治疗时间，“液体活检”技术应运而生。液体活检即通过检查各种体液，来检测癌症和监测疾病进展。
液体活检技术主要包括游离循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)检测、循环肿瘤DNA(ctDNA)检测及外泌体(Exosomes)检测，用于实现对癌症患者的超早期筛查、个体化治疗、疗效监测和复发监控等。与传统的组织活检相比，液体活检具备无侵入性、实时动态监测、克服肿瘤异质性以及提供全面检测信息等独特优势。
Mandel等在1948年从正常人血液中检测到游离的DNA片段，随之提出血浆游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)的概念，并发现cfDNA可以从血浆中分离出来。循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)，是指肿瘤细胞释放的、包含肿瘤变异信息的DNA片段(包括突变、缺少、插入、重排、拷贝数异常、甲基化等)，是cfDNA的一部分。根据肿瘤患者的临床分期不同，ctDNA占cfDNA总量的0.16％-43％不等，1ml血液中约含有0.08-38ng ctDNA，主要片段范围在166bp左右。ctDNA的半衰期非常短，一般不超过1.5小时。ctDNA是一类具备广泛应用前景的肿瘤标志物，可无创地用于肿瘤早期诊断、发展过程监测、预后判断、以及个性化用药指导，目前ctDNA已经成为临床中应用最广的液体活检标志物。
ctDNA在cfDNA中的比例波动范围较大，易受肿瘤分期、转移等影响，大部分在千分之几的数量级，导致cfDNA中能检测到的肿瘤突变频率很低，有研究表明半数以上突变频率在0.4％以下。另外，由于血液中DNA酶的存在，使得cfDNA在血液中不稳定易被降解。血清中ctDNA的浓度是血浆中的3-24倍，但是凝血过程中容易产生的杂质污染，用血浆提取DNA使用更广泛。尽管ctDNA是理想的肿瘤早筛生物标志物，但面临的技术挑战也不容忽视。首先，cfDNA有独特的断裂方式，释放到血浆中的cfDNA并不是均匀覆盖基因组，因此健康人基线对于灵敏检测非常关键。其次，每种癌症突变图谱都不同，能否检测到特异的染色体结构变异并以此作为肿瘤早筛的分子标记，尚需要积累更多样本并借助大数据来积累更多的证据。
DNA甲基化是表观遗传学的一种修饰方式，研究报告，DNA甲基化能影响正常哺乳细胞的基因表达和沉默；同时，在人类肿瘤研究中发现，DNA甲基化通常能导致肿瘤抑制基因启动子区域的CpG岛变化。肿瘤抑制基因启动子区域的高甲基化或者低甲基化都可能导致细胞转化，而使DNA甲基化状态成为肿瘤检测的潜在标志物。
DNA甲基化主要发生在基因的启动子区域(DNA开始转录为RNA的位置)，通常与抑癌基因的表达失活紧密相关。常见的应用于甲基化研究的方法有：甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR，MSP)、亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)和高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM)等。甲基化特异性PCR主要用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。这种方法经济实用，而且灵敏度高，无需特殊仪器，也是目前应用最为广泛的方法；亚硫酸氢盐测序法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。依靠测序引物进行PCR扩增，在此基础上进行后续测序以实现对甲基化位点的检测，这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但过程较为繁琐、昂贵，检测灵敏度低；高分辨率溶解曲线法主要利用样本甲基化和未甲基化DNA会存在序列差异，这种差异可通过溶解曲线分析来发现的原理，因为甲基化DNA含有更多的CG，相对更难溶解。根据溶解温度及峰型的变化，可轻易区分甲基化、完全非甲基化或杂合甲基化。但该方法对仪器要求颇高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪，灵敏度相对较低，判读比较复杂。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述问题，提供一种应用于CtDNA基因甲基化检测的超灵敏检测方法，能够实现CtDNA基因甲基化检测的超灵敏性。
本发明技术方案详述如下：
一种用于血浆游离DNA基因甲基化检测的超灵敏检测方法，其特征在于，包括：设计目标基因甲基化检测引物、目标基因检测探针和封闭引物，并利用设计的引物和探针对DNA样品进行扩增检测；其中，
目标基因甲基化引物包括正向引物和反向引物，每个引物均分布2-3个CpG位点；
目标基因检测探针增加MGB修饰，且探针与甲基化目标基因的结合自由能，和与非甲基化目标基因的结合自由能，差值ΔG相差20～25kcal mol-1；
封闭引物与野生目标基因的结合自由能ΔGWT，大于与突变型目标基因的结合自由能ΔGVar，且60℃时二者差值ΔΔG60℃＝ΔGWT-ΔGVar)≥2-7kcal mol-1。
由于血液中的ctDNA分子含量通常远低于非肿瘤来源的DNA片段，这使得检测它们非常困难，特别是在癌症的早期阶段。因此，检测血浆中基因的甲基化难度相对较大，因此甲基化的扩增体系，特别是引物设计就显得特别中药。本发明通过上述高灵敏的引物设计策略，来捕捉CtDNA中含量甚微的甲基化位点。上述引物基于荧光定量MGB探针方法，并在此基础上引入封闭引物，不仅能够封闭甲基化转化前序列，还能封闭甲基化转化后非甲基化序列，将转化后发生甲基化的模板释放出来，充分使引物探针能特异性的结合到转化后发生甲基化的模板上，进而增强整个反应中引物的扩增效率，以达到放大低突变检测的目的。
在目标基因甲基化特异性引物设计上主要在正向和反向引物中分布多个CpG岛，每个引物分布2-3个CpG位点为最佳，增强引物对甲基化区域的特异性精确识别，增加检测灵敏度和特异性。
探针的设计要点为：特异区分甲基化和非甲基化区域；探针与甲基化模板和探针与非甲基化模板的结合自由能ΔG相差20kcal mol-1；因重亚硫酸盐转化之后的序列只有A、T、G三种碱基(除CG位点外)，引物或者探针之间非常容易产生二聚体的形式，相互之间容易产生影响，设计时需要考虑二聚体的产生；在此基础上增加MGB修饰，减少探针的碱基长度，增加探针与模板结合的特异性。
封闭引物的主要作用就是针对转化前的模板序列和转化后未发生甲基化的模板序列。封闭引物(blocker引物)与野生型模板的结合自由能(ΔGWT)需要比blocker引物与突变型模板的结合自由能(ΔGVar)要强，即自由能(ΔΔG60℃＝ΔGWT-ΔGVar)≥2-7kcalmol-1。
优选的，上述方法中，引物和探针还包括内参基因检测引物和内参基因检测探针，内参基因检测引物包括正向引物和反向引物。
优选的，上述方法中，所述目标基因为SHOX2，其中，
SHOX2正向引物：SEQ ID NO:1，
SHOX2反向引物：SEQ ID NO:2；
SHOX2检测探针：SEQ ID NO:3；
SHOX2封闭引物：SEQ ID NO:4。
上述SHOX2基因中封闭引物的ΔΔG60℃＝2.78kcal mol-1，使封闭引物的封闭效果达到最佳。
优选的，上述方法中，包括内参基因检测引物和检测探针，所述内参基因为GAPDH，其中，
GAPDH正向引物：SEQ ID NO:5，
GAPDH反向引物：SEQ ID NO:6，
GAPDH检测探针：SEQ ID NO:7。
优选的，上述方法中，所述目标基因为ZNF671和HOXA11，其中，
ZNF671正向引物：SEQ ID NO:8，
ZNF671反向引物：SEQ ID NO:9；
ZNF671检测探针：SEQ ID NO:10；
ZNF671封闭引物：SEQ ID NO:11；
HOXA11正向引物：SEQ ID NO:12，
HOXA11反向引物：SEQ ID NO:13；
HOXA11检测探针：SEQ ID NO:14；
HOXA11封闭引物：SEQ ID NO:15。
ZNF671基因中封闭引物的ΔΔG60℃＝3.7kcal mol-1，使封闭引物的封闭效果达到最佳。HOX11基因中封闭引物的ΔΔG60℃＝5.2kcal mol-1，使封闭引物的封闭效果达到最佳。
优选的，上述方法中，包括内参基因检测引物和检测探针，所述内参基因为GAPDH，其中，
GAPDH正向引物：SEQ ID NO:16，
GAPDH反向引物：SEQ ID NO:17；
GAPDH检测探针：SEQ ID NO:18。
优选的，上述方法中，对DNA样品进行扩增检测时，使用的PCR反应液每一人份的组分为：1U/μL的Taq DNA聚合酶0.25μL、2.5mM的dNTPs 2.5μL、1.5mM的Mg2+ 2～5μL、10×DNA聚合酶buffer 2.5μL，用纯化水补足至所需量。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明主要基于MSP检测的手段，在目标基因检测引物对基础上，引入MGB探针和封闭引物，相互协同作用达到严格控制非特异性条带扩增的效果，使组合物及试剂盒检测灵敏度更高、特异性更好，并且操作简单，易于判读。
经验证，上述以SHOX2为目标基因的检测引物和探针组合试剂盒，对梯度稀释的甲基化标准品进行检测，能够准确检出1‰甲基化水平的标准品。以ZNF671和HOXA11为目标基因的检测引物和探针组合试剂盒，在高级别浆液性癌、低级别浆液性癌、透明细胞癌、粘液性癌的检出率分别为92.9％、77.8％、83.3％、85.7％，在卵巢癌中检测的综合灵敏度为88％，特异性为100％。
由于血浆中的CtDNA的含量甚微，临床急需高灵敏度的检测手段，用于更早期的检测到癌变的可能。本发明提供的上述检测引物和试剂盒，灵敏度和特异性优越，为早筛早诊各种恶性肿瘤提供了一种有效的检测手段。
附图说明
图1为实施例1中目的基因和内参基因的甲基化检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细解释和说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施。
实施例1通过CtDNA中SHOX2基因甲基化状态用于肺部结节良恶性辅助诊断。
人矮小同源盒基因SHOX2(short stature homebox2)是同源盒基因家族的一员，其表达于中胚层和外胚层，对骨骼、心脏和神经系统的发育起到重要的作用。有研究表明，肺癌患者中SHOX2基因发生高度甲基化。并且最新的研究表明，SHOX2基因的甲基化与肺癌密切相关，这也提示了SHOX2基因的甲基化可作为用于肺部结节良恶性辅助诊断的指标。
由于血浆游离DNA中体细胞突变含量很低，检测突变灵敏度至少需达到1％，甚至千分之一。本发明利用对SHOX2基因甲基化的检测，突出本方法在CtDNA中基因甲基化检测的超灵敏性，适用于液体活检的检测方法。
本发明在SHOX2基因甲基化特异性引物设计上主要在正向和反向引物中分布多个CpG岛，每个引物分布2-3个CpG位点为最佳，增强引物对甲基化区域的特异性精确识别，增加检测灵敏度和特异性。对于在探针的设计要点为：特异区分甲基化和非甲基化区域；探针与甲基化模板和探针与非甲基化模板的结合自由能ΔG相差20kcal mol-1；因重亚硫酸盐转化之后的序列只有A、T、G三种碱基(除CG位点外)，引物或者探针之间非常容易产生二聚体的形式，相互之间容易产生影响，设计时需要考虑二聚体的产生；在此基础上增加MGB修饰，减少探针的碱基长度，增加探针与模板结合的特异性。在特异性引物和探针之外，本方法引入封闭引物的设计方式，封闭引物的主要作用就是针对转化前的模板序列和转化后未发生甲基化的模板序列。封闭引物(blocker引物)与野生型模板的结合自由能(ΔGWT)需要比blocker引物与突变型模板的结合自由能(ΔGVar)要强，即自由能(ΔΔG60℃＝ΔGWT-ΔGVar)≥2-7kcal mol-1。本示例中经过大量筛选之后，SHOX2基因中封闭引物的ΔΔG60℃＝2.78kcal mol-1，使封闭引物的封闭效果达到最佳。
首先选取SHOX2甲基化和非甲基化细胞系DNA，模拟100％、50％、10％、1％、1‰甲基化状态的标准品和20例健康人血浆样本，用于后续SHOX2基因特异性甲基化引物探针的筛选，通过上述方法的设计筛选如下：
SHOX2-F(正向引物)：
TTAGTATCGTTTTTCGGATTGT(SEQ ID NO:1)；
SHOX2-R(反向引物)：
TACTAATAATCTTAACGACTACTACGAC(SEQ ID NO:2)；
SHOX2-FP：
FAM-TGGTCGCGGATTCG-MGB(SEQ ID NO:3)；
SHOX2-B：
CGCTGGCCGCGGATTCGGCTTCC-C3spacer(SEQ ID NO:4)。
GAPDH-F(内参基因正向引物)：
TTATTTTTTGGTATGTGGTTGG(SEQ ID NO:5)，
GAPDH-R(内参基因反向引物)：
ACCACCCTATTACTATAACCAAATT(SEQ ID NO:6)，
GAPDH-FP(内参基因探针)：
VIC-TTTGGTGGTTGGTTTAGAAAAAGGGTTTTGA-BHQ1(SEQ ID NO:7)。
探针SHOX2-FP和GAPDH-FP在核苷酸序列的5’端分别标记FAM荧光标记，VIC荧光标记，在3’端均标记MGB。除了相应的引物探针之外，还包括特异性的甲基化专用PCR反应液，包括DNA聚合酶(Taq酶)、dNTPs、Mg2+等。具体的实验步骤是：
1)提取相应基因甲基化的细胞系和血浆样本，然后进行重亚硫酸盐转化得到bis-DNA；
2)利用上述的引物探针混合液以及PCR反应液对1)中的bis-DNA进行荧光定量PCR检测；
3)PCR反应条件：96℃预变性5min；94℃变性15s，60℃退火延伸45s，50个循环；25℃保持10min。以步骤(1)中得到的Bis-DNA为模板，进行PCR扩增。进行信号收集，60℃收集FAM、VIC信号。
如图1所示。根据PCR反应之后的结果分析：读取目的基因Ct值和内参基因Ct值，若目的基因Ct值与内参基因Ct值之差小于等于9，则为SHOX2发生甲基化。
本发明主要基于MSP检测的手段，引入MGB探针和封闭引物，严格控制非特异性条带的扩增，使这个试剂盒检测灵敏度更高、特异性更好，并且操作简单，易于判读。利用该方法完成SHOX2基因甲基化反应体系确定之后，用于对血浆CtDNA中SHOX2甲基化的检测。
具体实施方式：
本发明在荧光定量PCR的基础上，加入相应检测位点的引物探针，配制成已经预混好的检测SHOX2基因甲基化检测引物探针混合液。直接可对提取完成的CtDNA样本进行检测，这样使检测步骤更为简便。
1)对上述细胞系和血浆样本进行提取，接着进行重亚硫酸盐转化成Bis-DNA，提取试剂盒和转化试剂盒均来自天根生化科技(北京)有限公司；
2)配置PCR反应液：DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、10*DNA聚合酶buffer、目的基因引物探针、内参基因引物探针，封闭引物；
4)PCR反应条件为：96℃预变性5min；94℃变性15s，60℃退火延伸45s，50个循环；25℃保持10min。
5)PCR反应体系的配置
DNA PCR扩增MIX
Figure BDA0002835163040000081
PCR扩增反应体系
Figure BDA0002835163040000082
Figure BDA0002835163040000091
PCR扩增程序如下：
第一扩增阶段：96℃预变性5min；
第二扩增阶段：94℃变性15s，60℃退火延伸45s，50个循环；
第三扩增阶段：25℃保持10min；
信号收集，第三阶段60℃收集FAM，VIC信号。
6)检测结果分析
利用上述反应体系对梯度稀释的甲基化标准品进行检测，能够准确检出1‰甲基化水平的标准品，检测到目的基因Ct值与内参基因Ct值之差均≤9，说明含有甲基化位点。其余20例血浆样本检测到目的基因Ct值与内参基因Ct值差值＞9，说明未检测到甲基化位点。
7)成品试剂盒的性能验证
利用配置完成的成品试剂盒进行产品精密度、稳定性的检测，根据上述设置的条件进行产品性能验证，使用上述提取的样本，若目的基因Ct值与内参基因Ct值之差均≤9，说明含有甲基化。目的基因Ct值与内参基因Ct值差值＞9，说明未检测到甲基化。
实施例2通过CtDNA中ZNF671、HOXA11基因甲基化检测早期卵巢癌。
Zinc Finger Protein 671(ZNF671)基因超甲基化在多种癌症中均有发生，如透明肾癌、尿路上皮癌；在卵巢癌中，ZNF671的甲基化导致其表达沉默。2019年，Shoko Mase等人研究发现ZNF671有肿瘤抑制作用，其DNA甲基化导致的基因表达沉默与癌症的进展相关联，而这与浆液性卵巢癌的早期复发相关。Hox genes 11(HOX11)是苗勒管发育中起重要作用的因素之一，在子宫内膜癌和卵巢癌中起调节作用。Heidi等人研究发现在卵巢癌患者中HOXA11基因的超甲基化，同时HOXA甲基化与卵巢癌患者中低生存率具有紧密联系。
本实施例中通过多基因多通道荧光技术手段对早期卵巢癌进行检测，以期在更早期将卵巢癌检测出来，并进行早期治疗。
本实施例在ZNF671和HOX11基因甲基化特异性引物设计上主要在引物中包含多个CpG岛，每个引物分布2-3个CpG位点为最佳，提高引物对甲基化区域的特异性精确识别，增加检测灵敏度和特异性。对于多基因多重扩增反应体系，要求的是基因之间的扩增相互之间不能产生干扰，直至筛选出多个基因多重扩增效率与其单重扩增效率一致时，说明在多重反应体系中基因的扩增效率没有受到抑制。对于探针的设计，要点为：特异区分甲基化和非甲基化区域；探针与甲基化模板和探针与非甲基化模板的结合自由能ΔG相差20kcalmol-1；因重亚硫酸盐转化之后的序列只有A、T、G三种碱基(除CG位点外)，引物或者探针之间非常容易产生二聚体的形式，相互之间容易产生影响，设计时需要考虑二聚体的产生；在此基础上增加MGB修饰，减少探针的碱基长度，增加探针与模板结合的特异性，同时需要注意的是多重反应中探针之间的影响。在特异性引物和探针之外，本方法引入封闭引物的设计方式，封闭引物的主要作用就是针对转化前的模板序列和转化后未发生甲基化的模板序列。封闭引物(blocker引物)与野生型模板的结合自由能(ΔGWT)需要比blocker引物与突变型模板的结合自由能(ΔGVar)要强，即自由能(ΔΔG60℃＝ΔGWT-ΔGVar)≥2-7kcal mol-1。本示例中经过大量筛选之后，ZNF671基因中封闭引物的ΔΔG60℃＝3.7kcal mol-1，使封闭引物的封闭效果达到最佳。HOX11基因中封闭引物的ΔΔG60℃＝5.2kcal mol-1，使封闭引物的封闭效果达到最佳。
与北京协和医院合作选取已知明确病理信息结果的50例卵巢癌血浆样本：28例鉴定为高级别浆液性癌、9例低级别浆液性癌、6例透明细胞癌、7例粘液性癌；15例为卵巢良性肿瘤血浆样本。用于后续ZNF671和HOX11基因特异性甲基化引物探针的筛选，通过上述方法的设计筛选如下：
ZNF671-F(正向引物)：
TTACGGTTTTATGGCGGAGTTA(SEQ ID NO:8)；
ZNF671-R(反向引物)：
TTTACGATTCGAAATCGAAA(SEQ ID NO:9)；
ZNF671-FP：
FAM-TTAACGGATTTCGCGCGGGTG-MGB(SEQ ID NO:10)；
ZNF671-B：
GCTAACGGACTCCGCGCGGGTGG-C3spacer(SEQ ID NO:11)；
HOX11-F(正向引物)：
TTCGCGGAGGAGTTCGTG(SEQ ID NO:12)；
HOX11-R(反向引物)：
AAACGTTAACCGAACTCTTAACCA(SEQ ID NO:13)；
HOX11-FP：
CY5-AGGCGTTTAGCGCGGT-MGB(SEQ ID NO:14)；
HOX11-B：
GCAGGCGCCCAGCGCGGCCGG-C3spacer(SEQ ID NO:15)；
GAPDH-F(内参基因正向引物)：
TTATTTTTTGGTATGTGGTTGG(SEQ ID NO:16)，
GAPDH-R(内参基因反向引物)：
ACCACCCTATTACTATAACCAAATT(SEQ ID NO:17)；
GAPDH-FP(内参基因探针)：
VIC-TTTGGTGGTTGGTTTAGAAAAAGGGTTTTGA-BHQ1(SEQ ID NO:18)。
探针ZNF671-FP、HOX11-FP、GAPDH-FP在核苷酸序列的5’端分别标记FAM荧光标记，VIC荧光标记，ROX荧光标记，在3’端均标记MGB。
除了相应的引物探针之外，还包括特异性的甲基化专用PCR反应液，包括DNA聚合酶(Taq酶)、dNTPs、Mg2+等。具体的实验步骤是：
1)提取相应基因甲基化的血浆样本，然后进行重亚硫酸盐转化得到bis-DNA；
2)利用上述的引物探针混合液以及PCR反应液对1)中的bis-DNA进行荧光定量PCR检测；
3)PCR反应条件：96℃预变性5min；94℃变性15s，60℃退火延伸45s，50个循环；25℃保持10min。以步骤(1)中得到的Bis-DNA为模板，进行PCR扩增。进行信号收集，60℃收集FAM、VIC、ROX信号。
根据PCR反应之后的结果分析：读取目的基因Ct值和内参基因Ct值，若ZNF671Ct值与内参基因Ct值之差≤8，则为ZNF671发生甲基化。若HOX11Ct值与内参基因Ct值之差≤10，则为HOX11发生甲基化。其中ZNF671或HOX11任一基因出现甲基化，则判定该样本发生甲基化。
本发明主要基于MSP检测的手段，引入MGB探针和封闭引物，严格控制非特异性条带的扩增，使这个试剂盒检测灵敏度更高、特异性更好，并且操作简单，易于判读。
具体实施方式：
本实施例在荧光定量PCR的基础上，加入相应检测位点的引物探针，配制成已经预混好的检测ZNF671和HOX11基因甲基化检测引物探针混合液。直接可对提取完成的CtDNA样本进行检测，这样使检测步骤更为简便。
1)对上述血浆样本进行提取，接着进行重亚硫酸盐转化成Bis-DNA，提取试剂盒和转化试剂盒均来自天根生化科技(北京)有限公司；
2)配置PCR反应液：DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、10*DNA聚合酶buffer、目的基因引物探针、内参基因引物探针，封闭引物；
4)PCR反应条件为：96℃预变性5min；94℃变性15s，60℃退火延伸45s，50个循环；25℃保持10min。
5)PCR反应体系的配置
DNA PCR扩增MIX
Figure BDA0002835163040000121
PCR扩增反应体系
Figure BDA0002835163040000131
PCR扩增程序如下：
第一扩增阶段：96℃预变性5min；
第二扩增阶段：94℃变性15s，60℃退火延伸45s，50个循环；
第三扩增阶段：25℃保持10min；
信号收集，第三阶段60℃收集FAM，VIC，ROX信号。
6)检测结果分析
根据已知病理信息结果，计算出ZNF671和HOX11甲基化的cut-off值。当ZNF671Ct值与内参基因Ct值之差≤8，HOX11Ct值与内参基因Ct值之差≤10，则ZNF671和HOX11发生甲基化，并且其中任一基因发生甲基化，该样本则发生甲基化。根据上述的cut-off值计算该组合对卵巢癌的灵敏度和特异性。28例鉴定为高级别浆液性癌中检测出26例发生甲基化，9例低级别浆液性癌中检测出7例发生甲基化，6例透明细胞癌中5例检测出甲基化，7例粘液性癌中检测出6例为甲基化，15例卵巢良性肿瘤中均未检测出甲基化。因此，该检测体系在高级别浆液性癌、低级别浆液性癌、透明细胞癌、粘液性癌的检出率分别为92.9％、77.8％、83.3％、85.7％，在卵巢癌中检测的综合灵敏度为88％，特异性为100％。
综合以上两个实施例，对本发明一种应用于CtDNA基因甲基化检测的超灵敏方法进行了详细分析，由于血浆中的CtDNA的含量甚微，临床急需高灵敏度的检测手段，用于更早期的检测到癌变的可能。本发明提供的早期发现癌症的检测引物探针组合手段，为早筛早诊、降低恶性肿瘤死亡提供了一种有效途径。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京起源聚禾生物科技有限公司
<120> 一种用于血浆游离DNA基因甲基化检测的超灵敏检测方法
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 1
ttagtatcgt ttttcggatt gt 22
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 2
tactaataat cttaacgact actacgac 28
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 3
tggtcgcgga ttcg 14
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 4
cgctggccgc ggattcggct tcc 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 5
ttattttttg gtatgtggtt gg 22
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 6
accaccctat tactataacc aaatt 25
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 7
tttggtggtt ggtttagaaa aagggttttg a 31
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 8
ttacggtttt atggcggagt ta 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 9
tttacgattc gaaatcgaaa 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 10
ttaacggatt tcgcgcgggt g 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Based on Homo sapiens
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gctaacggac tccgcgcggg tgg 23
<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 12
ttcgcggagg agttcgtg 18
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
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aaacgttaac cgaactctta acca 24
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 14
aggcgtttag cgcggt 16
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 15
gcaggcgccc agcgcggccg g 21
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 16
ttattttttg gtatgtggtt gg 22
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 17
accaccctat tactataacc aaatt 25
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 18
tttggtggtt ggtttagaaa aagggttttg a 31

Claims (7)

1.一种用于血浆游离DNA基因甲基化检测的超灵敏检测方法，其特征在于，包括：设计目标基因甲基化检测引物、目标基因检测探针和封闭引物，并利用设计的引物和探针对DNA样品进行扩增检测；其中，
目标基因甲基化引物包括正向引物和反向引物，每个引物均分布2-3个CpG位点；
目标基因检测探针增加MGB修饰，且探针与甲基化目标基因的结合自由能，和与非甲基化目标基因的结合自由能，差值ΔG相差20～25kcal mol-1；
封闭引物与野生目标基因的结合自由能ΔGWT，大于与突变型目标基因的结合自由能ΔGVar，且60℃时二者差值ΔΔG60℃＝ΔGWT-ΔGVar)≥2-7kcal mol-1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括内参基因检测引物和内参基因检测探针，内参基因检测引物包括正向引物和反向引物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述目标基因为SHOX2，其中，
SHOX2正向引物：SEQ ID NO:1，
SHOX2反向引物：SEQ ID NO:2；
SHOX2检测探针：SEQ ID NO:3；
SHOX2封闭引物：SEQ ID NO:4。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括内参基因检测引物和检测探针，所述内参基因为GAPDH，其中，
GAPDH正向引物：SEQ ID NO:5，
GAPDH反向引物：SEQ ID NO:6；
GAPDH检测探针：SEQ ID NO:7。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述目标基因为ZNF671和HOXA11，其中，
ZNF671正向引物：SEQ ID NO:8，
ZNF671反向引物：SEQ ID NO:9；
ZNF671检测探针：SEQ ID NO:10；
ZNF671封闭引物：SEQ ID NO:11；
HOXA11正向引物：SEQ ID NO:12，
HOXA11反向引物：SEQ ID NO:13；
HOXA11检测探针：SEQ ID NO:14；
HOXA11封闭引物：SEQ ID NO:15。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括内参基因检测引物和检测探针，所述内参基因为GAPDH，其中，
GAPDH正向引物：SEQ ID NO:16，
GAPDH反向引物：SEQ ID NO:17；
GAPDH检测探针：SEQ ID NO:18。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对DNA样品进行扩增检测时，使用的PCR反应液每一人份的组分为：1U/μL的Taq DNA聚合酶0.25μL、2.5mM的dNTPs 2.5μL、1.5mM的Mg2+2～5μL、10×DNA聚合酶buffer 2.5μL，用纯化水补足至所需量。
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