CN110656180A - 一种基因甲基化检测引物探针组合物、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种基因甲基化检测引物探针组合物、试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110656180A
CN110656180A CN201911038929.2A CN201911038929A CN110656180A CN 110656180 A CN110656180 A CN 110656180A CN 201911038929 A CN201911038929 A CN 201911038929A CN 110656180 A CN110656180 A CN 110656180A
Authority
CN
China
Prior art keywords
target region
shox2
seq
ptger4
methylation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911038929.2A
Other languages
English (en)
Inventor
喻德华
曹艳华
毛玉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen City Hong Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen City Hong Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen City Hong Biotechnology Co Ltd filed Critical Shenzhen City Hong Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201911038929.2A priority Critical patent/CN110656180A/zh
Publication of CN110656180A publication Critical patent/CN110656180A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种基因甲基化检测引物探针组合物、试剂盒及其应用，所述组合物包括检测SHOX2至少一个靶区域的引物和探针，和/或检测PTGER4至少一个靶区域的引物和探针；所述引物包括靶区域的甲基化特异性引物对和非甲基化封闭引物；所述探针包括靶区域的特异性探针。本发明通过检测血浆游离DNA中SHOX2或/和PTGER4基因的正负链甲基化，表明细胞异常增殖的存在，双链检测显著提高了基因甲基化检测的特异性和灵敏度。

Description

一种基因甲基化检测引物探针组合物、试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，涉及一种基因甲基化检测引物探针组合物、试剂盒及其应用。
背景技术
据全国肿瘤登记中心的最新数据显示，我国肺癌新发病例约73.3万例，位居所有恶性肿瘤发病率的第一位(19.9％)；死亡病例约59.1万，位于所有恶性肿瘤死亡率的第一位(26.5％)。在当前的医疗体系下，中晚期肺癌患者的五年生存率仅为10-20％，但是对于早期肺癌病人，通过手术切除的方法约有80％-90％的患者可以治愈。在临床实践中，肺癌早期诊断一直是难点，癌症的早期发现对于癌症患者的有效治疗非常重要。
癌症诊断的主要依据包括临床症状、影像学检测和组织病理学检查等，许多癌症患者的临床症状出现较晚，绝大多数的早期肺癌(尤其是0期和Ⅰ期)患者无任何明显的临床症状。对于肺癌的早期筛查，目前包括许多方法，比如低剂量CT诊断、组织细胞层面的肺癌诊断和基因层面的肺癌诊断等。但是这些手段存在诸多弊端：低剂量CT检测存在假阳性问题，且检测成本高；组织层面的肺癌诊断在取样方面会给患者带来较大痛苦，且有可能导致癌细胞扩散或转移：基因层面的肿瘤特异性分子标志物检测可以作为肺癌早期诊断的一种手段，但技术尚未成熟。
目前，疾病的基因检测方法受到了广泛的关注。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，不仅维持正常细胞功能，而且在癌症发生中也起着重要的作用，甲基化状态的改变是引起癌症的一个重要因素。采用DNA甲基化作为疾病诊断的标志物，优势主要为：其一，在肿瘤形成过程中，启动子超甲基化的发生频率很高，甚至高于基因突变，其中不乏与肿瘤形成相关的重要基因；其二，甲基化是肿瘤发生早期的重要事件；其三，DNA甲基化稳定存在，可以通过PCR放大效应进行检测。因此，甲基化检测对肿瘤早期诊断具有潜在的应用价值。
尽管现有技术已经发现了多种与早期肺癌相关的甲基化基因，但是在早期肺癌中，不同基因发生甲基化的频率、不同基因的高甲基化位点均不相同，适用的检测方法需要进一步研究。在外周血中，发生异常甲基化的DNA只占全部DNA的约0.1％～1％，这些非甲基化DNA与甲基化DNA只存在微小的差异，需要从高度复杂的“背景”中检测出异常甲基化DNA，对检测方法提出了高要求。
因此，有必要提供一种新的基因甲基化检测手段，在肺癌的早期筛查方面具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种基因甲基化检测引物探针组合物、试剂盒及其应用，针对两个与肺癌相关的基因SHOX2和PTGER4上的多个区域，在正义链和反义链上同时设计检测引物和探针，有助于提高基因异常甲基化的检出率。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括检测SHOX2至少一个靶区域的引物和探针，和/或检测PTGER4至少一个靶区域的引物和探针；
所述引物包括靶区域的甲基化特异性引物对和非甲基化封闭引物；
所述探针包括靶区域的特异性探针。
本发明中，通过同时检测血液游离DNA中SHOX2和PTGER4基因的正反义链的多个区域，表明细胞异常增殖的存在，显著提高了基因甲基化检测的特异性和灵敏度。
优选地，所述SHOX2靶区域包括SHOX2第一靶区域、SHOX2第二靶区域和SHOX2第三靶区域；
所述PTGER4靶区域包括PTGER4第一靶区域和PTGER4第二靶区域；
所述组合物等同、互补或杂交于所述靶区域上。
优选地，所述SHOX2第一靶区域包括如SEQ ID NO:50所示的核酸序列，所述SHOX2第二靶区域包括如SEQ ID NO:51所示的核酸序列，所述SHOX2第三靶区域包括如SEQ IDNO:52所示的核酸序列；
SEQ ID NO:50
GGTAGTTAATATGGCGTGGGCGTTTGTGTTCGTGCGATTTCGGTCGGGTAGGCGGGACGGAGATTATTTGGTTGTTTAGGGGATTTTATGTAGGGTTTGGTTCGAGTTTAGGGGTAGCGAGGGGCGTTTGCGGATGCGGTTTTTTGTGCGGTATAATATCGGGGTTTGTTGTTTTCGTTGATATTTTTCGGTTTAATTGTTTTTAAATTAGATTAGTAAGTTTGCGGTAGGTAGAGAGTTAGCGGTGGTGAGAGTT；
SEQ ID NO:51
GTAAATTTGTTGGTTTAATTTAGGAATAATTGGGTCGAAAGGTATTAGCGAGAGTAATAGATTTCGGTGTTGTGTCGTATAGGGAGTCGTATTCGTAGACGTTTTTCGTTGTTTTTGGGTTCGGGTTAAATTTTGTATAAGGTTTTTT GGATAGTTAGGTAATTTTCGTTTCGTTTGTTCGATCGGGGTCGTACGAGTATAGGCGTTTACGTTATGTTGGTTGTTTAAAGGGTTCGTCGTTTAAGTCGGGTTAGAAGGTAGGAGGCGGAAAATTAGTTTTCGGTGGCGGGCGAAAGTAATCGTTTTTTTTGTTTTTTTTTCGTTTTTTTTCGTGGAAACG；
SEQ ID NO:52
GAGTCGGTTTGTAGAGAAATTAATATTTGTTTTGAGTTTGGAAATTAATAATTTTAGGAATTGCGTTCGTCGGGGGTTTAGATTTGAATTTCGTCGTTAGGCGCGTTGGCGAATTTGTAGTTCGGGTTTGTAGTTGTGGATTTATGGTCGGGAGGTTGTATTGGGTATTTTGACGGTAA。
优选地，所述SHOX2第一靶区域正义链的引物和探针如SEQ ID NO:1～4所示，具体为：
SHOX2第一靶区域正义链的甲基化正向引物如SEQ ID NO:1所示：
GGTCGGGTAGGCGGGA；
SHOX2第一靶区域正义链的探针如SEQ ID NO:2所示：
AGGGGATTTTATGTAGGGTTTGGT；
SHOX2第一靶区域正义链的非甲基化封闭引物如SEQ ID NO:3所示：
AAATAGTTTTGATTATTTAAATTTAGTTTT；
SHOX2第一靶区域正义链的甲基化反向引物如SEQ ID NO:4所示：
CGCAAACGCCCCTCGCTA；
所述SHOX2第一靶区域反义链的引物和探针如SEQ ID NO:5～8所示，具体为：
SHOX2第一靶区域反义链的甲基化正向引物如SEQ ID NO:5所示：
ATATATTTTTTTGGAATTTTTA；
SHOX2第一靶区域反义链的探针如SEQ ID NO:6所示：
TCGAATTAGAGATTTCGGGTTTTAAG；
SHOX2第一靶区域反义链的非甲基化封闭引物如SEQ ID NO:7所示：
TTTATTTTTTGTGTTTGAATTAGAGATTTTGGGTTTT；
SHOX2第一靶区域反义链的甲基化反向引物如SEQ ID NO:8所示：
ACAAACAACCTCGACTATCTAAA。
优选地，所述SHOX2第二靶区域正义链的引物和探针如SEQ ID NO:9～12所示，具体为：
SHOX2第二靶区域正义链的甲基化正向引物如SEQ ID NO:9所示：
GGGTGAATAGTGAGGCGG；
SHOX2第二靶区域正义链的探针如SEQ ID NO:10所示：
AGGTACGTTTGTGAAGGAGGTGG；
SHOX2第二靶区域正义链的非甲基化封闭引物如SEQ ID NO:11所示：
TTTTTGTTTTTTGTTTTTTGGTTTGGTTTGGGTGG；
SHOX2第二靶区域正义链的甲基化反向引物如SEQ ID NO:12所示：
ACTTCTCAACCCACCCGAAA；
所述SHOX2第二靶区域反义链的引物和探针如SEQ ID NO:13～16所示，具体为：
SHOX2第二靶区域反义链的甲基化正向引物如SEQ ID NO:13所示：
AGGTTTTTTGGATAGTTAGGT；
SHOX2第二靶区域反义链的探针如SEQ ID NO:14所示：
TTCGTTTGTTCGATCGGGGTCG；
SHOX2第二靶区域反义链的非甲基化封闭引物如SEQ ID NO:15所示：
GTTAGGTAATTTTTGTTTTGTTTGTTTGATTGGG；
SHOX2第二靶区域反义链的甲基化反向引物如SEQ ID NO:16所示：
GACTTAAACGACGAACCCTTT。
优选地，所述SHOX2第三靶区域正义链的引物和探针如SEQ ID NO:17～20所示，具体为：
SHOX2第三靶区域正义链的甲基化正向引物如SEQ ID NO:17所示：
GAGTTTGCGTTTTTACGAGG；
SHOX2第三靶区域正义链的探针如SEQ ID NO:18所示：
GAATAGAAAGAGCGGTTGTTTTCGT；
SHOX2第三靶区域正义链的非甲基化封闭引物如SEQ ID NO:19所示：
AATTATAGGTTTGTTAGTGTGTTTGATGGTGAGGTTTA；
SHOX2第三靶区域正义链的甲基化反向引物如SEQ ID NO:20所示：
ACGAAAAACCAACCTCCGA；
所述SHOX2第三靶区域反义链的引物和探针如SEQ ID NO:21～24所示，具体为：
SHOX2第三靶区域反义链的甲基化正向引物如SEQ ID NO:21所示：
TGGAAATTAATAATTTTAGGAA；
SHOX2第三靶区域反义链的探针如SEQ ID NO:22所示：
GAATTTCGTCGTTAGGCGCG；
SHOX2第三靶区域反义链的非甲基化封闭引物如SEQ ID NO:23所示：
GGGTTTAGATTTGAATTTTGTTGTTAGGTGTGT；
SHOX2第三靶区域反义链的甲基化反向引物如SEQ ID NO:24所示：
ATCCACAACTACAAACCCGAAC。
优选地，所述PTGER4第一靶区域包括如SEQ ID NO:53所示的核酸序列，所述PTGER4第二靶区域包括如SEQ ID NO:54所示的核酸序列；
SEQ ID NO:53
TTTTGTAGTTTATGCGTTTAACGTGTTTTTTTGCGCGTTGTTTAATATGGGTTTCGGTAGTTCGCGGTTGTAGTATTTAGATATTTGGTGTTTTATCGATTGGATTATTAACGTGACGGCGTACGTCGTTTATTTTTATATGTACGCGGGTTTTAGTTTTTTTTTTATTTTCGTTATCGTTTTTTGTAACGTGTTTGTGTGCGGCGCGTTGTTTCGTATGTATCGTTAGTTTATGCGTCGTATTTCGTTGGGTATCGAGTAGTATTACGCGGTCGCGGTCGTTTCGGTTGTTTTTCGGGGTTATTTCGTTGTTTT；
SEQ ID NO:54
TACGTTTATTGTTAAGGATTTAGAGGGAAAGTAGGGAGCGGGGAATGGACGCGGGAGGTGGATGCGAGAAAAAGGTCGAGTAGGGTTTTAGTTTCGGTTATTTATTACGAGCGGGATGGAGTAGATGAGTATTATTAGGGAGGTGGTAATGAGTAAGATGATTATTTGGATTTCGGCGTTCGCGATGCGGCGGAAGTTTCGGCGGCGTCGAAAGTCGTTGAGGCGCGGTAAGGTTGGGGAGGTAGCGGGGTGGTTT。
优选地，所述PTGER4第一靶区域正义链的引物和探针如SEQ ID NO:25～28所示，具体为：
PTGER4第一靶区域正义链的甲基化正向引物如SEQ ID NO:25所示：
TCGTTTTTTGTAACGTGTTTGTG；
PTGER4第一靶区域正义链的探针如SEQ ID NO:26所示：
AACGACCGCGACCGCGTAATACT；
PTGER4第一靶区域正义链的非甲基化封闭引物如SEQ ID NO:27所示：
AAAATAACCCCAAAAAACAACCAAAACAA；
PTGER4第一靶区域正义链的甲基化反向引物如SEQ ID NO:28所示：
AAATAACCCCGAAAAACAAC；
所述PTGER4第一靶区域反义链的引物和探针如SEQ ID NO:29～32所示，具体为：
PTGER4第一靶区域反义链的甲基化正向引物如SEQ ID NO:29所示：
GGTAGCGGGGTGGTTTCG；
PTGER4第一靶区域反义链的探针如SEQ ID NO:30所示：
TTCATACGCCGCACCTCGCTAAAC；
PTGER4第一靶区域反义链的非甲基化封闭引物如SEQ ID NO:31所示：
CACACTACTCCACATACACCACCAATTCATAC；
PTGER4第一靶区域反义链的甲基化反向引物如SEQ ID NO:32所示：
GCGCTACTCCGCATACACC。
优选地，所述PTGER4第二靶区域正义链的引物和探针如SEQ ID NO:33～36所示，具体为：
PTGER4第二靶区域正义链的甲基化正向引物如SEQ ID NO:33所示：
TTTAACGAGATTTAGTAGGTG；
PTGER4第二靶区域正义链的探针如SEQ ID NO:34所示：
AAAAAACCCAAACTTCCGAAAACA；
PTGER4第二靶区域正义链的非甲基化封闭引物如SEQ ID NO:35所示：
CTATCTCAATAAAAAAAAAAACCCAAACTTCC；
PTGER4第二靶区域正义链的甲基化反向引物如SEQ ID NO:36所示：
AATAAAAACTATCTCGATAA；
所述PTGER4第二靶区域反义链的引物和探针如SEQ ID NO:37～40所示，具体为：
PTGER4第二靶区域反义链的甲基化正向引物如SEQ ID NO:37所示：
ATTATTAGGGAGGTGGTAATGAG；
PTGER4第二靶区域反义链的探针如SEQ ID NO:38所示：
GCATCGCGAACGCCGAAATC；
PTGER4第二靶区域反义链的非甲基化封闭引物如SEQ ID NO:39所示：
ACAAACACCAAAATCCAAATAATCATCTTACTCATT；
PTGER4第二靶区域反义链的甲基化反向引物如SEQ ID NO:40所示：
CGCCTCAACGACTTTCGAC。
本发明中，采用上述引物和探针组合物进行多重PCR检测SHOX2和PTGER4基因的正反义链的多个区域，具有特异性好、灵敏度高和可靠性佳等优点，对于早期肺癌患者的诊断具有重要意义。
优选地，所述探针的5’端标记荧光基团、3’端标记淬灭基团。
优选地，所述荧光基团包括FAM、VIC、JOE、NED、TAMRA、Cy3、ROX、TexasRed或Cy5中的任意一种；
所述淬灭基团包括TAMRA、BHQ1或ECLIPSE中的任意一种。
优选地，对于同一靶区域的正义链和反义链，所述探针的荧光基团相同，所述探针的淬灭基团相同。
第二方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的组合物。
优选地，所述试剂盒还包括检测内参基因的引物和探针；
所述内参基因包括ACTB、ALU或GAPDH中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述ACTB的引物和探针如SEQ ID NO:41～43所示；
ACTB的正向引物如SEQ ID NO:41所示：
GGGAGTATATAGGTTGGGGAAG；
ACTB的探针如SEQ ID NO:42所示：
GTGGGGTGGTGATGGAGGAGGTT；
ACTB的反向引物如SEQ ID NO:43所示：
ATAACAAACACAAATTCACAATCC。
优选地，所述ALU的引物和探针如SEQ ID NO:44～46所示；
ALU的正向引物如SEQ ID NO:44所示：
GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA；
ALU的探针如SEQ ID NO:45所示：
CCTACCTTAACCTCCC；
ALU的反向引物如SEQ ID NO:46所示：
ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA。
优选地，所述GAPDH的引物和探针如SEQ ID NO:47～49所示；
GAPDH的正向引物如SEQ ID NO:47所示：
TTGGAAAAGGATATTTTTATTGTAAAA；
GAPDH的探针如SEQ ID NO:48所示：
CTAACCTTTAAAATCAAAT；
GAPDH的反向引物如SEQ ID NO:49所示：
AATTCCCCAAAACACCCAAACACCCA。
优选地，所述引物的浓度为100～700nM，例如可以是100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM或700nM；所述探针的浓度为100～200nM，例如可以是100nM、150nM或200nM。
优选地，所述试剂盒还包括PCR缓冲液，所述PCR缓冲液包括0.5～2U聚合酶、1～50mM MgCl2、10～50mM氯化四甲基铵(TMAC)、0.5％～10％甘油、10～30mg/mL BSA和0.1～1mM dNTPs。
本发明中，所述试剂盒通过联合检测SHOX2基因的3个复孔与PTGER4基因的3个复孔来判断甲基化状态，在阴性对照、阳性对照和内参基因均正常扩增的情况下，若SHOX2或PTGER4基因至少两个复孔检出甲基化，或者SHOX2和PTGER4至少一个复孔同时检出甲基化，则判读为甲基化阳性，样本中存在细胞异常增殖情况。
第三方面，本发明提供了一种基因甲基化检测方法，所述方法包括：
获取待测样本，并对待测样本进行重亚硫酸盐处理；
将重亚硫酸盐处理的待测样本采用如第一方面所述的组合物和/或如第二方面所述的试剂盒进行PCR检测，检测靶基因正反义链的甲基化程度。
优选地，所述待测样本包括外周血游离DNA。
优选地，所述靶基因包括SHOX2和/或PTGER4。
优选地，所述基因甲基化的判读方法为：检测3个复孔，SHOX2或PTGER4基因至少两个复孔检出甲基化，或者SHOX2和PTGER4至少一个复孔同时检出甲基化，则待测样本呈甲基化阳性，待测样本中存在细胞异常增殖情况。
作为优选技术方案，本发明提供了一种基因甲基化检测方法，所述方法包括：
(1)获取待测样本，所述待测样本来源于健康人、肺癌高危人群和早期肺癌患者的血浆游离DNA；
(2)将步骤(1)得到的血浆游离DNA进行重亚硫酸盐转化，使DNA中未发生甲基化的5’胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的5’胞嘧啶不发生改变，得到重亚硫酸盐转化后的DNA(bis-DNA)；
(3)以步骤(3)得到的bis-DNA为模板，采用如第一方面所述的组合物进行SHOX2和/或PTGER4基因的PCR扩增；
(4)PCR扩增体系包括5～10ng bis-DNA模板、100～700nM引物、100～200nM探针、0.1～1mM dNTPs、1～50mM Mg2+和0.5～2U Taq DNA聚合酶；
PCR反应过程为：95℃预变性10min；95℃变性15s，64℃退火5s，59℃延伸1min，45个循环；25℃冷却5s。
第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的组合物和/或如第二方面所述的试剂盒在制备基因甲基化检测试剂中的应用。
第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的组合物和/或如第二方面所述的试剂盒在制备疾病诊断药物中的应用。
优选地，所述疾病包括肺癌。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明针对两个与肺癌相关的基因SHOX2和PTGER4，每一个基因在多个靶区域的正负链上同时设计甲基化特异性引物、探针以及对应的非甲基化封闭引物，检测血浆游离DNA中SHOX2和PTGER4基因的正负链，针对五重三个荧光设计了PCR反应体系，显著提高了基因甲基化检测的特异性和灵敏度；
(2)本发明的试剂盒通过联合检测SHOX2基因和PTGER4基因来判断细胞异常增殖的存在，在阴性对照、阳性对照和内参基因均正常扩增的情况下，若SHOX2基因或PTGER4基因至少两个复孔检出甲基化，或者SHOX2和PTGER4基因至少一个复孔同时检出甲基化，则待测样本呈甲基化阳性，待测样本中存在细胞异常增殖情况。
附图说明
图1为多重PCR扩增SHOX2的标准曲线；
图2为多重PCR扩增PTGER4的标准曲线；
图3为多重PCR扩增ACTB的标准曲线；
图4为早期肺癌患者血浆样本的扩增曲线。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1多重PCR的扩增体系与条件
本实施例为验证五重三荧光PCR扩增体系及条件的稳定性，对重亚硫酸盐转化的A549进行梯度稀释，检测SHOX2、PTGER4和ACTB的扩增效率；
对A549细胞进行DNA提取，将提取好的DNA进行重亚硫酸盐转化，未甲基化的5’胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)，而甲基化的5’胞嘧啶(C)不变，得到纯化好的bis-A549；
对提取转化后的A549细胞进行10倍梯度稀释，配制的样品浓度依次为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL和0pg/μL，15μL上机，3个复孔。
多重PCR反应体系如表1所示，PCR反应过程为：95℃预变性10min；95℃变性15s，64℃退火5s，59℃延伸1min，45个循环；25℃冷却5s。
表1五重三荧光PCR体系
Figure BDA0002252329230000141
检测结果的标准曲线(Standard Curve)如图1、图2和图3所示，采用五重三个荧光检测体系，SHOX2、PTGER4和ACTB的扩增效率(Eff％)都在90％以上。
实施例2 SHOX2和PTGER4上双链检测验证
为验证本发明采用的双链检测优于单链检测，对A549细胞和肺癌癌旁新鲜组织分离的细胞HFC进行DNA提取，将提取好的DNA进行重亚硫酸盐转化，得到纯化好的bis-DNA，具体为bis-A549和bis-HFC，将bis-A549和bis-HFC均稀释至500pg/μL，同时配制1％、0.4％的阳性对照品，其中，每一种阳性对照品重复鉴定10次，鉴定双链检测的最低检出限和单链检测的最低检出限，PCR反应过程为：95℃预变性10min；95℃变性15s，64℃退火5s，59℃延伸1min，45个循环；25℃冷却5s，阳性对照品制作方法见表2，双链扩增体系见表3。
表2阳性对照制作表
Figure BDA0002252329230000152
Figure BDA0002252329230000161
表3五重三荧光PCR体系
Figure BDA0002252329230000162
对比例1
与实施例2相比，PCR反应体系采用单链反应体系，如表4所示，其他条件与实施例2相同。
表4三重三荧光PCR体系
Figure BDA0002252329230000171
比较实施例2的正反双链检测SHOX2和PTGER4甲基化异常的体系与对比例1的单链检测SHOX2和PTGER4甲基化异常的体系在高浓度阴性背景下的阳性最低检出限，结果如表5所示，双链体系和单链体系的阳性对照(PC)和阴性对照(NC)均正常，但是，在高浓度阴性对照样品背景下，DNA双链可以稳定检测1％的阳性样品与0.4％的阳性样品，而DNA单链在检测0.4％的阳性样品时，出现了漏检的现象(UD)，说明双链体系的检测灵敏度和稳定性更高。
表5单双链体系最低灵敏度检测对比
Figure BDA0002252329230000181
实施例3 SHOX2和PTGER4基因靶区域验证
为验证本发明提供的两个基因的靶区域是肺癌特有的甲基化区域，在靶区域内与靶区域外设计相关引物探针，选择6例健康人血浆样本和6例病理信息为I期的肿瘤血浆样本，同时检测SHOX2和PTGER4基因的多个靶区域，具体步骤如下：
(1)对12例血浆样本进行游离DNA提取，将提取好的DNA进行重亚硫酸盐转化，未甲基化的5’胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)，而甲基化的5’胞嘧啶(C)不变，得到纯化好的bis-DNA；
(2)配制如表3所示的PCR反应体系；
(3)PCR反应过程为：95℃预变性10min；95℃变性15s，64℃退火5s，59℃延伸1min，45个循环；25℃冷却5s。
对本发明的靶区域进行检测，肺癌病人、良性和健康人的判断结果均正确，对本发明以外的区域进行检测，对健康人的判断结果正确，对病人仅有1例判断结果正确，说明本发明以外的甲基化区域不是肺癌特有的区域，结果见表6。
表6发明区域内外样本检测对比
Figure BDA0002252329230000201
实施例4小规模临床样本验证
本实施例收集深圳市某医院102例早期肺癌患者(0期30例、I期72例)的血浆样本和深圳市某医院120例正常人血浆样本，对222例血浆样本进行SHOX2和PTGER4基因甲基化的检测，按照实施例1的操作步骤进行检测。
通过联合检测SHOX2基因的3个复孔与PTGER4基因的3个复孔来判断细胞是否增殖异常，在阴性对照、阳性对照和内参基因均正常扩增的情况下，若SHOX2基因或PTGER4基因的3个复孔中至少两个复孔检出甲基化，或者SHOX2和PTGER4至少一个复孔同时检出甲基化，则判断为细胞增殖异常。
120例正常人血浆样本中，112例判读为阴性，特异性达到93％；102例早期肺癌患者血浆样本中，83例判读为阳性样本，灵敏度达81％，其中一例早期肺癌患者血浆样本的检测结果如图4所示。
综上所述，本发明的试剂盒同时检测SHOX2基因和PTGER4基因正反义链上的多个目标区域，提高了检测的灵敏度和特异性，提高了SHOX2和PTGER4基因甲基化的检出率；所述试剂盒在分子水平上对细胞增殖异常的存在具有很强的针对性，具有检测特异性好、灵敏度高和可靠性佳等优点，对于早期肺癌患者及早进行救治以及采取相应的治疗措施具有重要意义；本发明通过检测同一区域的正反义链提高了SHOX2和PTGER4基因的灵敏度和特异性，对比于仅检测一条链的方法，该方法具有更高的灵敏度和特异性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市优圣康生物科技有限公司
<120> 一种基因甲基化检测引物探针组合物、试剂盒及其应用
<130> 20191028
<160> 54
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggtcgggtag gcggga 16
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
aggggatttt atgtagggtt tggt 24
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aaatagtttt gattatttaa atttagtttt 30
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
cgcaaacgcc cctcgcta 18
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
atatattttt ttggaatttt ta 22
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tcgaattaga gatttcgggt tttaag 26
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tttatttttt gtgtttgaat tagagatttt gggtttt 37
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
acaaacaacc tcgactatct aaa 23
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gggtgaatag tgaggcgg 18
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
aggtacgttt gtgaaggagg tgg 23
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
tttttgtttt ttgttttttg gtttggtttg ggtgg 35
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
acttctcaac ccacccgaaa 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
aggttttttg gatagttagg t 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
ttcgtttgtt cgatcggggt cg 22
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
gttaggtaat ttttgttttg tttgtttgat tggg 34
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
gacttaaacg acgaaccctt t 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
gagtttgcgt ttttacgagg 20
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
gaatagaaag agcggttgtt ttcgt 25
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
aattataggt ttgttagtgt gtttgatggt gaggttta 38
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
acgaaaaacc aacctccga 19
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
tggaaattaa taattttagg aa 22
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
gaatttcgtc gttaggcgcg 20
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
gggtttagat ttgaattttg ttgttaggtg tgt 33
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
atccacaact acaaacccga ac 22
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
tcgttttttg taacgtgttt gtg 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
aacgaccgcg accgcgtaat act 23
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 27
aaaataaccc caaaaaacaa ccaaaacaa 29
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 28
aaataacccc gaaaaacaac 20
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 29
ggtagcgggg tggtttcg 18
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 30
ttcatacgcc gcacctcgct aaac 24
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 31
cacactactc cacatacacc accaattcat ac 32
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
gcgctactcc gcatacacc 19
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 33
tttaacgaga tttagtaggt g 21
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 34
aaaaaaccca aacttccgaa aaca 24
<210> 35
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 35
ctatctcaat aaaaaaaaaa acccaaactt cc 32
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 36
aataaaaact atctcgataa 20
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 37
attattaggg aggtggtaat gag 23
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 38
gcatcgcgaa cgccgaaatc 20
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 39
acaaacacca aaatccaaat aatcatctta ctcatt 36
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 40
cgcctcaacg actttcgac 19
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 41
gggagtatat aggttgggga ag 22
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 42
gtggggtggt gatggaggag gtt 23
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 43
ataacaaaca caaattcaca atcc 24
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 44
ggttaggtat agtggtttat atttgtaatt ttagta 36
<210> 45
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 45
cctaccttaa cctccc 16
<210> 46
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 46
attaactaaa ctaatcttaa actcctaacc tca 33
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 47
ttggaaaagg atatttttat tgtaaaa 27
<210> 48
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 48
ctaaccttta aaatcaaat 19
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 49
aattccccaa aacacccaaa caccca 26
<210> 50
<211> 256
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 50
ggtagttaat atggcgtggg cgtttgtgtt cgtgcgattt cggtcgggta ggcgggacgg 60
agattatttg gttgtttagg ggattttatg tagggtttgg ttcgagttta ggggtagcga 120
ggggcgtttg cggatgcggt tttttgtgcg gtataatatc ggggtttgtt gttttcgttg 180
atatttttcg gtttaattgt ttttaaatta gattagtaag tttgcggtag gtagagagtt 240
agcggtggtg agagtt 256
<210> 51
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 51
gtaaatttgt tggtttaatt taggaataat tgggtcgaaa ggtattagcg agagtaatag 60
atttcggtgt tgtgtcgtat agggagtcgt attcgtagac gtttttcgtt gtttttgggt 120
tcgggttaaa ttttgtataa ggttttttgg atagttaggt aattttcgtt tcgtttgttc 180
gatcggggtc gtacgagtat aggcgtttac gttatgttgg ttgtttaaag ggttcgtcgt 240
ttaagtcggg ttagaaggta ggaggcggaa aattagtttt cggtggcggg cgaaagtaat 300
cgtttttttt gttttttttt cgtttttttt cgtggaaacg 340
<210> 52
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 52
gagtcggttt gtagagaaat taatatttgt tttgagtttg gaaattaata attttaggaa 60
ttgcgttcgt cgggggttta gatttgaatt tcgtcgttag gcgcgttggc gaatttgtag 120
ttcgggtttg tagttgtgga tttatggtcg ggaggttgta ttgggtattt tgacggtaa 179
<210> 53
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 53
ttttgtagtt tatgcgttta acgtgttttt ttgcgcgttg tttaatatgg gtttcggtag 60
ttcgcggttg tagtatttag atatttggtg ttttatcgat tggattatta acgtgacggc 120
gtacgtcgtt tatttttata tgtacgcggg ttttagtttt ttttttattt tcgttatcgt 180
tttttgtaac gtgtttgtgt gcggcgcgtt gtttcgtatg tatcgttagt ttatgcgtcg 240
tatttcgttg ggtatcgagt agtattacgc ggtcgcggtc gtttcggttg tttttcgggg 300
ttatttcgtt gtttt 315
<210> 54
<211> 256
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 54
tacgtttatt gttaaggatt tagagggaaa gtagggagcg gggaatggac gcgggaggtg 60
gatgcgagaa aaaggtcgag tagggtttta gtttcggtta tttattacga gcgggatgga 120
gtagatgagt attattaggg aggtggtaat gagtaagatg attatttgga tttcggcgtt 180
cgcgatgcgg cggaagtttc ggcggcgtcg aaagtcgttg aggcgcggta aggttgggga 240
ggtagcgggg tggttt 256

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括检测SHOX2至少一个靶区域的引物和探针，和/或检测PTGER4至少一个靶区域的引物和探针；
所述引物包括靶区域的甲基化特异性引物对和非甲基化封闭引物；
所述探针包括靶区域的特异性探针。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述SHOX2的靶区域包括SHOX2第一靶区域、SHOX2第二靶区域和SHOX2第三靶区域；
所述PTGER4的靶区域包括PTGER4第一靶区域和PTGER4第二靶区域；
所述组合物等同、互补或杂交于所述靶区域上。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述SHOX2第一靶区域包括如SEQ IDNO:50所示的核酸序列，所述SHOX2第二靶区域包括如SEQ ID NO:51所示的核酸序列，所述SHOX2第三靶区域包括如SEQ ID NO:52所示的核酸序列；
所述SHOX2第一靶区域正义链的引物和探针如SEQ ID NO:1～4所示；
所述SHOX2第一靶区域反义链的引物和探针如SEQ ID NO:5～8所示；
所述SHOX2第二靶区域正义链的引物和探针如SEQ ID NO:9～12所示；
所述SHOX2第二靶区域反义链的引物和探针如SEQ ID NO:13～16所示；
所述SHOX2第三靶区域正义链的引物和探针如SEQ ID NO:17～20所示；
所述SHOX2第三靶区域反义链的引物和探针如SEQ ID NO:21～24所示。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述PTGER4第一靶区域包括如SEQ IDNO:53所示的核酸序列，所述PTGER4第二靶区域包括如SEQ ID NO:54所示的核酸序列；
所述PTGER4第一靶区域正义链的引物和探针如SEQ ID NO:25～28所示；
所述PTGER4第一靶区域反义链的引物和探针如SEQ ID NO:29～32所示；
所述PTGER4第二靶区域正义链的引物和探针如SEQ ID NO:33～36所示；
所述PTGER4第二靶区域反义链的引物和探针如SEQ ID NO:37～40所示。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团、3’端标记淬灭基团；
所述荧光基团包括FAM、VIC、JOE、NED、TAMRA、Cy3、ROX、TexasRed或Cy5中的任意一种；
所述淬灭基团包括TAMRA、BHQ1或ECLIPSE中的任意一种；
对于同一靶区域的正义链和反义链，所述探针的荧光基团相同，所述探针的淬灭基团相同。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-5任一项所述的组合物；
所述试剂盒还包括检测内参基因的引物和探针；
所述内参基因包括ACTB、ALU或GAPDH中的任意一种或至少两种的组合；
所述ACTB的引物和探针如SEQ ID NO:41～43所示；
所述ALU的引物和探针如SEQ ID NO:44～46所示；
所述GAPDH的引物和探针如SEQ ID NO:47～49所示；
所述引物的浓度为100～700nM，所述探针的浓度为100～200nM；
所述试剂盒还包括PCR缓冲液，所述PCR缓冲液包括0.5～2U聚合酶、1～50mM MgCl2、10～50mM TMAC、0.5％～10％甘油、10～30mg/mL BSA和0.1～1mM dNTPs。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测结果的判读标准为：检测3个复孔，SHOX2或PTGER4基因至少两个复孔检出甲基化，或者SHOX2和PTGER4至少一个复孔同时检出甲基化，则判读为甲基化阳性，样本中存在细胞异常增殖情况。
8.一种基因甲基化检测方法，其特征在于，所述方法包括：
获取待测样本，并对待测样本进行重亚硫酸盐处理；
将重亚硫酸盐处理的待测样本采用如权利要求1-5任一项所述的组合物和/或如权利要求6或7所述的试剂盒进行PCR检测，检测靶基因正反义链的甲基化程度；
所述待测样本包括外周血游离DNA；
所述靶基因包括SHOX2和/或PTGER4；
所述基因甲基化的判读方法为：检测3个复孔，SHOX2或PTGER4基因至少两个复孔检出甲基化，或者SHOX2和PTGER4至少一个复孔同时检出甲基化，则待测样本呈甲基化阳性，待测样本中存在细胞异常增殖情况。
9.一种如权利要求1-5任一项所述的组合物和/或如权利要求6或7所述的试剂盒在制备基因甲基化检测试剂中的应用。
10.一种如权利要求1-5任一项所述的组合物和/或如权利要求6或7所述的试剂盒在制备疾病诊断药物中的应用；
所述疾病包括肺癌。
CN201911038929.2A 2019-10-29 2019-10-29 一种基因甲基化检测引物探针组合物、试剂盒及其应用 Pending CN110656180A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911038929.2A CN110656180A (zh) 2019-10-29 2019-10-29 一种基因甲基化检测引物探针组合物、试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911038929.2A CN110656180A (zh) 2019-10-29 2019-10-29 一种基因甲基化检测引物探针组合物、试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110656180A true CN110656180A (zh) 2020-01-07

Family

ID=69042134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911038929.2A Pending CN110656180A (zh) 2019-10-29 2019-10-29 一种基因甲基化检测引物探针组合物、试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110656180A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112159846A (zh) * 2020-09-22 2021-01-01 深圳市核子基因科技有限公司 组合物、试剂盒及其应用
CN112391475A (zh) * 2020-12-03 2021-02-23 广东辉锦创兴生物医学科技有限公司 用于shox2基因甲基化检测的荧光定量pcr检测试剂盒及其应用
CN112522407A (zh) * 2020-12-14 2021-03-19 北京起源聚禾生物科技有限公司 一种用于血浆游离dna基因甲基化检测的超灵敏检测方法
CN113549694A (zh) * 2021-08-27 2021-10-26 深圳市优圣康生物科技有限公司 一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法
CN116397024A (zh) * 2022-09-22 2023-07-07 卡秋(江苏)生物科技有限公司 一种用于肺癌患者筛查的多基因联合检测试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104774957A (zh) * 2015-04-24 2015-07-15 上海透景生命科技股份有限公司 诊断人shox2基因和人rassf1a基因甲基化的方法和试剂盒
CN105925681A (zh) * 2016-05-06 2016-09-07 博尔诚（北京）科技有限公司 一种用于肺癌筛查的组合物及其应用
CN106636390A (zh) * 2016-12-16 2017-05-10 江苏为真生物医药技术股份有限公司 基因甲基化检测方法和检测试剂盒及其应用
CN107034296A (zh) * 2017-06-05 2017-08-11 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 一种用于早期肺癌无创筛查的组合物及其应用
CN107406874A (zh) * 2014-12-19 2017-11-28 表观基因组股份有限公司 用于检测CpG甲基化和诊断癌症的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107406874A (zh) * 2014-12-19 2017-11-28 表观基因组股份有限公司 用于检测CpG甲基化和诊断癌症的方法
CN104774957A (zh) * 2015-04-24 2015-07-15 上海透景生命科技股份有限公司 诊断人shox2基因和人rassf1a基因甲基化的方法和试剂盒
CN105925681A (zh) * 2016-05-06 2016-09-07 博尔诚（北京）科技有限公司 一种用于肺癌筛查的组合物及其应用
CN106636390A (zh) * 2016-12-16 2017-05-10 江苏为真生物医药技术股份有限公司 基因甲基化检测方法和检测试剂盒及其应用
CN107034296A (zh) * 2017-06-05 2017-08-11 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 一种用于早期肺癌无创筛查的组合物及其应用

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112159846A (zh) * 2020-09-22 2021-01-01 深圳市核子基因科技有限公司 组合物、试剂盒及其应用
CN112391475A (zh) * 2020-12-03 2021-02-23 广东辉锦创兴生物医学科技有限公司 用于shox2基因甲基化检测的荧光定量pcr检测试剂盒及其应用
CN112391475B (zh) * 2020-12-03 2024-02-09 广东辉锦创兴生物医学科技有限公司 用于shox2基因甲基化检测的荧光定量pcr检测试剂盒及其应用
CN112522407A (zh) * 2020-12-14 2021-03-19 北京起源聚禾生物科技有限公司 一种用于血浆游离dna基因甲基化检测的超灵敏检测方法
CN113549694A (zh) * 2021-08-27 2021-10-26 深圳市优圣康生物科技有限公司 一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法
CN116397024A (zh) * 2022-09-22 2023-07-07 卡秋(江苏)生物科技有限公司 一种用于肺癌患者筛查的多基因联合检测试剂盒
CN116397024B (zh) * 2022-09-22 2024-02-23 卡秋(江苏)生物科技有限公司 一种用于肺癌患者筛查的多基因联合检测试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110656180A (zh) 一种基因甲基化检测引物探针组合物、试剂盒及其应用
CN104946739B (zh) Egfr基因突变检测试剂盒及其应用
CN108611412B (zh) 一种egfr基因突变检测的引物探针组合及其应用
US20160032368A1 (en) Methylation detection
AU2015374019A1 (en) Methods and compositions for detecting esophageal neoplasias and/or metaplasias in the esophagus
CN110229908B (zh) 用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针及试剂盒
EP2808397B1 (en) Method for obtaining information on colon cancer and marker and kit for obtaining information on colon cancer
WO2023142630A1 (zh) 一种用于膀胱尿路上皮癌诊断的检测方法和试剂盒
CN107034296A (zh) 一种用于早期肺癌无创筛查的组合物及其应用
TWI730429B (zh) Hoxa7甲基化檢測試劑
CN105506133A (zh) 用于检测sept9基因甲基化的组合物、试剂盒及方法
CN113604563A (zh) 一种肝癌诊断或辅助诊断的核酸组合、检测试剂盒及其应用
CN110511984B (zh) Egfr基因19号外显子缺失突变的快速荧光检测方法及应用
CN111808963A (zh) 一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、应用与试剂盒及样本处理方法
CN115820847A (zh) 一种用于宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂及其应用
WO2020063901A1 (zh) Hoxa7和hoxa9甲基化检测试剂在制备肺癌诊断试剂中的用途
CN110964812B (zh) Hoxa9甲基化检测试剂在制备肺癌诊断试剂中的用途
CN112375824B (zh) Msc作为宫颈癌诊断、预后和/或治疗标志物的应用
CN113430272B (zh) 一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂、试剂盒及其应用
CN112375825B (zh) 一种宫颈癌诊断、预后判断试剂盒
CN105177164A (zh) 一种用于宫颈癌早期筛查的分子标记和检测引物
CN116970705A (zh) 用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用
CN110964813B (zh) Hoxa7甲基化检测试剂在制备肺癌诊断试剂中的用途
CN110964811B (zh) Hoxa9甲基化检测试剂
EP1531184B1 (en) Method for genetic testing of bladder cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200107

RJ01 Rejection of invention patent application after publication