CN116397024B

CN116397024B - 一种用于肺癌患者筛查的多基因联合检测试剂盒

Info

Publication number: CN116397024B
Application number: CN202211156111.2A
Authority: CN
Inventors: 胡子健
Original assignee: Kaqiu Jiangsu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Kaqiu Jiangsu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-09-22
Filing date: 2022-09-22
Publication date: 2024-02-23
Anticipated expiration: 2042-09-22
Also published as: CN116397024A

Abstract

本发明公开了一种用于肺癌患者筛查的多基因联合检测试剂盒，其中包括检测SHOX2基因甲基化的试剂，其引物探针组为SEQ ID No:1‑3所示序列；检测SCT基因甲基化的试剂，其引物探针组为SEQ ID No:4‑6所示序列；检测HOXA7基因甲基化的试剂，其引物探针组为SEQ ID No:7‑9所示序列；检测18S基因的试剂，其引物探针组为SEQ ID No:10‑12所示序列。本发明提供的多基因联合检测试剂盒，不仅能够同时检测人血浆游离DNA中SHOX2、SCT、HOXA7基因的甲基化状态，还可以通过检测18S基因间接确定人血浆游离DNA样品的总量。经临床实验验证，本发明所述试剂盒对于肺癌患者筛查的灵敏度高达87.5％，特异性高达95.0％，显著高于现有报道的肺癌肿瘤标志物，适于临床上进一步推广应用。

Description

一种用于肺癌患者筛查的多基因联合检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及到一种用于肺癌患者筛查的多基因联合检测试剂盒。

背景资料

肺癌是目前中国乃至全世界发病率、死亡率最高的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的生命健康和生活质量。而且在全球范围内，肺癌新发病例和死亡人数还在逐年增加。特别是在我国，快速发展的工业化进程带来的大气环境污染，叠加全球最高的烟草流行率和人口老龄化等因素的影响，使得我国肺癌发病率和死亡率越来越高。根据国家癌症中心2022年发布的统计数据：2016年我国肺癌新发病例数为82.8万人，居恶性肿瘤首位，占各类型癌症发病总数的20%。同期，我国肺癌患者死亡人数为65.7万人，居恶性肿瘤首位，占各类型癌症死亡总数的27%。

由于肺癌发病较为隐匿，接近90%的患者在确诊时就已经是中晚期了，很难采取有效的治疗手段，导致其五年生存率不足20%。但对于早期肺癌患者，有数据表明，在接受手术和药物治疗后，其五年生存率高达60%以上。因此，对肺癌高风险人群定期开展早期筛查具有重要的临床意义。

当前，最常用的肺癌筛查技术是低剂量螺旋CT (low-dose computedtomography, LDCT)。2011年，美国国家癌症研究所采用LDCT对53454例肺癌高风险人群进行大规模随机筛查，结果发现当年肺癌患者的死亡率下降了20%，验证了该技术的有效性，并一直沿用至今，使得美国肺癌患者的死亡率从与我国持平，到如今只有我国的一半左右，显著改善了美国肺癌患者的生存率。

然而也有研究表明，LDCT不仅会对人体有辐射等不良影响，同时还存在着过度诊断的风险，尤其是对于肺结节良恶性的鉴别时，常常无法做出准确的判断，造成了高达96.0%的肺癌假阳性率。因此，美国胸科协会发表专家共识称需要结合影像学检查和血液标志物检测的策略才能更加科学、合理的进行肺癌筛查。只是传统的蛋白标志物CEA、SCC等，对早期肺癌的灵敏度极低，亟需开发出新的肺癌标志物。

近年来，随着分子生物学研究的不断深入，科研人员发现抑癌基因异常高甲基化在癌症的发生、发展过程中发挥了重要的作用，因而认为其是一种有前景的生物标志物。特别是在结直肠癌早期筛查领域，目前已有多家上市公司取得了国内外监管机构颁发的三类医疗器械注册证书，通过检测粪便中脱落细胞的基因组DNA或者检测血液中游离的循环肿瘤DNA (Circulating tumor DNA, ctDNA)中Septin 9、SDC2等基因的甲基化状态，进而筛查结直肠癌，其临床性能完全不弱于金标准“肠镜”。

在肺癌筛查领域，虽然国内外已有三款甲基化检测试剂盒上市，但对于早期肺癌患者的灵敏度依旧不超过20%。而且，这三款试剂盒在检测靶标上的同质化十分严重，均为SHOX2、PTGER4、RASSF1A基因中的两种或三种。有研究表明，除了SHOX2基因的甲基化状态与肺癌的发生发展强烈相关之外，联合检测PTGER4和RASSF1A基因甲基化状态并不会显著增加肺癌患者的检出率。因此，亟需开发出新的甲基化标志物，联合SHOX2基因甲基化筛查肺癌。

发明内容

为了解决现有肺癌筛查技术所存在的问题，本发明新开发了一种多基因联合检测试剂盒，其不仅能够简单、快速的从血液样品中获得大量游离DNA，而且对于早期肺癌患者的灵敏度和特异性分别高达87.5%和95.0%，显著高于其他肺癌肿瘤标志物，适于临床上推广应用。

具体来说，本发明涉及以下内容：

一种用于肺癌筛查的多基因联合检测试剂盒，包括检测SHOX2、SCT、HOXA7基因的引物探针组中的一个或多个，其序列如SEQ ID NO:1-9所示。

优选地，联合检测试剂中还包含检测人内参基因18S的引物探针组，为SEQ ID NO:10-12所示序列。

一种用于肺癌筛查的多基因联合检测试剂盒，包括检测SHOX2、SCT、HOXA7基因一个或多个甲基化检测试剂的检测区域，其核苷酸序列依次如序列13、序列14和序列15所示。

一种用于肺癌筛查的多基因联合检测试剂盒，还包括以下组成部分：

（1）PCR预反应体系，由DNA聚合酶预混液、引物探针组组成；

（2）阴性质控品，即无菌蒸馏水；

（3）阳性质控品，经过亚硫酸氢盐转化后的A549细胞基因组DNA。

优选地，所述PCR预反应体系总体积为21 μL，拟加入待检测DNA模板量为9 μL，组成共30 μL的PCR反应体系。

更优选的，其中所述DNA聚合酶预混液中包含DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺离子；所述引物探针组中包含针对人SHOX2基因甲基化的上游引物、下游引物和探针浓度比例为2:2:1，(例如，设计PCR扩增体系上游引物、下游引物和探针终浓度为0.2 uM、0.2 uM、0.1 uM)；和/或针对人SCT基因甲基化的上游引物、下游引物和探针浓度比例为2:2:1，(例如，设计PCR扩增体系上游引物、下游引物和探针终浓度为0.2 uM、0.2uM、0.1 uM)；和/或针对人HOXA7基因甲基化的上游引物、下游引物和探针浓度比例为2:2:1，(例如，设计PCR扩增体系上游引物、下游引物和探针终浓度为0.2 uM、0.2 uM、0.1 uM)；和/或针对人18S基因甲基化的上游引物、下游引物和探针浓度比例为2:2:1，(例如，设计PCR扩增体系上游引物、下游引物和探针终浓度为0.2 uM、0.2uM、0.1 uM)。

本发明中，PCR反应温度与反应时间为58~62 ℃退火、延伸10~45s；进一步优选地， PCR反应温度与反应时间为60 ℃退火、延伸20 s。

此外，所述试剂盒中还包括（但不限于）：空白对照，以及阴、阳性质控品和说明书。其中，空白对照为无菌蒸馏水，以及阴性质控品为经过亚硫酸氢盐转化后的浓度为1000拷贝每微升的白细胞基因组DNA，阳性质控品为浓度为1000拷贝每微升的肺腺癌细胞系A549细胞基因组DNA。

一种用于肺癌筛查的多基因联合检测试剂盒，所述SHOX2、18S、SCT、HOXA7基因联合检测试剂中的TaqMan水解探针按先后顺序分别在其探针的5’端和3’端分别标记了不同的荧光信号和淬灭信号。

优选地，所述针对人SHOX2基因甲基化的探针，其5’端和3’端分别标记了FAM荧光信号和MGB淬灭信号；针对人SCT基因甲基化的探针，其5’端和3’端分别标记了VIC荧光信号和BHQ1淬灭信号；针对人HOXA7基因甲基化的探针，其5’端和3’端分别标记了ROX荧光信号和BHQ2淬灭信号；针对人18S基因甲基化的探针，其5’端和3’端分别标记了Cy5荧光信号和BHQ3淬灭信号。

核酸提取试剂，由裂解结合液、亚硫酸氢盐转化液、脱磺基液、无机盐洗涤液、洗脱液、超顺磁性羟基纳米磁珠溶液、蛋白酶k溶液和硅胶膜离心吸附柱组成。

其中，所述蛋白酶k溶液的浓度为20mg/ml；

所述磁珠为表面修饰有羟基的二氧化硅包被的Fe₃O₄颗粒，其粒径为1000nm，磁珠悬浮液浓度为30mg/ml；

所述离心纯化柱为底部带有硅胶模吸附柱的1mL规格的带盖EP管；

所述收集管为2 mL规格的无盖EP管；

所述裂解结合液为2-6mol/L的异硫氰酸胍、体积分数分别为10%-30%的异丙醇和10%-50%的曲拉通X-100的混合液；

所述亚硫酸盐转化液为3-6mol/L，pH为4.5-6.0的亚硫酸氢钠和浓度为20-100mM/L的对苯二酚的混合溶液；

所述脱磺液为10-200mM/L NaOH的80%的乙醇溶液；

所述洗涤液为80%的乙醇溶液；

所述洗脱液为纯化水。

上述核酸提取试剂，包含如下步骤：

步骤（1）：收集外周血液样品，并通过羟基纳米磁珠吸附游离DNA，无需纯化；

步骤（2）：将磁珠上吸附的游离DNA洗脱下来，进行亚硫酸氢盐转化；

步骤（3）：通过硅胶膜离心柱回收纯化转化完成后的游离DNA。

所述亚硫酸氢盐转化具体步骤为：98℃高温解链5 min后，64℃孵育20 min。

肺癌风险预测程序，包含“定性判断”与“定量判断”两种检测结果判定方法。

优选地，应用定性判断时，如果内参基因18S的Ct值≥27，则检测无效。如果内参基因18S的Ct值<27，且甲基化基因SHOX2、SCT、HOXA7任意2个及以上的CT值≤36，则报告测试结果为“阳性”；如果内参基因18S的Ct值<27，且甲基化基因SHOX2、SCT、HOXA7任意2个及以上的CT值>36，则报告测试结果为“阴性”。

更优选地，应用定量诊断时，将以上各个基因的Ct值输入方程即可得到“无风险”、“低风险”、“中风险”、“高风险”的判断结果。该方程的特征在于通过二元线性回归函数拟合SHOX2、SCT、HOXA7基因甲基化与年龄、性别、肺结节大小等参数预测肺癌风险，并通过构建ROC曲线设置阶段性的cut-off值确定肺癌风险等级。

有益效果：与现有技术相比，本发明至少具有如下的优点

1、本发明所述核酸提取试剂专门用于血浆样品中游离DNA的甲基化检测样品制备过程，将当前繁琐复杂的血浆游离DNA甲基化检测样品制备过程由长达4h缩短至2h以内。更重要的，所述核酸提取试剂开发了更适合血浆游离DNA的亚硫酸氢盐转化方法，将其回收率由此前的20%提升到40%。

2、本发明所述用于早期筛查肺癌基因甲基化的引物探针组合，其临床性能分别达到87.5%和90.0%的灵敏度和特异性，优于市面上现有的同类型试剂盒。并且，本发明采用多重荧光PCR方法，单次反应即可检测3种基因甲基化标志物和1种内参基因定量标志物。

3、本发明所述肺癌风险预测程序，包含定性判断和定量判断两种检测结果判定方法，能够适配市面上绝大多数国内外不同厂家生产的荧光定量PCR仪，扩大了本发明所述检测试剂盒的应用范围，尤其是其中的定量判断，为检验人员提供了更加详细的指导，避免了定性判断可能带来的遗漏或者误诊。

附图说明

图1为本发明所述试剂盒最低检测限的检测结果图；

图2为使用本发明核酸提取试剂与市面上其他核酸提取试剂的流程对比图；

图3为使用本发明核酸提取试剂与市面上其他核酸提取试剂的效果对比图；

图4为使用本发明试剂盒检测临床血液样本所得的各基因散点分布结果图；

图5为本发明试剂盒检测临床样本所得定性与定量数据的对比分析。

具体实施方式

为阐述本发明所采取技术方案的优势，下面结合实施例，对本发明作更加详细的说明，但本领域技术人员应该明了，以下列举的实施例仅用于解释本发明，并不作为对本发明的任何限制。

还包含检测人内参基因18S的引物探针组，为SEQ ID NO:10-12所示序列。

上述引物及探针的核苷酸序列如表1所示：

表1 引物和探针序列表

所述用于肺癌筛查的多基因联合检测试剂盒，包括检测SHOX2、SCT、HOXA7基因一个或多个甲基化检测试剂的检测区域，其核苷酸序列依次如表2中序列13、序列14和序列15所示。

表2 甲基化检测序列表

所述多基因联合检测试剂盒，还包括以下组成部分：

（1）PCR预反应体系，由DNA聚合酶预混液、引物探针组组成；

（2）阴性质控品，即无菌蒸馏水；

所述PCR预反应体系总体积为21 μL，拟加入待检测DNA模板量为9 μL，组成共30 μL的PCR反应体系。

还包括核酸提取试剂。

实施例1——荧光信号的选择

本发明试剂盒采用多重荧光定量PCR技术对检测四种靶标SHOX2、SCT、HOXA7、18S基因的甲基化水平，经过调研，FAM、VIC、ROX，以及Cy5荧光4种荧光染料能够被市场上大多数荧光定量PCR仪器所检测到。因此，为了确定哪个靶标的探针修饰哪个荧光染料，检测效果最好，本发明采用经过亚硫酸氢盐处理后的人肺腺癌细胞系A549细胞基因组DNA为模板进行实时荧光PCR扩增检测。

检测结果如表3所示。

表3 不同检测探针标记不同荧光染料的效果对比。

以上结果显示，VIC染料的荧光效率显著低于其他几种染料，ROX染料的荧光效率显著高于其他几种染料。经过比较后，本发明选择将检测SHOX2的探针修饰上FAM染料，检测SCT的探针修饰上VIC染料，检测HOXA7的探针修饰上ROX染料，检测18S的探针修饰上Cy5染料。

实施例2——PCR反应体系的优化

为了确定试剂盒中每个待测靶标的引物、探针的最佳浓度，进而提高检测灵敏度和特异性，本发明对4种靶标分别设置了引物浓度梯度和探针浓度梯度，并采用经过亚硫酸氢盐处理后的A549细胞基因组DNA为模板进行实时荧光PCR扩增检测。

检测结果如表4所示。

表4 PCR反应体系的优化。

以上结果显示，SHOX2基因甲基化上游引物、下游引物、探针的浓度最佳分别是0.2μM、0.2 μM、0.1 μM；SCT基因甲基化上游引物、下游引物、探针的浓度最佳分别是0.2 μM、0.2 μM、0.1 μM；HOXA7基因甲基化上游引物、下游引物、探针的浓度最佳分别是0.2 μM、0.2μM、0.1 μM；18S基因甲基化上游引物、下游引物、探针的浓度最佳分别是0.2 μM、0.2 μM、0.1 μM。

实施例3——PCR反应温度与反应时间的优化

PCR反应一般包括变性、退火、延伸三个阶段，但随着技术的进步，退火和延伸步骤现已可以同时完成，无需分步进行。因此，为了确定最佳的退火、延伸温度与时间，进而提高检测灵敏度和特异性，本发明对4种靶标分别设置了温度梯度和时间梯度，并采用经过亚硫酸氢盐处理后的A549细胞基因组DNA为模板进行实时荧光PCR扩增检测。

检测结果如表5所示。

表5 PCR反应温度与反应时间的优化。

以上结果显示，本发明所述试剂盒中多重引物探针组合，最佳的PCR反应温度与反应时间为60 ℃退火、延伸20 s。

实施例4——最低检测限的确定

经过上述实验，本发明确定了最佳的检测引物、探针浓度，以及最适的退火、延伸温度与时间，如表6和表7所示。

表6 优化后的PCR扩增反应体系。

组分	体积
		2X qPCR Mix	10 μL
20 μM S2-primer、10 μM S2-Probe (FAM)	0.25 μL
		20 μM 18S- primer、10 μM 18S-Probe (VIC)	0.25 μL
20 μM H7-primer、10 μM H7-Probe (ROX)	0.25 μL
		20 μM H9-primer、10 μM H9-Probe (Cy5)	0.25 μL
DNA template	9 μL
		Total volume	30μL

表7 优化后的PCR扩增反应程序。

因此，本发明按优化后的PCR反应体系和程序，采用经过亚硫酸氢盐处理后的A549细胞基因组DNA，稀释到5拷贝和3拷贝每微升，在99%的非甲基化背景下重复20次测定本发明所述试剂盒的最低检测限。

检测结果如图1和表8所示。

表8 最低检测限的确定。

以上结果显示，本发明所述肺癌甲基化基因检测试剂在99%非甲基化基因组DNA背景下，各个靶标均能检出27拷贝的甲基化DNA，检出率在95%以上，能够满足临床检测所需的分析灵敏度要求。

实施例5——分析特异性的验证

最低检测限确定之后，本发明使用人源正常细胞WBC为检测对象进一步评估所述试剂盒的分析特异性。

检测结果如图1和表9所示。

表9 分析特异性的验证。

拷贝数	SHOX2	SCT	HOXA7	18S
					100	Undetermined	Undetermined	Undetermined	27.162
1000	Undetermined	Undetermined	Undetermined	24.834

以上结果显示，本发明所述检测试剂的各个靶标在100、1000、10000拷贝的白细胞基因组DNA背景浓度下，均未检测到假阳性的甲基化信号，说明本发明所述引物探针组的分析特异性能够满足临床检测的要求。

实施例6——核酸提取试剂的对比

经过以上实验，评估了本发明所述试剂盒中检测引物、探针的分析性能，能够达到临床实验检测的要求。不过本发明所述试剂盒中包括的核酸提取试剂，其性能尚未与已备案上市的同类型试剂盒进行比较。因此，为了彰显所述核酸提取试剂的优势，本发明从医院收集到10例肺癌患者和10例健康人的血液样本，使用本发明所述核酸提取试剂与已备案上市的同类型试剂盒分别进行处理，然后平行检测，两者的处理过程如图2所示，结果对比如图3和表10所示。

本发明中核酸提取试剂，由裂解结合液、亚硫酸氢盐转化液、脱磺基液、无机盐洗涤液、洗脱液、超顺磁性羟基纳米磁珠溶液、蛋白酶k溶液和硅胶膜离心吸附柱组成。蛋白酶k溶液的浓度为20mg/ml；磁珠为表面修饰有羟基的二氧化硅包被的Fe₃O₄颗粒，其粒径为1000nm，磁珠悬浮液浓度为30mg/ml；离心纯化柱为底部带有硅胶模吸附柱的1mL规格的带盖EP管；收集管为2 mL规格的无盖EP管；裂解结合液为2-6mol/L的异硫氰酸胍、体积分数分别为10%-30%的异丙醇和10%-50%的曲拉通X-100的混合液；亚硫酸盐转化液为3-6mol/L，pH为4.5-6.0的亚硫酸氢钠和浓度为20-100mM/L的对苯二酚的混合溶液；所述脱磺液为200mM/L NaOH的80%的乙醇溶液；所述洗涤液为80%的乙醇溶液；所述洗脱液为纯化水。

上述核酸提取试剂，包含如下步骤：

步骤（2）：将磁珠上吸附的游离DNA洗脱下来，进行亚硫酸氢盐转化；98℃高温解链5 min后，64℃孵育20 min；

如图2所示，北京天根生化科技有限公司的磁珠法血浆游离DNA提取试剂盒(货号：DP709)提取纯化游离DNA，再用德国Zymo Research公司最新的EZ DNA Methylation-Lighting^TMKit (货号：D5030)转化纯化游离DNA，其操作流程将游离DNA的提取与亚硫酸氢盐转化分步进行，而本发明所述核酸提取试剂巧妙结合游离DNA的提取与亚硫酸氢盐转化过程，如图2所示，简化了操作流程，减少了试剂与时间的浪费。更重要的是，本发明所述核酸提取试剂开发了更适合游离DNA的亚硫酸氢盐转化程序，使得游离DNA的回收率由此前的20%提升到40%。

二者处理完成的样本，均使用本发明所述的肺癌甲基化基因检测试剂进行检测，具体比较结果如图3和表10所示。

表10 核酸提取试剂的对比。

表中结果显示，与当前已备案上市的同类型试剂盒相比，使用本发明所述核酸提取试剂显著减小了内参基因18S的Ct值，即证明使用本发明所述核酸提取试剂增加了游离DNA的回收率。同时，也增加了肺癌患者血液样本中各个甲基化基因的检出率。

实施例7——临床检测性能验证

为了验证上述肺癌甲基化基因检测试剂鉴别肺癌的临床性能，本发明首先从医院收集到40例肺癌患者、20例肺炎患者和20例健康人的血液样本，然后使用本发明所述核酸提取试剂进行DNA提取与亚硫酸盐转化纯化处理，得到经过亚硫酸盐转化的DNA样品后，再使用本发明所述肺癌甲基化基因检测试剂对其进行检测。

应用定性判断时，如果内参基因18S的Ct值≥27，则检测无效。如果内参基因18S的Ct值<27，且甲基化基因SHOX2、SCT、HOXA7任意2个及以上的CT值≤36，则报告测试结果为“阳性”；如果内参基因18S的Ct值<27，且甲基化基因SHOX2、SCT、HOXA7任意2个及以上的CT值>36，则报告测试结果为“阴性”。

更优选地，应用定量诊断时，将以上各个基因的Ct值输入方程即可得到“无风险”、“低风险”、“中风险”、“高风险”的判断结果。该方程的是通过二元线性回归函数拟合SHOX2、SCT、HOXA7基因甲基化与年龄、性别、肺结节大小等参数预测肺癌风险，并通过构建ROC曲线设置阶段性的cut-off值确定肺癌风险等级。

本实施例中定量诊断方程为：P=2.839-0.116 Ct_SHOX2-0.124 Ct_SCT-0.105 Ct_HOXA7。

检测结果如表11和图4、图5所示。

表11 临床血液样本检测结果。

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表11中结果显示，在40例肺癌患者血液样本中，定性诊断出34例“+”阳性，定量诊断出35例“高风险”；在40例肺炎患者和健康人血液样本中，定性诊断出36例“-”阴性，定量诊断出38例“中风险”、“低风险”和“无风险”。可以看出，无论是定性诊断，还是定量诊断，本发明所述肺癌甲基化基因检测试剂的灵敏度和特异性均在85%及以上，显著其他肺癌肿瘤标志物。

综上所述，本发明所述用于肺癌患者筛查的多基因联合检测试剂盒，不仅包含肺癌甲基化基因检测试剂，还包含核酸提取试剂。二者联合使用，不仅减少了试剂和时间的浪费，而且显著增加了肺癌患者的检出率。因此，本发明所述试剂盒的设计巧妙，结构简洁，适于大规模在临床上推广应用。

最后，申请人声明，本发明所述试剂盒的功能和原理已在实施例中予以展示和说明，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的添加、修饰、替代、组合、简化等置换方式，均应在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于肺癌患者筛查的多基因联合检测试剂盒，包括：检测SHOX2、SCT、HOXA7基因甲基化的检测试剂和人 18S基因的检测试剂，其特征在于，检测人内参18S基因的检测试剂为SEQ ID NO: 10-12所示序列；

检测人SHOX2基因甲基化的检测试剂为SEQ ID NO: 1-3所示序列；

检测人SCT基因甲基化的检测试剂为SEQ ID NO: 4-6所示序列；

检测人HOXA7基因甲基化的检测试剂为SEQ ID NO: 7-9所示序列；

其中：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10所示序列为上游引物；

SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11所示序列为下游引物；

SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12所示序列为探针；

基因SHOX2、SCT、HOXA7中甲基化检测试剂的检测区域所包含的核苷酸序列依次如SEQID NO: 13-15所示；

所述检测试剂中上游引物、下游引物和探针浓度比例为2:2:1。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括：

PCR预反应体系，由 DNA聚合酶预混液、0.1-0.4 μmol的引物探针组组成，加入待测DNA模板后组成PCR反应体系。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括：

空白对照，以及阴性和阳性质控品；空白对照为无菌蒸馏水，阴性质控品为经过亚硫酸氢盐转化后的白细胞基因组DNA，阳性质控品为肺腺癌细胞系A549细胞基因组DNA。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，检测SHOX2、SCT、HOXA7、18S基因的检测试剂按先后顺序分别在其探针的5’端分别标记FAM、VIC、ROX、Cy5荧光信号，3’端分别标记MGB、BHQ1、BHQ2、BHQ3淬灭信号。

5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括：

核酸提取和纯化试剂，由高盐低pH的裂解结合液、亚硫酸氢盐转化液、脱磺基液、无机盐洗涤液、洗脱液、超顺磁性羟基纳米磁珠溶液、蛋白酶k溶液和硅胶膜离心吸附柱组成；

裂解结合液为2-6 mol/L的异硫氰酸胍、体积分数分别为10%-30%的异丙醇和10%-50%的曲拉通X-100的混合液；

亚硫酸氢盐转化液为3-6mol/L、pH为4.5-6.0的亚硫酸氢钠和浓度为20-100mM/L的对苯二酚的混合溶液；

脱磺基液为10-200mM/L NaOH的80%的乙醇溶液；

无机盐洗涤液为80%的乙醇溶液；

洗脱液为纯化水。