CN117487922B - 一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒，其中包括检测SHOX2基因甲基化的引物探针；检测SCT基因甲基化的引物探针；检测HOXA7基因甲基化的引物探针；检测18S内控基因的引物探针。本发明提供的甲基化检测试剂盒，可以将CT扫描发现的需要进行手术的疑似恶性肺结节患者分为甲基化阳性和甲基化阴性两类。经临床试验验证，甲基化阳性组中疑似恶性肺结节患者的恶性概率为甲基化阴性组的2‑4倍。因此，本试剂盒的优点是辅助CT扫描筛选恶性概率大的肺结节患者进行手术，减少过度诊疗情况的发生。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及到一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒。
背景技术
低剂量螺旋CT（LDCT）是当前临床上最常用的肺癌筛查手段。对于LDCT筛查发现的肺结节患者，当前临床上常用的非侵入性检测技术包括PET-CT、痰细胞学检查、血清学检查等。这些技术各有优劣，其中，PET-CT的检测灵敏度最高，但费用昂贵，且伴有大量辐射，一年只能做一次。痰细胞学检查的特异性最高，但十分依赖于病理医师的诊断经验，漏诊率极高。至于血清学检查，例如癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）等，因为价格便宜，在医院被广泛应用，但检测灵敏度和特异性均不理想。因此，面对如今愈发严峻的癌症诊疗形势，许多专家学者都在呼吁开发新的检测指标。特别是对于癌症早筛，DNA突变指标假阳性率高，DNA甲基化最有前景。
DNA是人类最早发现的一种表观遗传现象，通常发生在抑癌基因的启动子区。在正常细胞中，抑癌基因通常是非甲基化的或者低甲基化的。但在肿瘤细胞中，抑癌基因通常是高甲基化的。这也就意味着，在正常细胞向肿瘤细胞转变的过程中，伴随着抑癌基因逐步甲基化的发生。因此，基于DNA的甲基化检测，可以用于癌症患者的辅助诊断。
因此，针对肺癌患者的早期筛查，最需要解决的关键点是提高基因甲基化检测的灵敏度，尽早从LDCT发现的疑似恶性肺结节（早期肺癌）患者中筛选出存在基因异常甲基化的人群进行手术。
其次，与传统病原微生物的PCR检测不同，甲基化检测不仅要将样本中的DNA提取出来，还要将DNA中非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。所以，甲基化检测样本的前处理流程更加繁琐，通常涉及20-30个操作步骤，需要4-6个小时的处理时间，严重影响了甲基化检测技术的推广普及。特别是亚硫酸氢盐转化，高温高盐低PH的反应环境使得超过70%的DNA损失在这一步。
因此，优化甲基化检测样本的前处理流程，尤其是亚硫酸氢盐转化，也是一个需要解决的关键点。
发明内容
为了解决现有肺癌基因甲基化检测技术所存在的问题，本发明公开了一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒，通过摸索转化试剂的配方，优化甲基化检测样本的前处理流程，筛选肺癌相关甲基化基因，调整阳性判断方式等途径，实现将CT扫描发现的需要进行手术的疑似恶性肺结节（早期肺癌）患者分为甲基化阳性和甲基化阴性两类；经临床试验验证，甲基化阳性组中疑似恶性肺结节患者的恶性概率为甲基化阴性组的2-3倍；避免肺癌患者错过早期发现的良好机会，减少良性病人接受不必要的手术，影响未来的生活质量。
具体来说，本发明涉及以下内容：
一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒，包括检测SHOX2、SCT、HOXA7基因的引物探针组，其序列如SEQ ID NO:1-9所示。
优选地，甲基化检测试剂盒中还包含检测人内参基因18S的引物探针组，为SEQ IDNO:10-12所示序列。
上述引物及探针的核苷酸序列如表1所示：
表1. 引物和探针序列表
一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒，包括以下组成部分：
（1）阴性质控品：人血细胞基因组DNA的胎牛血清溶液；
（2）阳性质控品：肺癌细胞基因组DNA的胎牛血清溶液。
优选地，人血细胞为人外周血单个核细胞（PBMC），肺癌细胞为人肺腺癌细胞（A549）。
更优选地，阴性质控品和阳性质控品中DNA的浓度均优选为25 ng/mL。
一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒，还包括：亚硫酸氢盐转化试剂，亚硫酸氢盐转化试剂为亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、甲酰胺和水的混合溶液，亚硫酸氢钠的浓度为2 mol/L，亚硫酸钠的浓度为0.15 mol/L，甲酰胺的体积分数为3%，亚硫酸氢盐转化试剂的PH为5.4。
亚硫酸氢盐转化试剂的使用方法如下：
（1）样品准备：收集LDCT发现的疑似恶性肺结节患者（早期肺癌）的外周血液样品，并通过羟基纳米磁珠吸附游离DNA，无需进行纯化；
（2）DNA洗脱转化：使用亚硫酸氢盐转化试剂直接将磁珠上吸附的游离DNA洗脱下来，进行亚硫酸氢盐转化，无需额外添加其他任何试剂，转化反应程序优选为98℃高温解链5 min后，62℃孵育30 min；
（3）通过硅胶膜离心柱回收纯化转化完成后的游离DNA。
一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒，还包括以下特征：
同时完成人SHOX2基因、SCT基因和HOXA7基因甲基化，以及人内参18S基因的3次PCR复孔检测。除18S基因外，任一复孔检测到PCR扩增信号，即代表该基因甲基化检出。任意1个甲基化基因检出，即判断该样本为疑似，一段时间后复查。任意2个及以上甲基化基因检出，即判断该样本为阳性。无甲基化基因检出则判断为阴性。
有益效果
与现有技术相比，本发明至少具有如下的优点：
（1）本发明的亚硫酸氢盐转化试剂中盐离子含量低，可直接洗脱磁珠上吸附的未纯化的DNA，进行亚硫酸氢盐转化，无需额外添加其他任何试剂；将甲基化检测样本制备的流程由传统的4-6小时缩短到2-3小时，避免了DNA在纯化过程中的损失；更重要的是亚硫酸氢盐转化试剂中包含DNA变性剂，降低了转化反应温度，减少了DNA在转化反应中的损失，将其回收率由以往的20%提升到40%；
（2）本发明的阴性质控品为人血浆样品类似物，可以监测从样本前处理到PCR反应的全流程，而传统质控品只能监测PCR反应过程是否正常；并且，因为DNA含量固定，经过DNA提取、转化等前处理流程后，本发明阴性质控品PCR检测所得的Ct值会在[23.00,26.00]的范围内，可用作室间质量评价的标准；
（3）相比传统ΔCT的判读方式，本发明检测试剂盒的判读方式更加清晰、直观，无需进行数学计算；而且传统判读方式要求3次PCR复孔检测中，2个复孔，甚至3个复孔检测到PCR扩增信号才代表该基因甲基化检出；但对PCR检测技术而言，只有待测核酸数量高于40拷贝时才能稳定检测到3个复孔检出；当待测核酸数量在20-40拷贝时，最有可能的情况就是3个复孔检测到2个复孔检出；当待测核酸数量低于20拷贝时，3个复孔中检测到1个复孔检出才是正常现象；而早期肺癌患者体内每毫升血浆中肿瘤DNA的含量往往不到20拷贝；因此，本发明检测试剂盒的阳性判读标准更低，能够在CT扫描发现的疑似恶性肺结节（早期肺癌）患者基础上，尽可能筛选出其中存在基因异常甲基化的患者进行手术；临床试验数据显示，当前CT发现的疑似恶性肺结节（早期肺癌）患者最终确诊肺癌的比例为60%，而联合应用本发明检测试剂盒及其判读方式后，可将最终确诊肺癌的比例提高至80%，并减少40%的手术工作量。
附图说明
图1是实施例1中由不同Na2SO3添加量制备的亚硫酸氢盐转化试剂对血液样本转化前后样本的CT值以及转化前后样本的PH值；
图2是实施例1中由不同体积分数的甲酰胺制备的亚硫酸氢盐转化试剂对血液样本转化前后样本的CT值；
图3是实施例2中甲基化检测样本前处理流程的具体步骤；
图4是实施例2中甲基化检测样本处理后的CT值、在不同转化反应温度下处理后样本的CT值以及在不同转化反应时间下处理后样本的CT值；
图5是实施例3中不同类型肺癌细胞系的相对甲基化水平；
图6是实施例3中肺癌患者血浆样本中甲基化基因的阳性检出率；
图7是实施例3中健康人血浆样本中甲基化基因的阳性检出率；
图8~10是实施例4中质控品的赋值研究；
图11是实施例5中CT扫描发现的疑似恶性肺结节患者在不同组间的阳性检出率。
具体实施方式
为了阐述本发明所采取技术方案的优势，下面结合实施例，对本发明作更加详细的说明，但本领域技术人员应该明了，以下列举的实施例仅用于解释本发明，并不作为对本发明的任何限制。
实施例1 亚硫酸氢盐转化试剂的配方摸索
本发明通过对比添加Na2SO3和甲酰胺前后的使用效果，确认亚硫酸氢盐转化试剂的配方，并最终通过梯度试验确认需添加的Na2SO3和甲酰胺的最佳含量。
检测结果如图1所示，向亚硫酸氢盐转化试剂中添加Na2SO3有助于DNA的转化反应，因为Na2SO3可以和NaHSO3形成缓冲，维持亚硫酸氢盐转化反应的PH。Na2SO3的最佳含量在0.1~0.2 M之间（Ct值小），超过0.2 M反而抑制转化反应（CT值大）。
添加甲酰胺有助于DNA的转化反应，因为甲酰胺可以使DNA变性，降低DNA的解链温度，避免DNA在高温转化过程中降解。甲酰胺的最佳含量为3%，添加至10%无明显优化，结果如图2所示。
实施例2 甲基化检测样本前处理流程的优化
本发明通过逐步调整传统甲基化检测样本的前处理流程，省略非必要的纯化步骤，增加转化反应温度并减少转化反应时间，将处理时间由以往的4-6小时缩短至2-3小时，减少了DNA在纯化和转化步骤中的损失，将DNA的回收率由20%增加至40%。
检测结果如图3所示，①为省略DNA洗脱过程，②为省略①和一次无机盐洗涤过程，③为省略②和一次无机盐洗涤过程，④为省略③和一次蛋白洗涤过程。与北京天根生化科技有限公司的磁珠法血浆游离DNA提取试剂盒(货号：DP709)提取纯化游离DNA，再用德国Zymo Research公司最新的EZ DNA Methylation-LightingTMKit (货号：D5030)转化纯化游离DNA相比，应用本发明亚硫酸氢盐转化试剂直接进行洗脱转化，DNA的回收率并未降低。
在④的基础上，通过调整转化反应温度和时间，摸索出最适合本发明亚硫酸氢盐转化试剂的反应条件为：98℃孵育5 min后62℃孵育30 min。与试剂盒方法相比，可以将DNA的回收率由20%增加至40%，结果如图4所示。
实施例3 肺癌相关甲基化基因的筛选
通过TCGA数据库检索和专利、文献调研，本发明收集到13种与肺癌发生发展相关的甲基化基因：CDH1、SCT、PTGER4、SOX17、RASSF1A、SHOX2、CDO1、MGMT、MPDZ、TAC1、HOXA7、PCDHGA12和HOXA9，按顺序分别标记为Gene1-Gene13。鉴于试剂盒开发成本和多重PCR检测技术的局限性，本发明通过肺癌细胞和临床样本对比，逐步从中筛选出3种肺癌相关甲基化基因开发试剂盒。
检测结果如图5所示，在4种不同类型肺癌细胞系中，13种肺癌相关甲基化基因的相对甲基化程度超过5%的基因分别为SHOX2、PTGER4、RASSF1A、SOX17、SCT、CDO1、HOXA7、HOXA9（在肺癌细胞中，甲基化基因的甲基化程度越高，和肺癌发生发展的相关性越强）。
在肺癌患者血浆样本中，阳性检出率超过80%的肺癌相关甲基化基因分别是SHOX2（Gene6）、SOX17（Gene4）、SCT（Gene2）、HOXA7（Gene11）和HOXA9（Gene13），结果如图6所示。
健康人血浆样本中，阳性检出率低于20%的甲基化基因分别是SHOX2（Gene6）、SCT（Gene2）和HOXA7（Gene11），结果如图7所示（健康人中，甲基化基因的检出率越低越好；肺癌患者中，甲基化基因的检出率越高越好）。
实施例4 质控品的赋值研究
样本前处理过程的质量与后续PCR检测结果的准确与否，紧密相关。但传统的质控品仅质控PCR反应过程是否正常，并不能质控样本前处理过程是否正常。本发明所述质控品往胎牛血清溶液中分别添加一定量细胞基因组DNA，模拟健康人和肺癌患者血浆样本，并分别在不同时间，不同地点，由3位不同熟练程度的操作者对质控品开展赋值研究。
检测结果如图8所示，人肺腺癌细胞A549检测出SHOX2、SCT和HOXA7甲基化，可作为阳性质控品原料；人支气管上皮细胞HBE135-E6E7、人胚肺细胞MRC-5和人外周血单核细胞PBMC中只有PBMC细胞未检测到甲基化，可作为阴性质控品的原料。
质控品中DNA浓度为20-30 ng/mL时，与健康人和肺癌患者血浆样本中DNA的含量最为接近，结果如图9所示。
阴性质控品的赋值研究结果显示，其18S基因的Ct值在[22.27, 25.83]的范围内，SHOX2、SCT和HOXA7基因无甲基化检出时，才表明样本前处理和PCR检测过程正常，结果如图10所示。
实施例5 试剂盒的临床应用效果
为了验证检测试剂盒的临床性能，本发明从医院收集到100例CT扫描发现的需要进行手术的疑似恶性肺结节（早期肺癌）患者的血液样本，然后使用本发明亚硫酸盐转化试剂进行样本的前处理，再使用本发明试剂盒对其进行甲基化检测。
检测结果如图11所示，100例CT扫描发现的需要进行手术的疑似恶性肺结节（早期肺癌）患者最终确诊肺浸润癌（恶性）为67例，肺原位癌（良性）为21例，炎性结节/结核为12例，即CT的阳性率为67%。这100例疑似恶性肺结节（早期肺癌）患者中，72例检出甲基化阳性，其中确诊肺浸润癌57例，肺原位癌10例，炎性结节/结核为5例。计算可得，CT疑似组确诊恶性肺癌的概率为67%，CT疑似甲基化阴性组确诊恶性肺癌的概率为26.31%，CT疑似甲基化阳性组确诊恶性肺癌的概率为79.17%。即本试剂盒辅助CT检测可将恶性肺结节患者检出率提升到80%，并可减少近30%的手术工作量。
综上所述，本发明所述辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒，优化了甲基化检测样本的前处理流程，尤其是亚硫酸氢盐转化，不仅将制备时间由传统的4-6小时缩短到2-3小时，而且将DNA回收率由以往的20%提升到40%。更重要的是，本发明所述试剂盒能够辅助CT扫描发现的疑似恶性肺结节（早期肺癌）患者的分类，尽可能避免肺癌患者错过早期发现的良好机会的同时，减少良性病人接受不必要的手术，影响未来的生活质量。最后，本发明所述的试剂盒还搭配定值质控品确保从样本前处理一直到PCR检测过程的操作准确。
最后，申请人声明，本发明所述试剂盒的功能和原理已在实施例中予以展示和说明，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的添加、修饰、替代、组合、简化等置换方式，均应在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒，其特征在于，包含：检测基因SHOX2、SCT、HOXA7的引物和探针以及亚硫酸氢盐转化试剂；
所述引物和探针的序列如SEQ ID NO:1-9所示：
检测SHOX2基因甲基化的引物和探针的序列号如SEQ ID NO:1-3所示；
检测SCT基因甲基化的引物和探针的序列号如SEQ ID NO:4-6所示；
检测HOXA7基因甲基化的引物和探针的序列号如SEQ ID NO:7-9所示；
所述亚硫酸氢盐转化试剂为亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、甲酰胺和水的混合溶液，所述亚硫酸氢钠的浓度为2mol/L，所述亚硫酸钠的浓度为0.15 mol/L，所述甲酰胺的体积分数为3%。
2.根据权利要求1所述的一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒，其特征在于，还包含：
阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为含有A549细胞基因组DNA的胎牛血清溶液，所述阳性质控品为含有PBMC细胞基因组DNA的胎牛血清溶液，所述阴性质控品和阳性质控品中DNA的浓度均为25 ng/mL。
3.根据权利要求1所述的一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒的检测方法包括如下步骤：
S1、对血液样本进行核酸提取，并使用亚硫酸氢盐转化试剂进行转化；
S2、对转化后的样本同时完成SHOX2基因、SCT基因和HOXA7基因甲基化的3次PCR复孔检测；
S3、任一基因的3次PCR复孔检测中，任意1孔检测到信号，判读为检出；任意两个基因检出，则将该样本判读为阳性。
4.根据权利要求3所述的一种辅助鉴别肺结节良恶性的甲基化检测试剂盒，其特征在于，亚硫酸氢盐转化试剂的转化方法如下：
（1）通过羟基纳米磁珠吸附血液样本中的游离DNA；
（2）使用亚硫酸氢盐转化试剂将磁珠上吸附的游离DNA洗脱下来；
（3）洗脱下来的DNA样品在98℃高温解链5 min后，62℃孵育30 min，完成亚硫酸盐转化反应。
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