JP2015528286A - 癌スクリーニングの検証キット - Google Patents
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Abstract
本発明は癌の生物分子マーカーとスクリーニングの検証キットに関し、検体の標的遺伝子のメチル化領域を利用・分析して、標的遺伝子に対する特異性を備える数区間のオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを設計し、当該オリゴヌクレオチドプローブを利用して標的遺伝子のメチル化の有無を測定し、更に癌発生の可能性を判断する。メチル化状態の鑑定方法は、メチル化特異的PCR法(methylation−specific PCR、 MSP)、定量メチル化特異的PCR法(quantitative methylation−specific PCR、 QMSP)、バイサルファイトシーケンシング法(bisulfite sequencing、 BS)、マイクロアレイ(microarrays)、質量分析計分析(mass spectrometer)、変性高速液体クロマトグラフィー(denaturing high−performance liquid chromatography、 DHPLC)、パイロシークエンス(pyrosequencing)又は酵素結合免疫吸着測定法(Enzyme−linked immunosorbent assay、 ELISA )などである。【選択図】なし
Description
本発明は癌の生物分子マーカーとスクリーニングの検証キットに関し、検体の標的遺伝子のメチル化領域を利用・分析して、標的遺伝子に対する特異性を備える数区間のオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを設計し、当該特異性を備えるオリゴヌクレオチドを利用して標的遺伝子のメチル化の有無を測定することで、癌発生の可能性を判断することに関する。
WHOが2008年に行った調査結果からは、癌は現在世界で十大死因のうちの1つであり、更にそのうち男性は肺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、口腔癌での死亡率が比較的高く、女性は乳癌、肺癌、子宮頸癌、大腸癌での死亡率が比較的高いことが分かる。そのため、各国の研究者は初期の予防的な測定又は癌発病の予後測定ができる方法について常に積極的に研究を行っており、なおかつ大半の早期癌が早めにスクリーニングで発見できれば、全て治癒率が大幅に高まる。例えば、X線、スメア、腫瘍マーカー、超音波などの、癌の有無を調べる従来型の検査では、癌スクリーニングでの発見率は約0.2〜0.3%である。これに消化器の内視鏡検査を加えれば、スクリーニングでの発見率は約0.5%高まる。しかし、上記のデータは、これらの一般的な検診で有効に癌の早期診断ができるとの説得力としては未だ不十分である。しかし、これらの検査と判読は往々にして時間と手間がかかり、利便性に欠け、なおかつスクリーニングでの発見率は今でも低迷している。
現在、科学界では異常なエピジェネティクス(epigenetic)修飾が、遺伝子表現の変更と腫瘍の形成への誘導に極めて重要な作用(Ting et al.,2006)を発揮し、DNAメチル化修飾がそのうちの1種であると一般的に認識されている。表現型(phenotype)に影響を与える情報は、恐らく修飾済の塩基5−メチルシトシン(5−methylcytosine)に保存される。5−メチルシトシンは、哺乳類動物の細胞内のパリンドローム配列5’−CpG−3’に存在することが発見されている。哺乳類動物の細胞内では、「CpGアイランド」(CpG islands, CGIs)と呼ばれるいくつかの領域を除き、大半のCpGジヌクレオチドがメチル化されている。CpGアイランドは大体1000個の塩基対(1Kb)の領域内に大量のGC−とCpG−を含有していることを指し、通常は遺伝子の付近に位置し、広範囲で表現する遺伝子のプロモーター付近にある。シトシンのメチル化はDNA合成後に発生し、メチル基供与体s−アデノシルメチオニン(S−adenosylmethionine, SAM)から、メチル基を酵素により5−メチルシトシンの位置まで転移させる。当該酵素反応はDNAメチルトランスフェラーゼ(DNA methyltransferase, DNMTs)により実行される。DNMT1は哺乳類動物の主たるメチルトランスフェラーゼであり、半メチル化位置を複製後修復(post−replicative restoration)して行う全メチル化を受けもち、維持メチル化(maintenance methylation)と呼ばれる。反対に、DNMT3AとDNMT3Bは主にメチル化の新しい位置に対して、1種のde novoメチル化(de novo methylation)と呼ばれる手順を受けもつと考えられる。
CpGジヌクレオチドのメチル化の消失(loss of methylation)は、一般的な低メチル化を意味し、癌細胞内の最初のエピジェネティクス異常(epigenetic abnormality)である。しかし、最近数年間の研究では、特定位置(例えば:いくつかの癌抑制遺伝子)の高メチル化(site−specific hypermethylation)がその機能の喪失と関係があり、これが恐らく癌形成時に選択優位性(selective advantages)をもたらすことが示された。プロモーター領域でのCpGアイランドの高メチル化は、ヒストン修飾(histone modification)を通じてそれに続く遺伝子サイレンシング現象(gene silencing)を伴うことで、クロマチン再構成(chromatin remodeling)を引き起こす。染色体の欠失と遺伝子突然変異を除き、プロモーターの高メチル化により癌抑制遺伝子のエピジェネティクス的サイレンシング現象(epigenetic silencing)が生じ、これは人類の癌でもよく見られる(Estelle et al., 1999; Herman et al., 2003)。
最近では疫学の研究により、血清葉酸(serum folate)の濃度(1種のメチル基の主たる供給源)がHPVの感染と除去に関連性があることが示されている。メチルサイクル(methyl cycle)の代謝作用では、酵素の遺伝的多型(genetic polymorphisms)もかつては子宮頸上皮内の病変の進行と関係があると報道されていた。超遺伝子進化の概念と同様に、DNAメチル化の子宮頸癌との関連性の研究も盛んである。子宮頸癌のDNAメチル化の研究も一日一日と活況を呈し、これがメチル化を子宮頸癌スクリーニングとして使う可能性を示している。遺伝と環境による相互作用の特性があるため、癌抑制遺伝子のメチル化程度は遺伝子と群によって異なり、疾病の種類が違うことでもメチル化表現型(methylator phenotypes)が異なってくる。しかし、子宮頸癌のメチル化表現型及びそれとHPV遺伝子型との関連性は未知のままであり、子宮頸癌のうちどの特定の遺伝子がメチル化されるのか、及び遺伝子がいくつあれば臨床応用の需要を満たせるのかという、これらの問題は依然として将来確認が必要となる課題となっている。
国防医学院の頼鴻政博士がかつて台湾(TW Pat. Pub.No. 200831900、TW Pat.Pub.No. 201038739)、中国(CN Appl. No. 200810094659.2、CN Appl. No. 200910135501.X)、マレーシア(UI20085354)及びアメリカ(US Pat.Pub.No. 20080311570、US Pat.Pub. No. 20110045465)のそれらの属する技術分野で、特許の出願(以下、「先行技術文献」という)を含む、関連する発明とその異なる技術手段と方法を説明した。DNAメチル化測定は学問理論発展の歴史が浅くなく、また学術研究者にも幅広く使用されている。しかし医療検査などの臨床関連分野への応用を望むのであれば、テストが安定で再現性を備えることが非常に重要となる。メチル化遺伝子測定は現在医療検査での応用はまだ普及していない。その理由の一部が、大量の研究により標的遺伝子の臨床面での意義と関連する検証を補助する必要があるほか、安定したテスト方法をどのように行うかもかなりの技術的障害となっている。
本発明の発明者は先行技術文献の不備と欠陥を深く理解し、改良と革新を行い、長年の苦心の中で研究に身を捧げ、最後に本発明の複数種の癌スクリーニングに適用可能な方法とその検証キットの研究開発を成し遂げた。それにより、例えば標的遺伝子に関連する配列と濃度範囲の定義づけのように、関連する標的遺伝子のメチル化測定が産業上の利用可能性を備え、加えて癌応用分野でも更に多くの情報を提供することで検証を支える力となっている。それにより標的遺伝子測定で繰り返し性のある結果が得られ、医療分野に応用できるようになった。本設計である癌スクリーニングキットは更に精密な検査が行え、試薬キットの形式で更に速く、便利でかつ効率的なレベルに達する設計を行い、検査面での完全な製品を提供する。
本発明の目的は、検査キットを提供することにある。それは測定用検体にある標的遺伝子CpG配列のメチル化が存在することの測定に使うものである。つまり、まず検体からそのgDNAを抽出し、このgDNAが適切な前処理と化学反応を経ることで、直ちにこの検査キットを使って標的遺伝子のメチル化が存在することのテストが行える。
本検査キットは次のものを含む。
(1)濃度範囲が20 nM−1250 nMの標的遺伝子混合プライマー。それは少なくとも1つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマーを含み、当該フォワードプライマー、リバースプライマーの配列はSEQ ID No:1−70に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種又は複数種から選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。
(2)濃度範囲が20nM−1250nMの内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液。それは少なくとも1つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマーを含む。
(3)ポリメラーゼ連鎖反応の主たる混合液。その主たる成分は少なくともポリメラーゼ、dNTPs及び硫酸マグネシウムを含む。
(1)濃度範囲が20 nM−1250 nMの標的遺伝子混合プライマー。それは少なくとも1つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマーを含み、当該フォワードプライマー、リバースプライマーの配列はSEQ ID No:1−70に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種又は複数種から選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。
(2)濃度範囲が20nM−1250nMの内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液。それは少なくとも1つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマーを含む。
(3)ポリメラーゼ連鎖反応の主たる混合液。その主たる成分は少なくともポリメラーゼ、dNTPs及び硫酸マグネシウムを含む。
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、当該内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液は、そのうちフォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列がSEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種の又は複数種からも選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。そのうち標的遺伝子と内部抑制遺伝子のプライマーは混和してシングルチューブ核酸分子検出用混合液とすることができる。
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、当該標的遺伝子混合プライマーは、更に、プローブを含む。そのプローブ配列はSEQ ID No:1−70に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種又は複数種又はその相補的配列から選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。
当該内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液は、更に、内部抑制遺伝子増幅産物が検出できるプローブを含む。本発明を通じて更に、そのうち内部抑制遺伝子のフォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列は、SEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種又は複数種から選ばれ、最適なものは配列が全く同じであり、プローブ配列はSEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種又は複数種又は相補的配列から選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。
そのうち標的遺伝子と内部抑制遺伝子のプライマーは混和してシングルチューブ核酸分子検出用混合液とすることができる。
当該内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液は、更に、内部抑制遺伝子増幅産物が検出できるプローブを含む。本発明を通じて更に、そのうち内部抑制遺伝子のフォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列は、SEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種又は複数種から選ばれ、最適なものは配列が全く同じであり、プローブ配列はSEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種又は複数種又は相補的配列から選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。
そのうち標的遺伝子と内部抑制遺伝子のプライマーは混和してシングルチューブ核酸分子検出用混合液とすることができる。
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのポリメラーゼ連鎖反応の主たる混合液は、更に、連鎖反応産物が識別できる蛍光物質を含み又は/及びDNA二重作用と蛍光を生じ、更に検出されることができる物質から選ばれる。この物質はSYBER Green、Syber Gold などのSYBR検出系物質を含む。
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのうち当該測定用検体にある内部抑制遺伝子は、次の少なくとも1種の又は1種以上の遺伝子:Col2A、β−Globin、GAPDH(glyceraldehyde−3−phosphate dehydrogenase)、β−actinにより構成される群から選ばれる。
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、その標的遺伝子と内部統制群遺伝子のプローブが蛍光色素標識を備える。この蛍光色素標識は次のいずれかの蛍光:FAM、HEX、TET、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、VIC、Red610、Yellow 555、Texas Red、Yakima Yellow, BHQ−1、BHQ−2及びBHQ−3により構成される群から選ばれる。
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのうち当該測定用検体にある遺伝子は、次の少なくとも1種の又は1種以上の遺伝子:PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1により構成される群から選ばれる。
上記発明の目的が達成できる1種の検証キットについて、それは、更に正常でない細胞増殖現象の測定に使用することができる。そのうち正常でない細胞増殖は前癌病変の測定、腫瘍の測定、腫瘍再発の測定又は腫瘍用薬予測又は予後効果の測定を含む。そのうち当該悪性腫瘍は下記の群のうちの1つである:子宮頸癌、口腔癌、頭頸部癌、食道癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、乳癌、舌癌、肺腺癌及び皮膚癌。
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのうち連鎖増幅産物の鑑定方法は、蛍光光度法、シークエンシング(sequencing)、マイクロアレイ(microarrays)、質量分析計分析(mass spectrometer)、変性高速液体クロマトグラフィー(denaturing high−performance liquid chromatography, DHPLC)、パイロシークエンス(pyrosequencing)又は免疫学的検定(immunoassay )などが利用できる。
「測定用検体」とは、in vitroの測定サンプルを指す。当該サンプルは子宮頸部スメア、腹水、血液、尿、糞便、痰、口腔粘膜細胞、胃液、胆汁、子宮頸上皮細胞又は手術後の癌組織などのin vitroの検体サンプルを含む。本発明の癌スクリーニング方法を、これらのin vitroサンプルにある標的遺伝子のメチル化状態の測定に用いることにより、各種癌のスクリーニング指標とする。本発明が提供する癌スクリーニング方法とそのスクリーニング指標は、測定研究従事者に実験室での測定用として供することができる。
本発明の目的は、検査キットを提供することにある。それは測定用検体にある標的遺伝子CpG配列のメチル化が存在することの測定に用いるものである。つまり、まず検体からそのgDNAを抽出し、このgDNAが適切な前処理と化学反応を経ることにより、直ちに本検査キットを使ってDNAメチル化が存在することのテストが行えることである。
本検査キットは次のものを含む。
(1)濃度範囲が20 nM−1250 nMの標的遺伝子混合プライマー。それは少なくとも1つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマーを含み、当該フォワードプライマー、リバースプライマーの配列はSEQ ID No:1−70に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種又は複数種から選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。
(1)濃度範囲が20 nM−1250 nMの標的遺伝子混合プライマー。それは少なくとも1つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマーを含み、当該フォワードプライマー、リバースプライマーの配列はSEQ ID No:1−70に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種又は複数種から選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。
(2)濃度範囲が20nM−1250nMの内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液。それは少なくとも1つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマーを含む。
(3)ポリメラーゼ連鎖反応の主たる混合液。その主たる成分は少なくともポリメラーゼ、dNTPs及び硫酸マグネシウムを含む。
(3)ポリメラーゼ連鎖反応の主たる混合液。その主たる成分は少なくともポリメラーゼ、dNTPs及び硫酸マグネシウムを含む。
上記発明の目的が達成できる検証キットであり、当該内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液は、そのうちフォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列がSEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種の又は複数種から選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。そのうち標的遺伝子と内部抑制遺伝子のプライマーは混和してシングルチューブ核酸分子検出用混合液とすることができる。
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、当該標的遺伝子混合プライマーは、更に、プローブを含む。そのプローブ配列はSEQ ID No:1−70に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種又は複数種又はその相補的配列から選ばれ、最適なものは配列が全く同じである。当該内部抑制遺伝子核酸分子検出混合液は、更に、内部抑制遺伝子増幅産物が検出できるプローブを含む。
本発明を通じて、更に、そのうち内部抑制遺伝子のフォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列がSEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種又は複数種から選ばれ、最適なものは配列が全く同じであり、プローブ配列はSEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種又は複数種又は相補的配列から選ばれ、最適なものは配列が全く同じであることを含むことを提供する。そのうち標的遺伝子と内部抑制遺伝子のプライマーは混和してシングルチューブ核酸分子検出混合液とすることができる。
本発明を通じて、更に、そのうち内部抑制遺伝子のフォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列がSEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種又は複数種から選ばれ、最適なものは配列が全く同じであり、プローブ配列はSEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じである配列の1種又は複数種又は相補的配列から選ばれ、最適なものは配列が全く同じであることを含むことを提供する。そのうち標的遺伝子と内部抑制遺伝子のプライマーは混和してシングルチューブ核酸分子検出混合液とすることができる。
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのポリメラーゼ連鎖反応の主たる混合液は、更に、連鎖反応産物が識別できる蛍光物質を含み又は/及びDNA二重結合と蛍光を生じ更に検出されることができる物質から選ばれる。この物質はSYBER Green, Syber Gold などのSYBR検出系物質を含む。
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのうち当該測定用検体にある内部抑制遺伝子は、次の少なくとも1種の又は1種以上の遺伝子:Col2A、β−Globin、GAPDH(glyceraldehyde−3−phosphate dehydrogenase)、β−actinにより構成される群から選ばれる。
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、その標的遺伝子と内部統制群遺伝子のプローブが蛍光色素標識を備える。この蛍光色素標識は次のいずれかの蛍光:FAM、HEX、TET、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、VIC、Red610、Yellow 555、Texas Red、Yakima Yellow, BHQ−1、BHQ−2及びBHQ−3により構成される群から選ばれる。
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのうち当該測定用検体にある遺伝子は、次の少なくとも1種の又は1種以上の遺伝子:PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1により構成される群から選ばれる。
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、それを更に正常でない細胞増殖現象の測定に用いることができる。そのうち正常でない細胞増殖は前癌病変の測定、腫瘍の測定、腫瘍再発の測定又は腫瘍用薬予測又は予後効果の測定を含む。そのうち当該悪性腫瘍は下記の群のうちの1つである:子宮頸癌、口腔癌、頭頸部癌、食道癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、乳癌、舌癌、肺腺癌及び皮膚癌。
上記発明の目的が達成できる検証キットについて、そのうち連鎖増幅産物の鑑定方法は蛍光光度法、シークエンシング(sequencing)、マイクロアレイ(microarrays)、質量分析計分析(mass spectrometer)、変性高速液体クロマトグラフィー(denaturing high−performance liquid chromatography, DHPLC)、パイロシークエンス(pyrosequencing)又は免疫学的検定(immunoassay)を用いることができる。
以下は、関連する具体的な実施例の詳細な説明であり、材料と測定方法などとを含むことにより、更に本発明の技術的特徴と効果を詳述する。ただし、本発明の具体的な実施例又は方法により範囲の制限又は本発明の実施制限としての解釈又はこれらに記載の実施例又は方法のみへの限定を行ってはならないと理解すべきである。
実施例1
検体サンプルについて、まずそのgDNAを抽出し、亜硫酸水素塩(bisulfite)の変換を通じ、表1から表4までに掲げる内容によりPAX1、ZNF582、SOX1、NKX6−1及び内部統制群を含有するメチル化領域の増幅に使えるプライマー対とプローブセット(表1から5参照)により測定を行う。試薬キットの主たる組成は下表6の通りである。
検体サンプルについて、まずそのgDNAを抽出し、亜硫酸水素塩(bisulfite)の変換を通じ、表1から表4までに掲げる内容によりPAX1、ZNF582、SOX1、NKX6−1及び内部統制群を含有するメチル化領域の増幅に使えるプライマー対とプローブセット(表1から5参照)により測定を行う。試薬キットの主たる組成は下表6の通りである。
PCR増幅反応は次の通りである。
(i)95℃のもとでポリメラーゼを10分間活性化させる。(ii)95℃のもとでDNAテンプレートを10秒変性させ、60℃のもとでDNA鎖を40秒結合/伸長させる。(iii)30から50回サイクルにわたり変性/結合/伸長させる。
(i)95℃のもとでポリメラーゼを10分間活性化させる。(ii)95℃のもとでDNAテンプレートを10秒変性させ、60℃のもとでDNA鎖を40秒結合/伸長させる。(iii)30から50回サイクルにわたり変性/結合/伸長させる。
PCR増幅反応については、そのうち1組の混合物は標的遺伝子と内部統制群遺伝子のプライマー対とそのプローブ混和物を含む。プライマー対はフォワードプライマーとリバースプライマーを含む。異なるプローブは異なる波長でなおかつ互いにコヒーレンスが低い蛍光により標識を行う。本実施例では、標的遺伝子プローブにはFAM標識を、内部統制群プローブにはVIC標識を使う。蛍光色素のほかにも、全てのプローブはquencher 基も加えるため、プローブ配列と増幅配列の相補的結合が行え、蛍光色素が蛍光を放出させ、更に検出される。標的遺伝子のメチル化遺伝子の程度はCp値(サイクル数)と信号強度により決定し、内部制御遺伝子を校正とデバッグに使える。本実施例にあるPAX1を例として、PAX1のCp値と内部制御遺伝子Cp値の差異が12を超えなければ、際立ってメチル化されているPAX1があることを示す。他の標的遺伝子はこれにより類推する。
実施例2 異なる癌細胞株にある標的遺伝子のメチル化程度分析
本テストでは、表1から表4までに掲げるPAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1を含有するメチル化領域の増幅に使えるプライマー対とプローブセットを応用することで、異なる癌細胞株を測定した。そのメチル化状態は分析表7に示す通りである。結果からは次のことが示される。子宮頸癌に関連する細胞株Helaのうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化されたと検出され、子宮頸癌に関連する細胞株SiHaのうち、PAX1、ZNF582及びSOX1がメチル化されたと検出され、子宮頸癌に関連する細胞株CaSkiのうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化されたと検出され、子宮頸癌に関連する細胞株C−33 Aのうち、ZNF582、SOX1及びNKX6−1がメチル化されたと検出された。大腸癌に関連する細胞株COLO 205のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化されたと検出され、大腸癌に関連する細胞株Caco−2のうち、ZNF582、SOX1及びNKX6−1がメチル化されたと検出され、大腸癌に関連する細胞株HT−29のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化されたと検出された。肝癌に関連する細胞株HuH−7のうち、SOX1とNKX6−1がメチル化されたと検出され、肝癌に関連する細胞株Mahlavuのうち、ZNF582とSOX1がメチル化されたと検出された。肺癌に関連する細胞株A549のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1はメチル化されたとは検出されなかった。皮膚癌に関連する細胞株A−375のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1はメチル化されたとは検出されなかった。卵巣癌に関連する細胞株A2780のうち、ZNF582及びSOX1がメチル化されたと検出された。乳癌に関連する細胞株T47Dのうち、PAX1及びNKX6−1がメチル化されたと検出され、乳癌に関連する細胞株BT474のうち、PAX1、ZNF582及びSOX1がメチル化されたと検出され、乳癌に関連する細胞株MDA−MB−231のうち、ZNF582、SOX1及びNKX6−1がメチル化されたと検出され、乳癌に関連する細胞株ZR−75−1のうち、ZNF582、SOX1及びNKX6−1がメチル化されたと検出され、乳癌に関連する細胞株HCC1954のうち、ZNF582とSOX1がメチル化されたと検出され、乳癌に関連する細胞株MCF−7のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1がメチル化されたと検出された。舌癌に関連する細胞株SASのうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化されたと検出された。口腔癌に関連する細胞株Ca9−22のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化されたと検出された。
本テストでは、表1から表4までに掲げるPAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1を含有するメチル化領域の増幅に使えるプライマー対とプローブセットを応用することで、異なる癌細胞株を測定した。そのメチル化状態は分析表7に示す通りである。結果からは次のことが示される。子宮頸癌に関連する細胞株Helaのうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化されたと検出され、子宮頸癌に関連する細胞株SiHaのうち、PAX1、ZNF582及びSOX1がメチル化されたと検出され、子宮頸癌に関連する細胞株CaSkiのうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化されたと検出され、子宮頸癌に関連する細胞株C−33 Aのうち、ZNF582、SOX1及びNKX6−1がメチル化されたと検出された。大腸癌に関連する細胞株COLO 205のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化されたと検出され、大腸癌に関連する細胞株Caco−2のうち、ZNF582、SOX1及びNKX6−1がメチル化されたと検出され、大腸癌に関連する細胞株HT−29のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化されたと検出された。肝癌に関連する細胞株HuH−7のうち、SOX1とNKX6−1がメチル化されたと検出され、肝癌に関連する細胞株Mahlavuのうち、ZNF582とSOX1がメチル化されたと検出された。肺癌に関連する細胞株A549のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1はメチル化されたとは検出されなかった。皮膚癌に関連する細胞株A−375のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1はメチル化されたとは検出されなかった。卵巣癌に関連する細胞株A2780のうち、ZNF582及びSOX1がメチル化されたと検出された。乳癌に関連する細胞株T47Dのうち、PAX1及びNKX6−1がメチル化されたと検出され、乳癌に関連する細胞株BT474のうち、PAX1、ZNF582及びSOX1がメチル化されたと検出され、乳癌に関連する細胞株MDA−MB−231のうち、ZNF582、SOX1及びNKX6−1がメチル化されたと検出され、乳癌に関連する細胞株ZR−75−1のうち、ZNF582、SOX1及びNKX6−1がメチル化されたと検出され、乳癌に関連する細胞株HCC1954のうち、ZNF582とSOX1がメチル化されたと検出され、乳癌に関連する細胞株MCF−7のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1がメチル化されたと検出された。舌癌に関連する細胞株SASのうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化されたと検出された。口腔癌に関連する細胞株Ca9−22のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化されたと検出された。
ここから分かるのは、子宮頸癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、乳癌、舌癌、口腔癌、肺癌、肺腺癌及び皮膚癌に関連する細胞株では、当該4つの遺伝子のうち少なくとも1つにメチル化現象が検出されことである。そのためPAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1のうち少なくとも1つがメチル化され、これが確実に癌の有無をスクリーニングするスクリーニング指標となり得る。
実施例3 子宮頸癌サンプル内での標的遺伝子のメチル化程度の分析
本テストでは、台湾で診断により正常と疾病状態にあると認識済みの279名の子宮頸部スメアサンプルを使った。表8に示すように、それぞれ正常239名(85.7%)、軽度(CIN1)22名(7.9%)、中度(CIN2)2名(0.7%)、重度(CIN3)/上皮内癌(CIS)12名(4.3%)、扁平上皮癌4名(1.4%)であり、それらのDNAを抽出し、亜硫酸水素塩(bisulfite)の変換を通じて表1から表4までに掲げる内容によりPAX1、ZNF582、SOX1、NKX6−1及び内部統制群を含有するメチル化領域の増幅に使えるプライマー対とプローブセットにより測定を行った。
表9に示すように、正常な子宮頸部スメアサンプルに比べて、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1を標的遺伝子とした場合には、重度以上の子宮頸部スメアサンプルにはそれぞれ85.45倍(95%信頼区間 = 33.95〜215.11)、289.17倍(95%信頼区間 = 39.20〜2133.14)、67.69倍(95%信頼区間 = 20.55〜223.01)及び2.56倍(95%信頼区間 = 1.36〜4.82)で重度子宮頸癌に罹患する危険性があることを検出した。表10に示すように、個別のメチル化された標的遺伝子と子宮頸部スメアを同時に一括して疾病を測定した場合には、いずれか1つのメチル化された標的遺伝子又は子宮頸部スメアの測定結果が陽性でありさえすれば、当該テストサンプルの子宮頸癌スクリーニング結果が陽性であると認めることを意味する。
正常な子宮頸部スメアサンプルに比べて、それぞれPAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1を標的遺伝子として検出を行い、子宮頸部スメアをこれに加えた場合には、重度以上子宮頸部スメアサンプルにはそれぞれ475.64倍(95%信頼区間=63.94〜3538.43)、543.31倍(95%信頼区間=33.11〜8914.18)、95.08倍(95%信頼区間=20.55〜223.01)及び14.25倍(95%信頼区間=6.12〜33.18)で重度子宮頸癌に罹患する危険性があると測定された。なおかつ各項目の敏感度は子宮頸部スメアをこれに加えない測定結果に比較して全て上昇している(PAX1:75%が94%に上昇、ZNF582:87%が94%に上昇、SOX1:75%が100%に上昇、NKX6−1:50.00%が84.78%に上昇)。
本テストでは、台湾で診断により正常と疾病状態にあると認識済みの279名の子宮頸部スメアサンプルを使った。表8に示すように、それぞれ正常239名(85.7%)、軽度(CIN1)22名(7.9%)、中度(CIN2)2名(0.7%)、重度(CIN3)/上皮内癌(CIS)12名(4.3%)、扁平上皮癌4名(1.4%)であり、それらのDNAを抽出し、亜硫酸水素塩(bisulfite)の変換を通じて表1から表4までに掲げる内容によりPAX1、ZNF582、SOX1、NKX6−1及び内部統制群を含有するメチル化領域の増幅に使えるプライマー対とプローブセットにより測定を行った。
表9に示すように、正常な子宮頸部スメアサンプルに比べて、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1を標的遺伝子とした場合には、重度以上の子宮頸部スメアサンプルにはそれぞれ85.45倍(95%信頼区間 = 33.95〜215.11)、289.17倍(95%信頼区間 = 39.20〜2133.14)、67.69倍(95%信頼区間 = 20.55〜223.01)及び2.56倍(95%信頼区間 = 1.36〜4.82)で重度子宮頸癌に罹患する危険性があることを検出した。表10に示すように、個別のメチル化された標的遺伝子と子宮頸部スメアを同時に一括して疾病を測定した場合には、いずれか1つのメチル化された標的遺伝子又は子宮頸部スメアの測定結果が陽性でありさえすれば、当該テストサンプルの子宮頸癌スクリーニング結果が陽性であると認めることを意味する。
正常な子宮頸部スメアサンプルに比べて、それぞれPAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1を標的遺伝子として検出を行い、子宮頸部スメアをこれに加えた場合には、重度以上子宮頸部スメアサンプルにはそれぞれ475.64倍(95%信頼区間=63.94〜3538.43)、543.31倍(95%信頼区間=33.11〜8914.18)、95.08倍(95%信頼区間=20.55〜223.01)及び14.25倍(95%信頼区間=6.12〜33.18)で重度子宮頸癌に罹患する危険性があると測定された。なおかつ各項目の敏感度は子宮頸部スメアをこれに加えない測定結果に比較して全て上昇している(PAX1:75%が94%に上昇、ZNF582:87%が94%に上昇、SOX1:75%が100%に上昇、NKX6−1:50.00%が84.78%に上昇)。
aカイ二乗検定による bフィッシャーの正確確率検定による
*CIN3以上のオッズ比(odds rations、 OR)(CIN1とCIN2を含まない)
CIN:子宮頸部上皮内腫瘍(Cervical intraepithelial neoplasia)
SCC:扁平上皮癌(squamous cell carcinoma)
Pap:子宮頸部スメア検査(Papanicolaou test)
実施例4
本テストでは診断により正常と疾病状態にあると認識済みの8名の口腔スメアサンプルを用い、それらのDNAを抽出し、亜硫酸水素塩(bisulfite)の変換を通じて表1から表4までに掲げる内容によりPAX1、ZNF582、SOX1、NKX6−1及び内部統制群を含有するメチル化領域の増幅に使えるプライマー対とプローブセット(表1から5参照)により測定を行った。
それらのメチル化状態の分析結果は表11に示す通りである。口腔1のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化せず、口腔2のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化せず、口腔3のうち、PAX1及びZNF582がメチル化し、口腔4のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化し、口腔5のうち、PAX1とZNF582がメチル化し、口腔6のうち、ZNF582がメチル化し、口腔7のうち、ZNF582、SOX1及びNKX6−1がメチル化し、口腔8のうち、PAX1とZNF582がメチル化した、との結果が示された。ここから分かるのは、口腔癌では異なる時期、異なる症状のもとで、当該4つの遺伝子のうち少なくとも1つが大幅にメチル化されたことである。そのためPAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1のうち少なくとも1つのメチル化程度は、確実に口腔癌をスクリーニングするスクリーニング指標となり得る。
本テストでは診断により正常と疾病状態にあると認識済みの8名の口腔スメアサンプルを用い、それらのDNAを抽出し、亜硫酸水素塩(bisulfite)の変換を通じて表1から表4までに掲げる内容によりPAX1、ZNF582、SOX1、NKX6−1及び内部統制群を含有するメチル化領域の増幅に使えるプライマー対とプローブセット(表1から5参照)により測定を行った。
それらのメチル化状態の分析結果は表11に示す通りである。口腔1のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化せず、口腔2のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化せず、口腔3のうち、PAX1及びZNF582がメチル化し、口腔4のうち、PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1は全てメチル化し、口腔5のうち、PAX1とZNF582がメチル化し、口腔6のうち、ZNF582がメチル化し、口腔7のうち、ZNF582、SOX1及びNKX6−1がメチル化し、口腔8のうち、PAX1とZNF582がメチル化した、との結果が示された。ここから分かるのは、口腔癌では異なる時期、異なる症状のもとで、当該4つの遺伝子のうち少なくとも1つが大幅にメチル化されたことである。そのためPAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1のうち少なくとも1つのメチル化程度は、確実に口腔癌をスクリーニングするスクリーニング指標となり得る。
Claims (20)
- 測定用検体にある遺伝子CpG配列のメチル化が存在することの測定に用いられ、まず検体によりそのgDNAを抽出し、このgDNAが適切な前処理と化学反応とを経ることで、直ちに本検査キットがDNAメチル化の存在についてテストが行えることであり、
本検査キットが、
(1)それが少なくとも1つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマーを含み、当該フォワードプライマー、リバースプライマーの配列がSEQ ID No:1−70に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じ配列の1種又は複数種から選ばれる、濃度範囲が20nM−1250nMの標的遺伝子混合プライマー、
(2)それが少なくとも1つのフォワードプライマーと1つのリバースプライマーを含む、濃度範囲が20nM−1250nMの内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液、
(3)その主たる成分が少なくともポリメラーゼ、dNTPs及び硫酸マグネシウムを含む、ポリメラーゼ連鎖反応の主たる混合液を含むことを特徴とする1種の検査キット。 - (1)当該標的遺伝子混合プライマーが更にプローブを含み、そのプローブ配列がSEQ ID No:1−70に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じ配列の1種又は複数種又はその相補的配列から選ばれ、
(2)当該内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液が更に、内部抑制遺伝子増幅産物が検出できるプローブを含む請求項1に記載の検査キット。 - 当該内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液が、そのうちフォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列SEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じ配列の1種又は複数種から選ばれる請求項1に記載の検査キット。
- 当該内部抑制遺伝子核酸分子検出用混合液が、更にプローブを含み、そのうち内部抑制遺伝子のフォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列がSEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じ配列の1種の又は複数種から選ばれ、プローブ配列がSEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の少なくとも80%の配列に同一性がある又は少なくとも10個の連続したヌクレオチドが同じ配列の1種又は複数種又は相補的配列から選ばれる請求項2に記載の検査キット。
- 標的遺伝子のフォワードプライマーとリバースプライマーの配列がSEQ ID No:1−70に示すヌクレオチド配列の1種又は複数種から選ばれる請求項1に記載の検査キット。
- フォワードプライマーとリバースプライマーの配列がSEQ ID No:1−70に示すヌクレオチド配列の1種又は複数種から選ばれ、記載の標的遺伝子プローブ配列がSEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の1種又は複数種又は相補的配列から選ばれる請求項2に記載の標的遺伝子。
- フォワードプライマー、リバースプライマーが含む配列がSEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の1種又は複数種から選ばれ、プローブ配列がSEQ ID No:71−80に示すヌクレオチド配列の1種又は複数種又は相補的配列から選ばれる請求項4に記載の内部統制群遺伝子。
- ポリメラーゼ連鎖反応の主たる混合液が、更に、連鎖反応産物が識別できる蛍光物質を含む又は/及びDNA二重作用と蛍光を生じ更に検出されることができる物質から選ばれる請求項1に記載の検査キット。
- 標的遺伝子と内部統制群遺伝子のプローブが蛍光色素標識を備え、この蛍光色素標識が次のいずれかの蛍光:FAM、HEX、TET、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、VIC、Red610、Yellow 555、Texas Red、Yakima Yellow、 BHQ−1、BHQ−2及びBHQ−3により構成される群から選ばれる請求項2に記載の検査キット。
- 更に正常でない細胞増殖現象の測定に用いられる請求項1に記載の検査キット。
- 正常でない細胞増殖の測定が前癌病変の測定、腫瘍の測定、腫瘍再発の測定又は腫瘍用薬予測又は予後効果の測定を含む請求項10に記載の検査キット。
- 下記の群のうちの1つ:子宮頸癌、口腔癌、頭頸部癌、食道癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、乳癌、舌癌、肺癌、肺腺癌及び皮膚癌である請求項11に記載の腫瘍。
- 更に不正常な細胞増殖現象の測定に使用される請求項2に記載の検査キット。
- 正常でない細胞増殖の測定が前癌病変の測定、腫瘍の測定、腫瘍再発の測定又は腫瘍用薬予測又は予後効果の測定を含む請求項13に記載の検査キット。
- 下記の群のうちの1つ:子宮頸癌、口腔癌、頭頸部癌、食道癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、乳癌、舌癌、肺癌、肺腺癌及び皮膚癌である請求項14に記載の腫瘍。
- 標的遺伝子と内部抑制遺伝子のプライマーが混和してシングルチューブ核酸分子検出用混合液となり得る請求項1に記載の検査キット。
- 標的遺伝子及び内部抑制遺伝子のプライマーとプローブが混和してシングルチューブ核酸分子検出用混合液となり得る請求項2に記載の検査キット。
- 当該測定用検体にある標的遺伝子が次の少なくとも1種の又は1種以上の遺伝子:PAX1、ZNF582、SOX1及びNKX6−1により構成される群から選ばれる請求項1又は2に記載の検査キット。
- 当該測定用検体にある内部抑制遺伝子が次の少なくとも1種の又は1種以上の遺伝子:Col2A、β−Globin、GAPDH及びβ−actinにより構成される群から選ばれる請求項1又は2に記載の検査キット。
- 連鎖増幅産物の鑑定方法が蛍光光度法、シークエンシング(sequencing)、マイクロアレイ(microarrays)、質量分析計分析(mass spectrometer)、変性高速液体クロマトグラフィー(denaturing high−performance liquid chromatography、 DHPLC)、パイロシークエンス(pyrosequencing)又は免疫学的検定(immunoassay)である請求項1又は2に記載の検査キット。
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