CN105296637A - 检测白血病相关融合基因的引物、探针及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测白血病相关融合基因的引物、探针及试剂盒,其引物和探针是专门针对于BCR/ABL、PML/RARα、AML1/ETO和TEL/AML1融合基因共计8种型别特异性设计的。灵敏度高,特异性好。能够检出低至10拷贝的突变样本。本发明的试剂盒采用一步实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应法检测待检样本,其逆转录和定量PCR在同一反应体系中进行,只需一步荧光PCR扩增即可,反应过程中无需添加试剂,无需打开管盖,检测时间只需90分钟即可完成,操作非常简单。同时具备了灵敏度高,特异性好,廉价快速,操作简单等优点,具有较高的科研价值和临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中分子生物学的基因检测,特别是涉及检测白血病相关融合基因的引物、探针及试剂盒。
背景技术
慢性粒细胞白血病(chronicmyelocyticleukemia,CML)是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。90%~95%的CML患者异常白细胞中可检测到含有一段染色体易位形成的被命名为费城(Ph)染色体。Ph染色体形成机理为9号染色体的一段拼接到了22号染色体上,这种拼接形成了一个致癌性的融合基因BCR/ABL。BCR/ABL基因的编码蛋白具有异常的酪氨酸酶活性,使调控细胞复制的信号传导途径一直处於活跃状态,从而源源不断地产生更多的异常白细胞,骨髓正常控制的白细胞的生成被破坏,形成CML病症。由于BCR基因断裂位点的不同,BCR/ABL融合基因呈现出不同的类型,并表达出不同的BCR/ABL融合蛋白,常见的融合类型有e1a2、b3a2(e14a2)、b2a2(e13a2)和e19a2。有研究报道,不同的BCR/ABL融合基因亚型对白血病的危险度评估提供一定的指导价值。e1a2型BCR/ABL融合基因所表达的P190融合蛋白的酪氨酸激酶活性高于b2a2/b3a2型BCR/ABL融合基因所表达的P210融合蛋白,因此其治疗方案也不同。及时检测患者白细胞中BCR/ABL融合类型,对于CML的诊断、治疗方案及预后评估等提供直接的理论依据。
急性早幼粒细胞白血病(APL)是较为常见的急性髓细胞白血病的一种特殊类型,98%以上的APL病人出现非随机的染色体易位t(15;17)(q22;q21),造成PML与RARa基因重排而形成PML/RARa融合基因。PML/RARa融合基因是由于15号染色体上的PML基因与位于17号染色体上的RARa基因发生易位而形成并产生融合蛋白,该融合蛋白具有不同于正常RARa等位基因编码的野生型维甲酸受体的功能,可阻断粒细胞的分化成熟,导致APL发生。因此,PML/RARa融合基因在APL白血病的发生中起关键作用,同时也成为APL特异性的分子标志。根据断裂点的不同所形成的PML/RARa融合基因相应的可分为长型(L)、短型(S)和变异型(V)。通常PML/RARa融合基因L型出现在50%~60%的APL患者,S型出现在20%~30%的APL患者,而V型则较为少见。研究发现L型APL患者通常对维甲酸的反应性较好,而仅仅只有部分S型患者对维甲酸的反应性较好。因此,进行PML/RARa融合基因以及亚型的检测,对于治疗方案选择以及疗效评估有一定的理论指导意义。
t(8;21)(q22,q22)易位最常见于儿童和年轻患者,很少见于60岁以上的患者,约10%~20%的AML儿童患者。t(8;21)易位使8号染色体上ETO基因和21号染色体上AML1基因形成AML1/ETO融合基因。美国国立综合癌症网络急性髓系白血病诊疗指南明确指出:急性髓系白血病需要进行骨髓或者外周血中AML1-ETO融合基因的检测,并定期进行监测。
t(12;21)(p13;q22)易位常见儿童急性淋巴细胞白血病,导致12号染色体上TEL基因与21号染色体上AML基因发生融合,最终形成TEL/AML1融合基因。研究表明,TEL/AML1融合基因已被认为是急性白血病发病关键机制之一,属于白血病特异性分子标志物。在临床研究中,急性淋巴细胞白血病患儿中TEL/AML1融合基因大多为阴性(20%~30%),即未发生TEL/AML1基因融合情况,且此类患儿临床总有效率并不理想(55.26%),而发生TEL/AML1融合基因的急性淋巴细胞白血病患儿临床总有效率较高(80.00%),治疗效果较为满意。因此,通过对急性淋巴细胞白血病患儿TEL/AML1基因融合情况进行检测,可准确评估患儿临床疗效及预后,对临床医生制定针对性的治疗方案提供可靠依据,具有重要的临床意义。
目前检测融合基因的方法主要包括荧光原位杂交(FISH)、PCR和基因芯片等。但这些方法存在着价格较为昂贵,操作步骤复杂,临床上广泛应用较为困难等问题。
发明内容
为解决现有技术中检测白血病相关融合基因的方法价格昂贵、操作繁琐复杂、临床应用受限、检测灵敏度第等问题,本发明提供了一组检测白血病相关融合基因的引物和探针。可以准确快速地检测鉴别BCR/ABL、PML/RARα、AML1/ETO和TEL/AML1共8种融合基因型别(即前述融合基因的8中剪切异构体),检测成本低,临床适用范围广。
本发明还提供了包括上述检测白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒,可以满足临床快速检测的实际需求。
本发明提供的检测白血病相关融合基因的引物和探针,其所述融合基因包括BCR/ABL、PML/RARα、AML1/ETO和TEL/AML1,各融合基因型别检测的引物和TaqMan-探针的核苷酸序列如下:
上述引物和探针,能够准确快速地检测出BCR/ABL、PML/RARα、AML1/ETO和TEL/AML1这四种常见白血病融合基因的8种剪切异构体,8种剪切异构体如下:BCR/ABL(e1a2)、BCR/ABL(e13a2)、BCR/ABL(e14a2)、BCR/ABL(e19a2)、PML/RARαL型、PML/RARαS型、AML1/ETO和TEL/AML1。其中,TaqMan-探针的核苷酸序列的5’端标记有报告基团,3’端标记有淬灭基团,这是TaqMan-探针的典型特点。
本发明提供的检测白血病相关融合基因的试剂盒,其包括以上所述的检测白血病相关融合基因的引物和探针。
优选地,上述检测白血病相关融合基因的试剂盒中,所述TaqMan-探针的核苷酸序列5’端标记的报告基团为FAM,3'端标记的淬灭基团为非荧光淬灭基团。3'端标记的淬灭基团采用非荧光淬灭基团,优点是其本身不产生荧光,可以大大降低本底信号的强度,有利于增加检测灵敏度。
优选地,上述检测白血病相关融合基因的试剂盒中,所述TaqMan-探针为TaqMan-MGB探针。
该试剂盒采用实时荧光定量PCR和TaqMan探针中MGB探针技术,TaqMan-MGB探针上连接有MGB修饰基团,可以将探针的Tm值提高10℃左右,因此为了获得同样的Tm值,MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短,既降低了合成成本,也使得探针设计的成功率大为提高。
优选地,上述检测白血病相关融合基因的试剂盒中,还包括内参基因β-actin的检测引物和TaqMan-MGB探针,其中检测引物的核苷酸序列如SEQIDNO:17~18所示,TaqMan-探针的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示。增加内参基因的主要目的是方便检测以及结果分析,降低样品污染等原因造成的结果失真,有利于提高检测灵敏度及特异性。理所当然地,内参基因β-actin的TaqMan-探针报告基团应区别于上述检测白血病相关融合基因的探针使用的报告基团。
优选地,上述检测白血病相关融合基因的试剂盒中,还包括阴性对照品:无菌无核酸酶的ddH2O,以及阳性对照品:8种型别融合基因的质粒混合物。所述8种型别融合基因分别为:BCR/ABL(e1a2)、BCR/ABL(e13a2)、BCR/ABL(e14a2)、BCR/ABL(e19a2)、PML/RARαL型、PML/RARαS型、AML1/ETO和TEL/AML1。
优选地,上述检测白血病相关融合基因的试剂盒中,试剂盒内包括8联PCR反应条、酶混合液管、阴性对照管和阳性对照管;其中8联PCR反应条的8个管中分别装有一种型别的融合基因的引物和TaqMan-探针,以及dNTPs和反应缓冲液;酶混合液管内装有逆转录酶和TaqDNA酶;阴性对照管装有无菌无核酸酶的ddH2O;阳性对照管装有8种型别融合基因的质粒混合液。
其中反应缓冲液可以直接购买市售商品,反应缓冲液2×buffer购自Takara公司OneStepPrimeScriptTMRT-PCRKit(PerfectRealTime),2×buffer主要成分有Mg2+(3mmol/L)、Tris-HCl(40mmol/L)和dNTP(1.2mmol/L)等,以供应商提供的质量合格报告为准。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的检测白血病相关融合基因的引物和探针,是针对四种融合基因的8种剪切异构体特异性筛选设计,灵敏度高,特异性好。能够检出低至10拷贝的突变样本。
本发明的试剂盒采用一步实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应法检测待检样本,试剂盒内含反转录酶可将样本RNA合成cDNA,再以cDNA为模板应用DNA聚合酶在同一反应管中进行PCR扩增反应,同时对探针的荧光信号进行实时监测,从而确定待测样本的白血病相关融合基因的融合情况。由于逆转录和定量PCR在同一反应体系中进行,只需一步荧光PCR扩增即可,反应过程中无需添加试剂,无需打开管盖,检测时间只需90分钟即可完成,操作非常简单。同时具备了灵敏度高,特异性好,廉价快速,操作简单等优点,可以满足临床快速检测的实际需求。
该试剂盒的8联PCR反应条中每孔代表着一种融合类型,能够做到快捷准确地定性检测人骨髓标本中的白血病相关融合基因中BCR-ABL、PML-RARa、AML1-ETO和TEL/AML1的RNA,既适合于科研项目中大规模的样本筛查,又适合于对临床对可疑具有白血病融合基因肿瘤的初步检测,从而指导白血病临床上的诊断和用药,可以满足临床快速检测的实际需求,也具有较高的科研价值。
附图说明
图1是应用本发明试剂盒检测BCR/ABL(e1a2)融合类型的灵敏度分析结果。
图2是应用本发明试剂盒检测BCR/ABL(e13a2)融合类型的灵敏度分析结果。
图3是应用本发明试剂盒检测BCR/ABL(e14a2)融合类型的灵敏度分析结果。
图4是应用本发明试剂盒检测BCR/ABL(e19a2)融合类型的灵敏度分析结果。
图5是应用本发明试剂盒检测PML/RARαL型融合类型的灵敏度分析结果。
图6是应用本发明试剂盒检测PML/RARαS型融合类型的灵敏度分析结果。
图7是应用本发明试剂盒检测AML1/ETO融合类型的灵敏度分析结果。
图8是应用本发明试剂盒检测TEL/AML1融合类型的灵敏度分析结果。
图9是应用本发明试剂盒检测白血病8种融合类型呈阴性的结果。
图10是应用本发明试剂盒检测BCR/ABL(e13a2)融合类型呈阳性的结果。
其中图1-图8中最接近横坐标基线的三条曲线为内参基因的S型曲线。
具体实施方式
下面结合具体的优选实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
以下实施例中所使用的技术,除非特别说明,均为本领域的技术人员已知的常规技术;所使用的仪器设备、试剂等,除非是本说明书特别说明,均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
实施例1:临床样本RNA的提取
本实施例是从白血病患者外周血中提取RNA,并对其进行定量,作为PCR检测的模板。采用Qiagen公司所提供的RneasyMinikit血液RNA提取试剂盒,按照说明书进行操作,具体详述如下:
a.向0.5~1.5mL新鲜的抗凝全血样本中,加入等体积的RLT,轻轻涡旋或颠倒混匀,置冰上3~5min。
b.在室温下加入等体积的无水乙醇混匀。
c.取700μL加入分离柱中,10000rpm,离心15s。
d.用700μL的RW1冲洗分离柱,10000rpm,离心15s。
e.用500μL洗液RPE冲洗分离柱,10000rpm,离心15s。
f.用500μL洗液RPE再一次冲洗分离柱,12000rpm,离心2min。
g.分离柱下换新的EP管,预先加入0.5μL的RNA酶抑制剂,在分离柱中加入30-50μL的DEPC水洗脱RNA,10000rpm,离心1min,-20℃保存。
h.将提取的RNA用紫外分光光度计进行定量,并稀释RNA浓度到2ng/μL。
实施例2:试剂盒检测临床样本的效果
白血病相关融合基因荧光PCR检测试剂盒含有可检测出BCR/ABL、PML/RARα、AML1/ETO和TEL/AML1这四种常见白血病融合基因的8种剪切异构体,8联PCR反应条中的检测体系依次分别检测8种融合基因剪切异构体如下:BCR/ABL(e1a2)、BCR/ABL(e13a2)、BCR/ABL(e14a2)、BCR/ABL(e19a2)、PML/RARαL型、PML/RARαS型、AML1/ETO和TEL/AML1。
表2白血病相关融合基因荧光PCR检测试剂盒组成
(注:RT酶为逆转录酶,用于将RNA逆转录为cDNA;TaqDNA酶为DNA聚合酶;buffer为反应缓冲液;探针为TaqMan-MGB探针)
检测方法如下(检测临床样本10例):
1.首先取出12支离心管(PCR级,需自备)在管盖分别标记样本1、样本2、……样本10、阴性对照和阳性对照;其次对应向12支离心管依次分别加入45μL(2ng/μL)待检测样本1、样本2、……样本10、阴性对照及阳性对照至管底;最后再向12支离心管中各加入混合酶液4.5μL;盖紧离心管盖后轻微震荡,离心,置于冰上,待用。
2.取8联PCR反应条12条,确定好管号后轻轻打开PCR反应条管盖。将步骤1混匀的10个样本、阴性对照和阳性对照待用液分别加到12条8联PCR反应体系各孔中,5.5μL/孔。盖紧PCR反应条管盖,混匀离心,确保试剂全在PCR反应管的管底。
3.把离心好的PCR反应条放于荧光定量PCR仪中,PCR反应体系为:
总体积为20~30μL。
4.反应程序如下:
第一阶段:45℃10min;
第二阶段:95℃5min;
第三阶段:95℃10s,58℃40s,40循环并收集荧光信号。
本发明可检测出BCR/ABL、PML/RARα、AML1/ETO和TEL/AML1这四种常见白血病融合基因的8种剪切异构体,本试剂盒8联PCR反应条不同反应孔代表一种融合型别,8种剪切异构体同时使用FAM荧光信号,内参基因检测使用JOE荧光信号来判断检测结果。
首先分析阴性对照的FAM信号及JOE信号不呈现典型S型曲线,FAM信号及JOE信号Ct值>30或无Ct值。满足上述条件再分析阳性对照,保证所有阳性对照的FAM信号及JOE信号呈现典型S型曲线,FAM信号和JOE信号Ct值<30。
阴性对照和阳性对照均满足条件后,再判定样本结果,检测样本的8联PCR反应孔的JOE信号均需满足Ct值<30,若JOE信号Ct值<30说明待测样本模板RNA质量合格;若Ct值>30或无Ct值说明待测样本模板RNA上样浓度太低或已经降解或漏加样本建议重新提取样本RNA再验证。满足模板浓度合格后再分析检测样本的8联PCR反应孔的FAM信号,Ct值<30样本检测为阳性;若Ct值>30或under样本结果为阴性,结果判定某种融合类型参考表2。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (7)
1.检测白血病相关融合基因的引物和探针,其特征在于,所述融合基因包括BCR/ABL、PML/RARα、AML1/ETO和TEL/AML1,各融合基因型别检测的引物和TaqMan-探针的核苷酸序列如下:
。
2.检测白血病相关融合基因的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的检测白血病相关融合基因的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的检测白血病相关融合基因的试剂盒,其特征在于,所述TaqMan-探针的核苷酸序列5’端标记的报告基团为FAM,3'端标记的淬灭基团为非荧光淬灭基团。
4.根据权利要求2所述的检测白血病相关融合基因的试剂盒,其特征在于,所述TaqMan-探针为TaqMan-MGB探针。
5.根据权利要求2~4任一所述的检测白血病相关融合基因的试剂盒,其特征在于,还包括内参基因β-actin的检测引物和TaqMan-MGB探针,其中检测引物的核苷酸序列如SEQIDNO:17~18所示,TaqMan-探针的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示。
6.根据权利要求5所述的检测白血病相关融合基因的试剂盒,其特征在于,还包括阴性对照品:无菌无核酸酶的ddH2O,以及阳性对照品:8种型别融合基因的质粒混合物。
7.根据权利要求6所述的检测白血病相关融合基因的试剂盒,其特征在于,试剂盒内包括8联PCR反应条、酶混合液管、阴性对照管和阳性对照管;其中8联PCR反应条的8个管中分别装有一种型别的融合基因的引物和TaqMan-探针,以及dNTPs和反应缓冲液;酶混合液管内装有逆转录酶和TaqDNA酶;阴性对照管装有无菌无核酸酶的ddH2O;阳性对照管装有8种型别融合基因的质粒混合液。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160203 |