CN112430664A - 用于检测PML-RARα融合基因的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测PML-RARα融合基因的引物组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测PML‑RARα融合基因的引物组、试剂盒及方法，该引物组包括：PML‑RARA融合基因突变情况的引物对和对应的荧光探针。利用该引物组进行荧光定量PCR检测时，通过一次PCR反应可以对上述PML‑RARA融合基因突变情况进行检测，从而降低PML‑RARA融合基因突变情况的检测难度。

Description

用于检测PML-RARα融合基因的引物组、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及用于检测PML-RARα融合基因的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)为急性髓细胞白血病(Acute myelocytic leukemia，AML)的一种亚型，约占AML的7％-27％。患者骨髓中出现大量异常早幼粒细胞，其中95％以上伴有特异性染色体异位t(15；17)(q22；q21)/PML-RARα融合基因阳性，即15号染色体上PML基因和17号染色体上的RARa基因形成PML-RARa融合基因。易位使15q22上的PML基因与17q21上的维甲酸受体α基因发生交互性重排，分别在15号染色体上形成PML-RARa融合基因和RARa-PML融合基因。根据PML断裂点的位置不同，PML-RARa融合基因有三种亚型bcr1、bcr2和bcr3，分别称为长型(L型)、变异型(V型)和短型(S型)，发生的概率则依次为55％、5％和40％。因此，PML-RARA融合基因是APL的典型分子特征和关键发病因素。
目前，检测PML-RARα融合基因突变情况的方法有探针杂交法、基因芯片法以及基因测序法。
但是，探针杂交法假阳性率较高；基因芯片法测试成本高、制备方法繁琐；基因测序法的测试成本比较高，而且操作较繁琐，耗时较长。从而增加了PML-RARA融合基因突变情况检测难度。
发明内容
本发明提供了用于检测PML-RARα融合基因的引物组、试剂盒及方法，能够降低PML-RARA融合基因突变情况检测难度、成本和检测时间。
本发明提供了用于检测PML-RARα融合基因的引物组，包括：
用于扩增ABL内参基因的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，对应的荧光探针的序列如SEQID NO.3所示；
用于扩增PML-RARαL型(即，bcr1)融合基因的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，荧光探针的序列如SEQ ID NO.8所示；
用于扩增PML-RARαV型(即，bcr2)融合基因的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，荧光探针的序列如SEQ ID NO.8所示；
用于扩增PML-RARαS型(即，bcr3)融合基因的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，荧光探针的序列如SEQ ID NO.8所示。
通过上述引物对组成的引物组，可确定是否发生PML-RARα融合基因突变以及PML-RARα融合基因的基因型。
实时荧光定量聚合酶链式反应PCR具有特异性增强、灵敏度提高和检测快速、降低了污染等特点。基于此，本发明还提供了用于检测PML-RARα融合基因的试剂盒，包括：上述所述的引物组、用于合成cDNA第一链的合成试剂、用于PCR测试的荧光定量PCR预混液、阴性对照样本和阳性对照样本，其中，所述阴性对照样本表征未带有PML-RARα融合基因突变的样本，阳性对照样本表征带有PML-RARα融合基因突变的样本。
本发明采用实时荧光定量PCR Taqman-MGB探针的方法检测PML-RARα融合基因，不但提高了特异性，还降低了成本；并且Taqman-MGB探针在实验结果的准确性、重复性、特异性、灵敏度等方面均优于普通的探针。因此，本发明建立的PML-RARα融合基因的检测方法具有结果准确高、特异性灵敏度高、无毒害无污染、成本低、快速高效等优点。
在本发明一实施例中，所述引物组中的SEQ ID NO.3所示的荧光探针和SEQ IDNO.8所示的荧光探针在5′末端区域均标记有荧光基团，且在3′末端区域标记有淬灭基团；
其中，荧光基团包括FAM、TET、VIC、ROX、Texas Red-X、Cy3以及Cy5中的任意一个。
所述淬灭基团包括：TAMRA、BHQ、DABCYL以及NFQ-MGB中的任意一个。
举例来说，SEQ ID NO.3所示的荧光探针的5′端标记有VIC的荧光基团，SEQ IDNO.8所示的荧光探针在5′末端标记有FAM荧光基团，上述两个荧光探针的3′端均标记有NFQ-MGB的淬灭基团。
在本发明一实施例中，所述cDNA第一链的合成试剂包括：MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)15、逆转录酶和不含有核糖核酸酶的去离子水。
在本发明一实施例中，所述荧光定量PCR预混液包括：Mg2+、dNTPs、脱氧尿苷三磷酸dUTP、DNA聚合酶、UNG酶和不含有核糖核酸酶的去离子水。
具体地，Mg2+包括氯化镁和/或硫酸镁。
具体地，DNA聚合酶包括：Taq聚合酶、KOD FX聚合酶、Pfu聚合酶或Phusion聚合酶。
在本发明一实施例中，所述引物组中的每一条引物的终浓度均为0.2～1.0μM；所述引物组中的荧光探针的终浓度为0.05～1.0μM。避免上下游引物以及荧光探针的终浓度过低不利于核酸片段扩增，也可以避免终浓度过高造成检测成本过高。
针对每一条引物的终浓度来说，0.2～1.0μM是指0.2μM至1.0μM范围内的任一值，比如，0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM以及1μM。
针对荧光探针的终浓度来说，0.05～1.0μM是指0.05μM至1.0μM范围内的任一值，比如，0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM以及1μM。
在本发明一实施例中，所述阳性对照样本包括带有L型、V型和S型的PML-RARα融合基因检测片段的质粒，以模拟带有PML-RARα融合基因突变的样本。
基于上述的引物组，本发明还提供了PML-RARα融合基因的检测方法，包括：
设计上述任一项所述的引物组，或，移取上述任一项所述的试剂盒中的引物组；
从待测样本中提取RNA；
将提取的RNA作为模板合成cDNA，并将该cDNA作为扩增模板；
配制包含所述引物组和所述扩增模板的荧光定量PCR反应体系；
对所述荧光定量PCR反应体系进行荧光定量PCR扩增反应，得到PCR产物的扩增曲线图谱；
根据所述扩增曲线图谱，确定所述待测样本的PML-RARα融合基因突变的基因型。
具体地，荧光定量PCR反应体系中包括引物组、扩增模板、Mg2+、dNTPs、脱氧尿苷三磷酸dUTP、DNA聚合酶、UNG酶和不含有核糖核酸酶的去离子水。
具体地，在利用提取的RNA合成cDNA时，可以通过上述试剂盒中的cDNA第一链的合成试剂和提取的RNA合成。
具体地，待测样本包括机体的外周血、骨髓液或骨髓血。
具体地，ABL内参基因拷贝数是实验质控的重要指标，因此，ABL内参基因的Ct值≤31，避免因ABL内参基因的浓度过低无法真实反应待测样本的测试结果。
当待测样本的PML-RARα融合基因的基因分型呈阳性结果时，PCR产物的扩增曲线图谱中的荧光定量曲线呈平滑S型，且曲线Ct值≤34。
当待测样本的PML-RARα融合基因的基因分型阴性结果时，PCR产物的扩增曲线图谱中的荧光定量曲线未起线；或曲线Ct值>34。
在本发明一实施例中，所述荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：45～55℃条件下反应60～300s；94～96℃条件下预变性120～900s；93～97℃条件下变性5～20s；58～62℃条件下退火20～180s；将变性、退火重复35～50次。
针对用于在荧光定量PCR反应前降解仪器中的酶的温度来说，45～55℃是指45℃至55℃范围内的任一值，比如，45℃、48℃、50℃、52℃、54℃以及55℃。
针对用于在荧光定量PCR反应前降解仪器中的酶的时间来说，60～300s是指，60s至300s范围内的任一值，比如，60s、100s、150s、200s、250s以及300s。
针对变性的温度来说，94～96℃是指94℃至96℃范围内的任一值，比如，94℃、95℃以及96℃。
针对变性的时间来说，120～900s是指120s至900s范围内的任一值，比如，120s、180s、200s、250s、300s、350s、400s、450s、500s、550s、600s、650s、700s、750s、800s、850s以及900s。
针对变性的温度来说，93～97℃是指93℃至97℃范围内的任一值，比如，93℃、94℃、95℃、96℃以及97℃。
针对变性的时间来说，5～20s是指5s至20s范围内的任一值，比如，5s、8s、10s、12s、14s、16s、18s以及20s。
针对退火的温度来说，58～62℃是指58℃至62℃范围内的任一值，比如，58℃、59℃、60℃、61℃以及62℃。
针对退火的时间来说，20～180s是指20s至180s范围内的任一值，比如，20s、30s、50s、80s、100s、120s、140s、160s以及180s。
针对变性、退火重复次数来说，35～50次是指35次至50次范围内的任一值，比如，35次、36次、38次、40次、42次、44次、46次、48次以及50次。
需要说明的是，本发明适用任何常见的荧光定量PCR仪，具体包括ABI荧光定量PCR仪(ABI7300，ABI7500，ABI ViiA7、ABI Stepone plus(Stepone))；Roche(罗氏)荧光定量PCR仪LightCycler480；Bio-rad(伯乐)荧光定量PCR仪CFX96TM等。可根据不同PCR仪选用不同荧光探针进行PCR扩增。
本发明检测方法的优点和效果如下：
(1)使用Taqman-MGB特异性探针对融合基因进行检测，特异性强、结果准确性高。
(2)整个检测过程均在PCR管内进行，无需开盖分析，不易造成气溶胶污染；无需进行电泳分析，不接触有毒有害试剂。
(3)从样本接收、RNA提取、cDNA合成到PCR扩增全部检测过程可在5小时内完成，可同时检测大批量样本，提高了检测效率，节约了时间成本。
本发明的检测方法能快速、准确、高效的检测是否发生PML-RARα融合基因突变，并判断基因融合的类型。
需要说明的是，该PML-RARα融合基因的检测方法为非诊断目的的方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的PML-RARα融合基因呈阴性样本的ABL内参基因的图谱；
图2是本发明一实施例提供的PML-RARα融合基因呈阴性样本的bcr1型检测孔的图谱；
图3是本发明一实施例提供的PML-RARα融合基因呈阴性样本的bcr2型检测孔的图谱；
图4是本发明一实施例提供的PML-RARα融合基因呈阴性样本的bcr3型检测孔的图谱；
图5是本发明一实施例提供的PML-RARα融合基因呈阳性样本的ABL内参基因的图谱；
图6是本发明一实施例提供的PML-RARα融合基因呈阳性样本的bcr1型检测孔的图谱；
图7是本发明一实施例提供的PML-RARα融合基因呈阳性样本的bcr2型检测孔的图谱；
图8是本发明一实施例提供的PML-RARα融合基因呈阳性样本的bcr3型检测孔的图谱。
具体实施方式
非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1：设计并合成引物组
步骤1.1：根据ABL参考基因和PML的外显子和RARα的外显子上的碱基序列分别设计特异性引物和特异性荧光探针。其中，特异性引物通过Primer Premier 5.0在融合基因融合位点的两端设计引物，通过软件分析选择最适合的引物；特异性荧光探针位于一对引物之间的区域，其中Tm值应当在60～70℃之间，通常比引物高5～10℃。其中，ABL内参基因所参考的荧光探针5’端采用VIC荧光报告基团标记，用于检测bcr1、bcr2、bcr3融合基因的探针5’端采用FAM荧光报告基团标记，3’端采用非荧光淬灭基团(NQF)标记，同时探针上还连接有MGB修饰基团。
另外，在实际操作中可根据实际情况更换荧光报告基团。
本实施例的引物和荧光探针如下述表1所示：
表1
序列名称 引物序列5’-3’
SEQ ID NO.1 TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT
SEQ ID NO.2 GATGTAGTTGCTTGGGACCCA
SEQ ID NO.3 VIC-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-NQF-MGB
SEQ ID NO.4 TCTTCCTGCCCAACAGCAA
SEQ ID NO.5 CCCCAGGAAGGTCATCAAGA
SEQ ID NO.6 CCGATGGCTTCGACGAGTT
SEQ ID NO.7 GCTTGTAGATGCGGGGTAGAG
SEQ ID NO.8 FAM-AGTGCCCAGCCCTCCCTCGC-NQF-MGB
其中，SEQ ID NO.3所示的荧光探针的5′末端标记有荧光基团VIC，3′末端标记有淬灭基团NQF-MGB；SEQ ID NO.8所示的荧光探针在5′末端区域均标记有荧光基团FAM，且在3′末端区域依次标记有淬灭基团NQF和修饰基团MGB。
步骤1.2：合成步骤1.1中设计好的引物组。
实施例2：从待测样本中提取RNA
步骤2.1：利用RNA提取试剂盒PAXgene Blood RNA Kit，QIAGEN(762174)从待测样本提取RNA，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定RNA的浓度及纯度，当测试结果在预设范围内时保存提取的RNA。
实施例3：利用步骤1.2合成的引物组和步骤2.1中的保存的RNA配制荧光定量PCR反应体系
步骤3.1：以步骤2.1中所保存的RNA为模板，利用MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)15、逆转录酶和不含有核糖核酸酶的去离子水合成cDNA。
步骤3.2：配制包含MgCl2、dNTPs、dUTP、DNA聚合酶、UNG酶、不含有核糖核酸酶的去离子水、步骤3.1得到的cDNA以及步骤1.2中合成的引物组得到荧光定量PCR反应体系。
具体地，ABL内参基因的PCR反应体系如下述表2所示。
表2
试剂成分 体积
2×TaqMan PCR Mix 9μl
ABL-F(10uM) 0.8μl
ABL-R(10uM) 0.8μl
ABL-Probe(10uM) 0.8μl
cDNA 1μl
超纯水 7.6μl
具体地，bcr1、bcr2、bcr3型融合基因的PCR反应体系如下述表3所示。
表3
试剂成分 体积
2×TaqMan PCR Mix 9μl
PML-F*(10uM) 0.8μl
RARA-R(10uM) 0.8μl
RARA-Probe(10uM) 0.8μl
cDNA 1μl
超纯水 7.6μl
其中，PML-RARα融合基因的L型、V型、S型除上游引物不同外，其他反向引物和荧光探针均一致。具体地，PML-RARα融合基因的L型的上游引物为：PML-Bcr1-L-F；PML-RARα融合基因的V型的上游引物为PML-bcr2-V-F；PML-RARα融合基因的S型的上游引物为PML-Bcr3-S-F。
需要说明的是，反应体系等比例放大/缩小均在本发明实施例的保护范围内；更换其他DNA聚合酶系，经过适当比例调整也可以达到扩增目的。
步骤3.2：按照下述表4所示的荧光定量PCR反应，设置PCR仪器的程序，并对步骤3.2中配制的荧光定量PCR反应体系，进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物的扩增曲线图谱。
表4
Figure BDA0002843281600000101
其中，表4中示出的*表示接收荧光信号位置。
具体地，上述实施例采用了ABI 7500实时荧光定量PCR仪扩增，但本发明不仅局限于ABI 7500，还适用其他型号的荧光定量PCR仪，具体地可根据不同PCR仪选用不同荧光探针进行检测。
实施例4：检测结果判断
根据实施例3.2中得到的扩增曲线图谱中的ABL内参基因、bcrl型、bcr2型和bcr 3型四个反应孔的起峰及Ct值情况判读阴阳性及融合基因分型，具体判读如下：
其中，样本ABL内参基因的Ct值≤31。
若待测样本的PML-RARα融合基因的基因分型呈阳性结果，则扩增曲线图谱中的荧光定量曲线呈平滑S型，且曲线Ct值≤34。
若待测样本的PML-RARα融合基因的基因分型呈阴性结果，则扩增曲线图谱中的荧光定量曲线未起线，或，曲线Ct值＞34。
如图1至图8所示，其中，图1至图4示出了一个待测样本的PML-RARα融合基因呈阴性结果的荧光PCR扩增曲线图谱；图5至图8示出了另一个待测样本的PML-RARα融合基因呈阳性结果的荧光PCR扩增曲线图谱。图1至图8的横坐标均为Cycle，纵坐标均为ΔRn。
图1至图8中缺失的图形不影响本方案的技术内容。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.用于检测PML-RARα融合基因的引物组，其特征在于，包括：
用于扩增ABL内参基因的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，对应的荧光探针的序列如SEQ IDNO.3所示；
用于扩增PML-RARαL型融合基因的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，对应的荧光探针的序列如SEQ ID NO.8所示；
用于扩增PML-RARαV型融合基因的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，对应的荧光探针的序列如SEQ ID NO.8所示；
用于扩增PML-RARαS型融合基因的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，对应的荧光探针的序列如SEQ ID NO.8所示。
2.用于检测PML-RARα融合基因的试剂盒，其特征在于，包括：如权利要求1所述的引物组、cDNA第一链的合成试剂、用于聚合酶链式反应PCR测试的荧光定量PCR预混液、阴性对照样本和阳性对照样本，其中，所述阴性对照样本表征未带有PML-RARα融合基因突变的样本，阳性对照样本表征带有PML-RARα融合基因突变的样本。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，
所述引物组中的SEQ ID NO.3所示的荧光探针和SEQ ID NO.8所示的荧光探针在5′末端区域均标记有荧光基团，且在3′末端区域标记有淬灭基团；
其中，荧光基团包括FAM、TET、VIC、ROX、Texas Red-X、Cy3以及Cy5中的任意一个。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，
所述淬灭基团包括：TAMRA、BHQ、DABCYL以及NFQ-MGB中的任意一个。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，
所述cDNA第一链的合成试剂包括：MgC12、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)15、逆转录酶和不含有核糖核酸酶的去离子水。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，
所述荧光定量PCR预混液包括：Mg2+、dNTPs、脱氧尿苷三磷酸dUTP、DNA聚合酶、UNG酶和不含有核糖核酸酶的去离子水。
7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，
所述引物组中的ABL内参基因的Ct值≤31。
8.根据权利要求2至7中任一所述的试剂盒，其特征在于，
所述引物组中的每一条引物的终浓度均为0.2～1.0μM；
所述引物组中的荧光探针的终浓度为0.05～1.0μM；
和/或，
所述阳性对照样本包括带有L型、V型和S型的PML-RARα融合基因检测片段的质粒。
9.PML-RARα融合基因的检测方法，其特征在于，包括：
设计权利要求1所述的引物组，或，移取如权利要求2至8中任一所述的试剂盒中的引物组；
从待测样本中提取RNA；
将提取的RNA作为模板合成cDNA，并将该cDNA作为扩增模板；
配制包含所述引物组和所述扩增模板的荧光定量PCR反应体系；
对所述荧光定量PCR反应体系进行荧光定量PCR扩增反应，得到PCR产物的扩增曲线图谱；
根据所述扩增曲线图谱，确定所述待测样本的PML-RARα融合基因突变的基因型。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，
所述荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：45～55℃条件下反应60～300s；94～96℃条件下预变性120～900s；93～97℃条件下变性5～20s；58～62℃条件下退火20～180s；将变性、退火重复35～50次。
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