CN107488711A - 点突变的基因型检测的方法及其试剂盒 - Google Patents

点突变的基因型检测的方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种点突变的基因型检测的方法及其试剂盒，所述试剂盒是利用荧光定量PCR的荧光探针熔解曲线直接进行点突变的基因型检测；所述试剂盒包括针对待检测样本的每个点突变位点进行不对称PCR扩增的一对上下游引物、针对待检测样本的每个点突变位点设计的一条Taqman探针和针对待检测样本的每个点突变位点的阳性质控品。本发明的点突变的基因型检测使用方便，便于推广使用。

Description

点突变的基因型检测的方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种利用荧光定量PCR的荧光探针熔解曲线直接进行点突变的基因型检测的方法及其试剂盒。
背景技术
威尔森氏症是一种严重影响人类生活质量的疾病，它是一种因为ATP7B基因突变而导致体内铜代谢缺陷的遗传病，其具有较高的遗传异质性，不同突变位点导致发病年龄及临床表型不尽相同。对威尔森氏症患者及其家系做ATP7B的基因检测对治疗及早诊断该疾病有着现实意义。
近年来随着测序技术的发展以及科研发现，大量的ATP7B基因的点突变被定位，威尔森氏症基因检测也随之得以快速发展。但威尔森氏症易感基因的突变位点多样化，且在不同地区或者不同种族，其突变的类型和频率存在差异。目前，通过流行病学调查数据表明，中国人群最常见的突变位点是ATP7B基因的c.2333G>T与c.2975C>T两个突变位点，这两个位点的突变占所有突变的比例高达51％左右，另外c.3809A>G与c.2755C>G这两个位点也是我国威尔森氏症患者中的高频位点(各自的发病率都大于1.5％)，由此可见，对这些威尔森氏症的易感位点及早进行检测具有重要的早诊断早治疗意义，这将使得威尔森氏症由传统的发病后治疗转向发病前的早诊断，从而提高治疗效果。
目前对威尔森氏症易感基因进行检测或者说用于检测基因多态性的方法很多，比较典型的包括如DNA直接测序，PCR质谱法，限制性片段长度多态性(restriction fragmentlength polymorphisms,RFLP)，扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutationsystem，ARMS)等，其中DNA直接测序为突变检测的金标准，但因其所需时间长，费用高，对取材要求严格，所以临床应用受到很大限制。PCR质谱法，所用仪器耗材昂贵，实验设计复杂且耗时长，对实验技术人员的要求较高，也不符合简单快速的要求。限制性片段长度多态性仅适用于突变位点附近存在适当的特定限制性内切酶识别序列的情况，应用局限性较大。
扩增阻碍突变系统是验证性检测DNA序列变化的常用经典方法之一。ARMS-PCR基因分型检测通常包括两个互补的PCR反应，使用相同的DNA模板和一条相同的共有引物和反应条件，区别仅在于与共有引物配对的ARMS引物不同，野生型ARMS引物3`末端与野生型模板匹配，突变型ARMS引物3`末端与突变型模板匹配，使两个反应选择性扩增特定的DNA模板，即3`末端不匹配引物的延伸受到阻碍，通常还在3`末端2-4个碱基设置一个错配碱基，以提高错配引物的选择扩增性。但由于人基因组DNA分子模板浓度一般较高，导致ARMS引物经选择性扩增后背景仍然很高，而且对于特定序列，ARMS引物不足以形成较明显的扩增差异，不利于结果判断。
发明内容
为了解决基因多态性的检测，本发明的目的在于提供一种利用荧光定量PCR的荧光探针熔解曲线直接进行点突变的基因型检测的方法及其试剂盒。
引物浓度不对称PCR是指利用不等量的一对引物来引导扩增得到大量的单链DNA的反应，其中低浓度引物被称为限制性引物，限制性引物量的多少在整个反应中起决定性作用，只有限制性引物基本耗完之后才开始单链DNA的合成，单链DNA可以用于后续的一些测序分析或者是分子杂交分析。
熔解曲线是指随温度升高反映DNA的双螺旋结构解链的曲线。DNA双螺旋结构解链一半的温度称为熔解温度，即熔点(Tm)，熔点是双链DNA固有的属性，不同序列的双链DNA，其Tm值不同，这与双链DNA序列长度、碱基组成相关。在实时PCR技术推出来之后，熔解曲线技术常用来分析基于荧光染料的实时PCR扩增的特异性，根据PCR产物的Tm值的大小判定产物是目标产物还是非特异扩增产物。
本发明整合了引物浓度不对称PCR技术和荧光定量PCR技术。在一种实施方式中，本发明提供一种利用荧光定量PCR的荧光探针熔解曲线直接进行点突变的基因型检测的试剂盒，所述试剂盒包括：针对待检测样本的每个点突变位点进行不对称PCR扩增的一对上下游引物，所述上下游引物用于扩增含有待测点突变位点的检测序列，所述上下游引物自身不包含待检测的点突变位点，而只是使含有所述点突变位点的检测序列得到扩增；针对待检测样本的每个点突变位点设计的一条Taqman探针，所述探针的5’末端进行荧光报告基团标记，3’末端进行荧光猝灭基团标记，所述探针在所述点突变位点位置只与所述点突变位点的野生型模板或者突变型模板中的一种完全匹配，与另外一种形成碱基错配，当它分别与野生型或者突变型的检测序列相结合时，有不同的Tm值；和针对待检测样本的每个点突变位点的阳性质控品，所述阳性质控品是所述点突变位点的野生型标准质粒与突变型标准质粒。
在一种实施方式中，所述点突变位点的野生型标准质粒与突变型标准质粒是将针对每个点突变位点分别PCR扩增出野生型的片段及突变型的片段分别插入到相同质粒载体中进行构建；并且所述野生型的片段和突变型的片段的长度都长于所述检测序列的长度。
在一种实施方式中，根据待检测样本的每个点突变位点的实验Tm值TmE与出现的熔解曲线峰的个数，以及相应点突变位点的阳性质控品的野生型Tm值TmP1和突变型Tm值TmP2进行每个点突变位点的基因型的判读：
a.若出现单峰，且TmP1-0.5℃≤TmE≤TmP1+0.5℃，判定为野生型；若TmP2-0.5℃≤TmE≤TmP2+0.5℃，判定为突变纯合型；
b.若出现双峰，且两个峰各自在TmP1-0.5℃≤TmE≤TmP1+0.5℃与TmP2-0.5℃≤TmE≤TmP2+0.5℃范围内，判定为杂合突变型。
在一种实施方式中，所述试剂盒是用于检测威尔森氏综合症相关基因ATP7B的c.2333G>T、c.3809A>G、c.2975C>T与c.2755C>G四个点突变位点的试剂盒。
在一种实施方式中，所述试剂盒检测c.2333G>T点突变位点的上下游引物和探针分别是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9；检测c.3809A>G点突变位点的上下游引物和探针分别是SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:10；检测c.2975C>T点突变位点的上下游引物和探针分别是SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:11；和检测c.2755C>G点突变位点的上下游引物和探针分别是SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12。
所述试剂盒中，为了检测样本是否合格，还包括用于检测管家相关基因β-actin的一对上下游引物，诸如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14，相应的探针，诸如SEQ ID NO:15；所用检测通道方面：c.2333G>T与c.3809A>G为HEX通道，c.2975C>T与c.2755C>G为ROX通道，β-actin为FAM通道。
本发明中，威尔森氏症基因检测的试剂盒进一步包括：阴性质控品(NC)与8个阳性质控品，8个阳性质控品分别为待测4个突变位点的野生型(W)与突变型(MT)的标准质粒：PC-2333-W、PC-2333-MT、PC-3809-W、PC-3809-MT、PC-2975-W、PC-2975-MT、PC-2755-W、PC-2755-MT。
在一种实施方式方式中，本发明提供一种利用荧光定量PCR的荧光探针熔解曲线直接进行点突变的基因型检测的方法，所述方法包括以下步骤：针对待检测样本的每个点突变位点进行实时荧光定量PCR扩增：扩增时使用针对待检测样本的每个点突变位点进行不对称PCR扩增的一对上下游引物，所述上下游引物用于扩增含有待测点突变位点的检测序列，所述上下游引物自身不包含待检测的点突变位点，而只是使含有所述点突变位点的检测序列得到扩增；扩增时使用针对待检测样本的每个点突变位点设计的一条Taqman探针，所述探针的5’末端进行荧光报告基团标记，3’末端进行荧光猝灭基团标记，所述探针在所述点突变位点位置只与所述点突变位点的野生型模板或者突变型模板中的一种完全匹配，当它分别与野生型或者突变型的检测序列相结合时，有不同的Tm值；和扩增时使用针对待检测样本的每个点突变位点的阳性质控品，所述阳性质控品是所述点突变位点的野生型标准质粒与突变型标准质粒；和
根据待检测样本的每个点突变位点的实验Tm值TmE与出现的熔解曲线峰的个数，以及相应点突变位点的阳性质控品的野生型Tm值TmP1和突变型Tm值TmP2进行每个点突变位点的基因型的判读：
a.若出现单峰，且TmP1-0.5℃≤TmE≤TmP1+0.5℃，判定为野生型；若TmP2-0.5℃≤TmE≤TmP2+0.5℃，判定为突变纯合型；
b.若出现双峰，且两个峰各自在TmP1-0.5℃≤TmE≤TmP1+0.5℃与TmP2-0.5℃≤TmE≤TmP2+0.5℃范围内，判定为杂合突变型。
在一种实施方式中，在针对待检测样本的每个点突变位点进行实时荧光定量PCR扩增过程中，所述点突变位点进行不对称PCR扩增与所述阳性质控品的扩增是不在同一PCR扩增管中进行。
在一种实施方式中，当所述待检测样本含有多个点突变位点时，所述待检测样本在一个反应管内可以进行多个突变位点的检测，和所有所述阳性质控品的扩增是在另一单管中进行，或者野生型阳性质控品与突变型阳性质控品分两个反应管进行。
在一种实施方式中，当进行PCR产物荧光检测时，每个点突变位点和其阳性质控品的检测是在同一检测通道中；和不同的点突变位点和其阳性质控品的检测是在不同的检测通道中或者是同一通道内的不同Tm值处进行。
本发明的反应体系(样本DNA、dNTP、聚合酶及缓冲液等)中，分别使用本发明的针对各个点突变位点的TaqMan探针和一对浓度不对称的引物，每个突变位点用单个反应管就可对一份待测样本进行检测，且单管内可同时检测多个突变位点，最后通过Tm值来判定样本的基因型。
本发明依据传统的熔解曲线的熔解温度判定目标产物与非特异扩增的原理，进行了Taqman探针的设计，使其只与野生型或者突变型中的一种型别完全匹配并结合，而与另一种型别的结合效率较低，这样造成不同型别的熔解曲线的Tm值则不相同，可以直接读取结果。
本发明中的PCR引物设计原则为，针对含有待测SNP位点的目标区域，设计一对上下游扩增引物，这对引物不包含待检测的SNP位点，而只是使含有SNP位点的目标序列得到扩增。本发明中的TaqMan探针设计原则为，每个突变位点设计一条Taqman探针，探针的末端进行荧光标记，例如，对所述探针进行5’端FAM标记；此探针只与野生型模板或者突变型模板中的一种型别完全匹配，其经过设计具有良好的特异性与保守性，当它分别与野生型或者突变型的目标序列相结合时，有不同的Tm值。
根据本发明的另一方面，提供了一种基于荧光探针熔解曲线检测基因突变的方法，在该方法的反应体系(TaqMan探针、dNTP、聚合酶、配对的上下游引物及缓冲液)中，在单个反应管内对一份待测样本进行检测，通过Tm值判定样本基因型。
本发明所述方法通常包括以下操作步骤：(1)设计并筛选含有待测位点的Taqman探针、一对扩增引物、反应体系，其中，所述taqman探针、配对引物如上所述；(2)从样本中提取人基因组DNA作为模板；(3)分别构建待测突变位点的野生型与突变型的标准质粒，以这两种标准质粒作为待测位点的阳性质控品；和(4)进行实时荧光定量PCR扩增：单管内进行多态性位点的检测，单管内既可检测一个位点，也可检测多个位点；每管中加入dNTP、聚合酶、缓冲液、taqman探针、配对但是浓度不对称引物和模板DNA，每次扩增要设置阴性对照管与阳性对照管，阴性对照管以DDH2O作为模板，阳性对照管以针对待检SNP位点构建好的野生型与突变型的两种标准质粒作为模板；(6)结果判定：依据设置的检测通道内的Tm值判定结果。
对每个待测突变位点根据实验中熔解曲线峰的个数及Tm值(TmE)来进行结果判定。实验样本的TmE值需参看相关位点的两个型别的阳性质控品的Tm值(野生型为TmP1、突变型为TmP2)，来进行结果判定：
a.若出现单峰，且TmP1-0.5℃≤TmE≤TmP1+0.5℃，判定为野生型；若TmP2-0.5℃≤TmE≤TmP2+0.5℃，判定为纯合突变型；
b.若出现双峰，且两个峰各自在TmP1-0.5℃≤TmE≤TmP1+0.5℃与TmP2-0.5℃≤TmE≤TmP2+0.5℃范围内，判定为杂合突变型；
若Tm值不在上述两种判定情况的判读范围内或者没有熔解曲线峰，则无法判读结果，需观察扩增曲线有无异常，并参看内参的扩增曲线以及阴性质控品与阳性质控品的扩增曲线与熔解曲线，建议重新取样后再进行检测。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1：为实施例1的检测威尔森氏症相关ATP7B基因的c.2333G>T与c.3809A>G点突变的野生型阳控品的熔解曲线峰图；
图2：为实施例1的检测威尔森氏症相关ATP7B基因的c.2333G>T与c.3809A>G点突变的突变型阳控品的熔解曲线峰图；
图3：为实施例1的检测威尔森氏症相关ATP7B基因的c.2333G>T与c.3809A>G点突变的野生型阳控品的熔解曲线峰图；
图4：为实施例1的检测威尔森氏症相关ATP7B基因的c.2975C>T与c.2755C>G点突变的突变型阳控品的熔解曲线峰图；
图5：为实施例2中的第一例样本的内参基因的扩增曲线
图6：为实施例2中的第二例样本的内参基因的扩增曲线
图7：为实施例2中的检测威尔森氏症相关ATP7B基因的c.2333G>T与c.3809A>G点突变的野生型阳控品的熔解曲线峰图；
图8：为实施例2中的检测威尔森氏症相关ATP7B基因的c.2333G>T与c.3809A>G点突变的突变型阳控品的熔解曲线峰图；
图9：为实施例2中的检测威尔森氏症相关ATP7B基因的c.2333G>T与c.3809A>G点突变的野生型阳控品的熔解曲线峰图；
图10：为实施例2中的检测威尔森氏症相关ATP7B基因的c.2975C>T与c.2755C>G点突变的突变型阳控品的熔解曲线峰图；
图11：为实施例2中的第一例样本的ATP7B基因的c.2333G>T与c.3809A>G两个位点的熔解曲线峰图；
图12：为实施例2中的第一例样本的ATP7B基因的c.2975C>T与c.2755C>G两个位点的熔解曲线峰图；
图13：为实施例2中的第二例样本的ATP7B基因的c.2333G>T与c.3809A>G两个位点的熔解曲线峰图；
图14：为实施例2中的第二例样本的ATP7B基因的c.2975C>T与c.2755C>G两个位点的熔解曲线峰图；
图15：为实施例2中的第一例样本的ATP7B基因的c.2333G>T位点的测序峰图；
图16：为实施例2中的第一例样本的ATP7B基因的c.3809A>G位点的测序峰图；
图17：为实施例2中的第一例样本的ATP7B基因的c.2975C>T位点的测序峰图；
图18：为实施例2中的第一例样本的ATP7B基因的c.2755C>G位点的测序峰图；
图19：为实施例2中的第二例样本的ATP7B基因的c.2333G>T位点的测序峰图；
图20：为实施例2中的第二例样本的ATP7B基因的c.3809A>G位点的测序峰图；
图21：为实施例2中的第二例样本的ATP7B基因的c.2975C>T位点的测序峰图；
图22：为实施例2中的第二例样本的ATP7B基因的c.2755C>G位点的测序峰图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
以下实施例中，PCR缓冲液、Mg2+、dNTP均随DNA聚合酶，购于宝生物工程(大连)有限公司，所用引物及探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成，血液基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司。
在下列实施例中均使用血液基因组DNA提取试剂盒制备样本DNA。均使用本发明的引物检测β-actin基因作为内参对照，本发明设计内参引物，在实时荧光定量PCR中评价提取样本的扩增是否正常，使得结果更易于判断。
1、检测引物的设计
使用发表在NCBI上的相关核酸序列进行设计检测引物，实施例中所使用的检测引物序列具体见下表：
2、探针设计
针对突变位点设计探针，对探针进行5’端荧光报告基团标记，3’端荧光淬灭基团标记，实施例中所使用的探针序列见下表：
3、阳性质控品的制备
从NCBI上下载ATP7B基因的序列，并在c.2333G>T、c.2755C>G、c.2975C>T与c.3809A>G四个检测位点的附近分别设计两对引物：SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23；SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：31。单独使用一对外引物：SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31用来扩增出含有检测位点的野生型的目标片段；两对引物同时使用，基于重叠延伸PCR的定点突变法，可以扩增出含有检测位点的突变型的目标片段。然后将每个检测位点的野生型的目标片段及突变型的目标片段分别插入到PMD19-T载体中，挑单克隆经测序验证后，选择插入成功并且序列正确的单克隆进行保菌。每次制备阳性质控品时：首先分别活化含有构建好的每个待测位点的野生型与突变型标准质粒的菌株，然后提取活化后的菌株的质粒并测序，确定序列正确后再分别培养菌液，进行质粒大提，分别得到每个待测位点构建的两个型别的质粒，并将每个质粒的浓度用灭菌后的双蒸水调至40ng/uL。制备完后的阳性质控品需要-20℃储存，避免反复冻融，有效期为自生产之日起一年。共构建了8个阳性质控品：PC-2333-W、PC-2333-MT、PC-3809-W、PC-3809-MT、PC-2975-W、PC-2975-MT、PC-2755-W、PC-2755-MT。
4、荧光定量PCR反应体系与反应程序
PCR反应体系为30ul，将四个突变位点在一个反应液中进行，核酸反应液的组分与终浓度如下表所示：
将待测样本加入上述核酸反应液进行荧光定量PCR，PCR反应程序为：50℃2分钟；95℃5分钟；50个循环：95℃15秒，60℃45秒(收集荧光)；40℃1分钟；40℃-85℃，每0.3℃收集一次荧光。所用仪器为SLAN、StepOne等。
试验结果如图1-14所示，扩增的荧光定量PCR反应中，本发明的β-actin基因作为样本的参照，及时判断样品是否合格；在以下实施例中，β-actin基因内参和阴性对照DDH20都正常，说明实施例中的两个样品、PCR反应都正常。
实施例1威尔森氏症相关的ATP7B基因的c.2333G>T、c.3809A>G、c.2975C>T与c.2755C>G四个位点的阳性质控品的检测
本发明采用Taqman探针与浓度不对称的配对引物，在实时荧光定量PCR中使得野生型与突变型的熔解曲线的Tm值不同，通过Tm值就可以判读突变型别，使得结果更易于判断。
1)反应体系、引物及探针设计如上所述；
2)荧光定量PCR反应体系及程序如上所述；
3)四个突变位点的野生型阳性质控品与突变型阳性质控品分别在两个反应孔中进行。
试验结果如图1所示，HEX通道有两个熔解曲线峰，其分别是c.2333G>T野生型阳控品(PC-2333-W)的峰，Tm值为60.3℃，及c.3809A>G野生型阳控品(PC-3809-W)的峰，Tm值为66.8℃。如图2所示，HEX通道有两个熔解曲线峰，其分别是c.2333G>T突变型阳控品(PC-2333-W)的峰，Tm值为54.1℃，及c.3809A>G野生型阳控品(PC-3809-W)的峰，Tm值为61.8℃。如图3所示，ROX通道有两个熔解曲线峰，其分别是c.2795C>T野生型阳控品(PC-2333-W)的峰，Tm值为61.5℃，及c.2755C>G野生型阳控品(PC-3809-W)的峰，Tm值为71.0℃。如图4所示，ROX通道有两个熔解曲线峰，其分别是c.2795C>T突变型阳控品(PC-2333-W)的峰，Tm值为54.9℃，及c.2755C>G突变型阳控品(PC-3809-W)的Tm值为63.8℃。
实施例2对两例威尔森氏症样本的ATP7B基因的c.2333G>T、c.3809A>G、c.2975C>T与c.2755C>G四个位点的基因型的检测
本发明采用Taqman探针与浓度不对称的配对引物，在实时荧光定量PCR中使得野生型与突变型的熔解曲线的Tm值不同，通过Tm值就可以判读突变型别，使得结果更易于判断。
1)反应体系、引物及探针设计如上所述
2)荧光定量PCR反应体系及程序如上所述；
3)四个突变位点的野生型阳性质控品与突变型阳性质控品分别在两个反应孔中进行；
4)每例待检测样本在一个反应孔中进行。
试验结果如图5所示，为第一例样本的内参基因的扩增曲线图，图中显示有扩增曲线且扩增曲线正常，说明样品及PCR反应正常。
试验结果如图6所示，为第二例样本的内参基因的扩增曲线图，图中显示有扩增曲线且扩增曲线正常，说明样品及PCR反应正常。
阳性质控品的试验结果如图7所示，HEX通道有两个熔解曲线峰，其分别是c.2333G>T野生型阳控品(PC-2333-W)的峰，Tm值为60.8℃，及c.3809A>G野生型阳控品(PC-3809-W)的峰，Tm值为67.0℃。如图8所示，HEX通道有两个熔解曲线峰，其分别是c.2333G>T突变型阳控品(PC-2333-W)的峰，Tm值为55.1℃，及c.3809A>G突变型阳控品(PC-3809-W)的峰，Tm值为62.7℃。如图9所示，ROX通道有两个熔解曲线峰，其分别是c.2795C>T野生型阳控品(PC-2333-W)的峰，Tm值为60.6℃，及c.2755C>G野生型阳控品(PC-3809-W)的峰，Tm值为71.0℃。如图10所示，ROX通道有两个熔解曲线峰，其分别是c.2795C>T突变型阳控品(PC-2333-W)的峰，Tm值为55.0℃，及c.2755C>G突变型阳控品(PC-3809-W)的Tm值为64.3℃。
第一例样本的检测结果如图11所示，HEX通道有两个熔解曲线峰，第一个峰的Tm值为61.0℃，第二个峰的Tm值为66.9℃。参照图7，这两个峰分别位于c.2333G>T野生型的判定区间60.8-0.5≤60.8≤60.8+0.5与c.3809A>G野生型的判定区间67.0-0.5≤67.0≤67.0+0.5，根据判定方法，样本的检测结果可以直接读取为c.2333G>T野生型、c.3809A>G野生型，不需要进一步分析计算。且此结果与测序峰图(图15，16)结果一致：如图15所示，测序的结果为野生型的碱基G；如图16所示，测序的结果为野生型的碱基A。如图12所示，ROX通道有三个熔解曲线峰，第一个峰的Tm值为55.0℃，第二个峰的Tm值为61.0℃，第三个峰的Tm值为70.8℃。参照图9与10，这三个峰分别位于c.2975C>T野生型的判定区间60.6-0.5≤60.6≤60.6+0.5、c.2975C>T突变型的判定区间55.0-0.5≤55.0≤55.0+0.5、c.2755C>G野生型的判定区间71.0-0.5≤71.0≤71.0+0.5，根据判定方法，样本的检测结果可以直接读取为c.2975C>T杂合突变型、c.2755C>G野生型，不需要进一步分析计算。且此结果与测序峰图(图17，18)结果一致：如图17所示，测序的结果为双峰，即杂合型的碱基C与T；如图18所示，测序的结果为野生型的碱基C。
第二例样本的检测结果如图13所示，HEX通道有两个熔解曲线峰，第一个峰的Tm值为55.6℃，第二个峰的Tm值为67.2℃。参照图7与8，这两个峰分别位于c.2333G>T突变型的判定区间55.1-0.5≤55.1≤55.1+0.5与c.3809A>G野生型的判定区间67.0-0.5≤67.0≤67.0+0.5，根据判定方法，样本的检测结果可以直接读取为c.2333G>T纯合突变型、c.3809A>G野生型，不需要进一步分析计算。且此结果与测序峰图(图19，20)结果一致：如图19所示，测序的结果为突变型的碱基T；如图20所示，测序的结果为野生型的碱基A。如图14所示，ROX通道有两个熔解曲线峰，第一个峰的Tm值为61.0℃，第二个峰的Tm值为71.5℃。参照图9，这两峰分别位于c.2975C>T野生型的判定区间60.6-0.5≤60.6≤60.6+0.5与c.2755C>G野生型的判定区间71.0-0.5≤71.0≤71.0+0.5，根据判定方法，样本的检测结果可以直接读取为c.2975C>T野生型、c.2755C>G野生型，不需要进一步分析计算。且此结果与测序峰图(图21，22)结果一致：如图21所示，测序的结果为野生型的碱基C；如图22所示，测序的结果为野生型的碱基C。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 北京宏微特斯生物科技有限公司
<120> 点突变的基因型检测的方法及其试剂盒
<130> 0725
<160> 31
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agccctgtga cattcttcg 19
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcagaggaa gtgagatttg ttta 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tctttgcaga ggtgctgcct 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cctcgatggc cacatccgt 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agaaccccaa caagcacatc t 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgctacaggc tgaccttgt 19
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tcataggttg taatttccca tgg 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cttacaggaa agtatctctg a 21
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgccctgggc cggtggctgg aacactt 27
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atggggtcaa tgactccccg gcc 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gccacgccca cggctgtcat ggt 23
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agcagctggc tgaccggttt agtggat 27
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
agtggcttcc ccagtgtgac atg 23
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccgtggtggt gaagctgta 19
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tcgtgatgga ctccggtgac ggggtc 26
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gccctgggcc tgtggctgga a 21
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ttccagccac aggcccaggg ca 22
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gccttcactg tccttgtctt 20
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
aatacacctg aatgatggtt tta 23
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ggctggccac gctcacggct gtcat 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cccaccatga cagccgtgag cgtgg 25
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
actctgctcc tgtaatgcct 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tggctactct gttgctactg tt 22
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gcagctggct gacgggttta gtggat 26
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
atccactaaa cccgtcagcc agctgc 26
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ttgtttcatg ttccctcagg 20
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tgactgttta tcctactctg gct 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gggtcagtga ctccccggcc ttg 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cggggagtca tcgaccccat ccc 23
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
acttgaggtt tctgctgcta 20
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ttcggacagt cctcttgg 18

Claims (10)

1.点突变的基因型检测的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒是利用荧光定量PCR的荧光探针熔解曲线直接进行点突变的基因型检测；和
所述试剂盒包括：针对待检测样本的每个点突变位点进行不对称PCR扩增的一对上下游引物，所述上下游引物用于扩增含有待测点突变位点的检测序列，所述上下游引物自身不包含待检测的点突变位点，而只是使含有所述点突变位点的检测序列得到扩增；
针对待检测样本的每个点突变位点设计的一条Taqman探针，所述探针的5’末端进行荧光报告基团标记，3’末端进行荧光猝灭基团标记，所述探针在所述点突变位点的位置只与所述点突变位点的野生型模板或者突变型模板中的一种完全匹配，与另外一种形成碱基错配，当它分别与野生型或者突变型的检测序列相结合时，有不同的Tm值；和
针对待检测样本的每个点突变位点的阳性质控品，所述阳性质控品是所述点突变位点的野生型标准质粒与突变型标准质粒。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述点突变位点的野生型标准质粒与突变型标准质粒是将针对每个点突变位点分别PCR扩增出野生型的片段及突变型的片段后分别插入到相同质粒载体中进行构建；并且所述野生型的片段和突变型的片段的长度都长于所述检测序列的长度。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：根据待检测样本的每个点突变位点的实验Tm值TmE与出现的熔解曲线峰的个数，以及相应点突变位点的阳性质控品的野生型Tm值TmP1和突变型Tm值TmP2，进行每个点突变位点的基因型的判读：
a.若出现单峰，且TmP1-0.5℃≤TmE≤TmP1+0.5℃，判定为野生型；若TmP2-0.5℃≤TmE≤TmP2+0.5℃，判定为纯合突变型；
b.若出现双峰，且两个峰各自在TmP1-0.5℃≤TmE≤TmP1+0.5℃与TmP2-0.5℃≤TmE≤TmP2+0.5℃范围内，判定为杂合突变型。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增所述PCR反应内参的上下游引物和相应的反应内参检测探针；和/或所述PCR反应的阴性对照。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是用于检测威尔森氏综合症相关基因ATP7B的c.2333G>T、c.3809A>G、c.2975C>T与c.2755C>G四个点突变位点的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：检测c.2333G>T点突变位点的上下游引物和探针分别是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9；
检测c.3809A>G点突变位点的上下游引物和探针分别是SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:10；
检测c.2975C>T点突变位点的上下游引物和探针分别是SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:11；和
检测c.2755C>G点突变位点的上下游引物和探针分别是SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12。
7.点突变的基因型检测的方法，其特征在于：
所述方法是利用荧光定量PCR的荧光探针熔解曲线直接进行点突变的基因型检测；和
所述方法包括以下步骤：
针对待检测样本的每个点突变位点进行实时荧光定量PCR扩增：扩增时使用针对待检测样本的每个点突变位点进行不对称PCR扩增的一对上下游引物，所述上下游引物用于扩增含有待测点突变位点的检测序列，所述上下游引物自身不包含待检测的点突变位点，而只是使含有所述点突变位点的检测序列得到扩增；扩增时使用针对待检测样本的每个点突变位点设计的一条Taqman探针，所述探针的5’末端进行荧光报告基团标记，3’末端进行荧光猝灭基团标记，所述探针在所述点突变位点位置只与所述点突变位点的野生型模板或者突变型模板中的一种完全匹配，当它分别与野生型或者突变型的检测序列相结合时，有不同的Tm值；和扩增时使用针对待检测样本的每个点突变位点的阳性质控品，所述阳性质控品是所述点突变位点的野生型标准质粒与突变型标准质粒；和
根据待检测样本的每个点突变位点的实验Tm值TmE与出现的熔解曲线峰的个数，以及相应点突变位点的阳性质控品的野生型Tm值TmP1和突变型Tm值TmP2进行每个点突变位点的基因型的判读：
a.若出现单峰，且TmP1-0.5℃≤TmE≤TmP1+0.5℃，判定为野生型；若TmP2-0.5℃≤TmE≤TmP2+0.5℃，判定为突变纯合型；
b.若出现双峰，且两个峰各自在TmP1-0.5℃≤TmE≤TmP1+0.5℃与TmP2-0.5℃≤TmE≤TmP2+0.5℃范围内，判定为杂合突变型。
8.根据权利要求7所述的基因型检测的方法，其特征在于：在针对待检测样本的每个点突变位点进行实时荧光定量PCR扩增过程中，所述点突变位点进行不对称PCR扩增与所述阳性质控品的扩增是不在同一PCR扩增管中进行。
9.根据权利要求8所述的基因型检测的方法，其特征在于：所述待检测样本在一个反应管内可以进行多个突变位点的检测，和所有所述阳性质控品的扩增是在另一单管中进行，或者野生型阳性质控品与突变型阳性质控品分两个反应管进行。
10.根据权利要求9所述的基因型检测的方法，其特征在于：当进行PCR产物荧光检测时，每个点突变位点和其阳性质控品的检测是在同一检测通道中；和不同的点突变位点和其阳性质控品的检测是在不同的检测通道中或者是同一通道内的不同Tm值处进行。
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