CN112029835A - 检测pik3ca基因突变的核酸组合物及其试剂盒和检测方法 - Google Patents

检测pik3ca基因突变的核酸组合物及其试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测PIK3CA基因突变的核酸组合物及其试剂盒和检测方法。该核酸组合物包括：序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的第一引物对和序列如SEQ ID No.3所示的第一探针。上述核酸组合物对PIK3CA基因突变的检测灵敏度较高。

Description

检测PIK3CA基因突变的核酸组合物及其试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种检测PIK3CA基因突变的核酸组合物及其试剂盒和检测方法。
背景技术
PIK3CA基因定位于3q26.3，长34kb，包含21个外显子，编码1068种氨基酸，该组氨基酸产生一组长124kD的蛋白。PIK3CA编码I类磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylino-sitol 3-kinases，PI3Ks)的p110催化亚单位，即PI3Kp110a。
目前，PIK3CA基因突变检测的主要方法有以下几种：1)Sanger测序法；直接测序法一直以来是基因突变检测的金标准，但是测序法存在很多缺点，比如耗时长，后续要对PCR产物进行处理，程序复杂，容易出现污染导致结果不准确。另外，测序法的灵敏度低，特别是在混合模板时检出率低，一般需要突变丰度达到20％以上才能准确检测。2)高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)是通过饱和燃料结合于PCR扩增产物监控其形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，其敏感性在5％左右。3)扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)是根据引物3’端末位碱基必须与其模板DNA链互补才能进行有效的扩增。基于此，设计针对基因突变位点的引物序列，可以检测突变基因，该检测方法的灵敏度在1％左右。这些方法的检测灵敏度较低，不能满足实际需求。
发明内容
基于此，有必提供一种灵敏度较高的检测PIK3CA基因突变的核酸组合物。
此外，还有必要提供一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒和PIK3CA基因突变的检测方法。
一种检测PIK3CA基因突变的核酸组合物，包括：
序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的第一引物对和序列如SEQ ID No.3所示的第一探针，所述第一引物对和所述第一探针用于检测PIK3CA基因的第9号外显子的E542K突变；
及/或，序列如SEQ ID No.4及SEQ ID No.5所示的第二引物对和序列如SEQ IDNo.6所示的第二探针，所述第二引物对和所述第二探针用于检测PIK3CA基因的第9号外显子的E545K突变；
及/或，序列如SEQ ID No.7及SEQ ID No.8所示的第三引物对和序列如SEQ IDNo.9所示的第三探针，所述第三引物对和所述第三探针用于检测PIK3CA基因的第9号外显子的E545D突变；
及/或，序列如SEQ ID No.10及SEQ ID No.11所示的第四引物对和序列如SEQ IDNo.12所示的第四探针，所述第四引物对和所述第四探针用于检测PIK3CA基因的第20号外显子的H1047L突变；
及/或，序列如SEQ ID No.13及SEQ ID No.14所示的第五引物对和序列如SEQ IDNo.12所示的第四探针，所述第五引物对和所述第四探针用于检测PIK3CA基因的第20号外显子的H1047R突变。
上述核酸组合物对PIK3CA基因的第9号外显子的E542K突变、第9号外显子的E545K突变、第9号外显子的E545D突变、第20号外显子的H1047L突变及第20号外显子的H1047R突变中的至少一种具有较高的特异性，能够分别检测PIK3CA基因的上述五种突变中的至少一种，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的PIK3CA基因的第9号外显子的E542K突变、第9号外显子的E545K突变、第9号外显子的E545D突变、第20号外显子的H1047L突变及第20号外显子的H1047R突变中的一种，灵敏度较高。
其中一个实施例中，还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。
其中一个实施例中，所述内控基因为RPPH基因，所述内控引物对的序列如SEQ IDNo.15及SEQ ID No.16所示，所述内控探针的序列如SEQ ID No.17所示。
其中一个实施例中，所述内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基因和内控荧光淬灭基团；
所述检测PIK3CA基因突变的核酸组合物中含有所述第一探针时，所述第一探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基因与所述内控荧光报告基因不同；
所述检测PIK3CA基因突变的核酸组合物中含有所述第二探针时，所述第二探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第二荧光报告基因与所述内控荧光报告基因不同；
所述检测PIK3CA基因突变的核酸组合物中含有所述第三探针时，所述第三探针的两端分别连接有第三荧光报告基团和第三荧光淬灭基团，所述第三荧光报告基因与所述内控荧光报告基因不同；
所述检测PIK3CA基因突变的核酸组合物中含有所述第四探针时，所述第四探针的两端分别连接有第四荧光报告基团和第四荧光淬灭基团，所述第四荧光报告基因与所述内控荧光报告基因不同。
一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒，包括上述检测PIK3CA基因突变的核酸组合物。
其中一个实施例中，所述检测PIK3CA基因突变的核酸组合物还包括质控引物对和质控探针。
其中一个实施例中，所述质控引物对的序列如SEQ ID No.18及SEQ ID No.19所示，所述质控探针的序列如SEQ ID No.20所示。
其中一个实施例中，还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
一种PIK3CA基因突变的检测方法，包括如下步骤：
向待测样品中加入上述检测PIK3CA基因突变的核酸组合物进行PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析。
其中一个实施例中，检测所述E542K突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的所述第一引物对中的正向引物，1μM的所述第一引物对中的反向引物，0.25μM的所述第一探针。
其中一个实施例中，检测所述E545K突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的所述第二引物对中的正向引物，1μM的所述第二引物对中的反向引物，0.25μM的所述第二探针。
其中一个实施例中，检测所述E545D突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的所述第三引物对中的正向引物，1μM的所述第三引物对中的反向引物，0.25μM的所述第三探针。
其中一个实施例中，检测所述H1047L突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的所述第四引物对中的正向引物，1μM的所述第四引物对中的反向引物，0.25μM的所述第四探针。
其中一个实施例中，检测所述H1047R突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的所述第五引物对中的正向引物，1μM的所述第五引物对中的反向引物，0.25μM的所述第四探针。
其中一个实施例中，所述检测PIK3CA基因突变的核酸组合物还包括质控引物对和质控探针，所述质控反应体系为：4mM的MgCl2，10mM的Tris，50mM的KCl，200mg/L的BSA，0.1mM的dNTPs，1.125U的rtaq酶，0.3μM的所述质控引物对中的正向引物，0.3μM的所述质控引物对中的反向引物，0.225μM的所述质控探针。
附图说明
图1为E524K突变位点检测限测试图；
图2为E545K突变位点检测限测试图；
图3为E545D突变位点检测限测试图；
图4为H047L突变位点检测限测试图；
图5为H047R突变位点检测限测试图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本研究第一实施方式提供一种检测PIK3CA基因突变的核酸组合物，能够检测PIK3CA基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测PIK3CA基因突变的核酸组合物包括序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的第一引物对和序列如SEQ ID No.3所示的第一探针，第一引物对和第一探针用于检测PIK3CA基因的第9号外显子的E542K突变。
上述核酸组合物对PIK3CA基因的第9号外显子的E542K突变具有较高的特异性，能够检测PIK3CA基因的第9号外显子的E542K突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的PIK3CA基因的第9号外显子的E542K突变，灵敏度较高。
具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为：TTCTACACGAGATCCTCTCT。如SEQ ID No.2所示的序列为：TTAGCACTTACCTGTGACT。如SEQ ID No.3所示的序列为：CCCTCTCTCTGAAATCACTGAGGG。其中，如SEQ ID No.1所示的序列为正向引物。如SEQ ID No.2所示的序列为反向引物。
第一探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团。进一步地，第一荧光报告基因选自TXR、HEX及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，第一荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第一荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，利用特异性ARMS引物扩增PIK3CA基因常见的突变型，同时荧光探针抑制野生型基因的扩增，起到了富集突变模板的作用，从而提高突变基因的检测灵敏度；另一方面对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。样品中有突变基因，则会出现熔解峰；若没有突变基因，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对PIK3CA基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为RPPH基因，即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.15及SEQ ID No.16所示。内控探针的序列如SEQ ID No.17所示。
具体地，如SEQ ID No.15所示的序列为：GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.16所示的序列为：ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.17所示的序列为：AGCTTGGAACAGACTCACGGCGCT。其中，如SEQ ID No.15所示的序列为正向引物，如SEQ IDNo.16所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第一荧光报告基团不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测PIK3CA基因突变的核酸组合物能够用于检测PIK3CA基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第二实施方式提供一种检测PIK3CA基因突变的核酸组合物，能够检测PIK3CA基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测PIK3CA基因突变的核酸组合物包括：序列如SEQ ID No.4及SEQ ID No.5所示的第二引物对和序列如SEQ ID No.6所示的第二探针，第二引物对和第二探针用于检测PIK3CA基因的第9号外显子的E545K突变。
上述核酸组合物对PIK3CA基因的第9号外显子的E545K突变具有较高的特异性，能够检测PIK3CA基因的第9号外显子的E545K突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的PIK3CA基因的第9号外显子的E545K突变，灵敏度较高。
具体地，如SEQ ID No.4所示的序列为：CGAGATCCTCTCTCTGAAATCAA。如SEQ IDNo.5所示的序列为：TCCATTTTAGCACTTACCTGTG。如SEQ ID No.6所示的序列为：CAATCTCTGAAATCACTGAGCAGGAGAATTG。其中，如SEQ ID No.4所示的序列为正向引物。如SEQID No.5所示的序列为反向引物。
第二探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团。进一步地，第二荧光报告基因选自TXR、HEX及FAM中的一种。第二荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第二荧光报告基因为FAM。第二荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，第二荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第二荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，利用特异性ARMS引物扩增PIK3CA基因常见的突变型，同时荧光探针抑制野生型基因的扩增，起到了富集突变模板的作用，从而提高突变基因的检测灵敏度；另一方面对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。样品中有突变基因，则会出现熔解峰；若没有突变基因，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对PIK3CA基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为RPPH基因，即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.15及SEQ ID No.16所示。内控探针的序列如SEQ ID No.17所示。
具体地，如SEQ ID No.15所示的序列为：GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.16所示的序列为：ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.17所示的序列为：AGCTTGGAACAGACTCACGGCGCT。其中，如SEQ ID No.15所示的序列为正向引物，如SEQ IDNo.16所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第二荧光报告基团不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测PIK3CA基因突变的核酸组合物能够用于检测PIK3CA基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第三实施方式提供一种检测PIK3CA基因突变的核酸组合物，能够检测PIK3CA基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测PIK3CA基因突变的核酸组合物包括：序列如SEQ ID No.7及SEQ ID No.8所示的第三引物对和序列如SEQ ID No.9所示的第三探针，第三引物对和第三探针用于检测PIK3CA基因的第9号外显子的E545D突变。
上述核酸组合物对PIK3CA基因的第9号外显子的E545D突变具有较高的特异性，能够检测PIK3CA基因的第9号外显子的E545D突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的PIK3CA基因的第9号外显子的E545D突变，灵敏度较高。
具体地，如SEQ ID No.7所示的序列为：CCTCTCTCTGAAATCACTGA。如SEQ ID No.8所示的序列为：GAATCTCCATTTTAGCACTTACCT。如SEQ ID No.9所示的序列为：CAATCTGAAATCACTGAGCAGGAGAATTG。其中，如SEQ ID No.7所示的序列为正向引物。如SEQ IDNo.8所示的序列为反向引物。
第三探针的两端分别连接有第三荧光报告基团和第三荧光淬灭基团。进一步地，第三荧光报告基因选自TXR、HEX及FAM中的一种。第三荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第三荧光报告基因为FAM。第三荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，第三荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第三荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，利用特异性ARMS引物扩增PIK3CA基因常见的突变型，同时荧光探针抑制野生型基因的扩增，起到了富集突变模板的作用，从而提高突变基因的检测灵敏度；另一方面对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。样品中有突变基因，则会出现熔解峰；若没有突变基因，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对PIK3CA基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为RPPH基因，即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.15及SEQ ID No.16所示。内控探针的序列如SEQ ID No.17所示。
具体地，如SEQ ID No.15所示的序列为：GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.16所示的序列为：ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.17所示的序列为：AGCTTGGAACAGACTCACGGCGCT。其中，如SEQ ID No.15所示的序列为正向引物，如SEQ IDNo.16所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第三荧光报告基团不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测PIK3CA基因突变的核酸组合物能够用于检测PIK3CA基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第四实施方式提供一种检测PIK3CA基因突变的核酸组合物，能够检测PIK3CA基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测PIK3CA基因突变的核酸组合物包括：序列如SEQ ID No.10及SEQ ID No.11所示的第四引物对和序列如SEQ ID No.12所示的第四探针，第四引物对和第四探针用于检测PIK3CA基因的第20号外显子的H1047L突变。
上述核酸组合物对PIK3CA基因的第20号外显子的H1047L突变具有较高的特异性，能够检测PIK3CA基因的第20号外显子的H1047L突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的PIK3CA基因的第20号外显子的H1047L突变，灵敏度较高。
具体地，如SEQ ID No.10所示的序列为：TGTTGTCCAGCCACCATG。如SEQ ID No.11所示的序列为：ATTCGAAAGACCCTAGCCT。如SEQ ID No.12所示的序列为：CCCAGCCACCATGATGTGCATCAGGG。其中，如SEQ ID No.10所示的序列为正向引物。如SEQ IDNo.11所示的序列为反向引物。
第四探针的两端分别连接有第四荧光报告基团和第四荧光淬灭基团。进一步地，第四荧光报告基因选自TXR、HEX及FAM中的一种。第四荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第四荧光报告基因为FAM。第四荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，第四荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第四荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，利用特异性ARMS引物扩增PIK3CA基因常见的突变型，同时荧光探针抑制野生型基因的扩增，起到了富集突变模板的作用，从而提高突变基因的检测灵敏度；另一方面对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。样品中有突变基因，则会出现熔解峰；若没有突变基因，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对PIK3CA基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为RPPH基因，即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.15及SEQ ID No.16所示。内控探针的序列如SEQ ID No.17所示。
具体地，如SEQ ID No.15所示的序列为：GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.16所示的序列为：ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.17所示的序列为：AGCTTGGAACAGACTCACGGCGCT。其中，如SEQ ID No.15所示的序列为正向引物，如SEQ IDNo.16所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第四荧光报告基团不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测PIK3CA基因突变的核酸组合物能够用于检测PIK3CA基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第五实施方式提供一种检测PIK3CA基因突变的核酸组合物，能够检测PIK3CA基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测PIK3CA基因突变的核酸组合物包括：序列如SEQ ID No.13及SEQ ID No.14所示的第五引物对和序列如SEQ ID No.12所示的第四探针，第五引物对和第四探针用于检测PIK3CA基因的第20号外显子的H1047R突变。
上述核酸组合物对PIK3CA基因的第20号外显子的H1047R突变具有较高的特异性，能够检测PIK3CA基因的第20号外显子的H1047R突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的PIK3CA基因的第20号外显子的H1047R突变，灵敏度较高。
具体地，如SEQ ID No.13所示的序列为：TGTTGTCCAGCCACCAT。如SEQ ID No.14所示的序列为：GACATTGCATACATTCGAAA。如SEQ ID No.12所示的序列为：CCCAGCCACCATGATGTGCATCAGGG。其中，如SEQ ID No.13所示的序列为正向引物。如SEQ IDNo.14所示的序列为反向引物。
第四探针的两端分别连接有第四荧光报告基团和第四荧光淬灭基团。进一步地，第四荧光报告基因选自TXR、HEX及FAM中的一种。第四荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第四荧光报告基因为FAM。第四荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，第四荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第四荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，利用特异性ARMS引物扩增PIK3CA基因常见的突变型，同时荧光探针抑制野生型基因的扩增，起到了富集突变模板的作用，从而提高突变基因的检测灵敏度；另一方面对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。样品中有突变基因，则会出现熔解峰；若没有突变基因，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对PIK3CA基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为RPPH基因，即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.15及SEQ ID No.16所示。内控探针的序列如SEQ ID No.17所示。
具体地，如SEQ ID No.15所示的序列为：GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.16所示的序列为：ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.17所示的序列为：AGCTTGGAACAGACTCACGGCGCT。其中，如SEQ ID No.15所示的序列为正向引物，如SEQ IDNo.16所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第四荧光报告基团不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测PIK3CA基因突变的核酸组合物能够用于检测PIK3CA基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究一实施方式还提供一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒，包括上述各实施方式的检测PIK3CA基因突变的核酸组合物中的至少一种。该检测PIK3CA基因突变的试剂盒能够较为准确检测PIK3CA基因突变，检测灵敏度较高。
进一步地，检测PIK3CA基因突变的试剂盒还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
其中，酶混合液例如可以包括酶Ⅰ混合液和酶Ⅱ混合液。酶Ⅰ混合液为不具有5’端到3’端外切酶活性的Taq酶和抗体等混合物。酶Ⅱ混合液为5’端到3’端外切酶活性和抗体等混合物。
检测PIK3CA基因突变的核酸组合物还包括：还包括质控引物对和质控探针。此种设置能够提高检测准确性。
进一步地，质控引物对的序列如SEQ ID No.18及SEQ ID No.19所示，质控探针的序列如SEQ ID No.20所示。
具体地，SEQ ID No.18所示的序列为：GCTAGAGACAATGAATTAAGGGAAAAT。SEQ IDNo.19所示的序列为：CCTGTGACTCCATAGAAAATCTTTCTC。SEQ ID No.20所示的序列为：CAGCTCAAAGCAATTTCTACACGAGCTC。其中，SEQ ID No.18所示的引物为正向引物。SEQ IDNo.19所示的引物为反向引物。
质控探针的两端分别连接有质控荧光报告基团和质控荧光淬灭基团。进一步地，质控荧光报告基因选自CY5及FAM中的一种。质控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，质控荧光报告基因为FAM。质控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，质控荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，质控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测PIK3CA基因突变的试剂盒本研究的检测PIK3CA基因突变的试剂盒结合了ARMS引物、分子信标探针和探针熔解曲线等技术，能够用于检测PIK3CA基因上第9外显子和第20外显子上的5种热点突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；用质控管对样品DNA质量进行监控，能够适用于血浆或者FFPE样本的检测，尤其适用于检测靶序列含量低的样本。
本研究一实施方式还提供一种PIK3CA基因突变的检测方法，检测灵敏度较低，能够用于PIK3CA基因突变的非疾病的治疗和诊断的检测，例如用于PIK3CA基因突变的实验性研究。
具体地，向待测样品中加入上述各实施方式的检测PIK3CA基因突变的核酸组合物中的至少一种进行PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析。
其中一个实施例中，检测E542K突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的第一引物对中的正向引物，1μM的第一引物对中的反向引物，0.25μM的第一探针。进一步地，检测E542K突变的反应体系还包括：0.05μM的内控引物对中的正向引物，0.5μM的内控引物对中的反向引物，0.1μM的内控探针。
其中一个实施例中，检测E545K突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的第二引物对中的正向引物，1μM的第二引物对中的反向引物，0.25μM的第二探针。进一步地，检测E545K突变的反应体系还包括：0.05μM的内控引物对中的正向引物，0.5μM的内控引物对中的反向引物，0.1μM的内控探针。
其中一个实施例中，检测E545D突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的第三引物对中的正向引物，1μM的第三引物对中的反向引物，0.25μM的第三探针。进一步地，检测E545D突变的反应体系还包括：0.05μM的内控引物对中的正向引物，0.5μM的内控引物对中的反向引物，0.1μM的内控探针。
其中一个实施例中，检测H1047L突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的第四引物对中的正向引物，1μM的第四引物对中的反向引物，0.25μM的第四探针。进一步地，检测H1047L突变的反应体系还包括：0.05μM的内控引物对中的正向引物，0.5μM的内控引物对中的反向引物，0.1μM的内控探针。
其中一个实施例中，检测H1047R突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的第五引物对中的正向引物，1μM的第五引物对中的反向引物，0.25μM的第四探针。进一步地，检测H1047R突变的反应体系还包括：0.05μM的内控引物对中的正向引物，0.5μM的内控引物对中的反向引物，0.1μM的内控探针。
其中一个实施例中，所述PIK3CA基因突变的核酸组合物还包括质控引物对和质控探针，所述质控反应体系为：4mM的MgCl2，10mM的Tris，50mM的KCl，200mg/L的BSA，0.1mM的dNTPs，1.125U的rtaq酶，0.3μM的质控引物对中的正向引物，0.3μM的质控引物对中的反向引物，0.225μM的质控探针。
本研究的PIK3CA基因突变的检测方法能够非疾病的治疗和诊断的检测PIK3CA基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
提供一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒。
该试剂盒包括：
检测PIK3CA基因突变的核酸组合物(如表1和表2所示)、dNTPs、PCR反应液、酶混合液、阳性对照品和空白对照品。
其中，酶混合液包括酶Ⅰ混合液和酶Ⅱ混合液。酶Ⅰ混合液为不具有5’端到3’端外切酶活性的Taq酶和抗体等混合物。酶Ⅱ混合液为5’端到3’端外切酶活性和抗体等混合物。其中，Taq酶购于TAKARA生物公司和广州百旺生物技术有限公司，抗体购于TOYOBO公司。
阳性对照品为人类PIK3CA基因E542K阳性质粒、E545K阳性质粒、E545D阳性质粒、H1047L阳性质粒、H1047R阳性质粒和野生型人类基因组DNA的混合物。
空白对照品为超纯水。
检测E542K突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的1624A-F4，1μM的1624A-R3，0.25μM的1624-P，0.05μM的Rpph-F5，0.5μM的Rpph-R2，0.1μM的Rpph-P。
检测E545K突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的1633-1F，1μM的1633-R3，0.25μM的1633-P，0.05μM的Rpph-F5，0.5μM的Rpph-R2，0.1μM的Rpph-P。
检测E545D突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的1635-6F，1μM的1635-T-Y-R4，0.25μM的1635-P，0.05μM的Rpph-F5，0.5μM的Rpph-R2，0.1μM的Rpph-P。
检测H1047L突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的3140T-F1，1μM的3140T-R2，0.25μM的3140-P，0.05μM的Rpph-F5，0.5μM的Rpph-R2，0.1μM的Rpph-P。
检测H1047R突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的3140G-3F，1μM的3140G-Y-R3，0.25μM的3140-P，0.05μM的Rpph-F5，0.5μM的Rpph-R2，0.1μM的Rpph-P。
PIK3CA基因突变的核酸组合物还包括质控引物对和质控探针，所述质控反应体系为：4mM的MgCl2，10mM的Tris，50mM的KCl，200mg/L的BSA，0.1mM的dNTPs，1.125U的rtaq酶，0.3μM的9-1F，0.3μM的9-1R，0.225μM的9-P。
表1 人类PIK3CA基因5种热点体细胞突变
突变名称 氨基酸变化 碱基变化 Cosmic ID
H1047R 组氨酸>精氨酸 CAT>CGT 775
H1047L 组氨酸>亮氨酸 CAT>CTT 776
E542K 谷氨酸>赖氨酸 GAA>AAA 760
E545K 谷氨酸>赖氨酸 GAG>AAG 763
E545D 谷氨酸>天冬氨酸 GAG>GAT 765
表2 检测PIK3CA基因突变的核酸组合物
Figure BDA0002721219580000211
Figure BDA0002721219580000221
实施例2
采用实施例1的检测PIK3CA基因突变的试剂盒的检测限
取人类PIK3CA基因野生型基因组，人PIK3CA基因各突变型质粒及TE buffer缓冲液，制备同时含有5ng/μL的人PIK3CA野生型DNA及含量分别为野生型的10％、1％和0.1％的人PIK3CA各突变型基因质粒，记录阳性检出率。
具体实施步骤如下：
1、待测样本的提取
组织样本使用QIAGEN的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit进行提取，血浆样本使用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid进行提取。提取过程应严格按照说明书要求进行。组织样本提取后的核酸稀释浓度2～100ng/μL，血浆提取后的核酸浓度应不少于2ng/μL，纯度都应满足A260/A280比值范围在1.6～2.3之间。模版可直接用于后续实验或置于-20℃冰箱备用，避免反复冻融。
2、试剂配置
(1)根据所测的待检样本的基因组DNA浓度，用纯化水进行稀释至推荐的浓度为5ng/μL，放置冰上待用。
(2)根据检测样品数量及实验设计，取对应检测需要的8联管、PIK3CA质控PCR反应液、酶Ⅰ混合液、酶Ⅱ混合液、PIK3CA阳性对照、超纯水一起放置冰上或4℃冰箱里。
(3)将8联管、PIK3CA阳性对照及样本混匀后微离心，放置冰上；DNA聚合酶和纯化水微离心后置冰上；按照下表3和表4的反应体系进行配置，每个样品、阳性对照及NTC各配制一个混合液mix A和一个混合液mix B。
表3 mix A的配液组份表
Figure BDA0002721219580000231
表4 mix B配液组份表
Figure BDA0002721219580000241
(4)轻取8联管，固定在加样板上，不得剧烈晃动，并轻轻揭开8联管管盖，将混合液mix B加入8联管中第6孔中，每孔加入16μl，将混合液mix A分别加入对应的8联管中1-5号，每孔加入5μL；在联管中6号中加入4μL的样本，然后小心盖上8联管管盖；加样完成的8联管轻轻混匀后微离心。
(5)将8联管放入PCR仪器中，按照加样布局排列，推荐排列布局详见表5。
表5 PCR仪96孔板建议布局
Figure BDA0002721219580000242
(6)PCR扩增荧光检测(PCR扩增区)
将各反应管按照一定顺序放入荧光定量PCR仪上，按照表6设置反应程序，进行反应。
表6 PCR扩增反应程序
Figure BDA0002721219580000251
备注：荧光通道选择FAM，HEX检测通道。
3、检测结果的解释
(1)试剂盒有效性情况判断：
a)空白对照在熔解分析后，FAM通道和HEX通道无明显熔解峰；若分析后出现明显熔解峰，可能为试剂受到污染或操作过程中污染，请排除污染源后重新检测。
b)阳性对照管在熔解曲线分析后，FAM通道和HEX通道出现单独熔解峰，FAM通道的熔解曲线Tm值在(58℃～65℃)范围内，HEX通道的熔解曲线Tm值在72±1℃范围内。
(2)样本有效性的判断：
a)质控PCR反应液：FAM通道Ct值≥26.0，说明所加入的样本基因组DNA含量过低，只有突变DNA含量较高的样本可以检测出突变类型，也可能为DNA样本中存在着PCR抑制剂，建议重新制备样本或者增加使用量进行检测。
b)质控PCR反应液：FAM通道23≤Ct值<26，说明所加入的样本基因组DNA量适中。
c)质控PCR反应液：FAM通道Ct值<23，说明所加入样本基因组DNA过量，建议稀释后重新检测。
d)质控PCR反应液管用于判断样本的有效性，通过扩增曲线判定样本的情况。
(3)检测结果的判定：若满足1和2要求，表明此时检测成功，对样本管进行分析。样本分析的标准结合下表7进行判断分析。
表7 结果判断
Figure BDA0002721219580000261
检测结果详见图1～图5。图1为E524K突变位点检测限测试图。图2为E545K突变位点检测限测试图。图3为E545D突变位点检测限测试图。图4为H047L突变位点检测限测试图。图5为H047R突变位点检测限测试图。图1～图5中，横坐标为温度，单位为℃，纵坐标的“-dF/dT”表示荧光强度的变化对温度变化的求导。
从图1～图5可以看出，上述检测PIK3CA基因突变的试剂盒，能够检测出5ng野生型背景下突变比例为0.1％的上述5种PIK3CA基因突变，检测灵敏度和特异性较高。
本研究的检测PIK3CA基因突变的试剂盒本研究的检测PIK3CA基因突变的试剂盒结合了ARMS引物、分子信标探针和探针熔解曲线等技术，能够用于检测PIK3CA基因上第9外显子和第20外显子上的5种热点突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；用质控管对样品DNA质量进行监控，能够适用于血浆或者FFPE样本的检测，尤其适用于检测靶序列含量低的样本；7管同时检测，检测效率高，整个过程闭管操作、简便快捷、同时大大降低污染机率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 苏州中科先进技术研究院有限公司
<120> 检测PIK3CA基因突变的核酸组合物及其试剂盒和检测方法
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttctacacga gatcctctct 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttagcactta cctgtgact 19
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccctctctct gaaatcactg aggg 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgagatcctc tctctgaaat caa 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tccattttag cacttacctg tg 22
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caatctctga aatcactgag caggagaatt g 31
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cctctctctg aaatcactga 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaatctccat tttagcactt acct 24
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caatctgaaa tcactgagca ggagaattg 29
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgttgtccag ccaccatg 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
attcgaaaga ccctagcct 19
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccagccacc atgatgtgca tcaggg 26
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgttgtccag ccaccat 17
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gacattgcat acattcgaaa 20
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcggatgcct ccttt 15
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acctcacctc agacattgaa 20
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agcttggaac agactcacgg cgct 24
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gctagagaca atgaattaag ggaaaat 27
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cctgtgactc catagaaaat ctttctc 27
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cagctcaaag caatttctac acgagctc 28

Claims (11)

1.一种检测PIK3CA基因突变的核酸组合物，其特征在于，包括：
序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的第一引物对和序列如SEQ ID No.3所示的第一探针，所述第一引物对和所述第一探针用于检测PIK3CA基因的第9号外显子的E542K突变；
及/或，序列如SEQ ID No.4及SEQ ID No.5所示的第二引物对和序列如SEQ ID No.6所示的第二探针，所述第二引物对和所述第二探针用于检测PIK3CA基因的第9号外显子的E545K突变；
及/或，序列如SEQ ID No.7及SEQ ID No.8所示的第三引物对和序列如SEQ ID No.9所示的第三探针，所述第三引物对和所述第三探针用于检测PIK3CA基因的第9号外显子的E545D突变；
及/或，序列如SEQ ID No.10及SEQ ID No.11所示的第四引物对和序列如SEQ IDNo.12所示的第四探针，所述第四引物对和所述第四探针用于检测PIK3CA基因的第20号外显子的H1047L突变；
及/或，序列如SEQ ID No.13及SEQ ID No.14所示的第五引物对和序列如SEQ IDNo.12所示的第四探针，所述第五引物对和所述第四探针用于检测PIK3CA基因的第20号外显子的H1047R突变。
2.根据权利要求1所述的检测PIK3CA基因突变的核酸组合物，其特征在于，还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。
3.根据权利要求2所述的检测PIK3CA基因突变的核酸组合物，其特征在于，所述内控基因为RPPH基因，所述内控引物对的序列如SEQ ID No.15及SEQ ID No.16所示，所述内控探针的序列如SEQ ID No.17所示。
4.根据权利要求2～3任一项所述的检测PIK3CA基因突变的核酸组合物，其特征在于，所述内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基因和内控荧光淬灭基团；
所述检测PIK3CA基因突变的核酸组合物中含有所述第一探针时，所述第一探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基因与所述内控荧光报告基因不同；
所述检测PIK3CA基因突变的核酸组合物中含有所述第二探针时，所述第二探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第二荧光报告基因与所述内控荧光报告基因不同；
所述检测PIK3CA基因突变的核酸组合物中含有所述第三探针时，所述第三探针的两端分别连接有第三荧光报告基团和第三荧光淬灭基团，所述第三荧光报告基因与所述内控荧光报告基因不同；
所述检测PIK3CA基因突变的核酸组合物中含有所述第四探针时，所述第四探针的两端分别连接有第四荧光报告基团和第四荧光淬灭基团，所述第四荧光报告基因与所述内控荧光报告基因不同。
5.一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的检测PIK3CA基因突变的核酸组合物。
6.根据权利要求5所述的检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述检测PIK3CA基因突变的核酸组合物还包括质控引物对和质控探针。
7.根据权利要求5所述的检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述质控引物对的序列如SEQ ID No.18及SEQ ID No.19所示，所述质控探针的序列如SEQ ID No.20所示。
8.根据权利要求5～7任一项所述的检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
9.一种PIK3CA基因突变的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
向待测样品中加入权利要求1～4任一项所述的检测PIK3CA基因突变的核酸组合物进行PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析。
10.根据权利要求9所述的PIK3CA基因突变的检测方法，其特征在于，检测所述E542K突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的所述第一引物对中的正向引物，1μM的所述第一引物对中的反向引物，0.25μM的所述第一探针；
检测所述E545K突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的所述第二引物对中的正向引物，1μM的所述第二引物对中的反向引物，0.25μM的所述第二探针；
检测所述E545D突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的所述第三引物对中的正向引物，1μM的所述第三引物对中的反向引物，0.25μM的所述第三探针；
检测所述H1047L突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的所述第四引物对中的正向引物，1μM的所述第四引物对中的反向引物，0.25μM的所述第四探针；
检测所述H1047R突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的所述第五引物对中的正向引物，1μM的所述第五引物对中的反向引物，0.25μM的所述第四探针。
11.根据权利要求9～10任一项所述的PIK3CA基因突变的检测方法，其特征在于，所述检测PIK3CA基因突变的核酸组合物还包括质控引物对和质控探针，所述质控反应体系为：4mM的MgCl2，10mM的Tris，50mM的KCl，200mg/L的BSA，0.1mM的dNTPs，1.125U的rtaq酶，0.3μM的所述质控引物对中的正向引物，0.3μM的所述质控引物对中的反向引物，0.225μM的所述质控探针。
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