CN112143788A - 一种鉴定pah基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法 - Google Patents

一种鉴定pah基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112143788A
CN112143788A CN202010945008.0A CN202010945008A CN112143788A CN 112143788 A CN112143788 A CN 112143788A CN 202010945008 A CN202010945008 A CN 202010945008A CN 112143788 A CN112143788 A CN 112143788A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mutation sites
kit
pah gene
mutation
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010945008.0A
Other languages
English (en)
Inventor
龚强
周梅华
代冰
余艳
李慧源
杨瑶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changsha Jinyu Medical Laboratory Co Ltd
Original Assignee
Changsha Jinyu Medical Laboratory Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changsha Jinyu Medical Laboratory Co Ltd filed Critical Changsha Jinyu Medical Laboratory Co Ltd
Priority to CN202010945008.0A priority Critical patent/CN112143788A/zh
Publication of CN112143788A publication Critical patent/CN112143788A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法。所述试剂盒中含有如下引物对：F1：GTGTAAATTACTTACTGTTAATGGAATCAG；R1：CCTCTATTACGTGGCAGAGAGTT；F2：GTGTAAATTACTTACTGTTAATGGAATCAT；R2：CCTCTATTACGTGGCAGAGAGTA；所述两个突变位点为：C.1301C>A、C.1174T>A突变位点。本发明能够鉴定C.1301C>A、C.1174T>A突变位点是在同一条染色体，还是不同的染色体上，工作量小，耗时短，易操作。

Description

一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点(C.1301C>A、C.1174T>A)位置的试剂盒及方法。
背景技术
苯丙氨酸羟化酶(PAH)在苯丙氨酸代谢途径中起重要的作用，当PAH缺乏或者活性减低可导致苯丙氨酸代谢障碍，从而使苯丙氨酸通过其他代谢途径产生苯丙酮酸等有害物质。这些有害的代谢产物达到异常增高的水平后，积蓄于组织、血浆和脑脊液中，并大量从尿中排出，产生苯丙酮尿症(PKU)。PAH基因突变引起经典型PKU，占所有患者的90％左右，本病遗传方式为常染色体隐性遗传，所以对PKU患者进行PAH基因的筛查，能及早的鉴别，诊断，从而达到早发现、早治疗的效果。
不同的PAH基因的突变对PAH活性及结构影响的程度不同。针对于本案中涉及到的两个突变位点，发生在同一条或者不同的染色体上，对患者病情严重程度的影响是不同的。如果两个突变发生在同一条染色体上，则不致病；两个突变分别发生在不同的染色体上，则致病。为了评估疾病的严重程度，鉴定已知的不同的PAH基因突变分布在同一条还是不同染色体上，对疾病的诊断具有决定性作用。现有的方法是提取DNA，构建载体，进行体外表达实验，需要全套的分子生物学及微生物、细胞培养的实验室，难度极大，且工作量大，耗时2-3个月，普通实验室难以实施。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
鉴定PAH基因同时含两个突变位点位置的试剂盒中含有如下引物对：
F1:GTGTAAATTACTTACTGTTAATGGAATCAG(SEQ ID NO.1)
R1:CCTCTATTACGTGGCAGAGAGTT(SEQ ID NO.2)
F2:GTGTAAATTACTTACTGTTAATGGAATCAT(SEQ ID NO.3)
R2:CCTCTATTACGTGGCAGAGAGTA(SEQ ID NO.4)；
所述两个突变位点为：C.1301C>A、C.1174T>A突变位点。
优选地，引物对按如下排列组合使用：
①：F1+R1
②：F1+R2
③：F2+R1
④：F2+R2。
优选地，根据C.1301C>A、C.1174T>A突变分布情况，引物对按如下排列组合使用：
①：当待测样本同时含C.1301C>A、C.1174T>A突变但分布在不同染色体上时：
F1+R2或F2+R1；其中，F1和R1是检测野生型的引物；
②当待测样本同时含C.1301C>A、C.1174T>A突变且分布在同一条染色体上时：
F2+R2。
基于上述试剂盒鉴定同时含C.1301C>A、C.1174T>A突变位点的方法是采用所述试剂盒中的引物对，在如下次序和条件下进行扩增检测：
①：94℃,5min；
②：94℃,30s；55℃,30s；72℃,2min；35Cycles；
③：72℃,7min；25℃,∝；
若扩增后的片段经琼脂糖凝胶电泳出现特异性条带，则表明存在C.1301C>A、C.1174T>A突变位点。
本发明根据PAH基因已知位点C.1301C>A、C.1174T>A突变，设计两组引物，第一组：3′端碱基与正常的模板碱基互补，第二组：3′端碱基与突变的模板碱基互补。基于耐热TaqDNA聚合酶缺乏3′→5′外切校正活性的特点，引物3′端的特异碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相对碱基，若此碱基对形成错配，链延伸反应就会因3′，5′-磷酸二酯键形成障碍而受阻，所以其扩增结果为：野生模板阻碍，突变引物放大；或突变模板阻碍，野生引物放大。
本发明设计了不同的引物对，将提取的模板扩增后进行琼脂糖凝胶电泳从而达到鉴定的目的。本发明能够鉴定C.1301C>A、C.1174T>A突变位点是在同一条染色体，还是不同的染色体上。现有的方法是提取DNA、构建克隆载体、构建克隆载体、体外表达实验，需要全套的分子生物学及微生物、细胞培养的实验室，难度极大，且工作量大，耗时2-3个月，普通实验室难以实施，本发明仅需要引物设计、提取DNA、扩增与跑胶，能够在1天内完成所有试验，工作量小，耗时短，易操作成本极低，且普通分子实验室均可操作。
附图说明
图1为Z、T样本电泳图；
图2为S样本电泳图；
图3为对比引物对电泳图。
具体实施方式
1.DNA提取
选取3个样本，一个野生型，命名为Z，一个同时含C.1301C>A、C.1174T>A突变但分布在不同染色体上的样本，命名为T，另一个同时含C.1301C>A、C.1174T>A突变且分布在同一条染色体上的样本，命名为S。根据试剂QIAamp DNA Blood Mini Kit(250)(凯杰，163030523)说明书提取DNA，保存于-20℃备用。
2.PCR扩增
根据表1所示反应体系进行片段扩增(商用试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司)。
表1反应体系
试剂 体积(μL)
2×Vazyme LAmp Master Mix(商用) 25
ddH2O 13
Primers Mixer(F+R) 8
模板DNA(商用) 4
总体积 50
按照表1配置反应体系，其中，Primers Mixer(F+R)为扩增引物。
本发明设计了两组扩增引物序列，如下表2。其中F1、F2序列3’端是针对位点C.1301C>A野生型和突变型模板，R1、R2序列3’端是针对位点C.1174T>A野生型和突变型模板。表2引物序列按5P浓度1:1F端与R端自由组合，可得4组Primers Mixer(F+R)混合物，如表3。
表2引物序列
Figure BDA0002675010880000031
Figure BDA0002675010880000041
表3Primers Mixer(F+R)引物组合
第1组 F1+R1
第2组 F1+R2
第3组 F2+R1
第4组 F2+R2
所有试剂配制完成后，将每组引物分装成3份，分别加入样本Z、T和S，得12份混合液，按照引物分组命名为Z1-Z4，T1-T4和S1-S4，并按照下列扩增程序进行PCR扩增：
[94℃，5min]；[94℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；35Cycles]；[72℃，7min；25℃,∝]。
3.电泳
①配置凝胶
取1g琼脂糖凝胶(干粉)加入100ul 1X TAE溶液混合。将混合液放入微波炉，设置微波炉“大火-3min”。待冷却后加入5ul DD核酸染料，混匀倒胶待凝固。
②点样
用水稀释到1X loading buffer。取出待测扩增产物，按照产物：(loadingbuffer)＝1:1比例在配置好的胶块上加样。同时在一泳槽内加入DL 2000DNA Marker。
③电泳
设置好电泳仪参数：70V-100min。
4.结果
结果如图1和图2所示，Z样本在第一组引物组合中出现特异性条带，其余组合未出现条带。T样本在第2组，第3组出现了特异性条带，第1组，第4组未出现条带。S样本在第4组引物组合中出现特异性条带，第1、2、3组均未出现。
5.对照
对照组的引物序列如表4，引物组合如表5，其他操作同具体实施方式的1至3。
表4对照引物序列
Figure BDA0002675010880000051
表5Primers Mixer(F+R)对照引物组合
第1组 F1+R1
第2组 F1+R2
第3组 F2+R1
第4组 F2+R2
结果如图3所示，Z样本除了在第一组引物组合中出现特异性条带，在不应该出现条带的其余组合也出现了条带；T样本除了在第2组、第3组出现了特异性条带，在不应该出现条带的第1组，第4组也出现了条带；S样本除了在第4组引物组合中出现特异性条带，在不应该出现条带的第1、2、3组也出现了条带。
序列表
<110> 长沙金域医学检验实验室有限公司
<120> 一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法
<141> 2020-09-10
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> null
<400> 1
gtgtaaatta cttactgtta atggaatcag 30
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> null
<400> 2
cctctattac gtggcagaga gtt 23
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> null
<400> 3
gtgtaaatta cttactgtta atggaatcat 30
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> null
<400> 4
cctctattac gtggcagaga gta 23
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> null
<400> 5
gtgtaaatta cttactgtta atggaatgag 30
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> null
<400> 6
cctctattac gtggcagaga ctt 23
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> null
<400> 7
gtgtaaatta cttactgtta atggaaacat 30
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> null
<400> 8
cctctattac gtggcagaga cta 23

Claims (4)

1.一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点位置的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如下引物对：
F1:GTGTAAATTACTTACTGTTAATGGAATCAG
R1:CCTCTATTACGTGGCAGAGAGTT
F2:GTGTAAATTACTTACTGTTAATGGAATCAT
R2:CCTCTATTACGTGGCAGAGAGTA；
所述两个突变位点为：C.1301C>A、C.1174T>A突变位点。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，引物对按如下排列组合使用：
①：F1+R1
②：F1+R2
③：F2+R1
④：F2+R2。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，根据C.1301C>A、C.1174T>A突变分布情况，引物对按如下排列组合使用：
①当待测样本同时含C.1301C>A、C.1174T>A突变但分布在不同染色体上时：F1+R2或F2+R1；
②当待测样本同时含C.1301C>A、C.1174T>A突变且分布在同一条染色体上时：F2+R2。
4.一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点位置的方法，其特征在于，所述方法是采用权利要求1至3任一项所述试剂盒中的引物对，在如下次序和条件下进行扩增检测：
①：94℃,5min；
②：94℃,30s；55℃,30s；72℃,2min；35Cycles；
③：72℃,7min；25℃,∝；
若扩增后的片段经琼脂糖凝胶电泳出现特异性条带，则表明存在C.1301C>A、C.1174T>A突变位点。
CN202010945008.0A 2020-09-10 2020-09-10 一种鉴定pah基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法 Pending CN112143788A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010945008.0A CN112143788A (zh) 2020-09-10 2020-09-10 一种鉴定pah基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010945008.0A CN112143788A (zh) 2020-09-10 2020-09-10 一种鉴定pah基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112143788A true CN112143788A (zh) 2020-12-29

Family

ID=73890868

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010945008.0A Pending CN112143788A (zh) 2020-09-10 2020-09-10 一种鉴定pah基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112143788A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111073884A (zh) * 2020-02-14 2020-04-28 昆明理工大学 提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点检测准确率的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103436616A (zh) * 2013-08-23 2013-12-11 苏州市立医院 中国人群苯丙酮尿症pah基因筛查试剂盒
CN105755109A (zh) * 2015-11-23 2016-07-13 苏州市立医院 一种新的苯丙酮尿症基因筛查和诊断体系及试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103436616A (zh) * 2013-08-23 2013-12-11 苏州市立医院 中国人群苯丙酮尿症pah基因筛查试剂盒
CN105755109A (zh) * 2015-11-23 2016-07-13 苏州市立医院 一种新的苯丙酮尿症基因筛查和诊断体系及试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARBARA ARBEITHUBER等: "Haplotyping of Heterozygous SNPs in Genomic DNA Using Long-Range PCR", METHODS MOL BIOL, pages 3 - 22 *
LI N.N.等: "Molecular characterisation of phenylketonuria in a Chinese mainland population using nextgeneration sequencing", SCIENTIFIC REPORTS, pages 15769 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111073884A (zh) * 2020-02-14 2020-04-28 昆明理工大学 提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点检测准确率的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108251522B (zh) 人类mthfr和mtrr基因检测试剂盒及其用途
US10519484B2 (en) Lytic composition and application thereof, kit, method for preparing nucleic acid by utilizing lytic composition, and nucleic acid analysis method
US20110086353A1 (en) Identification of MicroRNAs (miRNAs) in Fecal Samples as Biomarkers for Gastroenterological Cancers
CN111020031A (zh) 序列特异性阻断剂结合特定pcr程序检测肿瘤基因突变的方法
CN110283899B (zh) 一种检测人mthfr和mtrr基因突变的引物、探针及其试剂盒
Botezatu et al. DNA melting analysis: application of the “open tube” format for detection of mutant KRAS
CN110511984B (zh) Egfr基因19号外显子缺失突变的快速荧光检测方法及应用
CN106755352B (zh) 用于快速检测abcb1基因c3435t多态性的核酸、试剂盒及方法
CN113943763B (zh) 一种还原核酸的方法及其检测方法
US10851408B2 (en) Methods and kits for detecting gene mutations
CN112143788A (zh) 一种鉴定pah基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法
CN110564861A (zh) 人类Y染色体STR基因座和InDel位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CN109996891B (zh) 用于进行结肠癌和/或结肠癌前体细胞的早期检测和用于监测结肠癌复发的方法
CN107164473B (zh) 一种检测calr基因1型突变的引物组合物及试剂盒
KR101775953B1 (ko) 돌연변이 유전자 검사 방법 및 킷트
CN111172273A (zh) 一种smn1基因检测的引物组、试剂盒及检测方法
CN113481197B (zh) 一种线性探针及利用其检测miRNA的方法
CN109136367B (zh) 提高braf基因v600e突变的诊断效率的方法
US5719026A (en) Method for detecting polymorphism of human cytochrome P4501A2 gene
CN112143815B (zh) 一种用于检测人fgfr2基因融合突变的核酸组合物、试剂盒及检测方法
CN114891886A (zh) 用于诊断膀胱癌的核酸产品、试剂盒及应用
CN112063700A (zh) 一种鉴定slc12a3基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法
CN112126684A (zh) 一种鉴定gcdh基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法
CN112094898A (zh) 一种鉴定mefv基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法
CN112126685A (zh) 一种鉴定aldob基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination