CN112126685A - 一种鉴定aldob基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法 - Google Patents

一种鉴定aldob基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法 Download PDF

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余艳
李慧源
李淼
代冰
龚强
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Abstract

本发明公开了一种鉴定ALDOB基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法。所述试剂盒中含有如下引物对：F1：GATAGCATTGAGGTTGAGAGTCG；R1：CCTGTTAATTATTTGTATCCACAGTTAGAGC；F2：GATAGCATTGAGGTTGAGAGAGT；R2：CCTGTTAATTATTTGTATCCACAGTTAGTCT；所述两个突变位点为C.839C>A、C.331C>T突变位点。本发明能够鉴定C.839C>A、C.331C>T突变位点是在同一条染色体，还是不同的染色体上，工作量小，耗时短，易操作。

Description

一种鉴定ALDOB基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及 方法
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点(C.839C>A、C.331C>T)位置的试剂盒及方法。
背景技术
遗传性果糖不耐受症是一种常染色体隐性遗传的果糖代谢病，由编码果糖-1，6-二磷酸醛缩酶B的ALDOB基因发生致病变异所致。醛缩酶由A、B、C3种同工酶组成，其主要在肝脏、肾脏和小肠表达。遗传性果糖不耐受是由于醛缩酶B活力降低，导致1-磷酸果糖在肝脏、肾、肠中堆积，使肝糖原分解和糖异生受抑制，表现为低血糖发作，如未能及时诊治可导致严重肝病、低血糖脑病及肾损害，有潜在致命危险。疑诊病例应进行ALDOB单基因分析或者与糖代谢相关基因包序列分析，如果存在ALDOB单基因纯合或者复合杂合致病突变可以确诊。
不同的ALDOB基因的突变对ALDOB活性及结构影响的程度不同。针对于本案中涉及到的两个突变位点，发生在同一条或者不同的染色体上，对患者病情严重程度的影响是不同的。如果两个突变发生在同一条染色体上，则不致病；两个突变分别发生在不同的染色体上，则致病。为了评估疾病的严重程度，鉴定已知的不同的ALDOB基因突变分布在同一条还是不同染色体上，对疾病的诊断具有决定性作用。现有的方法是提取DNA，构建载体，进行体外表达实验，需要全套的分子生物学及微生物、细胞培养的实验室，难度极大，且工作量大，耗时长，普通实验室难以实施。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种鉴定ALDOB基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
鉴定ALDOB基因同时含两个突变位点位置的试剂盒中含有如下引物对：
F1：GATAGCATTGAGGTTGAGAGTCG(SEQ ID NO.1)
R1：CCTGTTAATTATTTGTATCCACAGTTAGAGC(SEQ ID NO.2)
F2：GATAGCATTGAGGTTGAGAGAGT(SEQ ID NO.3)
R2：CCTGTTAATTATTTGTATCCACAGTTAGTCT(SEQ ID NO.4)；
所述两个突变位点为：C.839C>A、C.331C>T突变位点。
优选地，引物对按如下排列组合使用：
①：F1+R1
②：F1+R2
③：F2+R1
④：F2+R2。
优选地，根据C.839C>A、C.331C>T突变分布情况，引物对按如下排列组合使用：
①：当待测样本同时含C.839C>A、C.331C>T突变但分布在不同染色体上时：F1+R2或F2+R1；其中，F1和R1是检测野生型的引物；
②当待测样本同时含C.839C>A、C.331C>T突变且分布在同一条染色体上时：F2+R2。
基于上述试剂盒鉴定同时含C.839C>A、C.331C>T突变位点的方法是采用所述试剂盒中的引物对，在如下次序和条件下进行扩增检测：
①：94℃，5min；
②：94℃，30s；59℃，30s；72℃，2min；35Cycles；
③：72℃，8min；25℃，∝；
若扩增后的片段经琼脂糖凝胶电泳出现特异性条带，则表明存在C.839C>A、C.331C>T。
本发明根据ALDOB基因已知位点C.839C>A、C.331C>T突变，设计两组引物，第一组：3′端碱基与正常的模板碱基互补，第二组：3′端碱基与突变的模板碱基互补。基于耐热TaqDNA聚合酶缺乏3′→5′外切校正活性的特点，引物3′端的特异碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相对碱基，若此碱基对形成错配，链延伸反应就会因3′，5′-磷酸二酯键形成障碍而受阻，所以其扩增结果为：野生模板阻碍，突变引物放大；或突变模板阻碍，野生引物放大。
本发明设计了不同的引物对，将提取的模板扩增后进行琼脂糖凝胶电泳从而达到鉴定的目的。本发明能够鉴定C.839C>A、C.331C>T突变位点是在同一条染色体，还是不同的染色体上。现有的方法是提取DNA、构建克隆载体、构建克隆载体、体外表达实验，需要全套的分子生物学及微生物、细胞培养的实验室，难度极大，且工作量大，耗时2-3个月，普通实验室难以实施，本发明仅需要引物设计、提取DNA、扩增与跑胶，能够在1天内完成所有试验，工作量小，耗时短，易操作成本极低，且普通分子实验室均可操作。
附图说明
图1为Z、T、S样本电泳图；
图2为对比引物对电泳图。
具体实施方式
1.DNA提取
选取3个样本，一个野生型，命名为Z，一个同时含C.839C>A、C.331C>T突变但分布在不同染色体上的样本，命名为T，另一个同时含C.839C>A、C.331C>T突变且分布在同一条染色体上的样本，命名为S。根据试剂QIAamp DNA Blood Mini Kit(250)(凯杰，163030523)说明书提取DNA，保存于-20℃备用。
2.PCR扩增
根据表1所示反应体系进行片段扩增(商用试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司)。
表1反应体系
试剂 体积(μL)
2×Vazyme LAmp Master Mix(商用) 25
ddH2O 13
Primers Mixer(F+R) 8
模板DNA(商用) 4
总体积 50
按照表1配置反应体系，其中，Primers Mixer(F+R)为扩增引物。
本发明设计了两组扩增引物序列，如下表2。其中F1、F2序列3’端是针对位点C.839C>A野生型和突变型模板，R1、R2序列3’端是针对位点C.331C>T野生型和突变型模板。表2引物序列按5P浓度1:1F端与R端自由组合，可得4组Primers Mixer(F+R)混合物，如表3。
表2引物序列
Figure BDA0002674945940000031
表3 Primers Mixer(F+R)引物组合
第1组 F1+R1
第2组 F1+R2
第3组 F2+R1
第4组 F2+R2
所有试剂配制完成后，将每组引物分装成3份，分别加入样本Z、T和S，得12份混合液，按照引物分组命名为Z1-Z4，T1-T4和S1-S4，并按照下列扩增程序进行PCR扩增：
[94℃，5min]；[94℃，30s；59℃，30s；72℃，2min；35Cycles]；[72℃，8min；25℃，∝]。
3.电泳
①配置凝胶
取1g琼脂糖凝胶(干粉)加入100ul 1X TAE溶液混合。将混合液放入微波炉，设置微波炉“大火-3min”。待冷却后加入5ul DD核酸染料，混匀倒胶待凝固。
②点样
用水稀释到1X loading buffer。取出待测扩增产物，按照产物：(loadingbuffer)＝1:1比例在配置好的胶块上加样。同时在一泳槽内加入DL 2000DNA Marker。
③电泳
设置好电泳仪参数：70V-100min。
4.结果
结果如图1所示，Z样本在第一组引物组合中出现特异性条带，其余组合未出现条带。T样本在第2组、第3组出现了特异性条带，第1组，第4组未出现条带。S样本在第4组引物组合中出现特异性条带，第1、2、3组均未出现。
5.对照
对照组的引物序列如表4，引物组合如表5，其他操作同具体实施方式的1至3。
表4对照引物序列
Figure BDA0002674945940000051
表5 Primers Mixer(F+R)对照引物组合
第1组 F1+R1
第2组 F1+R2
第3组 F2+R1
第4组 F2+R2
结果如图2所示，Z样本除了在第一组引物组合中出现特异性条带，在不应该出现条带的其余组合也出现了条带；T样本除了在第2组、第3组出现了特异性条带，在不应该出现条带的第1组，第4组也出现了条带；S样本除了在第4组引物组合中出现特异性条带，在不应该出现条带的第1、2、3组也出现了条带。
序列表
<110> 长沙金域医学检验实验室有限公司
<120> 一种鉴定ALDOB基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法
<141> 2020-09-10
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> null
<400> 2
gatagcattg aggttgagag tcg 23
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> null
<400> 2
cctgttaatt atttgtatcc acagttagag c 31
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> null
<400> 3
gatagcattg aggttgagag agt 23
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> null
<400> 4
cctgttaatt atttgtatcc acagttagtc t 31
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> null
<400> 5
gatagcattg aggttgagag tgg 23
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> null
<400> 6
cctgttaatt atttgtatcc acagttagac c 31
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> null
<400> 7
gatagcattg aggttgagag tgt 23
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> null
<400> 8
cctgttaatt atttgtatcc acagttagac t 31

Claims (4)

1.一种鉴定ALDOB基因同时含两个突变位点位置的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如下引物对：
F1：GATAGCATTGAGGTTGAGAGTCG
R1：CCTGTTAATTATTTGTATCCACAGTTAGAGC
F2：GATAGCATTGAGGTTGAGAGAGT
R2：CCTGTTAATTATTTGTATCCACAGTTAGTCT；
所述两个突变位点为：C.839C>A、C.331C>T突变位点。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，引物对按如下排列组合使用：
①：F1+R1
②：F1+R2
③：F2+R1
④：F2+R2。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，根据C.839C>A、C.331C>T突变分布情况，引物对按如下排列组合使用：
①当待测样本同时含C.839C>A、C.331C>T突变但分布在不同染色体上时：F1+R2或F2+R1；
②当待测样本同时含C.839C>A、C.331C>T突变且分布在同一条染色体上时：F2+R2。
4.一种鉴定ALDOB基因同时含两个突变位点位置的方法，其特征在于，所述方法是采用权利要求1至3任一项所述试剂盒中的引物对，在如下次序和条件下进行扩增检测：
①：94℃，5min；
②：94℃，30s；59℃，30s；72℃，2min；35CyCles；
③：72℃，8min；25℃，∝；
若扩增后的片段经琼脂糖凝胶电泳出现特异性条带，则表明存在C.839C>A、C.331C>T突变位点。
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