CN102808026B - 用于检测人mthfr基因多态性的引物、探针、荧光pcr试剂盒和方法 - Google Patents

用于检测人mthfr基因多态性的引物、探针、荧光pcr试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于MTHFR基因c.665与c.1286两个位点核苷酸多态性检测的引物、探针、荧光PCR试剂盒和检测方法，根据“等位基因特异PCR”原理，在实时荧光定量PCR技术平台上检测亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR基因c.665与c.1286两个多态性位点的核苷酸类型。

Description

用于检测人MTHFR基因多态性的引物、探针、荧光PCR试剂盒和方法
技术领域
本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及用于MTHFR基因c.665与c.1286两个位点核苷酸多态性检测的引物、探针、荧光PCR试剂盒和检测方法。
背景技术
亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是甲硫氨酸-叶酸代谢系统中的关键酶，可以使5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，一方面可以作为甲基的间接供体参与体内嘌呤、嘧啶的合成及DNA、RNA、蛋白质的甲基化；另一方面，在甲硫氨酸合成酶的催化下，以维生素B12为辅酶，使血液中同型半胱氨酸再发生甲基化生产甲硫氨酸，从而维持体内正常的同型半胱氨酸水平。MTHFR基因突变可导致其编码的叶酸代谢关键酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，造成叶酸水平降低及高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸可使血管内皮损伤及功能异常，刺激血管平滑肌细胞增生，破坏机体凝血和纤溶系统，使机体处于血栓前状态，而慢性的细胞内同型半胱氨酸水平的升高可导致DNA低甲基化，染色体异常。近年来发现高同型半胱氨酸水平与包括心脑血管疾病、出生缺陷、妊娠相关疾病、糖尿病等多种疾病缺陷密切相关。
MTHFR基因常见的突变有两种：NCBI单核苷酸多态性数据库（db SNP）中的c.665位点C/T多态性（SNP ID:rs1801133）与c.1286位点A/C多态性（SNP ID:rs1801131）。其中，c.665位点C/T多态性是由Frosst等于1995年首次发现的，也是到目前为止发现的MTHFR最为常见的突变位点。研究表明，c.665位点C变为T后，其编码的丙氨酸被缬氨酸替代，导致MTHFR酶的热稳定性与酶活性降低，据文献报道，该位点在亚洲人群中突变的频率高达40%。另外，c.1286位点A变为C后，谷氨酸被丙氨酸取代，同样使MTHFR的酶活性下降，引起血浆同型半胱氨酸水平的升高和叶酸水平的降低，该位点在亚洲人群中突变的频率高达19%。
我国推荐孕期补充量为400微克/天，对于MTHFR基因正常的人，摄取推荐量的叶酸，能够显著降低患儿的出生缺陷率；对于MTHFR基因异常的人，MTHFR酶活性明显降低，叶酸代谢障碍，导致新生儿神经管缺陷、唐氏综合症及唇腭裂等疾病的发病风险明显增高，这类人需要补充更多的叶酸才能达到预期的效果。
多年来，国内外对MTH FR多态性基因型进行分析，大多采用PCR-PFLP检测技术和DNA直接测序法。由于PCR-PFLP技术依赖限制性内切酶消化、电泳分析等原因，往往出现结果误判现象，影响其检测准确率，另外其检测周期长、通量较低，亦不适用于大量人群的快速筛选。另外，作为基因检测金标准的DNA直接测序法，由于其需要昂贵的仪器设备和复杂的操作流程以及检测周期长的特点，难以实现大规模推广。
发明内容
本发明针对现有技术检测MTHFR基因多态性时价格昂贵、周期长、低效率、数据分析繁琐等不足，提供了一种基于实时荧光定量PCR技术平台的MTHFR基因多态性检测的引物和荧光探针、试剂盒及检测方法，用于检测人MTHFR基因c.665位点（C/T）多态性和/或c.1286位点（A/C）多态性，本发明快速、成本低，具有广泛推广价值。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种用于检测人MTHFR基因多态性的引物及其相应探针，包括检测引物及其探针和内控引物及其探针，根据MTHFR基因c.665位点（C/T）多态性设计，检测引物及其探针序列如下所示：
反向引物：
MTHFR 665C: 5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGG-3’ （ SEQ ID No.1）；
MTHFR 665T: 5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGA-3’ （ SEQ ID No.2）；
正向引物：
MTHFR 665F: 5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’ （ SEQ ID No.3）；
荧光探针：
TM-MTHFR 665: 5’荧光基团-TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’淬灭基团（ SEQ ID No.4）；
所述内控引物对及相应荧光探针的序列如下所示：
内控引物对：
正向引物：GAPDH F: 5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’    （ SEQ ID No.9） ；
反向引物：GAPDH R: 5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’       （ SEQ ID No.10）；
内控荧光探针：
TM-GAPDH: 5’荧光基团-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’淬灭基团  （ SEQ ID No.11）。
本发明还提供了一种用于检测MTHFR基因多态性的引物及其相应探针，包括检测引物及其探针和内控引物及其探针，根据MTHFR基因c.1286位点（A/C）多态性设计，检测引物及其探针序列如下所示：
正向引物：
MTHFR 1286A: 5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’ （ SEQ ID No.5）；
MTHFR 1286C: 5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGC-3’ （ SEQ ID No.6）；
反向引物：
MTHFR 1286R: 5’-TGCCATGTCCACAGCATGGA-3’ （ SEQ ID No.7）；
荧光探针：
TM-MTHFR 1286: 5’荧光基团-TCACAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCT-3’淬灭基团（ SEQ ID No.8）；
所述内控引物对及相应荧光探针的序列如下所示：
内控引物对：
正向引物：GAPDH F: 5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’    （ SEQ ID No.9） ；
反向引物：GAPDH R: 5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’       （ SEQ ID No.10）；
内控荧光探针：
TM-GAPDH: 5’荧光基团-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’淬灭基团  （ SEQ ID No.11）。
上述检测人MTHFR基因c.665位点（C/T）多态性的探针、检测人MTHFR基因c.1286位点（A/C）多态性的探针以及内控引物对应的荧光探针5’端的荧光基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM，TET，VIC，HEX或ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团，优选BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更优选的方案为检测荧光探针的5’端连有的荧光基团为FAM，3’端连有的淬灭基团为Dabcyl；内控荧光探针的5’端连有的荧光基团为ROX，3’端连有的淬灭基团为BHQ-2。
本发明还提供了一种用于检测人MTHFR基因多态性的荧光PCR试剂盒，包括本发明所述检测人MTHFR基因c.665位点（C/T）多态性和/或人MTHFR基因c.1286位点（A/C）多态性的检测引物和相应的荧光探针和使用说明书。具体的说，包括检测人MTHFR基因c.665位点（C/T）多态性的两种特异性反应液：MTHFR 665C PCR反应液与MTHFR 665T PCR反应液，和/或检测人MTHFR基因c.1286位点（A/C）多态性的两种特异性反应液：MTHFR 1286A PCR反应液与MTHFR 1286C PCR反应液；其中PCR反应液包含了PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP等物质外，还对应的包含上述检测引物与探针。上述各特异性检测的PCR反应液分别包含的引物与探针的序列如下：
（1）MTHFR 665C PCR反应液
MTHFR 665C: 5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGG-3’；
MTHFR 665F: 5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’
TM-MTHFR 665: 5’荧光基团-TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’淬灭基团
（2）MTHFR 665T PCR反应液
MTHFR 665T: 5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGA-3’；
MTHFR 665F: 5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’
TM-MTHFR 665: 5’荧光基团-TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’淬灭基团
（3）MTHFR 1286A PCR反应液
MTHFR 1286A: 5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’；
MTHFR 1286R: 5’-TGCCATGTCCACAGCATGGA-3’
TM-MTHFR 1286: 5’荧光基团-TCACAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCT-3’淬灭基团
（4）MTHFR 1286C PCR反应液
MTHFR 1286C: 5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGC-3’；
MTHFR 1286R: 5’-TGCCATGTCCACAGCATGGA-3’
TM-MTHFR 1286: 5’荧光基团-TCACAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCT-3’淬灭基团
上述试剂盒的优选方案中各PCR反应液，除了包括检测引物和相应的荧光探针外，还包括一对内控引物及相应荧光探针，内控引物和探针的序列如下：
内控引物：
GAPDH F: 5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’ 
GAPDH R: 5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’
内控荧光探针：
TM-GAPDH: 5’荧光基团-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’淬灭基团。
上述试剂盒中检测人MTHFR基因c.665位点（C/T）多态性的探针、检测人MTHFR基因c.1286位点（A/C）多态性的探针以及内控引物对应的荧光探针 5’端的荧光基团可以为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM，TET，VIC，HEX或ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团，优选BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更优选的方案为检测荧光探针的5’端连有的荧光基团为FAM，3’端连有的淬灭基团为Dabcyl；内控荧光探针的5’端连有的荧光基团为ROX，3’端连有的淬灭基团为BHQ-2。
上述试剂盒使用说明书包含对PCR扩增条件的描述，优选的PCR扩增条件为：预变性的条件为：温度为95℃，时间为3分钟；
PCR反应由第一阶段和第二阶段构成：
第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为20秒；
退火：起始温度为56℃，时间为30 秒；
延伸：温度为65℃，时间为45秒；
第二阶段由30次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为20秒；
退火：温度为56℃，时间为30 秒；（设置荧光信号采集）
延伸：温度为65℃，时间为45秒。
本发明还提供了一种利用上述检测引物和荧光探针或者上述含有的检测MTHFR基因多态性的荧光PCR试剂盒进行MTHFR基因多态性检测的方法，步骤包括：
（1） 待测样品处理和模板提取
a. 从待检测者抽取血液样本；
b. 从血液样本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取外周血基因组DNA；
c. 测定DNA浓度和纯度，要求浓度大于10ng/μl；OD260nm/OD280nm=1.6~2.0。
（2）    荧光PCR扩增：
将待检测模板DNA与一定量的Taq DNA聚合酶加入含有本发明所述检测人MTHFR基因c.665位点（C/T）多态性和/或人MTHFR基因c.1286位点（A/C）多态性的检测引物和相应的荧光探针PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后，放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应，优选将待检测模板DNA与一定量的Taq DNA聚合酶加入含有内控引物及相应荧光探针的上述PCR反应液内（上述试剂盒优选方案），在荧光PCR管内混合均匀离心后放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应，用以监测反应有效性。
上述荧光PCR扩增方案优选采用以下温度循环及信号采集程序进行PCR反应：
预变性的条件为：温度为95℃，时间为3分钟；
PCR反应由第一阶段和第二阶段构成：
第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为20秒；
退火：起始温度为56℃，时间为30 秒；
延伸：温度为65℃，时间为45秒；
第二阶段由30次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为20秒；
退火：温度为56℃，时间为30 秒；（设置荧光信号采集）
延伸：温度为65℃，时间为45秒。
（3）分析结果
在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增“S”型曲线，如果形成对数扩增“S”型曲线则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阳性。
本发明还提供了一种检测人MTHFR基因c.665位点（C/T）多态性和/或人MTHFR基因c.1286位点（A/C）多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针在检测人MTHFR基因多态性中的应用。
本发明还提供了一种含有检测人MTHFR基因c.665位点（C/T）多态性和/或人MTHFR基因c.1286位点（A/C）多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针的试剂盒在检测人MTHFR基因多态性中的应用。
本发明所述技术方案中的有关内容解释如下。
1. 本发明工作原理是：等位基因特异PCR (Allele Specific PCR, ASPCR)，又称为等位基因特异性扩增法(Allele Specific Amplification, ASA)或者扩增受阻突变系统(Amplification Refractory Mutation System ARMS-PCR)，其基本原理是由于Taq DNA聚合酶缺少3’→5’外切酶活性，在进行PCR反应时，若引物3’端形成错配，链延伸反应就会因为3’,5’-磷酸二酯键形成的障碍而受阻，导致PCR产物量急剧减少，在一定扩增循环内，不会检测出特异的扩增产物；反之，3’端配对则能够检测出扩增产物。于是，针对已知的多态性位点，将其多态性碱基设计于检测引物的3’端，扩增反应后，通过凝胶电泳观察产物的有无即可判断多态性位点的碱基类型。
荧光定量PCR是( Real-time PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量实验技术，在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针被称“TaqMan探”，为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’→ 3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
通过基于荧光探针的实时荧光PCR技术检测“等位基因特异PCR”反应体系的产物，根据形成扩增曲线的荧光信号在特定阈值时循环数（Ct值）的大小可判断相应检测体系内模板相应目的位点的碱基类型。
2. 本发明所述技术方案中的引物和探针的设计：根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的MTHFR基因的参考序列（NG_013351.1, NM_005957.4）以及dbSNP 数据库公开的c.665位点(C/T) 多态性（SNP ID ：rs180113）与c.1286位点(A/C)多态性（SNP ID ：rs1801131）的信息, 采用ABI公司的Primer Express 3.0软件分别设计检测MTHFR基因c.665位点(C/T) 多态性与c.1286位点(A/C)多态性的引物与探针。为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人类保守基因GAPDH的一段序列（其GeneBank参考序列编号为：NG_007073.2），采用ABI公司的Primer Express 3.0软件设计检测引物及探针。
本发明所述技术方案中，所述引物（primer）是指由一定数量的dNTP构成的寡核苷酸序列，通常由DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。在聚合酶链式反应中，引物可与待扩增目的核酸链上与之互补的区域结合，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯键形式进行合成，因此引物的3’-OH必须是游离的。DNA聚合酶可由其3′端开始进行延伸，合成新的核酸链。
本发明所述技术方案中，所述荧光探针是一种寡聚核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。目前常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX，ROX等。淬灭基团有BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse、TAMRA等。
3. 本发明所述技术方案中，所述的内控引物及其相应的探针可以用来监测反应有效性的指标，用以判断是否存在模板质量、机器故障、试剂稳定性等因素影响试验结果的情况。正常情况下，PCR正常扩增会形成的指数级扩增曲线，形象的描述为“S”型扩增曲线，表明体系正常扩增。当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号形成对数扩增“S”型曲线时，为多态性类型的阳性结果，也说明PCR体系扩增正常，无需采用内控引物及其相应的探针进行结果的验证。然而，当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增“S”型曲线，检测结果为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阴性结果，但也有可能是模板质量、机器故障、试剂稳定性等因素影响试验结果，这种情况下，可以采用内控引物及其相应的探针进行排除。当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增“S”型曲线，而内控信号形成正常对数扩增“S”型曲线时，可以验证多态性类型的阴性结果的准确性。而当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增“S”型曲线，且内控信号也未形成正常对数扩增“S”型曲线时，则说明实验条件或仪器上出现问题影响试验结果，而非多态性类型的阴性结果。       
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：
1．本发明技术方案中的检测人MTHFR基因c.665位点（C/T）多态性和/或人MTHFR基因c.1286位点（A/C）多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针，其PCR检测特异性非常高，并且采用实时荧光PCR技术，检测结果判读容易。
2、本发明技术方案中的检测引物与探针价格低廉，而且在实验过程中不需测序，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率。
3、本发明技术方案中的检测引物与探针，采用实时荧光PCR技术平台，可实现高通量检测。
附图说明
附图1为某样本MTHFR基因c.665位点试剂盒检测图
附图2为某样本MTHFR基因c.665位点测序图
附图3为某样本MTHFR基因c.1286位点试剂盒检测图
附图4为某样本MTHFR基因c.1286位点测序图
 具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，通常采用常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。本发明所使用的荧光定量PCR仪型号为ABI 7500或BioRad CFX96。
[0027] 实施例1. 引物和探针的设计：
根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的MTHFR基因的参考序列（NG_013351.1, NM_005957.4）以及dbSNP 数据库公开的c.665位点(C/T) 多态性（rs180113）与c.1286位点(A/C)多态性（rs1801131）的信息, 采用ABI公司的Primer Express 3.0软件分别设计检测MTHFR基因c.665位点(C/T) 多态性与c.1286位点(A/C)多态性的引物与探针, 具体如下：
检测MTHFR基因c.665位点(C/T)多态性引物及探针的序列如下所示：
反向引物：
MTHFR 665C: 5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGG-3’；
MTHFR 665T: 5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGA-3’；
正向引物：
MTHFR 665F: 5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’
荧光探针：
TM-MTHFR 665: 5’ FAM -TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’ Dabcyl。
检测MTHFR基因c.1286位点(A/C)多态性引物及探针的序列如下所示：
正向引物：
MTHFR 1286A: 5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’；
MTHFR 1286C: 5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGC-3’；
反向引物：
MTHFR 1286R: 5’-TGCCATGTCCACAGCATGGA-3’；
荧光探针：
TM-MTHFR 1286: 5’ FAM -TCACAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCT-3’Dabcyl。
为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人类保守基因GAPDH的一段序列（其参考序列编号为：NG_007073.2），采用ABI公司的Primer Express 3.0软件设计检测引物及探针，具体序列如下所示：
内控引物对：
正向引物：GAPDH F: 5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’；
反向引物：GAPDH R: 5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’；
内控荧光探针：
TM-GAPDH: 5’ FAM-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’BHQ2。
实施例2. 引物的制备
将设计好的引物及探针序列交由合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需提供合成检验合格报告。
实施例3：荧光PCR检测人MTHFR基因多态性的试剂盒的准备
制备检测人MTHFR基因c.665位点（C/T）多态性的两种特异性反应液：MTHFR 665C PCR反应液与MTHFR 665T PCR反应液；检测人MTHFR基因c.1286位点（A/C）多态性的两种特异性反应液；MTHFR 1286A PCR反应液与MTHFR 1286C PCR反应液；其中PCR反应液包含了PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP等物质外，还包含了检测引物与探针和内控引物与探针。上述各特异性检测的PCR反应液组分浓度及包含的引物与探针的序列信息如下：
表1. PCR反应液组分
反应液组分 浓度
缓冲液 10×
镁离子 15mM
dNTP（A/T/G/C） 各20mM
上游检测引物 2μM
下游检测引物 2μM
检测信号探针 2μM
上游内控引物 1μM
下游内控引物 1μM
内控信号探针 1μM
（1）MTHFR 665C PCR反应液
MTHFR 665C: 5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGG-3’；
MTHFR 665F: 5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’
TM-MTHFR 665: 5’FAM-TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’Dabcyl
GAPDH F: 5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’
GAPDH R: 5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’
TM-GAPDH: 5’ ROX-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’BHQ2
（2）MTHFR 665T PCR反应液
MTHFR 665T: 5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGA-3’；
MTHFR 665F: 5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’
TM-MTHFR 665: 5’ FAM -TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’Dabcyl
GAPDH F: 5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’
GAPDH R: 5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’
TM-GAPDH: 5’ ROX-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’BHQ2
（3）MTHFR 1286A PCR反应液
MTHFR 1286A: 5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’；
MTHFR 1286R: 5’-TGCCATGTCCACAGCATGGA-3’
TM-MTHFR 1286: 5’ FAM -TCACAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCT-3’Dabcyl
GAPDH F: 5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’
GAPDH R: 5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’
TM-GAPDH: 5’ ROX-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’BHQ2
（4）MTHFR 1286C PCR反应液
MTHFR 1286C: 5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGC-3’；
MTHFR 1286R: 5’-TGCCATGTCCACAGCATGGA-3’
TM-MTHFR 1286: 5’ FAM -TCACAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCT-3’Dabcyl
GAPDH F: 5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’
GAPDH R: 5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’
TM-GAPDH: 5’ ROX-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’BHQ2
实施例4：荧光PCR检测人MTHFR基因多态性的方法
第一步：准备DNA
（1）.从待检测者抽取血液样本；
（2）.从血液样本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取外周血基因组DNA；
（3）.测定DNA浓度和纯度，要求浓度大于10ng/μl；OD260nm/OD280nm=1.6~2.0。
第二步：PCR反应体系配制
在荧光定量PCR专用的管子内按照下表配制PCR反应体系
表2.PCR反应体系组成
ddH2O 加至25μl
PCR反应液 2.5μl
DNA聚合酶（2.5U/μl） 0.2μl
基因组DNA 约80ng
石蜡油 20μl
上述PCR反应液采用实施例3制备的试剂盒中的MTHFR 665C PCR反应液、MTHFR 665T PCR反应液、MTHFR 1286A PCR反应液或MTHFR 1286C PCR反应液，也可以按照实施例3表1提供的配制方法制备含有检测人MTHFR基因c.665位点（C/T）多态性和检测人MTHFR基因c.1286位点（A/C）多态性的检测引物与探针并含有内控引物和探针的PCR反应液;
第三步：上机检测
按照下表设置温度循环及信号采集程序
表3.PCR反应程序
Figure 2012102911077100002DEST_PATH_IMAGE001
注：“*”处设置Fam和Rox双通道采集荧光信号。
第四步：分析结果
在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，在内控信号形成正常对数扩增“S”型曲线的前提条件下，观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增“S”型曲线，如果形成对数扩增“S”型曲线则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阳性。例如：某待检样本在MTHFR 665C反应体系和MTHFR 665T反应体系检测荧光信号（FAM通道）均形成对数扩增“S”型曲线，则提示该样本为MTHFR 665C/T杂合型。
附图1为某样本MTHFR基因c.665位点试剂盒检测图，检测图显示MTHFR 665C反应体系与MTHFR 665T反应体系内的内控荧光信号均合格，而在MTHFR 665C反应体系内检测荧光信号（FAM通道）无扩增曲线形成，在MTHFR 665T反应体系内检测荧光信号（FAM通道）形成对数扩增“S”型曲线，则判断该样本为MTHFR 665 T/T纯合型。
附图2为附图1样本MTHFR基因c.665位点测序图，测序结果显示该样本为MTHFR 665 T/T纯合型。试剂盒检测结果与测序结果一致。
附图3为某样本MTHFR基因c.1286位点试剂盒检测图， 检测图显示MTHFR 1286A反应体系与MTHFR1286C反应体系内的内控荧光信号均合格，在MTHFR 1286A反应与MTHFR1286C反应体系内检测荧光信号（FAM通道）均形成对数扩增“S”型曲线，则判断该样本为MTHFR 1286 A/C杂合型。
附图4为附图3样本MTHFR基因c.1286位点测序图，测序结果显示该样本为MTHFR 1286 A/C杂合型。试剂盒检测结果与测序结果一致。
注意：
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Organization Applicant
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      Street : 江苏省常熟高新技术开发区金都路8号
      City : 常熟市
      State : 江苏省
      Country : 中国
      PostalCode : 215500
      PhoneNumber : 0512-52358499
      FaxNumber :
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<110> OrganizationName : 苏州旷远生物分子技术有限公司
 
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<120> Title : 用于检测人MTHFR基因多态性的引物、探针、荧光PCR试剂盒和方法
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Claims (3)

1. 一种用于检测人MTHFR基因多态性的试剂盒，包括用于检测人MTHFR基因多态性的检测引物及其探针和内控引物及其探针，其特征在于所述检测引物及探针根据MTHFR基因c.665位点(C/T)多态性设计，序列如下所示：
反向引物：
MTHFR 665C: 5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGG-3’；
MTHFR 665T: 5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGA-3’；
正向引物：
MTHFR 665F: 5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’
荧光探针：
TM-MTHFR 665: 5’荧光基团-TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’淬灭基团；
所述内控引物对及相应荧光探针的序列如下所示：
内控引物对：
正向引物：GAPDH F: 5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’；
反向引物：GAPDH R: 5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’；
内控荧光探针：
TM-GAPDH: 5’荧光基团-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’淬灭基团。
2.  一种用于检测人MTHFR基因多态性的试剂盒，包括用于检测人MTHFR基因多态性的检测引物及其探针和内控引物及其探针，其特征在于所述检测引物及探针根据MTHFR基因c.1286位点(A/C)多态性设计，序列如下所示：
正向引物：
MTHFR 1286A: 5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’；
MTHFR 1286C: 5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGC-3’；
反向引物：
MTHFR 1286R: 5’-TGCCATGTCCACAGCATGGA-3’；
荧光探针：
TM-MTHFR 1286: 5’荧光基团-TCACAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCT-3’淬灭基团；
所述内控引物对及相应荧光探针的序列如下所示：
内控引物对：
正向引物：GAPDH F: 5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’；
反向引物：GAPDH R: 5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’；
内控荧光探针：
TM-GAPDH: 5’荧光基团-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’淬灭基团。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述荧光探针5’端的荧光基团为FAM、TET、VIC、HEX或ROX，3’端的淬灭基团为BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse、或TAMRA。
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