CN105886600A - 一种用于FTO基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于FTO基因分型的ARMS‑qPCR检测试剂盒，本发明还涉及一种基于本试剂盒的FTO基因分型ARMS‑qPCR检测方法。本试剂盒包括qPCR反应体系，所述qPCR反应体系包括qPCR混合反应液、参照引物、ARMS引物和阳极对照样品；所述qPCR混合反应液包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2、Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探针；所述qPCR反应体系中，各组分的终浓度分别为：PCR缓冲液为1X；dNTP为0.1～1.5mM；MgCl2为0.5～5mM；Tag酶为0.05～0.1U/μl；PCR下游引物为0.1～1μM；TaqMan探针为0.1～1μM；参照引物为0.5μM；ARMS引物为0.5μM；阳性对照样品为1～10ng/μl。与直接测序等基因分型的技术相比，本发明用于FTO基因分型有特异性强、灵敏度高，操作简单快速、高通量、判读结果可靠，简便等优势。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于FTO基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，本发明还涉及一种FTO基因分型ARMS-qPCR检测方法。
背景技术
肥胖症是一种慢性病，据世界卫生组织估计，是人类目前面临最容易被忽视，但发病率却在急剧上升的一种疾病。肥胖症能导致多种生理和心理疾病，比如糖尿病、癌症、心血管疾病以及社交障碍等。造成肥胖症的原因很多，比如过量的能量摄入和静止型的生活方式等。越来越多的研究表明，遗传因素在肥胖症发病过程中扮演着重要的角色(Frayling et al.2007，Gerken et al.2007，Dina et al.2007，Chu et al.2008)。
FTO基因位于人第16号染色体，编码3’mT的去甲基化酶(Jia et al.2011)。有研究表明，FTO的不同基因型与肥胖症的发病率紧密相关(Frayling et al.2007，)。FTO rs9939609AT和AA基因型的人比rs9939609TT基因型的人具有显著地肥胖症发病风险(Speakman et al.2008)。更有趣的是，FTO基因不同基因型与肥胖症之间显著地相关性具有性别差异，男性rs9939609 AT和AA基因型肥胖症发病风险显著地高于rs9939609 TT基因型的人，而在女性中却没有差异。因此rs9939609不同的基因型是一个极好的男性肥胖症风险预测指标，对于肥胖症的预防以及其后的治疗具有重要的指导意义。
可用于FTO rs9939609分型的技术很多，包括如DNA直接测序法、杂交芯片法、焦磷酸测序法以及变性高效液相色谱法等。其中，DNA测序法为基因分 型的金标准，该方法存在如下缺点：检测的灵敏度不高，只有大于15％的突变才能检测到；费时，操作复杂，对操作人员要求高；非闭管操作，涉及PCR扩增后的操作，因此易被污染，造成结果的不理想；通量太小，一次最多只能做24个，很难大规模开展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对技术现状提供一种灵敏度高、特异性强的用于FTO基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种FTO基因分型的ARMS-qPCR检测方法，该检测方法灵敏度高、特异性强，而且操作简单。
本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种用于FTO基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，包括qPCR反应体系，所述qPCR反应体系包括qPCR混合反应液、参照引物、ARMS引物和阳极对照样品；所述qPCR混合反应液包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2、Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探针；
所述qPCR反应体系中，各组分的终浓度分别为：PCR缓冲液为1X；dNTP为0.1～1.5mM；MgCl2为0.5～5mM；Tag酶为0.05～0.1U/μl；PCR下游引物为0.1～1μM；TaqMan探针为0.1～1μM；参照引物为0.5μM；ARMS引物为0.5μM；阳性对照样品为1～10ng/μl。
其中，所述PCR下游引物的序列如FTO-R所示；
所述TaqMan探针的序列如FTO-TaqMan所示；
所述参照引物的序列如FTO-C所示，能够扩增所有不同FTO基因型；
所述ARMS引物为两种上游引物中的任意一种，分别对应FTO AArs9939609、TTrs9939609型基因型，这两种上游引物的序列如FTO-F1、 FTO-F2所示；这两种ARMS引物分别在3’末端与不同的基因型碱基匹配，同时在其3’末端倒数第2、3位增加一个或者两个碱基错配，以增加其特异性；用于特异性扩增的FTO rs9939609位基因型为AA/TT/AT；
所述阳极对照样品分别为FTO不同基因型碱基置换的质粒基因组DNA。
各引物序列列举如下：
FTO-R：5’-ATCTTATGTCCAAACAGTAG-3’
FTO-TaqMan：5’-FAM-TAGGTAACAGTCAGAAATGG-3’
FTO-C：5’-AGTTATGCATTTAGAATGTC-3’
FTO-F1：5’-TTGCGACTGCTGTGAATGCT-3’
FTO-F2：5’-TTGCGACTGCTGTGAATGCA-3’
其中，所述Tag酶为Takara Tag酶或Goldstar Best Tag酶。
本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：基于上述试剂盒的FTO基因分型ARMS-qPCR检测方法，该方法先是针对FTO基因设计一对参照引物、TaqMan探针，针对rs9939609位点的不同基因型设计ARMS引物，反应体系中加入qPCR混合反应液，参照引物或者ARMS引物、TaqMan引物和待测模板DNA进行荧光定量PCR的检测，具体包括如下步骤：
(1)设计并筛选含有FTO基因rs9939609位不同基因型通用的参照引物、TaqMan探针及两种ARMS引物；
(2)从细胞体系或血液中提取到基因组DNA作为模板DNA；
(3)进行实时荧光定量PCR扩增，每个样本的检测分3管进行，每个管加入相同的qPCR混合反应液，TaqMan探针和模板DNA，每管分别加入参照引物和两种ARMS引物中的一种，进行FTO基因rs9939609位基因分型的qPCR检测；
(4)结果判读：
参照引物管扩增曲线阳性，FTO-F1管扩增曲线阳性，FTO-F2管扩增曲线阴性或者其与参照引物管的扩增曲线ΔCT＞10，该样本结果判定为rs9939609AA基因型；
参照引物管扩增曲线阳性，FTO-F1管扩增曲线阳性，FTO-F2管扩增曲线阳性，该样本结果判定为rs9939609A/T基因型；
参照引物管扩增曲线阳性，FTO-F1管扩增曲线阴性或者其与参照引物管的扩增曲线ΔCT＞10，FTO-F2管扩增曲线阳性，该样本结果判定为rs9939609TT基因型；
参照引物管扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新进行提取。
所述步骤(2)中，模板DNA选自人体血液基因组DNA或者口腔黏膜脱落细胞或头发。
所述步骤(3)中，进行PCR扩增反应的条件为，95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃延伸1min，46个循环。
上述技术方案中所提及的qPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明提供了一种FTO rs9939609基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，以解决现有基因分型检测技术中费时、程序繁琐以及易污染等问题。本试剂盒可以快速、准确、便宜、高通量给FTO rs9939609基因进行分型，其灵敏度高，特异性强，适用于常见样本比如血液、口腔黏膜以及头发等。
本发明能够快速、低廉、准确，高通量地检测人体血液或者其他组织细胞中FTO基因不同的类型，对于分型技术而言，是目前性价比最好的方法。便于 临床或者健康检测大规模的推行。
本发明所用的ARMS(amplification refractory mutation system)即扩增阻碍突变系统，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3’端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。
ARMS检测的灵敏度依赖于ARMS引物的特异性以及反应条件如反应液中MgCl2的浓度，加不加DMSO等的优化。为了增加引物的特异性，减少引物与靶向DNA有错配时的错配延伸，可通过在引物3’端的第2、3个碱基引入另外一个或者两个错配碱基，使之与模板之间形成多重错配以阻止错误延伸。
本发明所用的探针为5’端FAM标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)。在探针完整时，即在随机状态和无PCR产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，检测不到荧光的存在。在ARMS-qPCR扩增过程中，当特异的PCR产物与TaqMan探针发生杂交反应时，Goldstar Best Tag酶的5’端外切酶活性也把TaqMan探针的碱基逐个剪切，报告基团所释放出的荧光就可以被内置到PCR仪中的荧光计检测到。PCR经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数扩增的过程，荧光信号的强弱就代表模板DNA拷贝数的多少。因此本发明是个很好的基因分型的工具。
综合了ARMS引物以及实时荧光定量PCR的优点，与直接测序等基因分型的技术相比较，本发明用于FTO基因分型基因检测具有如下优势：
1、特异性强：设计的ARMS引物分别针对FTO AA rs9939609，TT rs9939609 的特异变异序列，能特异地扩增相应的基因型DNA；在ARMS引物3‘端的倒数第2、3个碱基引入另外一个或者两个错配碱基，增加ARMS引物的特异性；
2、本发明技术的灵敏度可达1％，远高于DNA直接测序15％的灵敏度；
3、检测过程为闭管反应，大大降低了污染及结果偏差的可能性；
4、操作快速简单，从样本送检到得到结果可在3个小时内完成。而直接测序法检测步骤繁琐：送检标本→提取DNA→PCR扩增→验证PCR产物(电泳)→纯化PCR产物→直接测序→结果分析，其经过两个PCR产物的电泳过程，污染几率很大，不适合在医院大规模开展；
5、判读结果明确客观，若需要时可对结果进行定量分析；
6、高通量，一次可以检测96个样本；
7、安全，整个体系中不包含有毒有害物质，无需PCR产物的后处理，对操作人员和环境都无害。
总之，与直接测序等基因分型的技术相比，本发明用于FTO基因分型有特异性强、灵敏度高，操作简单快速、高通量、判读结果可靠，简便等优势。
附图说明
图1为用FTO ARMS-qPCR基因分型试剂盒检测一抑郁症患者FTO rs9939609位置基因型的扩增曲线，经检测，此样品在rs9939609位置的基因型为FTO AA rs9939609；
图2为用FTO ARMS-qPCR基因分型试剂盒检测正常人FTO rs9939609位置基因型的扩增曲线，经检测，此样品在rs9939609位置的基因型为FTO TT rs9939609；
图3为用FTO ARMS-qPCR基因分型试剂盒检测正常人FTO rs9939609位置基因型的扩增曲线，经检测，此样品在rs9939609位置的基因型为FTO A/Trs9939609。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
收集100例抑郁症患者和50例正常人的血样，用ARMS-qPCR的方法对其FTO基因rs9939609位置进行分型。
设计并筛选能特异检测上述3种基因型的ARMS引物各一条及参照引物一条，设计通用下游引物一条，设计并筛选TaqMan通用探针一条，各引物、探针的序列如下：
FTO-R：5’-ATCTTATGTCCAAACAGTAG-3’
FTO-TaqMan：5’-FAM-TAGGTAACAGTCAGAAATGG-3’
FTO-C：5’-AGTTATGCATTTAGAATGTC-3’
FTO-F1：5’-TTGCGACTGCTGTGAATGCT-3’
FTO-F2：5’-TTGCGACTGCTGTGAATGCA-3’
反应体系的优化：
(1)引物浓度的优化，在反应体系中其他条件相同的情况下，将引物浓度从0.1μM/L～1.5μM/L作倍比连续稀释，通过实验结果的分析确定最佳浓度为0.5μM/L。
(2)探针浓度的优化，在反应体系中其他条件相同的情况下，将引物浓度从0.05μM/L～0.5μM/L作倍比连续稀释，通过实验结果的分析确定最佳浓度为0.1μM/L。
(3)退火温度的优化，在反应体系中其他条件相同的情况下，进行梯度PCR(55℃～65℃)，通过实验结果的分析确定最佳温度为60℃。
(4)扩增反应Tag酶的优化，通过比较市场上的各种PCR扩增Tag酶，选 取Goldstar Best Tag酶。
(5)优化后最终的反应体系为25ul，包括qPCR混合反应液23μl，参照引物和ARMS引物各0.5μl(终浓度0.5μM/L)，模板DNA 1μl(终浓度1-10ng/μl)，qPCR mix(即qPCR混合反应液)组分及其终浓度为：
ARMS-qPCR在ABI 7900检测仪上检测每个样本进行3管反应，每管加入相同的qPCR mix，通用下游引物，TaqMan探针，各管所不同的是参照引物或者ARMS引物。PCR反应条件为：95℃预变性10min，95℃15s，60℃1min，扩增反应为46循环。
结果为：100例男性肥胖症患者中有69人为FTO基因AA rs9939609基因型，21人为AT rs9939609，10人为TT rs9939609基因型；50人正常人中有38人为TT rs9939609型，9人为A/Trs9939609基因型，3人为AA rs9939609基因型，经DNA直接测序验证，完全与ARMS-qPCR结果一致。
上述结果表明，本发明的FTO基因ARMS-qPCR分型方法方法可靠，灵敏度高，操作简单，判读结果客观，利于大规模临床开展。
以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (5)
1.一种用于FTO基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，其特征在于：包括qPCR反应体系，所述qPCR反应体系包括qPCR混合反应液、参照引物、ARMS引物和阳极对照样品；所述qPCR混合反应液包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2、Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探针；
所述qPCR反应体系中，各组分的终浓度分别为：PCR缓冲液为1X；dNTP为0.1～1.5mM；MgCl2为0.5～5mM；Tag酶为0.05～0.1U/μl；PCR下游引物为0.1～1μM；TaqMan探针为0.1～1μM；参照引物为0.5μM；ARMS引物为0.5μM；阳性对照样品为1～10ng/μl。
所述PCR下游引物的序列如FTO-R所示；
所述TaqMan探针的序列如FTO-TaqMan所示；
所述参照引物的序列如FTO-C所示，能够扩增所有不同FTO基因型；
所述ARMS引物为两种上游引物中的任意一种，分别对应FTOAArs9939609、TTrs9939609型基因型，这两种上游引物的序列如FTO-F1、FTO-F2所示；这两种ARMS引物分别在3’末端与不同的基因型碱基匹配，同时在其3’末端倒数第2、3位增加一个或者两个碱基错配，用于特异性扩增的FTO rs9939609位基因型为AA/TT/AT；
所述阳极对照样品分别为FTO不同基因型碱基置换的质粒基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的用于FTO基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，其特征在于：所述Tag酶为Takara Tag酶或Goldstar Best Tag酶。
3.基于权利要求1或2所述试剂盒的FTO基因分型ARMS-qPCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)设计并筛选含有FTO基因rs9939609位不同基因型通用的参照引物、TaqMan探针及两种ARMS引物；
(2)从细胞体系或血液中提取到基因组DNA作为模板DNA；
(3)进行实时荧光定量PCR扩增，每个样本的检测分3管进行，每个管加入相同的qPCR混合反应液，TaqMan探针和模板DNA，每管分别加入参照引物和两种ARMS引物中的一种，进行FTO基因rs9939609位基因分型的qPCR检测；
(4)结果判读：
参照引物管扩增曲线阳性，FTO-F1管扩增曲线阳性，FTO-F2管扩增曲线阴性或者其与参照引物管的扩增曲线ΔCT＞10，该样本结果判定为rs9939609AA基因型；
参照引物管扩增曲线阳性，FTO-F1管扩增曲线阳性，FTO-F2管扩增曲线阳性，该样本结果判定为rs9939609A/T基因型；
参照引物管扩增曲线阳性，FTO-F1管扩增曲线阴性或者其与参照引物管的扩增曲线ΔCT＞10，FTO-F2管扩增曲线阳性，该样本结果判定为rs9939609TT基因型；
参照引物管扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新进行提取。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，模板DNA选自人体血液基因组DNA或者口腔黏膜脱落细胞或头发。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中，进行PCR扩增反应的条件为，95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃延伸1min，46个循环。
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