CN107841537A - 一种全预混mthfr和mtrr多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法 - Google Patents

一种全预混mthfr和mtrr多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107841537A
CN107841537A CN201710899417.XA CN201710899417A CN107841537A CN 107841537 A CN107841537 A CN 107841537A CN 201710899417 A CN201710899417 A CN 201710899417A CN 107841537 A CN107841537 A CN 107841537A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mthfr
mtrr
primer
detection
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710899417.XA
Other languages
English (en)
Inventor
王进
吴梦华
赵小龙
何晓辉
吴子侠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SUZHOU KUANGYUAN MOLECULAR BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Original Assignee
SUZHOU KUANGYUAN MOLECULAR BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SUZHOU KUANGYUAN MOLECULAR BIOTECHNOLOGY CO Ltd filed Critical SUZHOU KUANGYUAN MOLECULAR BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority to CN201710899417.XA priority Critical patent/CN107841537A/zh
Publication of CN107841537A publication Critical patent/CN107841537A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供用于检测叶酸代谢途径MTHFR基因c.677与c.1298和MTRR基因c.66三个位点核苷酸多态性的全预混多重引物特异性PCR检测试剂盒和方法，根据“等位基因特异PCR”原理，设计多重引物特异性PCR，在实时荧光定量PCR技术平台上实现两管反应同时检测叶酸代谢途径MTHFR基因c.677与c.1298和MTRR基因c.66三个位点的核苷酸类型。并采用修饰的Taq DNA聚合酶及在反应体系中加入二聚糖PCR保护剂，增加反应体系的稳定性，实现全预混检测体系保存的长期稳定性。

Description

一种全预混MTHFR和MTRR多重PCR基因多态性检测试剂盒和 方法
技术领域
本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及用于MTHFR基因c.677与c.1298和MTRR基因c.66三个位点核苷酸多态性检测的全预混多重引物特异性PCR检测试剂盒和检测方法。
背景技术
叶酸(Folic Acid)是指具有相关生物活性的一类同效水溶性B族维生素，其在机体内的活性形式为5-甲基四氢叶酸，为细胞生长和繁殖的必须物质，参与体内很多重要的代谢反应。作为体内一碳单位的传递体，叶酸参与嘌呤、胸腺嘧啶、核苷酸等多种物质的合成和转化，同时影响磷脂、肌酸、神经介质的生成，促进神经细胞与脑细胞发育。叶酸及其代谢中间产物在机体生理生化反应中具有重要作用，一旦机体发生叶酸缺陷或者叶酸代谢酶的缺陷，就会导致细胞周期不正常，DNA、蛋白质甲基化反应异常、DNA碱基无法正常合成等多种生化反应异常，从而直接或间接地导致新生儿或胎儿神经管缺陷以及成年人的癌症、心血管疾病的发生。
5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)能催化5,10-亚甲基四氢叶酸产生5-甲基四氢叶酸，参与甲基传递与核苷酸合成，是叶酸代谢过程中的关键酶。其基因位点突变对酶的活性和热稳定性产生影响，从而影响叶酸和甲硫氨酸代谢。该基因最常见的两个单核苷酸多态性677C>T和1298A>C，在中国发生率分别为45.2％和18.6％。MTHFR677C>T突变可造成其编码的氨基酸由丙氨酸变成缬氨酸，引起耐热性和酶活性下降，杂合MTHFR 677CT酶活性下降30％，纯合677TT酶活性下降65％以上，在低叶酸的环境下，纯合677TT可显著升高血浆同型氨酸浓度，从而引起静脉栓塞、肺栓塞、动脉粥样硬化、脑卒中等疾病，携带MTHFR677TT基因型的母亲在低叶酸环境情况下生育神经管缺陷的病儿的风险也大大增加。MTHFRA1298C突变引起编码的氨基酸由谷氨酸转变为丙氨酸，也会导致酶活性下降，但下降程度比MTHFR C677T突变轻微，文献报道与高同型胱氨酸血症无直接关系，但与MTHFR C677T突变有协同效应。
甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)主要作用是将失活的甲硫氨酸合成酶还原为活性状态，维持甲基传递通路继续进行，使得体内的同型半胱氨酸保持在无毒水平。其报道最多的单核苷酸多态性是66A>G，中国人群发生率为25.7％，突变导致其酶活与同型半胱氨酸再甲基化速率降低，引起高同型半胱氨酸血症。
科学研究发现，叶酸利用能力受遗传结构(基因)影响，如果与叶酸代谢相关的酶活性偏低(即相关基因功能异常)，这一人群如按常量(400微克/天)补充叶酸，机体叶酸水平也会不足。而叶酸补充过量同样会带来一定危害。因此，遗传体质的差异导致了机体对叶酸利用能力的差异，叶酸增补应因人而异。通过对叶酸代谢相关的MTHFR和MTRR基因位点进行检测，从分子水平上评估个体对叶酸的利用能力，通过检测可以判读个人叶酸代谢能力的高低。可辅助医生对孕围产期新生儿神经管畸形、妊娠高血压病等疾病的发病风险进行评估，指导叶酸的个体化服用。
对MTHFR和MTRR基因多态性进行分析，大多采用PCR-PFLP检测技术和DNA直接测序法。由于PCR-PFLP技术依赖限制性内切酶消化、电泳分析等原因，往往出现结果误判现象，影响其检测准确率，另外其检测周期长、通量较低，亦不适用于大量人群的快速筛选。另外，作为基因检测金标准的DNA直接测序法，由于其需要昂贵的仪器设备和复杂的操作流程以及检测周期长的特点，难以实现大规模推广。
发明内容
本发明针对现有技术检测MTHFR和MTRR基因多态性时价格昂贵、周期长、低效率、数据分析繁琐等不足，提供了一种基于实时荧光定量PCR技术平台的全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR检测试剂盒和方法。
本发明针对单重引物特异性PCR检测一个位点的基因多态性需要两管反应才能完成，应用多重引物特异性PCR检测基因多态性，两管反应体系能够同时检测人MTHFR基因c.677位点（C/T）多态性和c.1298位点（A/C）多态性和MTRR基因c.66位点（A/G）多态性。
本发明中将修饰的Taq DNA聚合酶与含PCR稳定剂的反应液预混，且预混后Taq酶活性及反应液稳定性不受影响，具有操作简便、反应快速、成本低的优点，具有广泛推广价值。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性检测的检测引物及其相应探针，根据MTHFR基因c.677位点（C/T）多态性设计，序列如下所示：
反向引物：
MTHFR 677C: 5’- GCTGCGTGATGATGAAATAGG-3’（ SEQ ID No.1）；
MTHFR 677T: 5’- GCTGCGTGATGATGAAATAGA-3’（ SEQ ID No.2）；
正向引物：
MTHFR 677F: 5’- GGCTGTGCTGTGCTGTTGGAAG-3’（ SEQ ID No.3）；
荧光探针：
TM-MTHFR 677: 5’荧光基团-TACCCCAAAGGCCACCCCGAAG-3’淬灭基团（ SEQ ID No.4）。
本发明还提供了一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性检测的检测引物及其相应探针，根据MTHFR基因c.1298位点（A/C）多态性设计，序列如下所示：
正向引物：
MTHFR 1298A: 5’- GGGGAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’（ SEQ ID No.5）；
MTHFR 1298C: 5’- GGGGAGGAGCTGACCAGTGATGC-3’（ SEQ ID No.6）；
反向引物：
MTHFR 1298R: 5’- CATGTCCACAGCATGGAGGG-3’（ SEQ ID No.7）；
荧光探针：
TM-MTHFR 1298: 5’荧光基团- CAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCTCCC-3’淬灭基团（ SEQID No.8）。
本发明还提供了一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性检测的检测引物及其相应探针，根据MTRR基因c.66位点（C/T）多态性设计，序列如下所示：
反向引物：
MTRR 66A: 5’- ATCCATGTACCACAGCTTGCTCAGAT-3’；（ SEQ ID No.9）；
MTRR 66G: 5’- TCCATGTACCACAGCTTGCTCAGAC-3’；（ SEQ ID No.10）；
正向引物：
MTRR 66F: 5’- TTACATGCCTTGAAGTGATGAGG-3’；（ SEQ ID No.11）；
荧光探针：
TM-MTRR 66: 5’荧光基团- ATGCTACACAGCAGGGACAGGC-3’淬灭基团（ SEQ ID No.12）。
本发明提供了一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性检测的内控引物对及相应荧光探针，序列如下所示：
内控引物对：
正向引物：GAPDH F: 5’- ATTCGCCCTCTTAATGGGGAGG-3’（ SEQ ID No.13）；
反向引物：GAPDH R: 5’-TGGGGCTCACCATGTAGCACTCAC-3’（ SEQ ID No.14）；
内控荧光探针：
TM-GAPDH: 5’荧光基团-TGCCATCAATGACCCCTTCATT-3’淬灭基团（ SEQ ID No.15）。
本发明提供了一种含PCR保护剂二聚糖的缓冲液，可以保证全预混试剂的稳定性，采用的二聚糖，可以为海藻糖或蔗糖。
本发明提供了将修饰的Taq聚合酶与引物探针和反应缓冲液预混的方法，可以保证全混试剂的-20度长期储存稳定性和4度条件下8个星期的储存稳定性。Taq聚合酶的修饰方式可以为Taq单克隆抗体修饰和化学修饰。
上述检测人MTHFR基因c.677位点（C/T）多态性的探针、检测人MTHFR基因c.1298位点（A/C）多态性的探针、检测人MTRR基因c.66位点（A/G）多态性的探针以及内控引物对应的荧光探针5’端的荧光基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM，TET，VIC，HEX或ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团，优选BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更优选的方案为检测人MTHFR基因c.677位点（C/T）多态性的荧光探针的5’端连有的荧光基团为FAM，3’端连有的淬灭基团为BHQ1；检测人MTHFR基因c.1298位点（A/C）多态性的荧光探针的5’端连有的荧光基团为ROX，3’端连有的淬灭基团为BHQ1；检测人MTRR基因c.66位点（A/G）多态性的荧光探针的5’端连有的荧光基团为CY5，3’端连有的淬灭基团为BHQ2；内控荧光探针的5’端连有的荧光基团为HEX，3’端连有的淬灭基团为BHQ2。
本发明还提供了一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR检测试剂盒，包括本发明所述检测人MTHFR基因c.677位点（C/T）多态性和/或人MTHFR基因c.1298位点（A/C）多态性和/或人MTRR基因c.66位点（A/G）多态性的检测引物和相应的荧光探针和使用说明书。具体的说，包括检测人MTHFR基因c.677位点C等位基因和人MTHFR基因c.1298位点A等位基因及人MTRR基因c.66位点A等位基因的特异性反应液：MTHFR和MTRR APCR反应液，和/或检测人MTHFR基因c.677位点T等位基因和人MTHFR基因c.1298位点C等位基因及人MTRR基因c.66位点G等位基因的特异性反应液：MTHFR和MTRR B PCR反应液；其中PCR反应液包含了PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP物质外，还对应的包含上述检测引物与探针以及修饰的Taq聚合酶，及PCR反应保护剂二聚糖。上述各特异性检测的PCR反应液分别包含的引物与探针的序列如下：
（1）MTHFR和MTRR A PCR反应液
MTHFR 677C: 5’- GCTGCGTGATGATGAAATAGG-3’；
MTHFR 677F: 5’- GGCTGTGCTGTGCTGTTGGAAG-3’；
TM-MTHFR 677: 5’荧光基团-TACCCCAAAGGCCACCCCGAAG-3’淬灭基团；
MTHFR 1298A: 5’- GGGGAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’；
MTHFR 1298R: 5’- CATGTCCACAGCATGGAGGG-3’；
TM-MTHFR 1298: 5’荧光基团- CAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCTCCC-3’淬灭基团；
MTRR 66A: 5’- ATCCATGTACCACAGCTTGCTCAGAT-3’；
MTRR 66F: 5’- TTACATGCCTTGAAGTGATGAGG-3’；
TM-MTRR 66: 5’荧光基团- ATGCTACACAGCAGGGACAGGC-3’淬灭基团。
（2）MTHFR和MTRR B PCR反应液
MTHFR 677T: 5’- GCTGCGTGATGATGAAATAGA-3’；
MTHFR 677F: 5’- GGCTGTGCTGTGCTGTTGGAAG-3’；
TM-MTHFR 677: 5’荧光基团-TACCCCAAAGGCCACCCCGAAG-3’淬灭基团；
MTHFR 1298C: 5’- GGGGAGGAGCTGACCAGTGATGC-3’；
MTHFR 1298R: 5’- CATGTCCACAGCATGGAGGG-3’；
TM-MTHFR 1298: 5’荧光基团- CAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCTCCC-3’淬灭基团；
MTRR 66G: 5’- TCCATGTACCACAGCTTGCTCAGAC-3’；
MTRR 66F: 5’- TTACATGCCTTGAAGTGATGAGG-3’；
TM-MTRR 66: 5’荧光基团- ATGCTACACAGCAGGGACAGGC-3’淬灭基团。
上述试剂盒的PCR反应液优选方案中，除了包括检测人MTHFR基因c.677位点（C/T）多态性和/或人MTHFR基因c.1298位点（A/C）多态性和/或人MTRR基因c.66位点（A/G）多态性的检测引物和相应的荧光探针外，还包括一对内控引物及相应荧光探针，内控引物和探针的序列如下：
内控引物：
GAPDH F: 5’- ATTCGCCCTCTTAATGGGGAGG-3’；
GAPDH R: 5’-TGGGGCTCACCATGTAGCACTCAC-3’；
内控荧光探针：
TM-GAPDH: 5’荧光基团-TGCCATCAATGACCCCTTCATT-3’淬灭基团。
上述试剂盒中检测人MTHFR基因c.677位点（C/T）多态性的探针、检测人MTHFR基因c.1298位点（A/C）多态性的探针、检测人MTRR基因c.66位点（A/G）多态性的探针以及内控引物对应的荧光探针 5’端的荧光基团可以为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM，TET，VIC，HEX或ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团，优选BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更优选的方案为检测人MTHFR基因c.677位点（C/T）多态性的荧光探针的5’端连有的荧光基团为FAM，3’端连有的淬灭基团为BHQ1；检测人MTHFR基因c.1298位点（A/C）多态性的荧光探针的5’端连有的荧光基团为ROX，3’端连有的淬灭基团为BHQ1；检测人MTRR基因c.66位点（A/G）多态性的荧光探针的5’端连有的荧光基团为CY5，3’端连有的淬灭基团为BHQ2；内控荧光探针的5’端连有的荧光基团为HEX，3’端连有的淬灭基团为BHQ2。
上述试剂盒使用说明书包含对PCR扩增条件的描述，优选的PCR扩增条件为：预变性的条件为：温度为95℃，时间为3分钟；
PCR反应由第一阶段和第二阶段构成：
第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为10秒；
退火：温度为56℃，时间为30秒；
延伸：温度为60℃，时间为30 秒；
第二阶段由35次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为10秒；
退火：温度为56℃，时间为30秒；
延伸：温度为60℃，时间为30 秒；（设置荧光信号采集）
本发明还提供了一种利用上述检测引物和荧光探针或者上述含有的一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性检测试剂盒进行MTHFR和MTRR基因多态性检测的方法，步骤包括：
（1）待测样品处理和模板提取
a. 从待检测者抽取血液样本；
b. 从血液样本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取外周血基因组DNA；
c. 测定DNA浓度和纯度，要求浓度大于10ng/µl；OD260nm/OD280nm=1.7~2.0。
（2）荧光PCR扩增：
将待检测模板DNA加入含有本发明所述检测人MTHFR基因c.677位点（C/T）多态性和/或人MTHFR基因c.1298位点（A/C）多态性和/或人MTRR基因c.66位点（A/G）多态性的检测引物和相应的荧光探针PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后，放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应，优选将待检测模板DNA加入含有内控引物及相应荧光探针的上述试剂盒优选方案的PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应，用以监测反应有效性。
上述荧光PCR扩增方案优选采用以下温度循环及信号采集程序进行PCR反应：
预变性的条件为：温度为95℃，时间为3分钟；
PCR反应由第一阶段和第二阶段构成：
第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为10秒；
退火：温度为56℃，时间为30秒；
延伸：温度为60℃，时间为30 秒；
第二阶段由35次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为10秒；
退火：温度为56℃，时间为30秒；
延伸：温度为60℃，时间为30 秒；（设置荧光信号采集）
（3）分析结果
在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增“S”型曲线，如果形成对数扩增“S”型曲线则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阳性。
本发明还提供了一种检测人MTHFR基因c.677位点（C/T）多态性和/或人MTHFR基因c.1298位点（A/C）多态性和/或人MTRR基因c.66位点（A/G）多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针在检测人MTHFR和MTRR基因多态性中的应用。
本发明还提供了一种含有检测人MTHFR基因c.677位点（C/T）多态性和/或人MTHFR基因c.1298位点（A/C）多态性和/或人MTRR基因c.66位点（A/G）多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针的试剂盒在检测人MTHFR和MTRR基因多态性中的应用。
本发明所述技术方案中的有关内容解释如下。
1. 本发明工作原理是：等位基因特异PCR (Allele Specific PCR, ASPCR)，又称为等位基因特异性扩增法(Allele Specific Amplification, ASA)或者扩增受阻突变系统(Amplification Refractory Mutation System ARMS-PCR)，其基本原理是由于Taq DNA聚合酶缺少3’→5’外切酶活性，在进行PCR反应时，若引物3’端形成错配，链延伸反应就会因为3’,5’-磷酸二酯键形成的障碍而受阻，导致PCR产物量急剧减少，在一定扩增循环内，不会检测出特异的扩增产物；反之，3’端配对则能够检测出扩增产物。于是，针对已知的多态性位点，将其多态性碱基设计于检测引物的3’端，扩增反应后，通过凝胶电泳观察产物的有无即可判断多态性位点的碱基类型。
荧光定量PCR是( Real-time PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量实验技术，在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针被称“TaqMan探”，为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’→ 3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
通过基于荧光探针的实时荧光PCR技术检测“等位基因特异PCR”反应体系的产物，根据形成扩增曲线的荧光信号在特定阈值时循环数（Ct值）的大小可判断相应检测体系内模板相应目的位点的碱基类型。
2. 本发明所述技术方案中的引物和探针的设计：根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的MTHFR基因的参考序列（NG_013351.1）以及dbSNP数据库公开的c.677位点(C/T) 多态性（SNP ID ：rs1801133）与c.1298位点(A/C)多态性（SNP ID ：rs1801131）的信息，MTRR基因的参考序列（NG_008856.1）以及dbSNP数据库公开的c.66位点（A/G）多态性（SNP ID：rs1801394），采用ABI公司的Primer Express 3.0软件分别设计检测MTHFR基因c.677位点(C/T) 多态性与c.1298位点(A/C)多态性以及MTRR基因c.66位点（A/G）多态性的引物与探针。为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人类保守基因GAPDH的一段序列（其GeneBank参考序列编号为：NG_007073.2），采用ABI公司的Primer Express 3.0软件设计检测引物及探针。
本发明所述技术方案中，所述引物（primer）是指由一定数量的dNTP构成的寡核苷酸序列，通常由DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。在聚合酶链式反应中，引物可与待扩增目的核酸链上与之互补的区域结合，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯键形式进行合成，因此引物的3’-OH必须是游离的。DNA聚合酶可由其3′端开始进行延伸，合成新的核酸链。
本发明所述技术方案中，所述荧光探针是一种寡聚核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。目前常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX，ROX等。淬灭基团有BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse、TAMRA等。
本发明所述技术方案中，所述修饰的Taq DNA聚合酶，通常有两种修饰方法，以帮助提高酶的稳定性：（1）使用Taq DNA聚合酶单克隆抗体修饰，TaqDNA聚合酶与抗体结合后形成非常稳定的聚合物，在常温或低温保存条件下非常稳定，当反应启动时，在高温条件下（95度），Taq DNA聚合酶与抗体分离，启动DNA链式聚合反应。
3. 本发明所述技术方案中，所述的内控引物及其相应的探针可以用来监测反应有效性的指标，用以判断是否存在模板质量、机器故障、试剂稳定性等因素影响试验结果的情况。正常情况下，PCR正常扩增会形成的指数级扩增曲线，形象的描述为“S”型扩增曲线，表明体系正常扩增。当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号形成对数扩增“S”型曲线时，为多态性类型的阳性结果，也说明PCR体系扩增正常，无需采用内控引物及其相应的探针进行结果的验证。然而，当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增“S”型曲线，检测结果为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阴性结果，但也有可能是模板质量、机器故障、试剂稳定性等因素影响试验结果，这种情况下，可以采用内控引物及其相应的探针进行排除。当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增“S”型曲线，而内控信号形成正常对数扩增“S”型曲线时，可以验证多态性类型的阴性结果的准确性。而当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增“S”型曲线，且内控信号也未形成正常对数扩增“S”型曲线时，则说明实验条件或仪器上出现问题影响试验结果，而非多态性类型的阴性结果。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：
1．本发明技术方案中的检测人MTHFR基因c.677位点（C/T）多态性和/或人MTHFR基因c.1298(A/C）多态性和/或人MTRR基因c.66(A/G）多态性的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针，其PCR检测特异性非常高，并且采用实时荧光PCR技术，检测结果判读容易。
2、本发明为多重引物特异性PCR检测基因多态性，两管反应体系能够同时检测人MTHFR基因c.677位点（C/T）多态性和c.1298位点（A/C）多态性和MTRR基因c.66位点（A/G）多态性；同时本发明反应酶为抗体包被的Taq DNA聚合酶或化学修饰的TaqDNA聚合酶, 支持将反应酶与反应液预混，且预混后Taq酶活性及反应液稳定性不受影响。
3、本发明技术方案中的检测引物与探针价格低廉，而且在实验过程中不需测序，采用实时荧光PCR技术平台，可实现高通量检测，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率。
附图说明
附图1为某样本MTHFR和MTRR A反应体系检测图
附图2为某样本MTHFR和MTRR B反应体系检测图
附图3为某样本MTHFR基因c.677位点测序图
附图4为某样本MTHFR基因c.1298位点测序图
附图5为某样本MTRR基因c.66位点测序图
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，通常采用常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。本发明所使用的荧光定量PCR仪型号为ABI 7500。
实施例1. 引物和探针的设计：
根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的MTHFR基因的参考序列（NG_013351.1）以及dbSNP 数据库公开的c.677位点(C/T) 多态性（SNP ID ：rs1801133）与c.1298位点(A/C)多态性（SNP ID ：rs1801131）的信息，MTRR基因的参考序列（NG_008856.1）以及dbSNP数据库公开的c.66位点（A/G）多态性（SNP ID：rs1801394）, 采用ABI公司的Primer Express 3.0软件分别设计检测MTHFR基因c.677位点(C/T) 多态性与c.1298位点(A/C)多态性以及MTRR基因c.66位点（A/G）多态性的引物与探针。为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人类保守基因GAPDH的一段序列（其GeneBank参考序列编号为：NG_007073.2），采用ABI公司的Primer Express 3.0软件设计检测引物及探针。
检测MTHFR基因c.677位点(C/T)多态性引物及探针的序列如下所示：
反向引物：
MTHFR 677C: 5’- GCTGCGTGATGATGAAATAGG-3’；
MTHFR 677T: 5’- GCTGCGTGATGATGAAATAGA-3’；
正向引物：
MTHFR 677F: 5’- GGCTGTGCTGTGCTGTTGGAAG-3’；
荧光探针：
TM-MTHFR 677: 5’ FAM -TACCCCAAAGGCCACCCCGAAG-3’BHQ1。
检测MTHFR基因c.1298位点(A/C)多态性引物及探针的序列如下所示：
正向引物
MTHFR 1298A: 5’- GGGGAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’；
MTHFR 1298C: 5’- GGGGAGGAGCTGACCAGTGATGC-3’；
反向引物
MTHFR 1298R: 5’- CATGTCCACAGCATGGAGGG-3’；
荧光探针
TM-MTHFR 1298: 5’ROX-CAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCTCCC-3’BHQ1。
检测MTRR基因c.66位点(A/G)多态性引物及探针的序列如下所示：
反向引物：
MTRR 66A: 5’- ATCCATGTACCACAGCTTGCTCAGAT-3’；
MTRR 66G: 5’- TCCATGTACCACAGCTTGCTCAGAC-3’；
正向引物：
MTRR 66F: 5’- TTACATGCCTTGAAGTGATGAGG-3’；
荧光探针：
TM-MTRR 66: 5’CY5- ATGCTACACAGCAGGGACAGGC-3’BHQ2。
为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人类保守基因GAPDH的一段序列（其参考序列编号为：NG_007073.2），采用ABI公司的PrimerExpress 3.0软件设计检测引物及探针，具体序列如下所示：
内控引物：
正向引物：GAPDH F: 5’- ATTCGCCCTCTTAATGGGGAGG-3’；
反向引物：GAPDH R: 5’-TGGGGCTCACCATGTAGCACTCAC-3’；
内控荧光探针：
TM-GAPDH: 5’HEX-TGCCATCAATGACCCCTTCATT-3’BHQ2。
实施例2. 引物的制备
将设计好的引物及探针序列交由合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需提供合成检验合格报告。
实施例3：全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性检测试剂盒的准备
制备检测人MTHFR基因c.677位点C等位基因和人MTHFR基因c.1298位点A等位基因及人MTRR基因c.66位点A等位基因的特异性反应液：MTHFR和MTRR A PCR反应液；检测人MTHFR基因c.677位点T等位基因和人MTHFR基因c.1298位点C等位基因及人MTRR基因c.66位点G等位基因的特异性反应液：MTHFR和MTRR B PCR反应液；其中PCR反应液包含了PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP等物质外，还包含了检测引物与探针和内控引物与探针以及抗体修饰的TaqDNA聚合酶和PCR保护剂海藻糖。上述各特异性检测的PCR反应液组分浓度及包含的引物与探针的序列信息如下：
表1. PCR反应液组分
反应液组分 浓度
ddH2O --
缓冲液 10×
镁离子 25mM
dNTP MIX 10mM
上游检测引物1 10µM
下游检测引物1 10µM
检测信号探针1 10µM
上游检测引物2 10µM
下游检测引物2 10µM
检测信号探针2 10µM
上游检测引物3 10µM
下游检测引物3 10µM
检测信号探针3 10µM
上游内控引物 10µM
下游内控引物 10µM
内控信号探针 10µM
Taq DNA聚合酶 5U/μL
（1）MTHFR和MTRR A PCR反应液
MTHFR 677C: 5’- GCTGCGTGATGATGAAATAGG-3’；
MTHFR 677F: 5’- GGCTGTGCTGTGCTGTTGGAAG-3’；
TM-MTHFR 677: 5’FAM-TACCCCAAAGGCCACCCCGAAG-3’BHQ1；
MTHFR 1298A: 5’- GGGGAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’；
MTHFR 1298R: 5’- CATGTCCACAGCATGGAGGG-3’；
TM-MTHFR 1298: 5’ROX- CAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCTCCC-3’BHQ1；
MTRR 66A: 5’- ATCCATGTACCACAGCTTGCTCAGAT-3’；
MTRR 66F: 5’- TTACATGCCTTGAAGTGATGAGG-3’；
TM-MTRR 66: 5’CY5- ATGCTACACAGCAGGGACAGGC-3’BHQ2；
GAPDH F: 5’- ATTCGCCCTCTTAATGGGGAGG-3’；
GAPDH R: 5’-TGGGGCTCACCATGTAGCACTCAC-3’；
TM-GAPDH: 5’HEX-TGCCATCAATGACCCCTTCATT-3’BHQ2。
（2）MTHFR和MTRR B PCR反应液
MTHFR 677T: 5’- GCTGCGTGATGATGAAATAGA-3’；
MTHFR 677F: 5’- GGCTGTGCTGTGCTGTTGGAAG-3’；
TM-MTHFR 677: 5’FAM-TACCCCAAAGGCCACCCCGAAG-3’BHQ1；
MTHFR 1298C: 5’- GGGGAGGAGCTGACCAGTGATGC-3’；
MTHFR 1298R: 5’- CATGTCCACAGCATGGAGGG-3’；
TM-MTHFR 1298: 5’ROX- CAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCTCCC-3’BHQ1；
MTRR 66G: 5’- TCCATGTACCACAGCTTGCTCAGAC-3’；
MTRR 66F: 5’- TTACATGCCTTGAAGTGATGAGG-3’；
TM-MTRR 66: 5’CY5- ATGCTACACAGCAGGGACAGGC-3’BHQ2。
GAPDH F: 5’- ATTCGCCCTCTTAATGGGGAGG-3’；
GAPDH R: 5’-TGGGGCTCACCATGTAGCACTCAC-3’；
TM-GAPDH: 5’HEX-TGCCATCAATGACCCCTTCATT-3’BHQ2。
实施例4：全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性检测的方法
第一步：准备DNA
（1）.从待检测者抽取血液样本；
（2）.从血液样本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取外周血基因组DNA；
（3）.测定DNA浓度和纯度，要求浓度大于10ng/µl；OD260nm/OD280nm=1.7~2.0。
第二步：PCR反应体系配制
在荧光定量PCR专用的管子内按照下表配制PCR反应体系
表2.PCR反应体系组成
PCR反应液 23μl
基因组DNA 约80ng
上述PCR反应液采用实施例3制备的试剂盒中的MTHFR和MTRR A PCR反应液、MTHFR和MTRR B PCR反应液，也可以按照实施例3表1提供的配制方法制备含有检测人MTHFR基因c.677位点（C/T）多态性和检测人MTHFR基因c.1298位点（A/C）多态性和检测人MTRR基因c.66位点（A/G）多态性的检测引物与探针并含有内控引物和探针的PCR反应液；
第三步：上机检测
按照下表设置温度循环及信号采集程序
表3. PCR反应程序
注：“*”处设置FAM、ROX、CY5和HEX四通道采集荧光信号。
第四步：分析结果
在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，在内控信号形成正常对数扩增“S”型曲线的前提条件下，观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增“S”型曲线，如果形成对数扩增“S”型曲线则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阳性。例如：某待检样本在MTHFR和MTRR A PCR反应体系和MTHFR和MTRR B PCR反应体系检测荧光信号（FAM通道）均形成对数扩增“S”型曲线，则提示该样本为MTHFR c.677 C/T杂合型。
附图1为某样本MTHFR和MTRR A反应体系检测图，检测图显示MTHFR和MTRR A反应体系内的内控荧光信号合格，而MTHFR 677C反应体系检测荧光信号（FAM通道）形成对数扩增“S”型曲线，则判断该样本含有MTHFR c.677C等位基因；MTHFR 1298A反应体系检测荧光信号（ROX通道）形成对数扩增“S”型曲线，则判断该样本含有MTHFR c.1298A等位基因；MTRR66A反应体系检测荧光信号（CY5通道）形成对数扩增“S”型曲线，则判断该样本含有MTRRc.66A等位基因。
附图2为某样本MTHFR和MTRR B反应体系检测图，检测图显示MTHFR和MTRR B反应体系内的内控荧光信号合格，而MTHFR 677T反应体系检测荧光信号（FAM通道）形成对数扩增“S”型曲线，则判断该样本含有MTHFR c.677T等位基因；MTHFR 1298C反应体系检测荧光信号（ROX通道）形成对数扩增“S”型曲线，则判断该样本含有MTHFR c.1298C等位基因；MTRR66C反应体系检测荧光信号（CY5通道）形成对数扩增“S”型曲线，则判断该样本含有MTRRc.66C等位基因。
附图3为附图1和附图2中样本MTHFR基因c.677位点测序图，测序结果显示该样本为MTHFR 677C/T杂合型。试剂盒检测结果与测序结果一致。
附图4为附图1和附图2中样本MTHFR基因c.1298位点测序图，测序结果显示该样本为MTHFR 1298A/C杂合型。试剂盒检测结果与测序结果一致。
附图5为附图1和附图2中样本MTRR基因c.66位点测序图，测序结果显示该样本为MTRR 66A/G杂合型。试剂盒检测结果与测序结果一致。
注意：
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> OrganizationName : 苏州旷远生物分子技术有限公司
Application Project
-------------------
<120> Title : 一种全预混MTHFR和MTRR多重PCR基因多态性检测试剂盒和方法
<130> AppFileReference :
<140> CurrentAppNumber :
<160> 73
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> SEQ ID No.1
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.1
reequencet ring 14
<212> Type : DNA
000
000
000
<210> SEQ ID No.2
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.2
reequencet ring 14
<212> Type : DNA
000
000
000
<210> SEQ ID No.3
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.3
reequencet ring 14
<212> Type : DNA
000
000
000
<210> SEQ ID No.4
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.4
reequencet ring 14
<212> Type : DNA
000
000
000
<210> SEQ ID No.5
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.5
reequencet ring 14
<212> Type : DNA
000
000
000
<210> SEQ ID No.6
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.6
reequencet ring 14
<212> Type : DNA
000
000
000
<210> SEQ ID No.7
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.7
reequencet ring 14
<212> Type : DNA
000
000
000
<210> SEQ ID No.8
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.8
reequencet ring 14
<212> Type : DNA
000
000
000
<210> SEQ ID No.9
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.9
reequencet ring 14
<212> Type : DNA
000
000
000
<210> SEQ ID No.10
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.10
reequencet ring 14
<212> Type : DNA
000
000
000
<210> SEQ ID No.11
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.11
reequencet ring 14
<212> Type : DNA
000
000
000
<210> SEQ ID No.12
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.12
reequencet ring 14
<212> Type : DNA
000
000
000
<210> SEQ ID No.13
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.13
reequencet ring 14
<212> Type : DNA
000
000
000
<210> SEQ ID No.14
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.14
reequencet ring 14
<212> Type : DNA
000
000
000
<210> SEQ ID No.15
<213> OrganismName : 人类(Homo sapiens)
<400> SEQ ID No.15
reequencet ring 14
<212> Type : DNA
000

Claims (12)

1.一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性检测的检测引物及其相应探针，其特征在于所述检测引物及探针根据MTHFR基因c.677位点(C/T)多态性设计，序列如下所示：
反向引物：
MTHFR 677C: 5’- GCTGCGTGATGATGAAATAGG-3’；
MTHFR 677T: 5’- GCTGCGTGATGATGAAATAGA-3’；
正向引物：
MTHFR 677F: 5’- GGCTGTGCTGTGCTGTTGGAAG-3’；
荧光探针：
TM-MTHFR 677: 5’荧光基团-TACCCCAAAGGCCACCCCGAAG-3’淬灭基团。
2.一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性检测的检测引物及其相应探针，其特征在于所述检测引物及探针根据MTHFR基因c.1298位点(A/C)多态性设计，序列如下所示：
正向引物：
MTHFR 1298A: 5’- GGGGAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’；
MTHFR 1298C: 5’- GGGGAGGAGCTGACCAGTGATGC-3’；
反向引物：
MTHFR 1298R: 5’- CATGTCCACAGCATGGAGGG-3’；
荧光探针：
TM-MTHFR 1298: 5’荧光基团- CAGCCCCGCAGCCTGGCCTGCAGCTCCC-3’淬灭基团。
3.一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性检测的检测引物及其相应探针，其特征在于所述检测引物及探针根据MTRR基因c.66位点(A/G)多态性设计，序列如下所示：
反向引物：
MTRR 66A: 5’- ATCCATGTACCACAGCTTGCTCAGAT-3’；
MTRR 66G: 5’- TCCATGTACCACAGCTTGCTCAGAC-3’；
正向引物：
MTRR 66F: 5’- TTACATGCCTTGAAGTGATGAGG-3’；
荧光探针：
TM-MTRR 66: 5’荧光基团- ATGCTACACAGCAGGGACAGGC-3’淬灭基团。
4.一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性检测的内控引物对及相应荧光探针，其特征在于所述内控引物对及相应荧光探针的序列如下所示：
内控引物对：
正向引物：GAPDH F: 5’- ATTCGCCCTCTTAATGGGGAGG-3’；
反向引物：GAPDH R: 5’-TGGGGCTCACCATGTAGCACTCAC-3’；
内控荧光探针：
TM-GAPDH: 5’荧光基团-TGCCATCAATGACCCCTTCATT-3’淬灭基团。
5.一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性检测试剂盒的修饰反应酶和含二聚糖成分的PCR缓冲液预混方式。
6.如权利要求1-4所述的引物对及相应荧光探针，其特征在于所述荧光探针5’端的荧光基团为FAM、TET、VIC、HEX、CY5或ROX，3’端的淬灭基团为BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse、或TAMRA。
7.一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要求1所述的检测引物及其相应探针和/或权利要求2所述的检测引物及其相应探针和/或权利要求3所述的检测引物及其相应探针。
8.如权利要求7所述的一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括如权利要求4所述内控引物对及相应荧光探针。
9.一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性的检测方法，所述方法包括使用权利要求1和/或权利要求2和/或权利要求3所述的引物及探针。
10.如权利要求9所述的一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性的检测方法，其特征在于所述方法还包括使用权利要求4所述的引物及探针。
11.一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性的检测方法，所述方法包括使用权利要求7-8所述的试剂盒。
12.权利要求1-4所述的引物及探针在一种全预混叶酸代谢途径MTHFR和MTRR多重引物特异性PCR基因多态性检测中的应用。
CN201710899417.XA 2017-09-28 2017-09-28 一种全预混mthfr和mtrr多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法 Pending CN107841537A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710899417.XA CN107841537A (zh) 2017-09-28 2017-09-28 一种全预混mthfr和mtrr多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710899417.XA CN107841537A (zh) 2017-09-28 2017-09-28 一种全预混mthfr和mtrr多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107841537A true CN107841537A (zh) 2018-03-27

Family

ID=61662100

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710899417.XA Pending CN107841537A (zh) 2017-09-28 2017-09-28 一种全预混mthfr和mtrr多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107841537A (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108048552A (zh) * 2017-12-19 2018-05-18 益善生物技术股份有限公司 一种用于检测y染色体微缺失的核酸组合及试剂盒和应用
CN108251522A (zh) * 2018-04-09 2018-07-06 江苏硕世生物科技股份有限公司 人类mthfr和mtrr基因检测试剂盒及其用途
CN109055512A (zh) * 2018-10-07 2018-12-21 浙江数问生物技术有限公司 一种检测人mthfr和mtrr基因多态性的试剂盒及其检测方法
CN109182501A (zh) * 2018-09-28 2019-01-11 江门市妇幼保健院 一种叶酸代谢基因多态性检测引物及试剂盒
CN110684832A (zh) * 2018-07-04 2020-01-14 苏州云泰生物医药科技有限公司 叶酸相关基因多态性检测的试剂盒及其使用方法
CN111187828A (zh) * 2020-02-11 2020-05-22 圣湘生物科技股份有限公司 检测人叶酸代谢基因多态性的组合物、试剂盒及方法
CN111876482A (zh) * 2020-09-21 2020-11-03 郑州安图生物工程股份有限公司 同时检测人mthfr和mtrr基因的试剂盒
WO2021042884A1 (zh) * 2019-09-02 2021-03-11 珠海赛乐奇生物技术股份有限公司 用于检测叶酸基因多态性的探针、基因芯片及试剂盒
CN114574575A (zh) * 2022-05-06 2022-06-03 深圳会众生物技术有限公司 深静脉血栓snp位点的检测引物、检测试剂盒

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108048552A (zh) * 2017-12-19 2018-05-18 益善生物技术股份有限公司 一种用于检测y染色体微缺失的核酸组合及试剂盒和应用
CN108251522A (zh) * 2018-04-09 2018-07-06 江苏硕世生物科技股份有限公司 人类mthfr和mtrr基因检测试剂盒及其用途
CN108251522B (zh) * 2018-04-09 2020-11-27 江苏硕世生物科技股份有限公司 人类mthfr和mtrr基因检测试剂盒及其用途
CN110684832A (zh) * 2018-07-04 2020-01-14 苏州云泰生物医药科技有限公司 叶酸相关基因多态性检测的试剂盒及其使用方法
CN109182501A (zh) * 2018-09-28 2019-01-11 江门市妇幼保健院 一种叶酸代谢基因多态性检测引物及试剂盒
CN109055512A (zh) * 2018-10-07 2018-12-21 浙江数问生物技术有限公司 一种检测人mthfr和mtrr基因多态性的试剂盒及其检测方法
WO2021042884A1 (zh) * 2019-09-02 2021-03-11 珠海赛乐奇生物技术股份有限公司 用于检测叶酸基因多态性的探针、基因芯片及试剂盒
CN111187828A (zh) * 2020-02-11 2020-05-22 圣湘生物科技股份有限公司 检测人叶酸代谢基因多态性的组合物、试剂盒及方法
CN111187828B (zh) * 2020-02-11 2023-09-15 圣湘生物科技股份有限公司 检测人叶酸代谢基因多态性的组合物、试剂盒及方法
CN111876482A (zh) * 2020-09-21 2020-11-03 郑州安图生物工程股份有限公司 同时检测人mthfr和mtrr基因的试剂盒
CN114574575A (zh) * 2022-05-06 2022-06-03 深圳会众生物技术有限公司 深静脉血栓snp位点的检测引物、检测试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107841537A (zh) 一种全预混mthfr和mtrr多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法
CN102808026B (zh) 用于检测人mthfr基因多态性的引物、探针、荧光pcr试剂盒和方法
CN104212904B (zh) 一种用于快速检测人类cyp2c19基因多态性的试剂盒及其使用方法
ES2543684T3 (es) Nuevos polimorfismos de un único nucleótido y combinaciones de polimorfismos nuevos y conocidos para determinar la expresión específica de alelo del gen IGF2
KR101171635B1 (ko) 변이의 검출 방법 및 그것에 이용하는 키트
CN104293920B (zh) 一种用于快速检测人类vkorc1和cyp2c9基因多态性的试剂盒及其使用方法
CN109182501B (zh) 一种叶酸代谢基因多态性检测引物及试剂盒
CN101568646B (zh) 基因扩增用引物对、含有其的基因扩增用试剂及其用途
CN106701987A (zh) 人叶酸代谢相关的三个snp位点基因分型的pcr扩增系统和检测试剂盒
CN102277424A (zh) Cyp2c19基因扩增用引物对、含有其的cyp2c19基因扩增用试剂及其用途
CN107119107A (zh) 一种检测人类cyp2c19基因多态性的方法及试剂盒
WO2011062258A1 (ja) Ｍｔｈｆｒ遺伝子増幅用プライマーセット、それを含むｍｔｈｆｒ遺伝子増幅用試薬およびその用途
CN108441553A (zh) 一种精准检测aldh2基因多态性的试剂盒及其应用
US9200326B2 (en) Probe for detecting polymorphism in disease-related gene and use of the probe
CN101622363B (zh) 用于检测jak2基因的突变的探针及其用途
EP2025764A1 (en) Probe for detection of mutation in abl gene and use thereof
CN104673891A (zh) 一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法及试剂盒
CN101501223A (zh) Cyp2c19基因扩增用引物对、含有其的cyp2c19基因扩增用试剂及其用途
CN115094130A (zh) 血栓形成导致复发流产风险基因检测引物及评估模型
CN104830992A (zh) 检测亚甲基四氢叶酸还原酶c677t多态性位点的引物、试剂盒及其pcr方法
EP2450443A1 (en) Target sequence amplification method, polymorphism detection method, and reagents for use in the methods
CN104818340A (zh) 检测jak2基因v617f位点多态性的引物、试剂盒及其pcr方法
CN102154272A (zh) 肥胖基因扩增用引物对、含有其的肥胖基因扩增用试剂及其用途
CN107841559A (zh) 一种全预混ugt1a1多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法
CN107043808A (zh) Ugt1a1基因多态性检测引物肽核酸及其试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180327

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication