CN102154272A - 肥胖基因扩增用引物对、含有其的肥胖基因扩增用试剂及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供引物对,其为用于通过基因扩增法扩增肥胖基因(β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因)中包含检测目标位点的目标区域的引物对,其可以特异性扩增上述区域。使用3对引物对,其分别包含含有序列号9或序列号109、序列号25和序列号43的碱基序列的正向引物,和包含序列号18、序列号30和序列号63的碱基序列的反向引物。通过使用该引物对,可以在同一反应液中同时特异性扩增β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因中包含发生检测目标多态性的位点的目标区域。
Description
技术领域
本发明涉及用于扩增肥胖基因β2AR基因、β3AR基因和UCP 1基因的引物对、含有该引物对的肥胖基因扩增用试剂及其用途。
背景技术
与肥胖相关的基因多态性,已知有编码β-2肾上腺素受体(β2AR)的基因(β2AR基因)、编码β-3肾上腺素受体(β3AR)的基因(β3AR基因)和编码解偶联蛋白(UCP)的基因(UCP1基因)的多态性。β2AR主要分布在心脏、支气管平滑肌等中,此外也存在于脂肪组织中,与脂肪分解相关。编码β2AR的β2AR基因存在第16位氨基酸精氨酸(Arg)变成甘氨酸(Gly)的多态性(Arg16Gly)。据报道:具有该多态性的受试者(日本人中16%存在该多态性)与没有上述多态性的受试者相比,其安静时的代谢量是亢进的。此外,β3AR存在于棕色脂肪细胞组织和白色脂肪细胞组织中,通过结合去甲肾上腺素,引起棕色脂肪细胞组织产热、白色脂肪细胞组织脂肪分解。编码它的β3AR基因存在第64位氨基酸色氨酸(Trp)变成精氨酸(Arg)的多态性(Trp64Arg)。据报道:具有该多态性的受试者(日本人中34%存在该多态性)与没有上述多态性的受试者相比,安静时的代谢量是减少的。此外,UCP 1是一种在交感神经处于兴奋状态时,发挥棕色脂肪组织中的产热中心作用的蛋白质。另外,编码它的UCP1基因存在mRNA的-3826位(基因组序列中的UCP1基因的翻译起始点的上游3826位)的腺嘌呤(A)变成鸟 嘌呤(G)的多态性。据报道:具有该多态性的受试者(日本肥胖女性中24%存在该多态性)与没有上述多态性的受试者相比,全身的代谢量是减少的。由于如上这种各基因的多态性和代谢量之间的关系,实际上已在进行解析这些基因的多态性,将解析结果用于受试者的肥胖治疗、预防中。
另外,作为在基因水平解析所有疾病的原因、个体间的疾病易感性(易患疾病)、个体间的药效的差异等的方法,广泛地进行点突变、所谓的单核苷酸多态性(SNP)的检测。点突变的通常检测方法可以举出:(1)利用PCR(聚合酶链反应)扩增试样的目标DNA的相当于检测对象序列的区域,再对其全基因序列进行解析的直接测序法;(2)利用PCR扩增试样的目标DNA的相当于检测对象序列的区域,通过随上述检测对象序列有无目标突变而切断作用不同的限制酶,将该扩增产物切断,进行电泳从而进行分型的RFLP解析;(3)使用目标突变位于3’末端区域的引物进行PCR,通过有无扩增来判断突变的ASP-PCR法等。
但是,这些方法例如必须进行由试样提取的DNA的精制、电泳、限制酶处理等,因此需要功夫和成本。另外,进行PCR后,有必要暂时开启反应容器,因此有上述扩增产物混入到之后的反应体系内、解析精度降低的顾虑。而且,由于自动化困难,因此无法解析大量的样品。另外,上述(3)的ASP-PCR法,还存在特异性低的问题。
由该问题出发,近年来作为点突变的检测方法,正在实施对由目标核酸和探针形成的双链核酸的融解温度(Tm)进行解析的方法。这种方法由于通过Tm解析或上述双链的融解曲线的解析来进行,因此称作融解曲线解析。其为如下的方法。即,首先使用与含有检测目标点突变的检测对象序列互补的探针, 形成检测试样的目标单链DNA与上述探针的杂交体(双链DNA)。接着,对该杂交产物实施加热处理,通过吸光度等信号的变动来检测随着温度上升的杂交体的解离(融解)。然后,根据该检测结果确定Tm值,从而判断有无点突变。在杂交产物的同源性越高时Tm值越高、同源性越低时Tm值越低。因此,对于含有点突变的检测对象序列和与其互补的探针形成的杂交产物,预先求得Tm值(评价标准值),测定检测试样的目标单链DNA和上述探针的Tm值(测定值)。上述测定值与评价标准值相同时,则可以判断为匹配、即目标DNA存在点突变,测定值低于评价标准值时,则可以判断为错配、即目标DNA不存在点突变。而且,通过该方法还可以实现自动化。
但是,对于利用此类Tm解析的检测方法而言,存在PCR中必须特异且高效地扩增含有检测目标位点的区域的问题。特别是,肥胖基因中很受重视的β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因分别存在多种同工酶,编码这些同工酶的序列也非常相似。因此,在PCR中存在除了作为目标的这些基因以外,同工酶的编码基因也被扩增的可能性。此外,如上所述地其它同工酶的编码基因也被扩增的情况,也成为例如β2AR基因、β3AR基因和UCP 1基因的各多态性的解析(非专利文献1~3)中解析结果可信度降低的原因。因此,由于即使解析1个样品也要伴随极大的劳动力,存在在解析大量样品中不实用的问题。
非专利文献1:PMID:9399966J Clin Invest.1997Dec 15;100(12):3184-8.
非专利文献2:PMID:9049481 Diabetologia.1997Feb;40(2):200-4.
非专利文献3:PMID:9541178 Diabetolo gia.1998Mar;41(3):357-61.
发明内容
因此,本发明的目的在于提供一种用于通过基因扩增法特异性扩增选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少一个肥胖基因的目标区域的引物对。
为了实现上述目的,本发明的引物对,其特征在于,其为用于通过基因扩增法扩增肥胖基因的引物对,上述肥胖基因是选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少一个基因,所述引物对包含选自由下述引物对(1)~(3)所组成的组中的至少一个引物对。
引物对(1):
包含含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对
(F1):下列寡核苷酸中的至少一个:
与序列号1的碱基序列中的、以第4248位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1碱基、向着5’方向到第18~25个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端
和
与序列号1的碱基序列中的、以第4250位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1位碱基、向着5’方向到第18~26个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端
(R1):下列寡核苷酸中的至少一个:
与序列号1的碱基序列中的、以第4292位的腺嘌呤碱基(A)作为第1位碱基、向着3’方向到第21~31个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第4292位的腺嘌呤碱基(A)互补的胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端
和
与序列号1的碱基序列中的、以第4301位的腺嘌呤碱基(A)作为第1位碱基、向着3’方向到第18~27个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第4301位的腺嘌呤碱基(A)互补的胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端
引物对(2):
包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对
(F2):与序列号2的碱基序列中的、以第4110位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着5’方向到第16~20个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)作为3’末端
(R2):与序列号2的碱基序列中的、以第4172位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1位碱基、向着3’方向到第15~19个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第4172位的鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基(C)作为3’末端
引物对(3):
包含含有下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对
(F3):与序列号3的碱基序列中的、以第280位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着5’方向到第25~44个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)作为3’末端
(R3):与序列号3的碱基序列中的、以第350位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着3’方向到第23~38个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第350位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端
此外,本发明的基因扩增用试剂,其特征在于,其为用于通过基因扩增法扩增肥胖基因的试剂,上述肥胖基因是选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少一个基因,所述试剂包含上述本发明的肥胖基因扩增用引物对。
本发明的扩增产物的制造方法,其特征在于,其为通过基因扩增法制造肥胖基因的扩增产物的方法,上述肥胖基因是选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少一个基因,所述方法包含下述(I)步骤。
(I)以试样中的核酸作为模板,使用本发明的肥胖基因扩增用引物对,在反应液中扩增上述选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少一个基因的步骤
本发明的多态性解析方法,其特征在于,其为解析肥胖基因中的检测对象位点的多态性的方法,上述肥胖基因是选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少一个基因,所述方法包含下述(i)~(iv)步骤。
(i)通过本发明的扩增产物的制造方法,在反应液中扩增上述选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少1个基因中含有检测对象位点的区域的步骤
(ii)准备反应液的步骤,所述反应液含有上述(i)步骤中的扩增产物和能够与上述选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少1个基因的检测对象位点杂交的探针
(iii)改变上述反应液的温度,测定上述扩增产物和上述探针的杂交产物显示融解状态的信号值的步骤
(iv)根据伴随温度变化的上述信号值的变动,确定上述选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少1个基因中的检测对象位点的多态性的步骤
根据本发明的引物,可以在反应液中特异且高效地扩增选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少一个肥胖基因中的、含有发生检测目标多态性的位点的目标区域。因此,与上述的现有方法不同,可以减少功夫和成本。另外,由于如此特异地扩增上述肥胖基因中含有发生特定多态性的检测对象位点的区域,再通过使用例如与含有检测对象位点的检测对象序列互补的探针,可以使用上述反应液直接进行Tm解析、并进行所述多态性的分型。另外,由于可以在一个反应液中进行扩增、多态性的分型,因此还能够实现操作的自动化。而且,当使用本发明的引物对时,例如即便是含有杂质的试样(例如全血或口腔粘膜等),也可以省略预处理、因此,能够更为迅速且简单地进行扩增反应。另外,当使用本发明的引物对时,可以以优于以往的扩增效率进行扩增反应,因此还能够缩短扩增反应。因此,通过本发明的引物对、含有其的试剂以及使用它们的扩增产物的制造方法和多态性解析方法,可以迅速且简单的解析选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少一个肥胖基因的多态性,在医疗领域是非常有效的。
附图说明
图1是表示本发明的实施例1中的Tm解析结果的图。
图2是表示本发明的上述实施例1中的Tm解析结果的图。
图3是表示本发明的上述实施例1中的Tm解析结果的图。
图4是表示本发明的实施例2中的Tm解析结果的图。
图5是表示本发明的实施例3中的Tm解析结果的图。
图6是表示比较例中的Tm解析结果的图。
图7是表示本发明的实施例4中的Tm解析结果的图。
具体实施方式
<肥胖基因扩增用引物对>
本发明的肥胖基因扩增用引物对,如上所述,其特征在于,含有选自由上述引物对(1)~(3)所组成的组中的至少1个引物对。由于含有至少任一个引物对,因此,能够特异性扩增例如选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少一个肥胖基因中的特定的目标区域。
本发明的肥胖基因扩增用引物对,例如可以仅含有上述引物对(1)~(3)中的任意一种,也可以含有任意两种或者引物对(1)~(3)的全部。如后所述,通过引物对(1)可特异性扩增出的目标区域是β2AR基因中含有发生特定多态性的位点(序列号1中第4265位)的区域,通过引物对(2)可特异性扩增出的目标区域是β3AR基因中含有发生特定多态性的位点(序列号2中第4134位)的区域,通过引物对(3)可特异性扩增出的目标区域是UCP1基因中含有发生特定多态性的位点(序列号3中第292位)的区域。
如上所述,已知肥胖基因β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因的各自的特定的多态性都是对代谢有影响的多态性。因此,不仅要重视研究任意一种基因的多态性,研究任意2种基因或者所有3种基因的多态性都应予以重视。但是,传统方法存在无法在1个反应体系中解析多个序列的问题。如上所述,认为这是由于上述各肥胖基因存在多个同工酶,在PCR中连上述各基因以外的同工酶的编码基因也被扩增。因此,为了研究β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因中2种基因的多态性或者所有3种基因的多态性,需要在各个反应体系中分别扩增含有各个多态性发生位点的区域,再各自解析所获得的扩增产物。这样一来,传统的方法很难做到仅以肥胖基因中的上述特定的基因作为模板、 并仅特异性扩增各基因中分别含有上述多态性发生位点的2种或3种目标区域。因此,如上所述,解析1个样品就需要大量的劳动力,导致解析大量样品中不实用的问题。针对这一点,通过使用本发明的肥胖基因扩增用引物对,即便在含有上述引物对(1)~(3)中的任意2种或所有3种的情况下,也可以在同一反应液中同时且特异性扩增各个目标区域。因此,与上述传统方法不同,能够降低时间和成本。此外,如上所述,由于可以在同一反应液中特异性扩增2个或者3个目标区域,再通过使用与各个目标区域中的检测对象序列互补的探针,则可以使用上述反应液直接进行Tm解析、对上述2种或者3种多态性分别进行分型。如上所述,由于可以在同一反应液中对β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因中的2种或3种基因中的特定的多态性进行解析,因此本发明的肥胖基因扩增用引物对优选例如含有引物对(1)~(3)中任一种,还优选含有任意2种或3种。使用这样的肥胖基因扩增用引物对,当然可以扩增1个目标区域,若同时扩增2个或者3个目标区域,则可以比目前方法更高效地对上述肥胖基因进行多态性解析。
此外,以下有时将正向引物称为F引物,将反向引物称为R引物。
首先,对用于扩增β2AR基因的引物对(1)进行说明。引物对(1)如上所述是包含含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对。
(F1):下列寡核苷酸中的至少一个:
与序列号1的碱基序列中的、以第4248位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1碱基、向着5’方向到第18~25个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端
和
与序列号1的碱基序列中的、以第4250位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1位碱基、向着5’方向到第18~26个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端
(R1):下列寡核苷酸中的至少一个:
与序列号1的碱基序列中的、以第4292位的腺嘌呤碱基(A)作为第1位碱基、向着3’方向到第21~31个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第4292位的腺嘌呤碱基(A)互补的胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端
和
与序列号1的碱基序列中的、以第4301位的腺嘌呤碱基(A)作为第1位碱基、向着3’方向到第18~27个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第4301位的腺嘌呤碱基(A)互补的胸腺嘧啶碱基(T)作为3’末端
序列号1表示的碱基序列是编码人(Homo sapiens)源的β2肾上腺素受体蛋白(Homo sapiens adrenergic,beta-2-,receptor,surface;ADRβ2(β2AR))的ADRβ2基因的全长序列,例如,NCBI登录号为No.DQ094845的序列。
以下,也将该引物对(1)称为“β2AR基因用引物对”。上述β2AR基因用引物对是用于扩增序列号1中的、含有第4249~4291位的区域、第4249~4300位的区域、第4251~4291位的区域或者第4251~4300位的区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内的第4265位碱基(序列号1中的第4265位碱基)存在点突变(4265A、4265G)。如果第4265位碱基是A,则β2AR基因被翻译为蛋白质时,氨基酸16位是精氨酸(Arg);第4265位的碱基突变为G的情况下,呈现出氨基酸16位为甘氨酸(Gly) 的多态性。进而,在纯合子的情况下,这些多态性可以表示为4265A/4265A、4265G/4265G,在杂合子的情况下,这些多态性可以表示为4265A/4265G。此外,在用氨基酸表示的情况下,4265A/4265A可以表示为Arg-16/Arg-16,4265G/4265G可以表示为Gly-16/Gly-16,4265A/4265G可以表示为Arg-16/Gly-16,这种用氨基酸进行的表示是目标基因β2AR基因的多态性的常见表示。进而,在仅解析β2AR基因的上述多态性的情况下,可以仅使用β2AR基因用引物对。
在本发明中,β2AR基因用引物对的F 1引物和R1引物,只要用于决定DNA聚合酶扩增起始点的3’末端的碱基满足上述条件即可。通过如上所述固定各引物的3’末端的碱基,可以充分防止β2AR基因用引物对与例如相似的其它同工酶的基因(例如,β1AR基因等)结合。
如上所述,由于只需要固定F1引物和R1引物的3’末端的碱基,因此对各引物的长度本身并没有特殊的限定,可以适当调整为一般的长度。作为引物长度的一个例子,例如为13~50mer的范围,优选14~45mer,更优选15~40mer。作为具体例子,上述F 1引物优选如下:与序列号1的碱基序列中的、以第4248位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1碱基、向着5’方向到第18~25个碱基(优选第19~24个碱基,更优选第19~23个碱基)的区域序列相同的至少1个寡核苷酸、或者是与序列号1的碱基序列中的、以第4250位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1位碱基、向着5’方向到第18~26个碱基(优选第19~24个碱基,更优选第19~22个碱基)的区域序列相同的至少1个寡核苷酸。此外,上述R1引物优选如下:与序列号1的碱基序列中的、以第4292位的腺嘌呤碱基(A)作为第1位碱基、向着3’方向到第21~31个碱基(优选22~30个碱基、更优选23~28个碱基)的区域互补的 至少1个寡核苷酸。进而,由于F 1引物和R 1引物的3’末端被固定,因此从引物延伸出的区域例如如上所述为序列号1中的第4249~4291位的区域、4249~4300位的区域、4251~4291位的区域或者第4251位~4300位的区域,所获得的扩增产物的全长随使用的引物的长度而变化。
此外,R1引物可以是与序列号1表示的碱基序列不完全互补的寡核苷酸,F1引物可以是与上述碱基序列的互补链不完全互补的寡核苷酸。也就是说,各引物中除3’末端的碱基以外的部分可以与完全互补的寡核苷酸有1个~5个碱基不同。
构成R1引物的寡核苷酸中,与序列号1的碱基序列中第4298位互补的碱基可以是胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)中的任意一个。更优选同时使用与第4298位互补的碱基是胞嘧啶的寡核苷酸以及与第4298位互补的碱基是鸟嘌呤的寡核苷酸两者作为R1引物。已知序列号1的碱基序列中第4298位的碱基有多态性(4298C、4298G),但是本发明并不以该部分中的多态性为检测目标。因此,通过使用上述两种寡核苷酸作为R1引物,无论是4298C和4298G中的哪一种,都可以通过上述引物进行基因扩增,可以充分避免检测目标以外的多态性对目标区域的扩增的影响。与第4298位互补的碱基是胞嘧啶的寡核苷酸和与第4298位互补的碱基是鸟嘌呤的寡核苷酸的比例没有特别的限定,例如,优选摩尔比为1∶10~10∶1。
以下,示意出F1引物和R1引物的具体例子,但是本发明不限定于此。进而,序列号12~22的碱基序列中的“s”表示胞嘧啶(C)或者鸟嘌呤(G),相当于与序列号1第4298位互补的碱基。此外,对这些F1引物和R1引物的组合也没有任何限定,其中,特别优选包含含有序列号9或序列号109的寡核苷酸的F1’引物、以及含有序列号12或序列号18或序列号134的寡核苷酸的R1’引 物的引物对(1’)。进而,含有序列号12的寡核苷酸以及含有序列号18的寡核苷酸的R1’引物,如上所述优选同时含有“s”是胞嘧啶的寡核苷酸、和“s”是鸟嘌呤的寡核苷酸两者。下表中的“Tm(℃)”是下表的序列和与其完全互补的序列杂交的情况下的Tm(℃),是通过MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com)将参数设为寡核苷酸浓度0.2μM、钠当量(Na eq.)50mM而计算出来的(以下相同)。上述Tm值可以通过例如目前已知的MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com)等算出来,此外,还可以通过领接法(Nearest Neighbor Method)确定(以下相同)。下表中,记载了与序列号1的第4298位的碱基互补的碱基“s”是鸟嘌呤的R1引物的一个例子的Tm值。
[表1]
然后,对用于扩增β3AR基因的引物对(2)进行说明。上述引物对(2),如上所述,是包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对。
(F2):与序列号2的碱基序列中的、以第4110位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着5’方向到第16~20个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胞嘧 啶碱基(C)作为3’末端
(R2):与序列号2的碱基序列中的、以第4172位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1位碱基、向着3’方向到第15~19个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第4172位的鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基(C)作为3’末端
序列号2表示的碱基序列是编码人源的β3肾上腺素受体蛋白(Homo sapiens adrenergic,beta-3-,receptor;ADRβ3(β3AR))的ADRβ3基因的全长序列,例如NCBI登录号为:No.D Q 104441的序列。
以下,也将该引物对(2)称为“β3AR基因用引物对”。上述β3AR基因用引物对是用于扩增序列号2中的、含有第4111~4171位的区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内的第4134位碱基(序列号2中的第4134位碱基)存在点突变(4134T、4134C)。如果第4134位碱基是T,则β3AR基因被翻译为蛋白质时,氨基酸64位为色氨酸(Trp),第4134位的碱基突变为C的情况下,呈现出氨基酸64位变为精氨酸(Arg)的多态性。进而,在纯合子的情况下,这些多态性可以表示为4134T/4134T或4134C/4134C,在杂合子的情况下,这些多态性可以表示为4134T/4134C。此外,在用氨基酸表示的情况下,4134T/4134T可以表示为Trp-64/Trp-64,4134C/4134C可以表示为Arg-64/Arg-64,4134T/4134C可以表示为Trp-64/Arg-64,这种用氨基酸进行的表示是目标基因β3AR基因的多态性的常见表示。进而,在仅解析β3AR基因的多态性的情况下,可以仅使用β3AR基因用引物对。
β3AR基因用引物对的F2引物和R2引物,只要用于决定DNA聚合酶扩增起始点的3’末端的碱基满足上述条件即可。通过如上所述固定各引物的3’末端的碱基,可以充分防止β3AR基 因用引物对与例如相似的其它同工酶基因(例如,β1AR基因等)结合。
出于与上述β2AR基因用引物对相同的理由,F2引物和R2引物只要用于决定DNA聚合酶扩增起始点的3’末端的碱基满足上述条件即可。因此,F2引物和R2引物的长度本身并没有特殊的限定,可以例举与上述相同的长度。作为具体例子,上述F2引物优选如下:与序列号2的碱基序列中的、以第4110位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着5’方向到第16~20个碱基(优选第17~20个碱基,更优选第17~19个碱基)的区域序列相同的至少1个寡核苷酸。此外,上述R2引物优选如下:与序列号2的碱基序列中的、以第4172位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1位碱基、向着3’方向到第15~19个碱基(优选第16~19个碱基、更优选第16~18个碱基)的区域互补的至少1个寡核苷酸。进而,由于F2引物和R2引物的3’末端被固定,从引物延伸出的区域例如如上所述为序列号2中第4111~4171位的区域,所获得的扩增产物的全长随使用的引物的长度而变化。
此外,R2引物可以是与序列号2表示的碱基序列不完全互补的寡核苷酸,F2引物可以是与上述碱基序列的互补链不完全互补的寡核苷酸。也就是说,各引物除3’末端的碱基以外的部分中,与完全互补的寡核苷酸可以有1个~5个碱基不同。
以下,示意出F2引物和R2引物的具体例子,但是本发明不限定于此。此外,对这些F2引物和R2引物的组合也没有任何限定,其中,特别优选的是包含含有序列号24或序列号25的寡核苷酸的F2’引物、以及含有序列号28或序列号30的寡核苷酸的R2’引物的引物对(2’)。
[表2]
然后,对用于扩增UCP1基因的引物对(3)进行说明。上述引物对(3),如上所述,是包含含有下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对。
(F3):与序列号3的碱基序列中的、以第280位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着5’方向到第25~44个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)作为3’末端
(R3):与序列号3的碱基序列中的、以第350位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着3’方向到第23~38个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第350位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端
序列号3表示的碱基序列是编码人源的解偶联蛋白的5’多态性区域(Human polymorphic region 5’of uncoupling protein;UCP)的基因序列,例如,NCBI登录号:No.U28479所登录的序列。
以下,也将该引物对(3)称为“UCP1基因用引物对”。上述UCP1基因用引物对是用于扩增序列号3中的、含有第281~349位区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内的第292位碱基(序列号3中的第292位碱基)存在点突变(292A、292G)。在纯合子的情况下,这些多态性可以表示为292A/292A、 292G/292G,在杂合子的情况下,这些多态性可以表示为292A/292G。进而,序列号3中的第292位的碱基相当于UCP1的mRNA中的-3826位(UCP1基因翻译起始点的上游第-3826位)的碱基,上述多态性一般已知为-3826A/-3826A、-3826G/-3826G、-3826A/-3826G。进而,在仅解析UCP1基因的上述多态性的情况下,可以仅使用UCP1基因用引物对。
F3引物和R3引物只要用于决定DNA聚合酶扩增起始点的3’末端的碱基满足上述条件即可。通过如上所述固定各引物的3’末端的碱基,可以充分防止UCP1基因用引物对与例如相似的其它同工酶基因(例如,UCP2、UCP3、UCP4基因等)结合。
出于与β2AR基因用引物对相同的理由,UCP1基因用引物对的F 3引物和R3引物只要用于决定DNA聚合酶扩增起始点的3’末端的碱基满足上述条件即可。因此,F3引物和R3引物的长度本身并没有特殊的限定,可以例举与上述相同的长度。作为具体例子,上述F3引物优选如下:与序列号3的碱基序列中的、以第280位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着5’方向到第25~44个碱基(优选第30~40个碱基,更优选第32~37个碱基)的区域序列相同的至少1个寡核苷酸。上述R3引物优选如下:与序列号3的碱基序列中的、以第350位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着3’方向到第23~38个碱基(优选第25~36个碱基、更优选第26~32个碱基)的区域互补的至少1个寡核苷酸。进而,由于F 3引物和R3引物的3’末端被固定,从引物延伸出的区域例如如上所述为序列号3中的第281位~第349位的区域,所获得的扩增产物的全长随使用的引物的长度而变化。
此外,R3引物可以是与序列号3表示的碱基序列不完全互补的寡核苷酸,F3引物可以是与上述碱基序列的互补链不完全互补的寡核苷酸。也就是说,各引物除3’末端的碱基以外的部 分中,与完全互补的寡核苷酸可以有1个~5个碱基不同。
构成R3引物的寡核苷酸中,与序列号3的碱基序列中的第376位互补的碱基可以是鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)中的任一个。更优选同时使用与第376位互补的碱基是鸟嘌呤的寡核苷酸、及与第376位互补的碱基是胸腺嘧啶的寡核苷酸二者作为R3引物。已知序列号3的碱基序列中第376位的碱基有多态性(376C、376A),但是本发明并不以该部分中的多态性为检测目标。因此,通过使用上述两种寡核苷酸作为R3引物,不论是376C和376A中的哪一种,都可以通过上述引物进行基因扩增,可以充分避免检测目标以外的多态性对目标区域的扩增的影响。与第376位互补的碱基是鸟嘌呤的寡核苷酸和与第376位互补的碱基是胸腺嘧啶的寡核苷酸的比例没有特别的限定,例如优选摩尔比为1∶10~10∶1。
以下,示意出F3引物和R3引物的具体例子,但是本发明不限定于此。进而,序列号53~64的碱基序列中的“k”表示鸟嘌呤(G)或者胸腺嘧啶(T),下表的序列号53~64中记载了与序列号3的第376位碱基互补的碱基是鸟嘌呤或者胸腺嘧啶的情况下各自的Tm值。对这些F3引物和R3引物的组合也没有任何限定,其中,特别优选包含含有序列号43的寡核苷酸的F3’引物、以及含有序列号63的寡核苷酸的R3’引物的引物对(3’)。进而,含有序列号63的寡核苷酸的R3’引物,如上所述,优选同时含有“k”是鸟嘌呤的寡核苷酸和“k”是胸腺嘧啶的寡核苷酸。
[表3]
此外,例如为了升高扩增反应的反应温度,上述引物对(1)~(3)的各引物还可以在5’末端添加目前已知的任意序列。
含有此类引物对(1)~(3)中的至少一个的本发明肥胖基因扩增用引物对,优选例如在扩增全血试样等生物试样中的肥胖基因时使用。特别是,将本发明的肥胖基因扩增用引物对与如后所述的多态性检测用探针同时使用的时候,基因扩增用反应液中全血试样的添加比例优选为0.1~0.5体积%。关于该点,容后再叙。
<肥胖基因扩增用试剂>
如上所述,本发明的肥胖基因扩增用试剂,其特征在于,其是用于通过基因扩增法扩增肥胖基因的试剂,上述肥胖基因是选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少1个基因,所述试剂含有本发明的肥胖基因扩增用引物对。本发明的肥胖基因扩增用试剂,以含有本发明的引物对为特征,对于此外的组成等没有任何限定。
为了检测使用本发明引物对通过基因扩增法获得的扩增产物,本发明的肥胖基因扩增用试剂,例如可以进一步含有能与上述肥胖基因的检测对象位点杂交的探针。如上所述,利用本发明的引物对,例如可以根据其所含的引物对(1)~(3)的种类,通过基因扩增法,分别特异性扩增3种肥胖基因各自的区域。因此,通过同时存在有与上述肥胖基因目标区域中的检测对象序列互补的(能够杂交的)探针,例如能够通过后述的方法检测扩增的有无、检测对象位点的基因型(多态性)等。此类探针、其利用方法将在后面的多态性解析方法中说明。此外,本发明的肥胖基因扩增用试剂,优选用在扩增全血等生物试样中的肥胖基因时。特别是,本发明的肥胖基因扩增用试剂,在与如上所述的探针一同使用时,优选基因扩增用反应液中全血试样的添加比例为0.1~0.5体积%。进而,在本发明中,“检测对象序列”意指含有发生多态性的位点(检测对象位点)的序列。
本发明的肥胖基因扩增用试剂的形态没有特别的限定,例如,可以是含有本发明的肥胖基因扩增用引物对的液体试剂,也可以是在使用前用溶剂悬浮的干燥试剂。此外,对肥胖基因扩增用引物对的含量也没有特别的限定。
<扩增产物的制造方法>
本发明的扩增产物的制造方法,如上所述,其特征在于, 其为通过基因扩增法制造肥胖基因的扩增产物的方法,上述肥胖基因为选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少1个基因,所述方法含有下述(I)步骤。
(I)以试样中的核酸作为模板,使用本发明的肥胖基因扩增用引物对,在反应液中扩增上述选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少1个基因的步骤。
如上通过使用本发明的引物对进行扩增反应,如上所述,可以扩增肥胖基因的目标区域。此外,在本发明的肥胖基因扩增用引物对含有上述引物对(1)~(3)中任意2种的情况下,可以对任意2种肥胖基因在同一反应液中同时扩增含有各自检测对象位点的目标区域。此外,在本发明的肥胖基因扩增用引物对含有上述引物对(1)~(3)的全部的情况下,可以对上述全部3种肥胖基因在同一反应液中同时扩增含有各自检测对象位点的目标区域。利用本发明所扩增出的目标区域,如上所述,是各肥胖基因中分别含有发生各多态性的检测对象位点的区域。进而,本发明的扩增产物的制造方法以使用本发明的引物对为特征,对基因扩增法的种类、条件等没有任何限定。
上述基因扩增法如上所述并无特别限定,例如可以举出PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)法、NASBA(Nucleic acid sequence based amplification,基于核酸序列的扩增)法、TMA(Transcription me diated amplification,转录介导扩增)法、SDA(Strand Displacement Amplification,链置换扩增)法等,优选PCR法。另外,以下以PCR法为例说明本发明,但并非局限于此。
作为适用本发明的试样,例如只要含有成为模板的核酸即可,并无特别限定,例如优选应用于含有杂质的试样。作为上 述含有杂质的试样例如可以举出全血、口腔内细胞(例如口腔粘膜)、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、吐出的痰液、羊水、石蜡包埋组织、尿、胃液(例如胃洗涤液)等、它们的混悬液等。根据使用本发明引物对的扩增产物的制造方法,例如即便是含有各种杂质的试样(特别是全血或口腔细胞等生物试样),也不易受杂质影响,可以特异地扩增3种肥胖基因各自的目标区域。因此,通过本发明,即便是通过以往方法较难测定的杂质多的试样,也可以不进行例如精制等预处理而直接使用。因此,从试样的预处理的观点出发,可以说可以较以往方法更为迅速地制造扩增产物。
上述反应液中的试样添加比例并无特别限定。作为具体例,当上述试样为生物试样(例如全血试样)时,上述反应液中的添加比例的下限优选为例如0.01体积%以上、更优选为0.05体积%以上、进一步优选为0.1体积%以上。上述添加比例的上限并无特别限定,例如优选为2体积%以下、更优选为1体积%以下、进一步优选为0.5体积%以下。
另外,以如后所述的光学检测为目的时,特别是进行使用标记探针的光学检测时,全血试样这类生物试样的添加比例例如优选设定为0.1~0.5体积%。在PCR反应中,通常为了使DNA变性(解离成单链DNA)而实施加热处理,但由于该加热处理,试样所含的糖、蛋白质等变性,有产生不溶沉淀物、混浊等的顾虑。因此,在利用光学方法确认扩增产物的有无、检测对象位点的基因型(多态性)时,这种沉淀物、混浊的发生有可能对测定精度造成影响。但是,通过将反应液中的全血试样的添加比例设定在上述范围内,虽然原理不明,但可以充分防止变性所产生的沉淀物等造成的影响,因此可以提高光学方法的测定精度。另外,由于还可充分地抑制全血试样中的杂质对PCR 的干扰,因此可以进一步提高扩增效率。因而,在使用本发明的引物对的基础上,通过进一步将全血试样等试样的添加比例设定在上述范围内,可以进一步排除试样预处理的必要性。
另外,上述反应液中的全血试样的比例不仅可以用上述体积比例(例如0.1~0.5体积%),还可以用血红蛋白(以下称作“Hb”)的重量比例表示。此时,上述反应液中的全血试样的比例换算为Hb例如优选为0.565~113g/L的范围、更优选为2.825~56.5g/L的范围、进一步优选为5.65~28.25g/L的范围。另外,上述反应液中的全血试样的添加比例例如可以满足上述体积比例和Hb重量比例两者,也可以满足任一者。
作为全血,例如可以是溶血的全血、未溶血的全血、抗凝固全血、含有凝固部分的全血等的任一种。
本发明中,试样所含的目标核酸例如为DNA。上述DNA例如可以是生物试样等试样中原本含有的DNA,还可以是通过基因扩增法扩增出的扩增产物DNA。为后者时,可以举出利用逆转录反应(例如RT-PCR,逆转录PCR)由上述试样原本含有的RNA(总RNA、mRNA等)产生的cDNA。
本发明的扩增产物的制造方法中,优选在基因扩增反应开始前,向上述反应液中添加白蛋白。通过这种白蛋白的添加,例如可以进一步降低上述沉淀物、悬浊的产生所带来的影响,且可以进一步提高扩增效率。具体地说,优选在上述(I)步骤的扩增反应或解离为单链DNA的步骤前添加白蛋白。
上述反应液中白蛋白的添加比例例如为0.01~2重量%的范围、优选为0.1~1重量%、更优选为0.2~0.8重量%。上述白蛋白并无特别限定,例如可以举出牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、马血清白蛋白等,这些物质可以使用任一种,还可以并用两种以上。
然后,对于本发明的扩增产物的制造方法列举如下的例子进行说明,所述例子为:对全血试样,以DNA作为目标核酸,使用含有上述引物对(1)~(3)的本发明的肥胖基因扩增用引物对,利用PCR在同一反应液中同时制造β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因的各扩增产物。进而,本发明是以使用本发明的引物对为特征,对其它的构成和条件没有任何限定。
首先,制备PCR反应液。本发明的引物对的添加比例并无特别限定,优选按照引物对(1)~(3)的F引物分别达到0.1~2μmol/L的方式进行添加、更优选为0.25~1.5μmol/L、特别优选为0.5~1μmol/L。另外,优选按照引物对(1)~(3)的R引物分别达到0.1~2μmol/L的方式进行添加、更优选为0.25~1.5μmol/L、特别优选为0.5~1μmol/L。各引物对中的F引物和R引物的添加比例(F∶R,摩尔比)并无特别限定,例如优选为1∶0.25~1∶4、更优选为1∶0.5~1∶2。
反应液中全血试样的比例并无特别限定,优选上述范围。全血试样可以直接添加在反应液中,还可以预先用水或缓冲液等溶剂稀释后添加至反应液中。预先稀释全血试样时,其稀释率并无特别限定,例如稀释率可以按照反应液中最终全血添加比例达到上述范围来进行设定,稀释率例如设定为100~2000倍、优选为200~1000倍。
上述反应液中的其它组成成分并无特别限定,可以举出目前已知的成分,其比例也无特别限定。上述组成成分例如可以举出DNA聚合酶、核苷酸(核苷三磷酸(dNTP))和溶剂。另外,如上所述,优选上述反应液中进一步含有白蛋白。另外,上述反应液中,各组成成分的添加顺序并无任何限定。
上述DNA聚合酶并无特别限定,例如可以使用目前已知的耐热性细菌来源的聚合酶。具体例子有可以商业地获得的来自 栖热水生菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(美国专利第4,889,818号以及美国专利第5,079,352号)(商品名Taq聚合酶)、来自极端嗜热菌(Thermus thermophilus)的DNA聚合酶(WO 91/09950)(rTth DNA polymerase)、来自强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的DNA聚合酶(WO 92/9689)(Pfu DNA polymerase:Stratagenes公司产)、来自嗜热球菌(Thermococcus litoralis)的DNA聚合酶(EP-A 455430)(商标Vent:New England Biolabs公司产)等,其中,优选来自栖热水生菌(Thermus aquaticus)的耐热性DNA聚合酶。
上述反应液中DNA聚合酶的添加比例并无特别限定,例如为1~100U/mL、优选为5~50U/mL、更优选为20~30U/mL。另外,DNA聚合酶的活性单位(U)一般是以活化鲑鱼精子DNA为模板引物,在活性测定用反应液中、74℃下、30分钟内,将10nmol的总核苷酸吸收到酸不溶性沉淀物中的活性作为1U。上述活性测定用反应液的组成例如为25mM TAP S buffer(pH9.3、25℃)、50mM KCl、2mM MgCl2、1mM巯基乙醇、200μM dATP、200μM dGTP、200μM dTTP、100μM“α-32P”dCTP、0.25mg/mL活化鲑鱼精子DNA。
上述核苷三磷酸通常可以举出dNTP(dATP、dCTP、dTTP)。上述反应液中的dNTP的添加比例并无特别限定,例如为0.01~1mmol/L、优选为0.05~0.5mmol/L、更优选为0.1~0.3mmol/L。
上述溶剂例如可以举出Tris-HCl、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、MES、MOPS、HEPES、CAPS等缓冲液,可以使用市售的P CR用缓冲液或市售的PCR试剂盒的缓冲液等。
另外,上述PCR反应液还可以含有肝素、甜菜碱、KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等,它们的添加比例例如可以设定为不干扰PCR反应的范围。
反应液的总体积并无特别限定,例如可以根据所用机器(热循环仪)等适当地设定,通常为1~500μL、优选为10~100μL。
接着,进行PCR。PCR循环条件并无特别限定,例如(1)全血来源的双链DNA解离成单链DNA、(2)引物的退火、(3)引物的延伸(聚合酶反应)分别如下所述。另外,循环数也无特别限定,以下述(1)~(3)的3步骤为1个循环,例如优选为30个循环。上限并无特别限定,例如共计100个循环以下、优选70个循环以下、更优选50个循环以下。各步骤的温度变化例如可以使用热循环仪等自动地控制。使用本发明的引物对时,如上所述由于扩增效率优异,因此与利用以往方法时50个循环需要3小时左右相比,利用本发明可以在约1小时左右(优选1小时以内)完成50个循环。
[表4]
如上操作,可以在同一反应液中同时制造β2AR基因、β3AR基因和UCP 1基因的各目标区域的扩增产物。进而,在制造与3种肥胖基因中任意1种或任意2种肥胖基因的各目标区域互补的扩增产物的情况下,可以使用含有引物对(1)~(3)中与目标区域相应的任意1种或任意2种引物对的本发明的肥胖基因扩增用引物对。
本发明的扩增产物的制造方法还包含检测通过上述扩增反应获得的扩增产物的步骤。如此,可以检测扩增产物的有无、或者上述肥胖基因的目标区域的基因型。扩增产物的有无可以 通过目前已知的方法来确定。具体来说,可以如下进行确认:在上述(I)步骤中,向上述反应液中预先添加能够与β2AR基因、β3AR基因或UCP1基因的检测对象位点杂交的探针(例如荧光标记探针),进而,通过(II)步骤、即对于上述反应液测定上述探针的荧光标记的荧光强度来确认。另外,当所扩增的目标区域为2个或3个时,例如可以如下进行确认:在上述(I)步骤中向上述反应液中预先添加两种或三种能够与β2AR基因、β3AR基因和UCP 1基因中任一个的各检测对象位点杂交的探针(例如荧光标记探针),进而,通过(II)步骤、即对上述反应液测定各探针的各荧光标记的荧光强度来确认。另外,以下将肥胖基因多态性的检测作为本发明的一方式来进行说明。
<肥胖基因的多态性解析方法>
本发明的多态性解析方法,其特征在于,其为解析肥胖基因中的检测对象位点的多态性的方法,上述肥胖基因是选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少1个基因,所述方法含有下述(i)~(iv)的步骤。
(i)通过本发明的扩增产物的制造方法,在反应液中扩增上述选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少1个基因中的、含有检测对象位点的区域的步骤
(ii)准备反应液的步骤,所述反应液含有上述(i)步骤中的扩增产物、和能够与上述选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少1个基因的检测对象位点杂交的探针
(iii)改变上述反应液的温度,测定上述扩增产物和上述探针的杂交产物显示融解状态的信号值的步骤
(iv)根据伴随温度变化的上述信号值的变动,确定上述选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少 1个基因的检测对象位点的多态性的步骤
如此,通过使用本发明的引物对制造扩增产物,如上所述可以扩增β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因中的至少1个肥胖基因中的、含有多态性检测对象位点的目标区域,可以解析上述目标区域中的检测对象位点的多态性。
上述(ii)步骤中的探针没有特别的限定,优选与β2AR基因的检测对象位点杂交的探针(以下,称为“β2AR基因用探针”)、与β3AR基因的检测对象位点杂交的探针(以下,称为“β3AR基因用探针”)和与UCP1基因的检测对象位点杂交的探针(以下,称为“UCP1基因用探针”)。这些探针优选为与含有上述检测对象位点的检测对象序列互补的探针。这些探针可以是任意一种,也可以是任意2种或者全部3种,例如可以根据使用本发明的肥胖基因扩增用引物对所扩增的目标区域的种类来确定。在使用2种或3种探针的情况下,例如可以使用同一反应液解析任意2个检测对象位点或者全部的上述3个检测对象位点的多态性。
针对上述肥胖基因的探针没有特殊的限定,可以根据目前已知的方法来设定,例如,基于各肥胖基因的正义链的序列来设计含有多态性检测对象位点的检测对象序列;也可基于反义链的序列来设计含有多态性检测对象位点的检测对象序列。此外,多态性的检测对象位点的碱基,可以根据各多态性的种类适当确定。也就是说,在β2AR基因的情况下,由于已知序列号1中第4265位碱基存在“A”和“G”的多态性,因此例如可以列举与第4265位是A的检测对象序列和第4265位是G的检测对象序列中的任意一种互补的探针(正义链检测用探针)、或者与其反义链的序列互补的探针(反义链检测用探针)。此外,在β3AR基因的情况下,由于已知序列号2中第4134位碱基存在“T”和 “C”的多态性,因此可以列举与第4134位是T的检测对象序列和第4134位是C的检测对象序列中的任意一种互补的探针(正义链检测用探针)、或者与其反义链的序列互补的探针(反义链检测用探针)。此外,在UCP1基因的情况下,由于已知序列号3中第292位碱基存在“A”和“G”的多态性,因此例如可以列举与第292位是A的检测对象序列和第292位是G的检测对象序列中的任意一种互补的探针(正义链检测用探针)、或者与其反义链的序列互补的探针(反义链检测用探针)。如此,不论将发生多态性的检测目标位点的碱基设计成上述的任一种碱基,都可以通过后述的方法判断各肥胖基因的检测目标位点显示何种多态性。
上述各探针可以在上述(i)步骤后、即对上述肥胖基因的目标区域进行扩增反应后添加于扩增反应液中,但优选在上述(i)步骤的扩增反应之前预先添加到反应液中,其原因在于这样能容易且迅速地进行解析。
上述反应液中探针的添加比例并无特别限定,例如优选按照各探针达到10~400nmol的范围的方式进行添加,更优选为20~200nmol。另外,使用荧光染料作为探针的标记时,例如为了调整所检测的荧光强度,可以同时使用与标记探针序列相同的未标记探针,该未标记探针可以在其3’末端添加有磷酸。此时,标记探针与未标记探针的摩尔比例如优选为1∶10~10∶1。上述探针的长度并无特别限定,例如为5~50mer、优选为10~30mer。
对于Tm值进行说明。当持续加热含有双链DNA的溶液时,260nm的吸光度上升。这是由于双链DNA双链间的氢键通过加热而打开,解离成单链DNA(DNA的融解)。而且,当全部双链DNA解离、变为单链DNA时,其吸光度显示为加热开始时的 吸光度(仅双链DNA时的吸光度)的约1.5倍左右,由此可以判断融解结束。根据该现象,融解温度Tm一般定义为吸光度到达吸光度总上升量的50%时的温度。
在上述(iii)步骤中,测定上述扩增产物与上述探针的杂交产物显示融解状态的信号,既可以是上述260nm的吸光度的测定,还可以是标记物的信号的测定。具体地说,优选如下:使用被标记物标记的标记探针作为上述探针,测定上述标记物的信号。上述标记探针例如可以举出单独显示信号、由于杂交而不显示信号的标记探针;或者单独不显示信号、由于杂交而显示信号的标记探针。为前者的探针时,在与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时不显示信号,通过加热探针游离时,则显示信号。另外,为后者的探针时,在与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时显示信号,通过加热探针游离时,则信号减少(消失)。因此,通过利用信号特有的条件(吸收波长等)检测该标记所产生的信号,可以与上述260nm的吸光度测定同样,在融解进行的同时确定Tm值等。
本发明中,还可以对于在同一反应液中扩增出的2种或3种肥胖基因的扩增产物确认各自的多态性。因此,使用2种或3种探针时,优选用在不同的条件下检测的不同标记(例如荧光标记)进行标记。如此,通过使用不同的标记,即便是同一反应液,也可以通过改变检测条件来分别解析各扩增产物。
上述标记探针的标记物的具体例子,例如可以举出荧光染料(荧光团)。上述标记探针的具体例子例如优选用荧光染料进行标记、单独显示荧光、且由于杂交荧光减少(例如淬灭)的探针。利用这种荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针一般被称作荧光淬灭探针。其中,上述探针优选寡核苷酸的3’末端或5’末端被荧光染料标记,被标记的上述末端的碱基优选 为C。此时,优选如下设计上述标记探针的碱基序列:在上述标记探针所杂交的检测对象序列中,与上述标记探针的末端碱基C成对的碱基或者从上述成对的碱基距离1~3个碱基的碱基为G。这种探针一般被称作鸟嘌呤淬灭探针,已知有所谓的QProbe(注册商标)。这种鸟嘌呤淬灭探针与检测对象序列杂交时,用荧光染料标记的末端C接近上述检测对象DNA中的G,因此显示上述荧光染料的发光减弱(荧光强度减少)的现象。使用这种探针时,可以利用信号的变动容易地确认杂交和解离。
上述荧光染料并无特别限定,例如可以举出荧光染料、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等,作为市售的荧光染料例如可以举出BODIPYFL(商标、モレキユラ一·プロ一ブ公司制)、FluorePrime(商品名、アマシヤムフアルマシア公司制)、Fluoredite(商品名、Milipore公司制)、FAM(ABI公司制)、Cy3和Cy 5(アマシヤムフアルマシア公司制)、TAMRA(モレキユラ一·プロ一ブ公司制)等。三种探针中使用的荧光染料的组合例如只要能够在不同条件下检测即可,并无特别限定,例如可以举出Pacific Blue(检测波长450~480nm)、TAMRA(检测波长585~700nm)、BODIPYFL(检测波长515~555nm)的组合等。
以下,示意出用于检测上述β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因的各多态性的探针序列的具体例子。但是本发明不限定于此。下述探针(P1)是β2AR基因用探针的一个例子,(1-1)是用于检测正义链的探针,(1-2)是用于检测反义链的探针。下述探针(2)是β3AR基因用探针的一个例子,(2-1)是用于检测反义链的探针,(2-2)是用于检测正义链的探针。下述探针(3)是UCP1基因用探针的一个例子,是用于检测反义链的探针。进而,各探针(P1)~(P3)可以分别使用1种,也可以 如后述,同时使用2种以上。
探针(P1)
(1-1):与序列号1中的、以第4254位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1位碱基、向着3’方向到第21~26个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述胸腺嘧啶碱基互补的腺嘌呤碱基(A)作为3’末端
(1-2):与序列号1中的、以第4259位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着3’方向到第15~19个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基作为5’末端
探针(P2)
(2-1):与序列号2中的、以第4140位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着5’方向到第17~28个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基作为3’末端
(2-2):与序列号2中的、以第4144位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1位碱基、向着5’方向到第12~17个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述鸟嘌呤碱基互补的胞嘧啶碱基(C)作为5’末端
探针(P3)
与序列号3中的、以第280位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着3’方向到第17~31个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基作为5’末端
在上述探针(1-1)中,用y表示与序列号1第4265位互补的碱基,上述y是T或者C。在上述探针(1-2)中,用r表示位于序列号1第4265位的碱基,上述r是A或者G。在上述探针(2-1) 中,用y表示位于序列号2第4134位的碱基,上述y是T或者C,在上述探针(2-2)中,用r表示与序列号2第4134位互补的碱基,上述r是A或者G。在上述探针(3)中,用r表示位于序列号3第292位的碱基,上述r是A或者G。
进一步,下表示意出上述探针(1)、探针(2)和探针(3)的具体例子。而且,下表中的“Tm(℃)”是下表的序列和与其完全互补的序列杂交的情况下的Tm(℃),是利用MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)将参数设为寡核苷酸浓度0.2μM、钠当量(Na eq.)50mM而计算出的值。
[表5]
在上表中,序列号69~74的寡核苷酸是探针(1-1)的具体例子,各碱基序列中的“y”,如下所述,可以是T和C中的任一个。在上表中,“y”是C的序列号69~序列号74所表示的探针(1-1)是与序列号1的第4265位碱基是G的β2AR基因(正义链)互补(完全匹配)的探针,大写的碱基C表示与序列号1第4265 位的碱基G互补的碱基。在上表中,示意出“y”是“C”的探针序列、以及上述探针和与其完全互补的序列杂交时的Tm值(℃)作为具体例子。
5’-cgcatggcttcyattgggtgcca-3’(序列号72:y)
5’-cgcatggcttccattgggtgcca-3’(序列号72、101:y是C)
5’-cgcatggcttctattgggtgcca-3’(序列号72、101:y是T)
在上表中,序列号112~116的寡核苷酸是上述探针(1-2)的具体例子,各碱基序列中的“r”如上所述可以是A和G中的任一个。此外,在上表中,“r”是G的序列号112~序列号116所表示的探针(1-2)是与序列号1第4265位碱基是G的β2AR基因的互补链(反义链)互补(完全匹配)的探针,大写的碱基表示序列号1第4265位的碱基。在上表中,示意出“r”是“G”的探针序列、以及上述探针和与其完全互补的序列杂交时的Tm值(℃)作为具体例子。
[表6]
在上表中,序列号75~86所示的探针(2-1)包含与序列号2第4134位是C的区域相同的序列,大写的碱基表示序列号2中第4134位的碱基。进而,在上述探针(2-1)中,上述大写的碱基可以置换为y,上述y可以是C和T中的任一个。在上表中,序列号117~128所示的探针(2-2)包含与序列号2中第4134位碱基是C的区域互补的序列,大写的碱基表示与序列号2中第4134位的碱基互补的碱基。进而,在上述探针(2-2)中,上述大写的碱基可以置换为r,上述r可以是G和A中的任一个。在上表中, 序列号87~100和139所表示的探针(3)包含与序列号3中第292位碱基是G的区域相同的序列,大写的碱基表示序列号3中的第292位的碱基。进而,在上述探针(3)中,大写的碱基可以置换为r,上述r可以是G和A中的任一个。进而,本发明中的探针的具体例子,如上所述例如也可以是上表中所示的寡核苷酸的互补链。
上述探针是一个例子,本发明并不限定于此。β2AR基因用探针优选探针(1-1)之中含有序列号72的碱基序列的寡核苷酸,“y”如上所述可以是T和C的任一个。此外,在探针(1-2)之中,优选含有序列号114的碱基序列的寡核苷酸,“r”可以是A和G的任一个。此外,优选同时使用所谓的野生型检测用探针和突变型检测用探针作为β2AR基因用探针。在此,野生型检测用探针是指例如用于检测序列号1第4265位碱基是A(或者G)的检测对象序列(正义链)或其互补链(反义链)的探针,突变型检测用探针是指用于检测序列号1第4265位碱基是G(或者A)的检测对象序列(正义链)或其互补链(反义链)的探针。在本发明中,探针(1-1)之中优选例如同时使用含有“y”是“C”的序列号69~74的碱基序列的至少1个寡核苷酸(突变型检测用探针)、和含有“y”是“T”的序列号69~74的碱基序列的至少1个寡核苷酸(野生型检测用探针),更优选同时使用含有“y”是“C”的序列号72的碱基序列的寡核苷酸(突变型检测用探针)、和含有“y”是“T”的序列号72的碱基序列的寡核苷酸(野生型检测用探针)。
本发明人根据其它方法对多态性解析进行研究,结果发现在解析β2AR基因多态性(编码β2AR第16位氨基酸的位点的多态性:序列号1第4265位碱基的多态性)的情况下,通过使用探针进行Tm解析时,信号检测很困难。因此,本发明人进行进一 步深入研究,结果发现若上述探针(1)是含有序列号72的碱基序列的寡核苷酸(也就是序列号101的寡核苷酸和序列号102的寡核苷酸),则如后述那样能够充分区分并检测与β2AR基因的扩增产物匹配情况下的信号和错配情况下的信号。序列号101表示的探针是与序列号1第4265位碱基是G的β2AR基因(正义链)的检测对象序列完全匹配的探针,序列号102表示的探针是与序列号1的第4265位碱基是A的β2AR基因(正义链)的检测对象序列完全匹配的探针。进而,如上所述,本发明的特征是通过使用肥胖基因扩增用引物对,在同一反应液中同时且特异性扩增3种基因各自的目标区域,因此,对所获得的扩增产物的解析中所使用的探针序列没有特殊的限定。
β3AR基因用探针优选探针(2-1)之中含有序列号83的碱基序列的寡核苷酸。此外,优选同时使用所谓的野生型检测用探针和突变型检测用探针作为探针(2-2)。在此,野生型检测用探针例如是指用于检测序列号2第4134位碱基是T的检测对象序列(正义链)或其互补链(反义链)的探针,突变型检测用探针是指用于检测序列号2第4134位碱基是C的检测对象序列(正义链)或其互补链(反义链)的探针。在本发明中,例如优选同时使用含有序列号117~122的碱基序列的至少1个寡核苷酸(突变型检测用探针)、和含有序列号123~128的碱基序列的至少1个寡核苷酸(野生型检测用探针),更优选同时使用含有序列号120的碱基序列的寡核苷酸(突变型检测用探针)、和含有序列号127的碱基序列的寡核苷酸(野生型检测用探针)。在这样同时使用野生型检测用探针和突变型检测用探针的情况下,优选例如设定为使各探针的完全匹配的Tm值错开。
UCP1基因用探针优选探针(3)之中含有序列号95或序列号139的碱基序列的寡核苷酸。
并且,使用2种以上这些探针时,如前所述优选分别用不同的荧光染料(用不同的波长检测的荧光染料)进行标记。例如,将上表中所示的探针作成淬灭探针的情况下,优选探针(1-1)和探针(2-1)的3’末端用上述那样的荧光染料(例如,Pacific Blue、BODIPY FL等)进行标记,优选探针(1-2)、探针(2-2)和探针(3)的5’末端的胞嘧啶用上述那样的荧光染料(例如TAMRA等)进行标记。进而,上表中表示的探针(1-1)的3’末端是腺嘌呤(A),但由于可以通过相邻的胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)杂交来确定淬灭,因此也可以作为鸟嘌呤淬灭探针来使用。另外,在5’末端标记有荧光染料的探针,为了预防探针本身延伸,还可以在其3’末端进一步添加磷酸基。此外,如上所述地使用野生型检测用探针和突变型检测用探针的情况下,各自的荧光染料可以相同也可以不同。
接下来,举一个例子对本发明的检测方法进行说明,所述例子为:使用下述探针检测β2AR基因的多态性(序列号1中第4265位碱基的多态性)、β3AR基因的多态性(序列号2中第4134位碱基的多态性)和UCP1基因的多态性(序列号3中第292位碱基的多态性)。另外,本发明并不限定于此。
(探针)
β2AR基因用探针
5’-cgcatggcttcCattgggtgcca-(Pacific Blue)-3’(序列号72)或
5’-(Pacific Blue)-cccaatGgaagccatgc-P-3’(序列号114)
β3AR基因用探针
5’-cgtggccatcgccCggactc-(BODIPY FL)-3’(序列号83)或
5’-(BODIPY FL)-ctcggagtccGggc-P-3’(序列号120)和
5’-(BODIPY FL)-ctcggagtccAggc-P-3’(序列号127)
UCP1基因用探针
5’-(TAMRA)-cacagtttgatcGagtgcatttg-3’(序列号95)或
5’-(TAMRA)-cacagtttgatcGagtg-3’(序列号139)
首先,使用添加了上述3种标记探针的反应液,如上所述地进行PCR,在同一反应液中同时扩增β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因的各目标区域。
接着,进行所得的扩增产物的解离以及通过解离获得的单链DNA与上述标记探针的杂交。这可以通过例如改变上述反应液的温度来进行。
上述解离步骤的加热温度只要是上述扩增产物能够解离的温度则无特别限定,例如为85~95℃。加热时间也无特别限定,通常为1秒~10分钟、优选1秒~5分钟。
解离的单链DNA和上述标记探针的杂交例如可以在上述解离步骤后,通过降低上述解离步骤的加热温度来进行。温度条件例如为40~50℃。
然后,改变上述反应液的温度,测定上述扩增产物与上述标记探针的杂交产物显示融解状态的信号值。具体地说,例如加热上述反应液(上述单链DNA与上述标记探针的杂交产物),测定随温度上升的信号值的变动。如上所述,例如当使用鸟嘌呤淬灭探针时,在与单链DNA杂交的状态下,荧光减少(或者淬灭),在解离的状态下发出荧光。因此,例如可以慢慢加热荧光减少(或者淬灭)了的杂交产物,测定随温度上升的荧光强度的增加。
测定荧光强度变动时的温度范围并无特别限定,例如起始温度为室温~85℃、优选为25~70℃,终止温度例如为40~105℃。另外,温度的上升速度并无特别限定,例如为0.1~20℃/秒、优选为0.3~5℃/秒。
接着,解析上述信号的变动来确定Tm值。具体地说,可以 从所得荧光强度求得各温度下每单位时间的荧光强度变化量(-d荧光强度增加量/dt),将显示最低值的温度作为Tm值。另外,可以将每单位时间的荧光强度增加量(d荧光强度增加量/dt)最高的点作为Tm值。另外,不使用淬灭探针,而是使用单独不显示信号、由于杂交而显示信号的探针作为标记探针时,相反地可以测定荧光强度的减少量。
在本发明中,为了检测3个基因的多态性,在与3种探针的各标记相应的条件下,确定各自的Tm值。β2AR基因用探针的Pacific Blue例如可在波长450~480nm下检测;β3AR基因用探针的BODIPY FL例如可在波长515~555nm下检测;UCP1基因用探针的TAMRA例如可以在波长585~700nm下检测。
然后,由这些Tm值确定各基因的检测对象位点的基因型。Tm解析中,可以获得如下的结果:与有一个碱基不同的杂交体(错配)相比,完全互补的杂交体(匹配)其显示解离的Tm值增高。因此,通过对上述探针预先确定完全互补的杂交体的Tm值和有一个碱基不同的杂交体的Tm值,可以确定扩增产物与探针是匹配还是错配。例如,在将检测对象序列中的目标位点的碱基假设为突变型(例如假定序列号1的第4265位碱基为G)、使用与含有其的检测对象序列互补的探针时,所形成的杂交体的Tm值若与完全互补的杂交体的Tm值相同,则可判定上述扩增产物的多态性为突变型。另外,所形成的杂交体的Tm值若与有一个碱基不同的杂交体的Tm值相同(低于完全互补的杂交体的Tm值),则可判定上述扩增产物的多态性为野生型(例如序列号1的第4265位的碱基为A)。而且,当检测到两种Tm值时,可以判断为杂合子。如此,由与各标记探针相应的Tm值,可以判断β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因的各多态性。进而,通过检测荧光强度来确定Tm值时,为了充分区分匹配的信号和错 配的信号,优选如上所述那样组合使用相同寡核苷酸序列的非标记探针作为探针。在β2AR基因用探针、β3AR基因用探针和UCP1基因用探针中,对何者组合添加非标记探针没有特别的限定,优选例如对β3AR基因用探针添加标记探针和非标记探针。
另外,本发明中,还可以测定杂交体形成时的信号变动来代替如上所述的升高含有上述探针的反应液的温度(加热杂交产物)、测定伴随温度上升的信号变动的方法。即,也可以在降低含有上述探针的反应液的温度以形成杂交产物时,测定伴随上述温度降低的信号变动。
作为具体例,当使用单独显示信号、且由于杂交而不显示信号的标记探针(例如鸟嘌呤淬灭探针)时,在单链DNA和探针解离的状态下发出荧光,当温度降低而形成杂交体时,上述荧光减少(或者淬灭)。因此,例如可以慢慢降低上述反应液的温度,测定伴随温度降低的荧光强度的减少。另外,使用单独不显示信号、且由于杂交而显示信号的标记探针时,在单链DNA和探针解离的状态下不发出荧光,当温度降低而形成杂交体时,则发出荧光。因此,例如可以慢慢降低上述反应液的温度,测定伴随温度降低的荧光强度的增加。
进而,在解析3种肥胖基因(β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因)中任意1种基因的多态性或者任意2种基因的多态性的情况下,例如使用含有引物对(1)~(3)中与目标区域相应的任意1种或者任意2种引物对的本发明的肥胖基因扩增用引物对,进一步还可使用与目标检测对象位点杂交的任意1种探针或者任意2种探针。
<β2AR基因解析用探针>
本发明的肥胖基因解析用探针,其特征在于,其是用于肥胖基因的多态性解析中的探针,上述肥胖基因是β2AR基 因,含有下述(P1)所示的寡核苷酸。
(P1):下述(1-1)和下述(1-2)中的至少一种寡核苷酸
(1-1):与序列号1中的、以第4254位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1位碱基、向着3’方向到第21~26个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述胸腺嘧啶碱基互补的腺嘌呤碱基(A)作为3’末端
(1-2):与序列号1中的、以第4259位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着3’方向到第15~19个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基作为5’末端
包含上述(P1)所示的寡核苷酸的探针,其为上述β2AR基因用探针,其如上所述。
使用本发明的β2AR基因用探针,可以检测β2AR基因中的包含编码β2AR16位氨基酸的位点的检测对象序列。具体的,通过使用本发明的探针,例如能够以优异的可靠性对本发明的探针和上述检测对象序列的杂交产物的融解温度进行解析,进而,通过上述融解温度解析,可以以优异的可靠性进行试样中的上述检测对象序列的有无和量的解析、确定上述检测对象序列中上述检测对象位点的多态性(序列号1中第4265位碱基的多态性)。因此,如后所述,本发明的β2AR基因解析用探针可以用于β2AR基因的解析、具体来说例如融解温度的解析、通过融解温度解析而进行的β2AR基因的多态性解析中。此外,也可以在上述3种肥胖基因的多态性解析方法中使用。因此,可以说本发明的β2AR基因解析用探针、解析方法,尤其在肥胖的治疗和预防的医疗领域中是非常有用的工具、解析方法。
上述β2AR基因用探针,例如可以是不带标记物的未标记探 针,但优选的是带有标记物的标记探针。标记位点和标记物,均如上所述。
<β2AR基因解析用试剂>
本发明的肥胖基因解析用试剂,其特征在于,其为用于β2AR基因解析的试剂,所述试剂含有本发明的β2AR基因解析用探针(以下,也称为“β2AR基因解析用试剂”)。如后所述,本发明的解析用试剂,可以用于β2AR基因的解析、具体而言例如融解温度的解析、通过融解温度解析来进行的β2AR基因的多态性解析中。此外,也可以在含有β2AR基因的上述2种或3种肥胖基因的多态性解析方法中使用。进而,本发明的β2AR基因解析用试剂特征在于含有本发明的β2AR基因解析用探针,对于此外的组成等没有任何限定。
本发明的β2AR基因解析用试剂还优选含有用于扩增β2AR基因中含有上述检测对象位点的检测对象序列的引物。上述引物例如可以例举上述β2AR基因用引物对。这样,使用含有β2AR基因用引物对的本发明的解析用试剂,可以进行例如β2AR基因的扩增反应、使用通过上述反应获得的扩增产物进一步进行β2AR基因的解析。通过上述β2AR基因用引物扩增出的区域只要是β2AR基因中含有上述检测对象位点的区域即可。作为具体例子,例如可以是β2AR基因中、具有上述检测对象位点的检测对象序列、即与本发明的探针杂交的序列,也可以是含有上述检测对象序列的区域。以下,将扩增反应所扩增出的区域称为“目标区域”。
此外,本发明的β2AR基因解析用试剂优选用于例如解析全血等生物试样中的β2AR基因。特别是,本发明的β2AR基因解析用试剂,在本发明的β2AR基因解析用探针之外还含有上述β2AR基因用引物对并用于扩增检测对象序列时,优选扩增反应 的反应液中全血试样的添加比例为0.1~0.5体积%。关于该点,如上所述。
本发明的β2AR基因解析用试剂的形态没有特别的限定,例如,可以是含有本发明的β2AR基因解析用探针的液体试剂,也可以是在使用前用溶剂悬浮的干燥试剂。此外,对β2AR基因解析用探针的含量也没有特别的限定。
此外,本发明的β2AR基因解析用试剂例如还可以在同一反应液中进一步含有用于检测其它基因、其它多态性的探针、引物。如上所述,已知β3AR基因和UCP1基因的多态性与β2AR基因同样,也是肥胖治疗和预防的指标,因此例如还可以含有用于检测任意一者或者两者的探针、引物对。如此,在扩增多个基因的目标区域、用探针进行检测的情况下,为了能够特异性扩增β2AR基因的目标区域,优选含有如上所述的β2AR基因用的引物对。
<β2AR基因解析方法>
本发明的肥胖基因解析方法,其特征在于,其为解析β2AR基因的解析方法,含有下述(a)~(c)步骤。
(a)准备反应液的步骤,所述反应液含有β2AR基因中的、含有多态性检测对象位点的检测对象序列、以及本发明的β2AR基因解析用探针
(b)改变上述反应液的温度,测定上述检测对象序列和上述β2AR基因解析用探针的杂交产物显示融解状态的信号值的步骤
(c)由伴随温度变化的上述信号值的变动,确定上述杂交产物的融解温度的步骤
如此,通过使用本发明的β2AR基因解析用探针,例如可以充分地检测上述检测对象序列和上述β2AR基因解析用探针的 杂交产物显示融解状态的信号值的变动。因此,根据本发明的β2AR基因解析方法,能够以高可靠性进行与β2AR基因的检测对象序列有关的融解温度的确定。由此,例如对含有β2AR基因的检测对象位点的区域进行核酸扩增的时候,能够通过融解温度(Tm)的解析,高可靠性地判断上述目标区域有无扩增。进而,因为本发明的探针和上述检测对象序列完全匹配的情况下的Tm值、和错配情况下的Tm值间显示出能够充分进行判断的差异,所以能够充分地区分受试对象的β2AR基因与本发明的探针是完全匹配和错配中的哪一种。如此地可以充分区分完全匹配和错配,就可以以更优异的可靠性判断受试对象的β2AR基因的多态性。进而,本发明的β2AR基因解析方法特征在于使用本发明的β2AR基因解析用探针,对例如测定的信号的种类、测定方法、测定条件等没有任何限定。
本发明的β2AR基因解析方法,如上所述能够确定Tm值,还可以含有下述(d)步骤。
(d)根据所确定的融解温度来确定β2AR基因的检测对象位点的多态性的步骤
本发明的β2AR基因解析方法,可以进一步含有下述(x)步骤。根据此类方法,例如能够使用同一反应液连续地进行β2AR基因的扩增、Tm值的确定还有多态性的解析。另外,下述引物可以使用上述的β2AR基因用引物。
(x)以试样中的核酸作为模板,使用用于扩增β2AR基因中的上述检测对象序列的引物,在反应液中扩增上述检测对象序列的步骤
上述(x)步骤中的基因扩增方法没有特殊的限定,例如,可以采用如上所述的方法,优选PCR法。
可以在上述(x)步骤之后、也就是在进行β2AR基因的扩 增反应之后,向扩增反应的反应液中添加上述β2AR基因解析用探针,但为了能够容易且迅速地进行解析,优选在上述(x)步骤的扩增反应之前,预先向反应液中添加上述β2AR基因解析用探针。在此情况下,可以将上述(x)步骤的扩增反应后的上述反应液作为上述(a)步骤中的反应液使用。根据此类方法,可以直接使用进行了扩增反应的反应液来进行融解温度解析。
上述反应液中探针的添加比例并无特别限定,例如优选按照各探针达到10~400nmol/L的范围的方式进行添加,更优选为20~200nmol/L。另外,使用荧光染料作为探针的标记时,例如为了调整检测的荧光强度,可以同时使用与标记探针序列相同的未标记探针,该未标记探针可以在其3’末端添加有磷酸。此时,标记探针与未标记探针的摩尔比例如优选为1∶10~10∶1。上述探针的长度并无特别限定,例如为5~50mer、优选为10~30mer。
在上述(b)步骤中,上述检测对象序列和上述β2AR基因解析用探针的杂交产物显示融解状态的信号值的测定,例如可以使用非标记的探针进行上述260nm的吸光度测定,但优选使用标记探针进行标记物的信号测定。具体而言,优选使用用标记物标记的标记探针作为上述β2AR基因解析用探针,进行上述标记物的信号测定。上述标记探针可以列举如上所述的探针,并与上述同样地测定。
对于应用本发明的试样,例如,只要含有作为模板的核酸就没有特别的限定,可以列举如上所述的试样。此外,上述反应液中的试样的添加比例例如也如上所述。
然后,列举一个例子对本发明的β2AR基因解析方法进行说明,所述例子为:通过PCR从全血试样中扩增β2AR基因,使用本发明的β2AR基因解析用探针来确定β2AR基因的多态性(序 列号1中第4265位碱基的多态性)。此外,只要没有特别声明,则与上述本发明的肥胖基因的多态性解析方法同样进行,并且不限定于此。
首先,制备PCR反应液进行PCR,进行所获得的扩增产物的解离、以及将通过解离获得的单链DNA和上述β2AR基因解析用探针进行杂交。然后,加热上述反应液(加热上述单链DNA和上述β2AR基因解析用探针的杂交产物),测定上述反应液的信号值。信号值的测定与上述同样地可以根据所使用的β2AR基因解析用探针的标记的有无、以及标记物的种类等适当确定。
接着,解析测得的上述信号的变动来确定Tm值。当β2AR基因解析用探针为荧光标记探针时,可以从所得荧光强度求得各温度下每单位时间的荧光强度变化量(-d荧光强度变化量/dt或d荧光强度变化量/dt),将显示最大绝对值的温度作为Tm值。例如,使用鸟嘌呤淬灭探针时,将-d荧光强度变化量/dt显示最低值的温度作为Tm或将d荧光强度变化量/dt最高的点作为Tm值。另外,不使用淬灭探针,而是使用单独不显示信号且由于杂交显示信号的探针作为标记探针时,相反地可以测定荧光强度的减少量。
然后,由Tm值确定β2AR基因的检测对象位点的基因型。Tm解析中,可以获得如下的结果:与有一个碱基不同的杂交体(错配)相比,完全互补的杂交体(完全匹配)其显示解离的Tm值增高。因此,通过对上述探针预先确定完全互补的杂交体的Tm值和有一个碱基不同的杂交体的Tm值,可以确定扩增产物与探针是匹配还是错配。例如,在将检测对象序列中的检测对象位点的碱基假设为突变型(例如假定序列号1的第4265位碱基为鸟嘌呤)、使用与含有其的检测对象序列互补的探针时(序列号2中的y为胞嘧啶),所形成的杂交体的Tm值若与完全互补 的杂交体的Tm值相同,则可判定上述扩增产物的多态性为突变型。另外,所形成的杂交体的Tm值若与有一个碱基不同的杂交体的Tm值相同(低于完全互补的杂交体的Tm值),则可判定上述扩增产物的多态性为野生型(例如序列号1的第4265位的碱基为腺膘呤)。而且,当仅检测到一个Tm值时,可以判断为纯合子;当检测到两种Tm值时,可以判断为杂合子。如此,由β2AR基因解析用探针的Tm值,可以判断β2AR基因的多态性。
根据本发明的β2AR基因解析方法,通过使用本发明的探针,如上所述,上述探针和检测对象序列完全匹配的情况下的Tm值和错配情况下的Tm值显示出能够充分区别的差异。该差值例如是4℃以上,优选6℃以上。
此外,在本发明中,可以进行例如杂交形成时信号变动的测定来代替如上所述的升高含有上述探针的反应液的温度(加热杂交产物)并测定伴随温度上升的信号变动的方法。
<多态性解析方法>
本发明的多态性解析方法,其特征在于,其是通过解析融解温度来解析β2AR基因中的检测对象位点的多态性的多态性解析方法,所述方法含有本发明的β2AR基因解析方法。本发明的多态性解析方法,可以与上述本发明的β2AR基因解析方法同样来进行。
接下来,根据本发明的实施例进行说明。但是,本发明不限定于下述实施例。
实施例1
对受试者8人使用肝素锂采血管进行采血(样品1~8)。将获得的血液10μL与蒸馏水90μL混合,再将该混合液10μL与蒸馏水90μL混合。将该混合液10μL添加到40μL下述组成的PCR反应液中,使用热循环仪进行P CR。PCR条件是95℃处理60秒之后, 以95℃1秒和56℃10秒作为1个循环,重复进行50个循环,再在95℃下处理1秒,在40℃下处理60秒。然后,将温度的上升速度设为1℃/3秒,将上述PCR反应液从40℃加热到95℃,测定荧光强度的经时变化。测定波长是450~480nm(荧光染料Pacific Blue的检测),515~555nm(荧光染料BODIPY FL的检测)和585~700nm(荧光染料TAMRA的检测)。进而,50个循环的PCR需要的时间是约1小时。
[表7]
*商品名Gene Taq FP:ニツポンジ一ン公司产
(探针)
β2AR基因用探针
5’-cgcatggcttcCattgggtgcca-(Pacific Blue)-3’(序列号72)
β3AR基因用探针1
5’-cgtggccatcgccCggactc-(BODIPY FL)-3’(序列号83)
β3AR基因用探针2
5’-cgtggccatcgccCggactc-P-3’(序列号83)
UCP1基因用探针
5’-(TAMRA)-cacagtttgatcGagtgcatttg-3’(序列号95)
(引物对)
β2AR基因F1引物
5’-cccgggaacggcagcgcctt-3’(序列号9)
β2AR基因R1引物混合物
5’-cccacacctcgtccctttSctgcgt-3’(序列号18)
S是c或者g,将两种引物按1∶1(摩尔比)混合
β3AR基因F2引物
5’-ccaccgtgggaggcaacc-3’(序列号26)
β3AR基因R2引物
5’-ctgcggccagcgaagtc-3’(序列号31)
UCP1基因F3引物
5’-ggaagacattttgtgcagcgatttctgattgacc-3’(序列号44)
UCP1基因R3引物混合物
5’-cKtagcaaaggagtggcagcaagttctg-3’(序列号63)
K是g或t,将两种引物以1∶1(摩尔比)混合
与β2AR基因用探针匹配的杂交体的Tm值是70.0℃,错配的杂交体的Tm值是62.0℃,与β3AR基因用探针匹配的杂交体的Tm值是73.0℃,错配的杂交体的Tm值是66.0℃,与UCP1基因用探针匹配的杂交体的Tm值是65.0℃,错配的杂交体的Tm值是60.0℃。
在图1~3中分别示出样品1~8的结果。这些图是表示伴随温度上升的荧光强度的变化的Tm解析的图,纵轴的微分值表示“-d荧光强度增加量/dt”,横轴表示温度(以下,相同)。如该图所示,根据信号的峰值来确定各样品中β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因的各多态性。为了支持这些实施例的结果,通过RFLP法确定8位受试者的β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因的各多态性,获得了与实施例相同的结果。如此,通过使用本发明的引物对,使用未实施预处理的全血试样,可以在同一反应液中同时扩增β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因,并且,可以使用上述同一反应液解析上述基因的各多态性。
实施例2
对受试者3人使用EDTA采血管进行采血(样品1~3)。将获得的血液10μL与下述稀释液A 70μL混合,再将该混合液10μL与下述稀释液B 70μL混合。将所得的混合液10μL在95℃加热处理5分钟之后,添加到46μL下述组成的PCR反应液中,使用热循环仪进行PCR。PCR条件是95℃处理60秒之后,以95℃1秒和64℃15秒作为1个循环,重复进行50个循环,再在95℃下处理1秒,在40℃处理60秒。然后将温度的上升速度设为1℃/3秒,将上述PCR反应液从40℃加热到75℃,测定荧光强度的经时变化。测定波长是450~480nm(荧光染料Pacific Blue的检测),515~555nm(荧光染料BODIPY FL的检测)和585~700nm(荧光染料TAMRA的检测)。
(稀释液A)
10mM Tris-HCl(pH8)、0.1mM EDTA、0.05%NaN3、0.3%SDS
(稀释液B)
10mM Tris-HCl(pH8)、0.1mM EDTA、0.05%NaN3
(表8)
*商品名Gene Taq FP:ニツポンジ一ン公司产
(探针)
β2AR基因用探针
5’-(Pacific Blue)-cccaatGgaagccatgc-P-3’(序列号114)
β3AR基因用探针1
5’-(BODIPY FL)-ctcggagtccGggc-P-3’(序列号120)
β3AR基因用探针2
5’-(BODIPY FL)-ctcggagtccAgg-P-3’(序列号120)
UCP1基因用探针
5’-(TAMRA)-cacagtttgatcGagtg-P-3’(序列号139)
(引物对)
β2AR基因F1引物
5’-cgggaacggcagcgccttct-3’(序列号109)
β2AR基因R1引物
5’-ccaccacccacacctcgtccct-3’(序列号134)
β3AR基因F2引物
5’-gccaccgtgggaggcaacc-3’(序列号24)
β3AR基因R2引物
5’-ggctgcggccagcgaagtc-3’(序列号28)
UCP1基因F3引物
5’-ggaagacattttgtgcagcgatttctgattgacc-3’(序列号43)
UCP1基因R3引物混合物
5’-cKtagcaaaggagtggcagcaagttctg-3’(序列号63)
K是g或者t,将两种引物按1∶1(摩尔比)混合
与β2AR基因用探针匹配的杂交体的Tm值是58℃,错配的杂交体的Tm值是51℃,与β3AR基因用探针匹配的杂交体的Tm值是58℃,错配的杂交体的Tm值是51℃,与UCP1基因用探针 匹配的杂交体的Tm值是56℃,错配的杂交体的Tm值是49℃。
在图4中示意出样品1~3的结果。该图是显示伴随温度上升的荧光强度的变化的Tm解析的图,纵轴的微分值表示“-d荧光强度增加量/dt”,横轴表示温度。如该图所示,根据信号的峰值来确定各样品中β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因的各多态性。为了支持这些实施例的结果,通过RFLP法确定3位受试者的β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因的各多态性,获得了与实施例相同的结果。如此,通过使用本发明的引物对,使用未实施预处理的全血试样,可以在同一反应液中同时扩增β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因,并且,可以使用上述同一反应液解析上述基因的各多态性。
实施例3
制造β2AR基因的各种探针,进行Tm解析。首先,合成下述表9中所示的探针、和与前述各探针互补的下述表10中所示的寡核苷酸(互补链DNA)。在下述表9的探针序列中,大写的碱基是与序列号1中第4265位相应的碱基,这些探针是作为用于检测正义链中第4265位(G、A)或者与其互补的反义链中的碱基(C、T)的探针而设计的。下述表10中所示的寡核苷酸是β2AR基因的正义链或反义链的部分序列,是含有序列号1的第4265位碱基或与其互补的碱基的序列。然后,使用这些探针和互补链DNA,制备反应液,使其为下述表11的组成。在探针的检测对象链是正义链的情况下,互补链DNA使用1A(4265A)和1B(4265G),制备分别添加它们的反应液。此外,在探针的检测对象链是反义链的情况下,互补链DNA使用2A(4265A)和2B(4265G),制备分别添加它们的反应液。将这些反应液供给热循环仪(商品名Smart Cycler,Cepheid公司制),将温度的上升速度设为1℃/3秒,将上述反应液从45℃加热到95℃,测定荧光 强度的经时变化。测定波长是565~605nm(TAMRA的检测,ch3)。
(表9)
探针 | 序列 | 检测对象链 | mer | GC含量 | 序列号 |
比较例3-1 | 5′-cacccaatGgaagcc-(TAMRA)-3′ | 反义 | 15 | 60.0 | 140 |
比较例3-2 | 5′-(TAMRA)-ccaatGgaagccatgc-P-3′ | 反义 | 16 | 56.3 | 141 |
比较例3-3 | 5′-catggcttcCattgggtgcc-(TAMRA)-3′ | 正义 | 20 | 60.0 | 142 |
比较例3-4 | 5′-(TAMRA)-catggcttcCattgggtg-P-3′ | 正义 | 18 | 55.6 | 143 |
比较例3-5 | 5′-ggcttcCattgggtgcc-(TAMRA)-3′ | 正义 | 17 | 64.7 | 144 |
比较例3-6 | 5′-ggcacccaatAgaagcc-(TAMRA)-3′ | 反义 | 17 | 58.8 | 145 |
比较例3-7 | 5′-(TAMRA)-ccggcgcatggcttcCattg--P-3′ | 正义 | 20 | 65.0 | 146 |
比较例3-8 | 5′-tAgaagccatgcgcc-(TAMRA)-3′ | 反义 | 15 | 60.0 | 147 |
比较例3-9 | 5′-(TAMRA)-ccaatAgaagccatgcg-P-3′ | 反义 | 17 | 52.9 | 148 |
比较例3-10 | 5′-(BODIPY FL)-ccaatGgaagccatg-P-3′ | 反义 | 15 | 53.3 | 149 |
比较例3-11 | 5′-tGgaagccatgcgcc-(TAMRA)-3′ | 反义 | 15 | 66.7 | 150 |
比较例3-12 | 5′-(TAMRA)-caatGgaagccatgc-P-3′ | 反义 | 15 | 53.3 | 151 |
比较例3-13 | 5′-(TAMRA)-cttcCattgggtgccag-P-3′ | 正义 | 17 | 58.8 | 152 |
比较例3-14 | 5′-(TAMRA)-cCattgggtgccagca-P-3′ | 正义 | 16 | 62.5 | 153 |
比较例3-15 | 5′-(TAMRA)-cttcCattgggtgccagcaaga-P-3′ | 正义 | 22 | 54.5 | 154 |
比较例3-16 | 5′-gctggcacccaatGgaagcc-(TAMRA)-3′ | 反义 | 20 | 65.0 | 155 |
比较例3-17 | 5′-(TAMRA)-ccaatGgaagccatgcgc-P-3′ | 反义 | 18 | 61.1 | 156 |
比较例3-18 | 5′-(TAM RA)-ccaatGgaagccatgcgccg-P-3′ | 反义 | 20 | 65.0 | 157 |
比较例3-19 | 5′-ccaatGgaagccatgcgcc-(TAMRA)-3′ | 反义 | 19 | 63.2 | 158 |
比较例3-20 | 5′-ggcttcCattgggtgcca-(TAMRA)-3′ | 正义 | 18 | 61.1 | 159 |
比较例3-21 | 5′-(TAMRA)-catggcttcCattgggtgccag-P-3′ | 正义 | 22 | 59.1 | 160 |
实施例3-1 | 5′-cgcatggcttcCattgggtgcca-(TAMRA)-3′ | 正义 | 23 | 60.9 | 72 |
(表10)
互补链DNA | 序列 | 序列号 |
1A:正义链(4265A) | cgccttcttgctggcacccaatAgaagccatgcgccggac | 161 |
1B:正义链(4265G) | cgccttcttgctggcacccaatGgaa gccatgcgccggac | 162 |
2A:反义链(4265T) | gtccggcgcatggcttcTattgggtgccagcaagaaggcg | 163 |
2B:反义链(4265C) | gtccggcgcatggcttcCattgggtgccagcaagaaggcg | 164 |
(表11)
*商品名Gene Taq FP:ニツポンジ一ン公司产
在图5中示意出使用实施例3-1的探针的结果,图6中分别示意出使用比较例3-9和比较例3-11的探针的结果。这些图是表示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm解析的图(融解曲线),纵轴的微分值表示“-d荧光强度增加量/dt”,横轴表示温度(以下,相同)。图5中综合示意出在反应液中添加了上述互补链DNA(1A)的体系的融解曲线(细线)和添加了上述互补链DNA(1B)的体系的融解曲线(粗线),图6综合示意出在反应液中添加了上述互补链DNA(2A)的体系的融解曲线(细线)和添加了上述互补链DNA(2B)的体系的融解曲线(粗线)。
根据图6所示,在使用比较例3-9的探针的情况下,检测不到4265G的信号。此外,在使用比较例3-11的探针的情况下,表示上述探针和互补链DNA(2B)完全匹配的峰的Tm值(68℃)和表示上述探针和互补链DNA(2A)错配的峰的Tm值(65℃)的差值小(3℃)。因此,根据使用这些比较例的探针的融解曲线无法以优异的可靠性来判断完全匹配或错配为哪一个。进而,其它的比较例也表现出与图6中的比较例3-9或者比较例3-11相同的融解曲线。与其相反,使用实施例3-1的探针的情况下,如图5所示,可以充分地确认表示上述探针和互补链DNA(1B)完全匹配的信号和表示上述探针和互补链DNA(1A)错配的信号。进而,表示上述完全匹配的峰的Tm值(75℃)和表示上述错配的峰的Tm值(68℃)之间的差值约为7℃。是能够充分判断两者的差值。因此,根据实施例的探针,能够充分地判断所显示的是完全匹配还是错配。
实施例4
制备序列号1中第4265位表现为4265A/4265A的纯合子的纯化的人基因组、以及第4265位表现为4265G/4265G的纯合子 的纯化的人基因组。将这些纯化的基因组1μL,分别加入到24μL下述组成的PCR反应液中,供给热循环仪(商品名Smart Cycler,Cepheid公司制)进行PCR。PCR的条件是:95℃处理60秒后,以95℃1秒和62℃30秒作为1个循环,重复进行50个循环。然后将温度的上升速度设为1℃/3秒,将上述反应液从45℃加热到95℃,测定荧光强度的经时变化。测定波长是505~537nm(荧光染料FAM的检测,1ch)。
(表12)
*商品名Gene Taq FP:ニツポンジ一ン公司产
(探针)
β2AR基因解析用探针
5’-cgcatggcttcCattgggtgcca-(BODIPY FL)-3’(序列号72)
(引物对)
β2AR基因用正向引物
5’-gggaacggcagcgccttcttgct-3’(序列号165)
β2AR基因用反向引物
5’-tggtgaccgtctgcagacgctcgaac-3’(序列号166)
使用上述引物对通过PCR扩增出的区域是序列号1中含有第4265位的200个碱基左右的DNA链。从显示为4265G/4265G的基因组扩增出第4265位是G(反义链是C)的DNA链,从显示为4265A/4265A的基因组扩增出第4265位是A(反义链是T)的DNA。
与上述序列号72所示的β2AR基因解析用探针匹配的杂交体的Tm值是69℃,错配的杂交体的Tm值是62℃。
图7中示意出这些结果。图7显示了伴随温度上升的荧光强度变化的Tm解析的图(融解曲线),纵轴的微分值表示“-d荧光强度增加量/dt”,横轴表示温度(以下相同)。图7中综合示意出添加了表示4265A/4265A纯合子的纯化的人基因组的体系的融解曲线(细线)、以及添加了表示4265G/4265G纯合子的纯化的人基因组的体系的融解曲线(粗线)。
根据该图所示,在实施例4的探针共存下,扩增人纯化基因组的β2AR基因中的DNA、进行Tm解析的结果,能够与4265位的碱基相区别而检测。具体的,表示上述探针和4265G/4265G纯合子来源的扩增产物完全匹配的峰的Tm值(69℃)与表示上述探针和4265A/4265A纯合子来源的扩增产物错配的峰的Tm值(62℃)之间的差值约为7℃,是足以充分区别两者的差值。因此,根据实施例的探针,能够充分地解析β2AR基因中第4265位的多态性。
产业上的实用性
如上,根据本发明的引物,可以特异且高效地扩增肥胖基 因(β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因)中含有发生特定多态性的位点的区域。因此,如上所述,与传统方法相比,能够降低时间和成本。此外,由于可以特异性扩增含有多态性的检测对象位点的区域,再通过使用例如与含有上述检测对象位点的检测对象序列互补的探针,可以使用上述反应液直接进行Tm解析、将上述多态性进行分型。另外,由于可以在一个反应液中进行扩增、分型,因此还能够实现操作的自动化。而且,当使用本发明的引物对时,例如即便是含有杂质的试样(例如全血或口腔粘膜等),也可以省略预处理、因此,能够更为迅速且简单地进行扩增反应。另外,当使用本发明的引物对时,可以以优于以往的扩增效率进行扩增反应,因此还能够缩短扩增反应。因此,通过本发明的引物对、含有其的试剂以及使用它们的扩增产物的制造方法,可以迅速且简单地解析选自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所组成的组中的至少一个肥胖基因的多态性,在医疗领域是非常有效的。
Claims (26)
1.一种肥胖基因解析用探针,其特征在于,其为用于肥胖基因的多态性解析中的探针,
所述肥胖基因是β2AR基因,
所述探针含有下述(P1)所示的寡核苷酸,
(P1):下述(1-1)和下述(1-2)中的至少一种寡核苷酸,
(1-1):与序列号1中的、以第4254位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1位碱基、向着3’方向到第21~26个碱基的区域互补的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以与所述胸腺嘧啶碱基互补的腺嘌呤碱基(A)作为3’末端,
(1-2):与序列号1中的、以第4259位的胞嘧啶碱基(C)作为第1位碱基、向着3’方向到第15~19个碱基的区域序列相同的至少1个寡核苷酸,该寡核苷酸以所述胞嘧啶碱基作为5’末端。
2.根据权利要求1所述的肥胖基因解析用探针,所述探针是用于通过融解温度的解析来进行的β2AR基因的多态性解析中的探针。
3.根据权利要求1所述的肥胖基因解析用探针,所述探针是含有下述(P1’)所示的寡核苷酸的探针,
(P1’)含有序列号72的碱基序列的寡核苷酸和含有序列号114的碱基序列的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸。
4.根据权利要求1所述的肥胖基因解析用探针,所述探针是带有标记物的标记探针。
5.根据权利要求4所述的肥胖基因解析用探针,所述标记物是荧光物质。
6.根据权利要求5所述的肥胖基因解析用探针,所述标记探针是单独显示荧光、且由于杂交而荧光消失的探针。
7.根据权利要求4所述的肥胖基因解析用探针,所述探针是所述(1-1)的寡核苷酸的3’末端带有所述标记物的标记探针。
8.根据权利要求4所述的肥胖基因解析用探针,所述探针是所述(1-2)的寡核苷酸的5’末端带有所述标记物的标记探针。
9.一种肥胖基因解析用试剂,其特征在于,其为用于肥胖基因的解析的试剂,
所述肥胖基因是β2AR基因,
所述试剂含有权利要求1所述的肥胖基因解析用探针。
10.根据权利要求9所述的肥胖基因解析用试剂,所述试剂是用于通过融解温度的解析来进行的肥胖基因的多态性解析中的试剂。
11.根据权利要求9所述的肥胖基因解析用试剂,其还含有用于扩增β2AR基因中的、含有多态性检测对象位点的检测对象序列的引物。
12.根据权利要求9所述的肥胖基因解析用试剂,所述肥胖基因解析用试剂是用于解析生物试样中的β2AR基因中的检测对象位点的多态性的试剂。
13.根据权利要求9所述的肥胖基因解析用试剂,其还含有能与β3AR基因的检测对象位点杂交的探针和能与UCP1基因的检测对象位点杂交的探针中的至少一者。
14.根据权利要求13所述的肥胖基因解析用试剂,所述探针为由(P2’)的寡核苷酸构成的探针和由(P3’)的寡核苷酸构成的探针中的至少一者,
(P2’):选自由含有序列号83的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号120的碱基序列的寡核苷酸、和含有序列号127的碱基序列的寡核苷酸所组成的组中的至少一种寡核苷酸,
(P3’):含有序列号95的碱基序列的寡核苷酸和含有序列号139的碱基序列的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸。
15.根据权利要求32所述的肥胖基因解析用试剂,所述生物试样是全血。
16.一种肥胖基因解析方法,其特征在于,其为解析肥胖基因的肥胖基因解析方法,
所述肥胖基因是β2AR基因,
所述方法包含下述(a)~(c)步骤,
(a)准备反应液的步骤,所述反应液含有β2AR基因中的、含有多态性检测对象位点的检测对象序列、以及权利要求19所述的肥胖基因解析用探针,
(b)改变所述反应液的温度,测定所述检测对象序列和所述探针的杂交产物显示融解状态的信号值的步骤,
(c)由伴随温度变化的所述信号值的变动,确定所述杂交产物的融解温度的步骤。
17.根据权利要求16所述的肥胖基因解析方法,还包含下述(d)步骤,
(d)根据所确定的融解温度,判断β2AR基因的所述检测对象位点的多态性的步骤。
18.根据权利要求16所述的肥胖基因解析方法,所述肥胖基因为β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因中的至少1个基因,
所述(a)步骤中,准备含有所述探针和选自由下述(P2’)的寡核苷酸构成的探针和由(P3’)的寡核苷酸构成的探针中的至少一者的所述反应液,
(P2’):选自由含有序列号83的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号120的碱基序列的寡核苷酸、和含有序列号127的碱基序列的寡核苷酸所组成的组中的至少一种寡核苷酸,
(P3’):含有序列号95的碱基序列的寡核苷酸和含有序列号139的碱基序列的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸。
19.根据权利要求16所述的肥胖基因解析方法,所述探针是带有荧光染料的标记探针,
在所述(b)步骤中,测定所述荧光染料的荧光强度作为所述信号值。
20.根据权利要求19所述的肥胖基因解析方法,所述标记探针是单独显示荧光、且由于杂交而荧光消失的探针,
在所述(b)步骤中,升高所述反应液的温度,测定伴随温度上升的荧光强度的减少。
21.根据权利要求16所述的肥胖基因解析方法,还含有下述(x)步骤,
(x)以试样中的核酸作为模板,使用用于扩增β2AR基因中的所述检测对象序列的引物,在反应液中扩增所述检测对象序列的步骤。
22.根据权利要求21所述的肥胖基因解析方法,在所述(x)步骤中,在扩增反应前,向所述反应液中添加所述探针,将所述(x)步骤中的扩增反应后的所述反应液作为所述(a)步骤中的反应液使用。
23.根据权利要求21所述的肥胖基因解析方法,所述试样是生物试样。
24.根据权利要求23所述的肥胖基因解析方法,所述生物试样是全血。
25.根据权利要求24所述的肥胖基因解析方法,所述反应液中全血的添加比例是0.1~0.5体积%。
26.一种多态性解析方法,其特征在于,其为通过融解温度的解析来解析肥胖基因中的检测对象位点的多态性的多态性解析方法,
所述肥胖基因是β2AR基因,
所述方法包括权利要求16所述的肥胖基因解析方法。
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