KR20110004918A - 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트, 그것을 포함하는 비만 유전자 증폭용 시약 및 그 용도 - Google Patents

비만 유전자 증폭용 프라이머 세트, 그것을 포함하는 비만 유전자 증폭용 시약 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

유전자 증폭법에 의해, 비만 유전자(β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자)에 있어서의 검출 목적 부위를 포함하는 목적 영역을 증폭하기 위한 프라이머 세트로서, 상기 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다. 서열번호 9 또는 서열번호 109, 서열번호 25 및 서열번호 43의 염기서열로 이루어지는 포워드 프라이머(forward primer)와, 서열번호 18, 서열번호 30 및 서열번호 63의 염기서열로 이루어지는 리버스 프라이머(reverse primer)를 각각 포함하는 3쌍의 프라이머 세트를 사용한다. 이 프라이머 세트를 사용함으로써, 동일 반응액에 있어서, 동시에, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자에 있어서 검출 목적의 다형이 발생하는 부위를 포함하는 목적 영역을, 특이적으로 증폭할 수 있다.

Description

비만 유전자 증폭용 프라이머 세트, 그것을 포함하는 비만 유전자 증폭용 시약 및 그 용도{PRIMER SET FOR AMPLIFICATION OF OBESITY GENE, REAGENT FOR AMPLIFICATION OF OBESITY GENE COMPRISING THE PRIMER SET, AND USE OF THE PRIMER SET}
본 발명은 비만 유전자인 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 그것을 포함하는 비만 유전자 증폭용 시약 및 그 용도에 관한 것이다.
비만에 관여하는 유전자 다형으로서, β-2 아드레날린 수용체(β2AR)를 코드하는 유전자(β2AR 유전자), β-3 아드레날린 수용체(β3AR)를 코드하는 유전자(β3AR 유전자) 및 탈공역 단백질(UCP)을 코드하는 유전자(UCP1 유전자)의 다형이 알려져 있다. β2AR은, 주로 심장, 기관지 평활근 등에 분포하고 있으나, 그 외에 지방 조직에 있어서도 존재하며, 지방 분해에 관여하고 있다. 그리고, 이것을 코드하는 β2AR 유전자에는, 아미노산 16위의 아르기닌(Arg)이 글리신(Gly)이 되는 다형(Arg16Gly)이 있다. 이 다형을 갖는 피검자(일본인에게는 16% 존재)는, 상기 다형을 갖지 않는 피검자와 비교해서, 안정 시에 있어서의 대사량이 항진(亢進)하고 있다는 것이 보고되어 있다. 또한, β3AR은, 갈색 지방 세포 조직과 백색 지방 세포 조직에 존재하며, 노르아드레날린의 결합에 의해, 갈색 지방 세포 조직에서는 열 생산이, 백색 지방 세포 조직에서는 지방 분해가 개시된다. 이것을 코드하는 β3AR 유전자에는, 아미노산 64위의 트립토판(Trp)이 아르기닌(Arg)이 되는 다형(Trp64Arg)이 있다. 이 다형을 갖는 피검자(일본인에게는 34% 존재)는, 상기 다형을 갖지 않는 피검자와 비교해서, 안정 시의 대사량이 감소하고 있다는 것이 보고되어 있다. 또한, UCP1은, 교환 신경이 흥분 상태에 있을 때, 갈색 지방 조직에 있어서의 열 생산의 중심적인 역할을 수행하는 단백질이다. 그리고, 이것을 코드하는 UCP1 유전자에는, mRNA의 -3826위(게놈서열에 있어서의 UCP1 유전자의 번역 개시점의 상류 3826위)의 아데닌(A)이 구아닌(G)이 되는 다형이 있다. 이 다형을 갖는 피검자(일본인 비만 여성에게는 24% 존재)는, 상기 다형을 갖지 않는 피검자에 비해서, 전신의 대사량이 감소하고 있다는 것이 보고되어 있다. 이상과 같은 각 유전자의 다형과 대사량과의 관계로부터, 이들 유전자의 다형을 해석하여, 해석 결과를 피검자의 비만 치료나 예방에 이용하는 것이, 실제로 행해지고 있다.
한편, 모든 질환의 원인이나, 개체 간의 질환 이환(罹患) 용이성(질환의 걸리기 쉬움), 개체 간에 있어서의 약효의 차이 등을 유전자 레벨로 해석하는 방법으로서, 점돌연변이, 소위 일염기다형(SNP)의 검출이 널리 행해지고 있다. 점돌연변이의 일반적인 검출 방법으로서는, (1) 시료의 표적 DNA에 대해서, 검출 대상 서열에 상당하는 영역을 PCR(Polymerase chain reaction)에 의해 증폭시키고, 그 전체 유전자 서열을 해석하는 Direct Sequencing법, (2) 시료의 표적 DNA에 대해서, 검출 대상 서열에 상당하는 영역을 PCR에 의해 증폭시키고, 상기 검출 대상 서열에 있어서의 목적의 변이의 유무에 의해 절단 작용이 다른 제한 효소에 의해서 그 증폭 산물을 절단하며, 전기영동함으로써 타이핑을 행하는 RFLP 해석, (3) 3'말단 영역에 목적의 변이가 위치하는 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고, 증폭의 유무에 의해 변이를 판단하는 ASP-PCR법 등을 들 수 있다.
그러나, 이러한 방법들은, 예컨대, 시료로부터 추출한 DNA의 정제, 전기영동, 제한 효소 처리 등이 필수이기 때문에, 시간이나 비용이 든다. 또한, PCR을 행한 후, 반응 용기를 일단 개봉할 필요가 있기 때문에, 상기 증폭 산물이 다음 반응계에 혼입되어, 해석 정밀도가 저하될 우려가 있다. 또한, 자동화가 곤란하기 때문에, 대량의 샘플을 해석할 수 없다. 또한, 상기 (3)의 ASP-PCR법에 대해서는, 특이성이 낮다고 하는 문제도 있다.
이러한 문제로부터, 최근, 점돌연변이의 검출 방법으로서, 표적 핵산과 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해 온도(Tm: melting temperature)를 해석하는 방법이 실용화되어 있다. 이러한 방법은, 예컨대, Tm 해석, 또는, 상기 이중쇄의 융해 곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해 곡선 해석이라고 불리고 있다. 이것은 이하와 같은 방법이다. 즉, 우선, 검출 목적의 점돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따르는 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 점돌연변이의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 점돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정한다. 상기 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 점돌연변이가 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값보다 낮으면, 미스 매치, 즉 표적 DNA에 점돌연변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다. 그리고, 이 방법에 따르면, 자동화도 가능하다.
그러나, 이러한 Tm 해석을 이용한 검출 방법에 대해서도, PCR에 있어서, 검출 목적 부위를 포함하는 영역을 특이적이고 또한 효율적으로 증폭할 수 없으면 안 된다고 하는 문제가 있다. 특히, 비만 유전자 중에서도 중요시되고 있는 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자에는, 각각 많은 아이소자임(isozyme)이 존재하며, 이들을 코드하는 서열도 매우 유사하다. 이 때문에, PCR에 있어서, 목적으로 하는 이들 유전자 이외에, 아이소자임의 코드 유전자까지도 증폭될 우려가 있다. 또한, 이와 같이 다른 아이소자임의 코드 유전자까지도 증폭된 경우, 예컨대, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자의 각 다형의 해석(비특허 문헌 1∼3)에 있어서, 해석 결과의 신뢰성을 저하시키는 원인이 된다. 그리고, 이와 같이, 하나의 샘플을 해석하는 데에도 많은 노력이 들기 때문에, 대량의 샘플을 해석하는 것은 실용적이지 않다고 하는 문제도 있다.
비특허 문헌 1: PMID: 9399966 J Clin Invest. 1997 Dec 15; 100(12): 3184-8.
비특허 문헌 2: PMID: 9049481 Diabetologia. 1997 Feb; 40(2): 200-4.
비특허 문헌 3: PMID: 9541178 Diabetologia. 1998 Mar; 41(3): 357-61.
그래서, 본 발명은 유전자 증폭법에 의해, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 비만 유전자의 목적 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 세트의 제공을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 프라이머 세트는, 유전자 증폭법에 의해 비만 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트로서, 상기 비만 유전자가, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자이며, 하기 프라이머 세트 (1)∼(3)으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
프라이머 세트 (1)
하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 포워드 프라이머(forward primer) 및 하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 리버스 프라이머(reverse primer)를 포함하는 한 쌍의 프라이머 세트
(F1) 서열번호 1의 염기서열에 있어서의 4248번째의 티민 염기(T)를 1염기째로 하여 5'방향을 향해서 18∼25염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 티민 염기(T)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드, 및
서열번호 1의 염기서열에 있어서의 4250번째의 티민 염기(T)를 1염기째로 하여 5'방향을 향해서 18∼26염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 티민 염기(T)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
중 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드
(R1) 서열번호 1의 염기서열에 있어서의 4292번째의 아데닌 염기(A)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 21∼31염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 4292번째의 아데닌 염기(A)에 상보적인 티민 염기(T)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드, 및
서열번호 1의 염기서열에 있어서의 4301번째의 아데닌 염기(A)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 18∼27염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 4301번째의 아데닌 염기(A)에 상보적인 티민 염기(T)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
중 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드
프라이머 세트 (2)
하기 (F2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 포워드 프라이머 및 하기 (R2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 리버스 프라이머를 포함하는 한 쌍의 프라이머 세트
(F2) 서열번호 2의 염기서열에 있어서의 4110번째의 시토신 염기(C)를 1염기째로 하여 5'방향을 향해서 16∼20염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기(C)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
(R2) 서열번호 2의 염기서열에 있어서의 4172번째의 구아닌 염기(G)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 15∼19염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 4172번째의 구아닌 염기(G)에 상보적인 시토신 염기(C)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
프라이머 세트 (3)
하기 (F3)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 포워드 프라이머 및 하기 (R3)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 리버스 프라이머를 포함하는 한 쌍의 프라이머 세트
(F3) 서열번호 3의 염기서열에 있어서의 280번째의 시토신 염기(C)를 1염기째로 하여 5'방향을 향해서 25∼44염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기(C)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
(R3) 서열번호 3의 염기서열에 있어서의 350번째의 시토신 염기(C)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 23∼38염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 350번째의 시토신 염기(C)에 상보적인 구아닌 염기(G)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
또한, 본 발명의 유전자 증폭용 시약은, 유전자 증폭법에 의해 비만 유전자를 증폭하기 위한 시약으로서, 상기 비만 유전자가, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자이며, 상기 본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 증폭 산물의 제조 방법은, 유전자 증폭법에 의해 비만 유전자의 증폭 산물을 제조하는 방법으로서, 상기 비만 유전자가, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자이며, 하기 (Ⅰ)공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(Ⅰ) 시료 중의 핵산을 주형(鑄型)으로 하고, 본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트를 이용하여, 반응액 중에서, 상기 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자의 증폭을 행하는 공정
본 발명의 다형 해석 방법은, 비만 유전자에 있어서의 검출 대상 부위의 다형을 해석하는 방법으로서, 상기 비만 유전자가, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자이며, 하기 (ⅰ)∼(ⅳ)공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(ⅰ) 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 의해, 상기 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자에 있어서의 검출 대상 부위를 포함하는 영역을 반응액 중에서 증폭시키는 공정
(ⅱ) 상기 (ⅰ)공정에 있어서의 증폭 산물과, 상기 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자에 있어서의 검출 대상 부위에 하이브리다이즈(hybridize) 가능한 프로브를 포함하는 반응액을 준비하는 공정
(ⅲ) 상기 반응액의 온도를 변화시켜, 상기 증폭 산물과 상기 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널 값을 측정하는 공정
(ⅳ) 온도 변화에 따르는 상기 시그널 값의 변동으로부터, 상기 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자에 있어서의 검출 대상 부위의 다형을 결정하는 공정
본 발명의 프라이머 세트에 따르면, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 비만 유전자에 있어서의 검출 목적의 다형이 발생하는 부위를 포함하는 목적 영역을, 반응액 중에서, 특이적이고 또한 고효율로 증폭할 수 있다. 이 때문에, 전술한 바와 같은 종래법과는 달리, 시간이나 비용을 저감하는 것이 가능해진다. 또한, 이와 같이, 상기 비만 유전자의 특정의 다형이 발생하는 검출 대상 부위를 포함하는 영역을 특이적으로 증폭할 수 있기 때문에, 예컨대, 또한, 검출 대상 부위를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 사용함으로써, 상기 반응액을 이용하여 그대로 Tm 해석을 행해서, 상기 다형을 타이핑하는 것이 가능해진다. 또한, 하나의 반응액으로 증폭이나 타이핑이 가능하기 때문에, 조작의 자동화도 가능해진다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면, 예컨대, 협잡물이 포함되는 시료(예컨대, 전혈(全血)이나 구강 점막 등)여도, 전처리를 생략할 수 있기 때문에, 보다 신속하고 또한 간편하게 증폭 반응을 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면, 종래보다도 우수한 증폭 효율로 증폭 반응을 행할 수 있기 때문에, 증폭 반응도 단축화가 가능하다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트나 이것을 포함하는 시약, 및 이들을 이용한 증폭 산물의 제조 방법 및 다형 해석 방법에 따르면, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 비만 유전자의 다형을 신속하고 또한 간편하게 해석할 수 있기 때문에, 의료 분야에 있어서 매우 유효하다고 말할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 있어서의 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 상기 실시예 1에 있어서의 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 상기 실시예 1에 있어서의 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에 있어서의 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 3에 있어서의 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 6은 비교예에 있어서의 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예 4에 있어서의 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.
<비만 유전자 증폭용 프라이머 세트>
본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트는, 전술한 바와 같이, 상기 프라이머 세트 (1)∼(3)으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다. 적어도 어느 하나의 프라이머 세트를 포함함으로써, 예컨대, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 비만 유전자에 있어서의 특정의 목적 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능하다.
본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트는, 예컨대, 상기 프라이머 세트 (1)∼(3) 중 어느 1종류만을 포함해도 좋고, 어느 2종류, 또는 프라이머 세트 (1)∼(3)을 모두 포함해도 좋다. 후술하지만, 프라이머 세트 (1)에 의해 특이적으로 증폭할 수 있는 목적 영역은, β2AR 유전자의 특정의 다형이 발생하는 부위(서열번호 1에 있어서의 4265번째)를 포함하는 영역이고, 프라이머 세트 (2)에 의해 특이적으로 증폭할 수 있는 목적 영역은, β3AR 유전자의 특정의 다형이 발생하는 부위(서열번호 2에 있어서의 4134번째)를 포함하는 영역이며, 프라이머 세트 (3)에 의해 특이적으로 증폭할 수 있는 목적 영역은, UCP1 유전자의 특정의 다형이 발생하는 부위(서열번호 3에 있어서의 292번째)를 포함하는 영역이다.
전술한 바와 같이, 비만 유전자인 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자의 각각의 특정의 다형은, 모두 대사에 영향을 주는 다형으로서 알려져 있다. 이 때문에, 어느 1종류의 유전자의 다형뿐만 아니라, 어느 2종류의 유전자 또는 3종류 모든 유전자의 다형을 조사하는 것이 중요시되고 있다. 그러나, 종래법에서는, 하나의 반응계에 있어서 복수의 서열을 해석할 수 없다고 하는 문제가 있다. 이것은, 전술한 바와 같이, 상기 각 비만 유전자에는 많은 아이소자임이 존재하기 때문에, PCR에 있어서, 상기 각 유전자 이외의 아이소자임의 코드 유전자까지도 증폭되는 것이 원인이라고 생각된다. 이 때문에, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자 중, 2종류의 유전자의 다형 또는 3종류 모든 유전자의 다형을 조사하기 위해서는, 각각의 다형이 발생하는 부위를 포함하는 영역을, 별개의 반응계에 있어서 각각 증폭시키고, 얻어진 증폭 산물을 별개로 해석할 필요가 있다. 이와 같이, 종래의 방법에서는, 비만 유전자 중에서도, 전술한 특정의 유전자만을 주형으로 하고, 또한, 각 유전자에 있어서의 상기 다형이 발생하는 부위를 각각 포함하는 2종류 또는 3종류의 목적 영역만을 특이적으로 증폭시키는 것은 매우 곤란하다. 그리고, 이와 같이, 하나의 샘플을 해석하는 데에도 많은 노력이 들기 때문에, 대량의 샘플을 해석하는 것은 실용적이지 않다고 하는 문제가 있다. 이에 비해서, 본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트에 따르면, 상기 프라이머 세트 (1)∼(3) 중 어느 2종류 또는 3종류 모두를 포함하는 경우라도, 각각의 목적 영역을, 동일 반응액에 있어서 동시에 또한 특이적으로 증폭할 수 있다. 이 때문에, 전술한 종래법과는 달리, 시간이나 비용을 저감하는 것이 가능해진다. 또한, 이와 같이 동일 반응액에 있어서 2개 또는 3개의 목적 영역이 특이적으로 증폭되기 때문에, 예컨대, 각각의 목적 영역에 있어서의 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 사용함으로써, 상기 반응액을 이용하여 그대로 Tm 해석을 행해서, 상기 2종류 또는 3종류의 다형을 각각 타이핑하는 것이 가능해진다. 이와 같이, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자 중, 2종류 또는 3종류의 유전자에 있어서의 특정의 다형을 동일 반응액으로 해석하는 것이 가능해지기 때문에, 본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트는, 예컨대, 프라이머 세트 (1)∼(3) 중 어느 1종류를 포함하는 경우는 물론, 어느 2종류 또는 3종류를 포함하는 것도 바람직하다. 이러한 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트를 이용하여, 1개의 목적 영역은 물론, 2개 또는 3개의 목적 영역을 동시에 증폭하면, 종래보다도 효율적으로, 상기 비만 유전자의 다형 해석을 행할 수 있다.
또한, 이하, 포워드 프라이머를 F 프라이머, 리버스 프라이머를 R 프라이머라고 말하는 경우가 있다.
우선, β2AR 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트 (1)에 대해서 설명한다. 프라이머 세트 (1)은, 전술한 바와 같이, 하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 포워드 프라이머 및 하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 리버스 프라이머를 포함하는 한 쌍의 프라이머 세트이다.
(F1) 서열번호 1의 염기서열에 있어서의 4250번째의 티민 염기(T)를 1염기째로 하여 5'방향을 향해서 18∼25염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 티민 염기(T)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드, 및
서열번호 1의 염기서열에 있어서의 4247번째의 티민 염기(T)를 1염기째로 하여 5'방향을 향해서 18∼26염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 티민 염기(T)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드
(R1) 서열번호 1의 염기서열에 있어서의 4292번째의 아데닌 염기(A)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 21∼31염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 4292번째의 아데닌 염기(A)에 상보적인 티민 염기(T)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드, 및
서열번호 1의 염기서열에 있어서의 4301번째의 아데닌 염기(A)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 18∼27염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 4301번째의 아데닌 염기(A)에 상보적인 티민 염기(T)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
중 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드
서열번호 1에 나타내는 염기서열은, 인간(Homo sapiens) 유래 β2 아드레날린 수용체 단백질(Homo sapiens adrenergic, beta-2-, receptor, surface; ADRβ2(β2AR))을 코드하는 ADRβ2 유전자의 완전 길이 서열이며, 예컨대 NCBI 액세션(accession): N0.DQ094845에 등록되어 있다.
이하, 이 프라이머 세트 (1)을 「β2AR 유전자용 프라이머 세트」라고도 말한다. 상기 β2AR 유전자용 프라이머 세트는, 서열번호 1에 있어서의 4249번째∼4291번째의 영역, 4249번째∼4300번째의 영역, 4251번째∼4291번째의 영역, 또는 4251∼4300번째의 영역을 포함하는 DNA쇄 및 그 상보쇄(相補鎖)를 증폭시키기 위한 프라이머 세트이다. 이 영역 내의 4265번째의 염기(서열번호 1에 있어서의 4265번째의 염기)는, 점돌연변이의 존재가 알려져 있다(4265A, 4265G). 4265번째의 염기가 A이면, β2AR 유전자가 단백질로 번역되었을 때, 아미노산 16위는 아르기닌(Arg)이 되고, 4265번째의 염기가 G로 변이한 경우, 아미노산 16위는 글리신(Gly)이 되는 다형을 나타낸다. 또한, 이들 다형은, 호모 접합체의 경우는, 4265A/4265A, 4265G/4265G, 헤테로 접합체의 경우는, 4265A/4265G로 나타낼 수 있다. 또한, 아미노산으로 치환한 경우, 4265A/4265A는 Arg-16/Arg-16, 4265G/4265G는, Gly-16/Gly-16, 4265A/4265G는 Arg-16/Gly-16으로 나타낼 수 있으며, 이 아미노산에 의한 표기가, 목적으로 하는 β2AR 유전자의 다형의 일반적인 표기이다. 또한, β2AR 유전자의 상기 다형만을 해석하는 경우에는, β2AR 유전자용 프라이머 세트만을 사용하면 된다.
본 발명에 있어서, β2AR 유전자용 프라이머 세트의 F1 프라이머 및 R1 프라이머는, DNA 폴리메라아제에 의한 증폭의 개시점을 결정하는 역할을 수행하는 3'말단의 염기가, 전술한 조건을 만족시키고 있으면 된다. 이와 같이 각 프라이머의 3'말단의 염기를 고정함으로써, β2AR 유전자용 프라이머 세트가, 예컨대, 유사한 다른 아이소자임의 유전자(예컨대, β1AR 유전자 등)에 결합하는 것을 충분히 방지할 수 있다.
이와 같이, F1 프라이머 및 R1 프라이머는, 그 3'말단의 염기가 고정되어 있으면 되기 때문에, 각 프라이머의 길이 자체는 특별히 제한되지 않으며, 일반적인 길이로 적절하게 조정할 수 있다. 프라이머의 길이의 일례로서는, 예컨대, 13∼50 mer의 범위이고, 바람직하게는 14∼45 mer이며, 보다 바람직하게는 15∼40 mer이다. 구체예로서, 상기 F1 프라이머는, 서열번호 1의 염기서열에 있어서의 4248번째의 티민 염기(T)를 1염기째로 하여 5'방향을 향해서 18∼25염기째(바람직하게는, 19∼24염기째, 보다 바람직하게는 19∼23염기째)까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드, 또는 서열번호 1의 염기서열에 있어서의 4250번째의 티민 염기(T)를 1염기째로 하여 5'방향을 향해서 18∼26염기째(바람직하게는, 19∼24염기째, 보다 바람직하게는 19∼22염기째)까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또한, 상기 R1 프라이머는, 서열번호 1의 염기서열에 있어서의 4292번째의 아데닌 염기(A)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 21∼31염기째(바람직하게는, 22∼30염기째, 보다 바람직하게는 23∼28염기째)까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또한, F1 프라이머와 R1 프라이머의 3'말단이 고정되어 있기 때문에, 프라이머로부터 신장하는 영역은, 예컨대, 전술한 바와 같이 서열번호 1에 있어서의 4249번째∼4291번째의 영역, 4249번째∼4300번째의 영역, 4251번째∼4291번째의 영역, 또는 4251∼4300번째의 영역이 되지만, 얻어지는 증폭 산물의 전체의 길이는, 사용하는 프라이머의 길이에 따라서 변화한다.
또한, R1 프라이머는, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 대하여, F1 프라이머는, 상기 염기서열에 대하여, 각각 완전히 상보인 올리고뉴클레오티드가 아니어도 좋다. 즉, 각 프라이머에 있어서의 3'말단의 염기를 제외하는 부분에 있어서, 완전히 상보인 올리고뉴클레오티드와 1개∼5개의 염기가 달라도 좋다.
R1 프라이머를 구성하는 올리고뉴클레오티드는, 서열번호 1의 염기서열에 있어서의 4298번째에 상보적인 염기가, 시토신(C) 및 구아닌(G)의 어떠한 것이어도 좋다. 보다 바람직하게는, R1 프라이머로서, 4298번째에 상보적인 염기가 시토신 인 올리고뉴클레오티드와 4298번째에 상보적인 염기가 구아닌인 올리고뉴클레오티드의 양방을 동시에 사용하는 것이 바람직하다. 서열번호 1의 염기서열에 있어서의 4298번째의 염기에 대해서는, 다형(4298C, 4298G)이 알려져 있으나, 본 발명은, 이 부분에 있어서의 다형을 검출 목적으로 하는 것이 아니다. 이 때문에, 상기 양방의 올리고뉴클레오티드를 R1 프라이머로서 사용함으로써, 4298C 및 4298G의 어떠한 것이어도 상기 프라이머에 의한 유전자 증폭을 행할 수 있으며, 검출 목적 이외의 다형에 의해, 목적 영역의 증폭이 영향을 받는 것을 충분히 회피할 수 있다. 4298번째에 상보적인 염기가 시토신인 올리고뉴클레오티드와 4298번째에 상보적인 염기가 구아닌인 올리고뉴클레오티드의 비율은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 몰비 1:10∼10:1이 바람직하다.
이하에, F1 프라이머와 R1 프라이머의 구체예를 나타내지만, 본 발명은, 이것에는 한정되지 않는다. 또한, 서열번호 12∼22의 염기서열에 있어서의 「s」는, 시토신(C) 또는 구아닌(G)을 나타내고, 서열번호 1의 4298번째에 상보적인 염기에 해당한다. 또한, 이들 F1 프라이머와 R1 프라이머와의 조합은 조금도 제한되지 않으나, 이들 중에서도, 서열번호 9 또는 서열번호 109의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 F1' 프라이머와, 서열번호 12, 서열번호 18 또는 서열번호 134의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 R1' 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 (1')가 특히 바람직하다. 또한, 서열번호 12 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 R1' 프라이머는, 전술한 바와 같이, 「s」가 시토신인 올리고뉴클레오티드와, 「s」가 구아닌인 올리고뉴클레오티드의 양방을 포함하는 것이 바람직하다. 하기 표에 있어서의 「Tm(℃)」은, 하기 표의 서열과 완전히 상보적인 서열이 하이브리드한 경우의 Tm(℃)이며, MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/)에 의해, 파라미터를 올리고뉴클레오티드 농도 0.2 μM, 나트륨당량(Na eq.) 50 mM로 해서 산출한 값이다(이하, 동일). 상기 Tm값은, 예컨대, 종래 공지의 MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/) 등에 의해 산출할 수 있으며, 또한, 인접법(Nearest Neighbor Method)에 의해 결정할 수도 있다(이하, 동일). 하기 표에는, R1 프라이머의 일례로서, 서열번호 1의 4298번째의 염기에 상보적인 염기 「s」를 구아닌으로 한 경우의 Tm값을 기재한다.
Figure pat00001
다음으로, β3AR 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트 (2)에 대해서 설명한다. 상기 프라이머 세트 (2)는, 전술한 바와 같이, 하기 (F2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 포워드 프라이머 및 하기 (R2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 리버스 프라이머를 포함하는 한 쌍의 프라이머 세트이다.
(F2) 서열번호 2의 염기서열에 있어서의 4110번째의 시토신 염기(C)를 1염기째로 하여 5'방향을 향해서 16∼20염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기(C)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
(R2) 서열번호 2의 염기서열에 있어서의 4172번째의 구아닌 염기(G)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 15∼19염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 4172번째의 구아닌 염기(G)에 상보적인 시토신 염기(C)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
서열번호 2에 나타내는 염기서열은, 인간 유래 β3 아드레날린 수용체 단백질(Homo sapiens adrenergic, beta-3-, receptor: ADRβ3(β3AR))을 코드하는 ADRβ2 유전자의 완전 길이 서열이며, 예컨대, NCBI 액세션: N0.DQ104441에 등록되어 있다.
이하, 이 프라이머 세트 (2)를 「β3AR 유전자용 프라이머 세트」라고도 말한다. 상기 β3AR 유전자용 프라이머 세트는, 서열번호 2에 있어서의 4111∼4171번째의 영역을 포함하는 DNA쇄 및 그 상보쇄를 증폭시키기 위한 프라이머 세트이다. 이 영역 내의 4134번째의 염기(서열번호 2에 있어서의 4134번째의 염기)는, 점돌연변이의 존재가 알려져 있다(4134T, 4134C). 그리고, 4134번째의 염기가 T이면, β2AR 유전자가 단백질로 번역되었을 때, 아미노산 64위는 트립토판(Trp)이 되고, 4134번째의 염기가 C로 변이한 경우, 아미노산 64위는 아르기닌(Arg)이 되는 다형을 나타낸다. 또한, 이들 다형은, 호모 접합체의 경우, 4134T/4134T 또는 4134C/4134C, 헤테로 접합체의 경우, 4134T/4134C로 나타낼 수 있다. 또한, 아미노산으로 치환한 경우, 4134T/4134T는, Trp-64/Trp-64, 4134C/4134C는 Arg-64/Arg-64, 4134T/4134C는, Trp-64/Arg-64로 나타낼 수 있고, 이 아미노산에 의한 표기가, 목적으로 하는 β3AR 유전자의 다형의 일반적인 표기이다. 또한, β3AR 유전자의 다형만을 해석하는 경우에는, β3AR 유전자용 프라이머 세트만을 사용하면 된다.
β3AR 유전자용 프라이머 세트의 F2 프라이머 및 R2 프라이머는, DNA 폴리메라아제에 의한 증폭의 개시점을 결정하는 역할을 수행하는 3'말단의 염기가, 전술한 조건을 만족시키고 있으면 된다. 이와 같이 각 프라이머의 3'말단의 염기를 고정함으로써, β3AR 유전자용 프라이머 세트가, 예컨대, 유사한 다른 아이소자임의 유전자(예컨대, β1AR 유전자 등)에 결합하는 것을 충분히 방지할 수 있다.
F2 프라이머 및 R2 프라이머는, 상기 β2AR 유전자용 프라이머 세트와 동일한 이유에서, DNA 폴리메라아제에 의한 증폭의 개시점을 결정하는 역할을 수행하는 3'말단의 염기가, 전술한 조건을 만족시키고 있으면 된다. 이 때문에, F2 프라이머 및 R2 프라이머의 길이 자체는 특별히 제한되지 않으며, 전술과 동일한 길이를 예시할 수 있다. 구체예로서, 상기 F2 프라이머는, 서열번호 2의 염기서열에 있어서의 4110번째의 시토신 염기(C)를 1염기째로 하여 5'방향을 향해서 16∼20염기째(바람직하게는, 17∼20염기째, 보다 바람직하게는 17∼19염기째)까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또한, 상기 R2 프라이머는, 서열번호 2의 염기서열에 있어서의 4172번째의 구아닌 염기(G)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 15∼19염기째(바람직하게는, 16∼19염기째, 보다 바람직하게는 16∼18염기째)까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또한, F2 프라이머와 R2 프라이머의 3'말단이 고정되어 있기 때문에, 프라이머로부터 신장하는 영역은, 예컨대, 전술한 바와 같이 서열번호 2에 있어서의 4111∼4171번째의 영역이지만, 얻어지는 증폭 산물의 전체의 길이는, 사용하는 프라이머의 길이에 따라서 변화한다.
또한, R2 프라이머는, 서열번호 2에 나타내는 염기서열에 대하여, F2 프라이머는, 상기 염기서열에 대하여, 각각 완전히 상보인 올리고뉴클레오티드가 아니어도 좋다. 즉, 각 프라이머에 있어서의 3'말단의 염기를 제외하는 부분에 있어서, 완전히 상보인 올리고뉴클레오티드와 1개∼5개의 염기가 달라도 좋다.
이하에, F2 프라이머와 R2 프라이머의 구체예를 나타내지만, 본 발명은, 이것에는 한정되지 않는다. 또한, 이들 F2 프라이머와 R2 프라이머와의 조합은 조금도 제한되지 않으나, 이들 중에서도, 서열번호 24 또는 서열번호 25의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 F2' 프라이머와 서열번호 28 또는 서열번호 30의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 R2' 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 (2')가 특히 바람직하다.
Figure pat00002
다음으로, UCP1 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트 (3)에 대해서 설명한다. 상기 프라이머 세트 (3)은, 전술한 바와 같이, 하기 (F3)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 포워드 프라이머 및 하기 (R3)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 리버스 프라이머를 포함하는 한 쌍의 프라이머 세트이다.
(F3) 서열번호 3의 염기서열에 있어서의 280번째의 시토신 염기(C)를 1염기째로 하여 5'방향을 향해서 25∼44염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기(C)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
(R3) 서열번호 3의 염기서열에 있어서의 350번째의 시토신 염기(C)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 23∼38염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 350번째의 시토신 염기(C)에 상보적인 구아닌 염기(G)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
서열번호 3에 나타내는 염기서열은, 인간 유래 탈공역 단백질의 5' 다형 영역(Human polymorphic region 5' of uncoupling protein; UCP)을 코드하는 유전자서열이며, 예컨대, NCBI 액세션: N0.U28479에 등록되어 있다.
이하, 상기 프라이머 세트 (3)을, 「UCP1 유전자용 프라이머 세트」라고도 말한다. 상기 UCP1 유전자용 프라이머 세트는, 서열번호 3에 있어서의 281번째∼349번째의 영역을 포함하는 DNA쇄 및 그 상보쇄를 증폭시키기 위한 프라이머 세트이다. 이 영역 내의 292번째의 염기(서열번호 3에 있어서의 292번째의 염기)는, 점돌연변이의 존재가 알려져 있다(292A, 292G). 이들 다형은, 호모 접합체의 경우, 292A/292A, 292G/292G로 나타나고, 헤테로 접합체의 경우, 292A/292G로 나타낼 수 있다. 또한, 서열번호 3에 있어서의 292번째의 염기는, UCP1의 mRNA에 있어서의 -3826번째(UCP1 유전자 번역 개시점의 상류 -3826번째)의 염기에 상당하며, 전술한 다형은, 통상, -3826A/-3826A, -3826G/-3826G, -3826A/-3826G로서 알려져 있다. 또한, UCP1 유전자의 상기 다형만을 해석하는 경우에는, UCP1 유전자용 프라이머 세트만을 사용하면 된다.
F3 프라이머 및 R3 프라이머는, DNA 폴리메라아제에 의한 증폭의 개시점을 결정하는 역할을 수행하는 3'말단의 염기가, 전술한 조건을 만족시키고 있으면 된다. 이와 같이 각 프라이머의 3'말단의 염기를 고정함으로써, UCP1 유전자용 프라이머 세트가, 예컨대, 유사한 다른 아이소자임의 유전자(예컨대, UCP2, UCP3, UCP4 유전자 등)에 결합하는 것을 충분히 방지할 수 있다.
UCP1 유전자용 프라이머 세트의 F3 프라이머 및 R3 프라이머는, β2AR 유전자용 프라이머 세트와 동일한 이유에서, DNA 폴리메라아제에 의한 증폭의 개시점을 결정하는 역할을 수행하는 3'말단의 염기가, 전술한 조건을 만족시키고 있으면 된다. 이 때문에, F3 프라이머 및 R3 프라이머의 길이 자체는 특별히 제한되지 않으며, 전술과 동일한 길이를 예시할 수 있다. 구체예로서, 상기 F3 프라이머는, 서열번호 3의 염기서열에 있어서의 280번째의 시토신 염기(C)를 1염기째로 하여 5'방향을 향해서 25∼44염기째(바람직하게는, 30∼40염기째, 보다 바람직하게는 32∼37염기째)까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또한, 상기 R3 프라이머는, 서열번호 3의 염기서열에 있어서의 350번째의 시토신 염기(C)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 23∼38염기째(바람직하게는, 25∼36염기째, 보다 바람직하게는 26∼32염기째)까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또한, F3 프라이머와 R3 프라이머의 3'말단이 고정되어 있기 때문에, 프라이머로부터 신장하는 영역은, 예컨대, 전술한 바와 같이, 서열번호 3에 있어서의 281번째∼349번째의 영역이지만, 얻어지는 증폭 산물의 전체의 길이는, 사용하는 프라이머의 길이에 따라서 변화한다.
또한, R3 프라이머는, 서열번호 3에 나타내는 염기서열에 대하여, F3 프라이머는, 상기 염기서열에 대하여, 각각 완전히 상보인 올리고뉴클레오티드가 아니어도 좋다. 즉, 각 프라이머에 있어서의 3'말단의 염기를 제외하는 부분에 있어서, 완전히 상보인 올리고뉴클레오티드와 1개∼5개의 염기가 달라도 좋다.
R3 프라이머를 구성하는 올리고뉴클레오티드는, 서열번호 3의 염기서열에 있어서의 376번째에 상보적인 염기가, 구아닌(G) 및 티민(T)의 어떠한 것이어도 좋다. 보다 바람직하게는, R1 프라이머로서, 376번째에 상보적인 염기가 구아닌인 올리고뉴클레오티드와 376번째에 상보적인 염기가 티민인 올리고뉴클레오티드의 양방을 동시에 사용하는 것이 바람직하다. 서열번호 3의 염기서열에 있어서의 376번째의 염기에 대해서는, 다형(376C, 376A)이 알려져 있으나, 본 발명은, 이 부분에 있어서의 다형을 검출 목적으로 하는 것이 아니다. 이 때문에, 상기 양방의 올리고뉴클레오티드를 R3 프라이머로서 사용함으로써, 376C 및 376A의 어떠한 것이어도 상기 프라이머에 의한 유전자 증폭을 행할 수 있으며, 검출 목적 이외의 다형에 의해, 목적 영역의 증폭이 영향을 받는 것을 충분히 회피할 수 있다. 376번째에 상보적인 염기가 구아닌인 올리고뉴클레오티드와 376번째에 상보적인 염기가 티민인 올리고뉴클레오티드의 비율은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 몰비 1:10∼10:1이 바람직하다.
이하에, F3 프라이머와 R3 프라이머의 구체예를 나타내지만, 본 발명은, 이것에는 한정되지 않는다. 또한, 서열번호 53∼64의 염기서열에 있어서의 「k」는, 구아닌(G) 또는 티민(T)을 나타내며, 하기 표의 서열번호 53∼64에는, 서열번호 3의 376번째의 염기에 상보적인 염기를 구아닌 또는 티민으로 한 경우의 각각의 Tm값을 기재한다. 이들 F3 프라이머와 R3 프라이머와의 조합은 조금도 제한되지 않으나, 이들 중에서도, 서열번호 43의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 F2' 프라이머와 서열번호 63의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 R3' 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 (3')가 특히 바람직하다. 또한, 서열번호 63의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 R3' 프라이머는, 전술한 바와 같이, 「k」가 구아닌인 올리고뉴클레오티드와, 「k」가 티민인 올리고뉴클레오티드의 양방을 포함하는 것이 바람직하다.
Figure pat00003
또한, 전술한 프라이머 세트 (1)∼(3)의 각 프라이머는, 예컨대, 증폭 반응의 반응 온도를 올리기 위해서, 종래 공지의 임의의 서열을 5'말단에 부가한 것이어도 좋다
이러한 프라이머 세트 (1)∼(3) 중 적어도 하나를 포함하는 본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트는, 예컨대, 전혈 시료 등의 생체 시료에 있어서의 비만 유전자를 증폭시킬 때에 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트를, 후술하는 바와 같은 다형의 검출용 프로브와 함께 사용할 때에는, 유전자 증폭용 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율을 0.1∼0.5 체적%로 하는 것이 바람직하다. 이 점에 대해서는 후술한다.
<비만 유전자 증폭용 시약>
본 발명의 비만 유전자 증폭용 시약은, 전술한 바와 같이, 유전자 증폭법에 의해 비만 유전자를 증폭하기 위한 시약으로서, 상기 비만 유전자가 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자이며, 본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 비만 유전자 증폭용 시약은, 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 것이 특징이며, 이 이외의 조성 등에 대해서는 조금도 제한되지 않는다.
본 발명의 비만 유전자 증폭용 시약은, 예컨대, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 유전자 증폭법에 의해 얻어지는 증폭 산물을 검출하기 위해서, 또한, 상기 비만 유전자의 검출 대상 부위에 하이브리다이즈 가능한 프로브를 포함해도 좋다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트에 따르면, 예컨대, 그것에 포함되는 프라이머 세트 (1)∼(3)의 종류에 따라서, 유전자 증폭법에 의해 3종류의 비만 유전자의 각 목적 영역을, 각각 특이적으로 증폭할 수 있다. 이 때문에, 상기 비만 유전자의 목적 영역에 있어서의 검출 대상 서열에 상보적(하이브리다이즈 가능한)인 프로브를 공존시킴으로써, 예컨대, 증폭의 유무나, 검출 대상 부위의 유전자형(다형) 등을, 후술하는 방법에 의해 검출하는 것이 가능하다. 이러한 프로브나 그 이용 방법에 관해서는, 이후의 다형의 해석 방법에 있어서 설명한다. 또한, 본 발명의 비만 유전자 증폭용 시약은, 전혈 등의 생체 시료에 있어서의 비만 유전자를 증폭시킬 때에 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명의 비만 유전자 증폭용 시약을, 전술한 바와 같은 프로브와 함께 사용할 때에는, 유전자 증폭용 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율을 0.1∼0.5 체적%로 하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서, 「검출 대상 서열」이란, 다형이 발생하는 부위(검출 대상 부위)를 포함하는 서열을 의미한다.
본 발명의 비만 유전자 증폭용 시약의 형태는, 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트를 함유하는 액체 시약이어도 좋고, 사용 전에 용매로 현탁하는 건조 시약이어도 좋다. 또한, 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트의 함유량도, 특별히 제한되지 않는다.
<증폭 산물의 제조 방법>
본 발명의 증폭 산물의 제조 방법은, 전술한 바와 같이, 유전자 증폭법에 의해 비만 유전자의 증폭 산물을 제조하는 방법으로서, 상기 비만 유전자가, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자이며, 하기 (Ⅰ)공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(Ⅰ) 시료 중의 핵산을 주형(鑄型)으로 하고, 본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트를 이용하여, 반응액 중에서, 상기 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자의 증폭을 행하는 공정
이와 같이 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 행함으로써, 전술한 바와 같이, 비만 유전자의 목적 영역을 증폭시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트가, 상기 프라이머 세트 (1)∼(3) 중 어느 2종류를 포함하는 경우는, 어느 2종류의 비만 유전자에 대해서, 각각의 검출 대상 부위를 포함하는 목적 영역을, 동일 반응액 중에서 동시에 증폭시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트가, 상기 프라이머 세트 (1)∼(3)을 모두 포함하는 경우에는, 상기 3종류의 비만 유전자 모두에 대해서, 각각의 검출 대상 부위를 포함하는 목적 영역을, 동일 반응액 중에서 동시에 증폭시킬 수 있다. 본 발명에 의해 증폭시키는 목적 영역은, 전술한 바와 같이, 각 비만 유전자에 있어서의 각 목적의 다형이 발생하는 검출 대상 부위를 각각 포함하는 영역이다. 또한, 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 있어서는, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하는 것이 특징이며, 유전자 증폭법의 종류나 조건 등은 조금도 제한되지 않는다.
상기 유전자 증폭법으로서는, 전술한 바와 같이 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, PCR(Polymerase Chain Reaction)법, NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)법, TMA(Transcription-mediated amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법 등을 들 수 있으나, PCR법이 바람직하다. 또한, 이하, PCR법을 예로 들어 본 발명을 설명하지만, 이것에는 제한되지 않는다.
본 발명을 적용하는 시료로서는, 예컨대, 주형이 되는 핵산을 포함하고 있으면 되고, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 협잡물이 포함되는 시료에 적용하는 것이 바람직하다. 상기 협잡물이 포함되는 시료로서는, 예컨대, 전혈, 구강 내 세포(예컨대, 구강 점막), 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식세포, 객담(喀痰), 양수, 파라핀 포매 조직, 오줌, 위액(예컨대, 위 세정액) 등이나, 이들의 현탁액 등을 들 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물의 제조 방법에 따르면, 예컨대, 여러 가지 협잡물이 포함되는 시료(특히, 전혈이나 구강 내 세포 등의 생체 시료)여도, 그 영향을 받기 어려워, 3종류의 비만 유전자의 각각의 목적 영역을 특이적으로 증폭할 수 있다. 이 때문에, 본 발명에 따르면, 종래법에서는 곤란하였던 협잡물이 많은 시료여도, 예컨대, 정제 등의 전처리를 행하지 않고서, 그대로 사용하는 것이 가능하다. 따라서, 시료의 전처리의 관점에서도, 종래법보다 더욱 신속하게 증폭 산물을 조제하는 것이 가능하다고 말할 수 있다.
상기 반응액에 있어서의 시료의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않는다. 구체예로서, 상기 시료가 생체 시료(예컨대, 전혈 시료)인 경우, 상기 반응액에 있어서의 첨가 비율의 하한이, 예컨대, 0.01 체적% 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.05 체적% 이상, 더욱 바람직하게는 0.1 체적% 이상이다. 또한, 상기 첨가 비율의 상한도, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 2 체적% 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1 체적% 이하, 더욱 바람직하게는 0.5 체적% 이하이다.
또한, 후술하는 바와 같은 광학적 검출을 목적으로 하는 경우, 특히, 표지화 프로브를 이용한 광학적 검출을 행하는 경우, 전혈 시료와 같은 생체 시료의 첨가 비율은, 예컨대, 0.1∼0.5 체적%로 설정하는 것이 바람직하다. PCR 반응에 있어서는, 통상, DNA 변성(단일쇄 DNA로의 해리)을 위해서 열처리가 실시되지만, 이 열처리에 의해 시료에 포함되는 당이나 단백질 등이 변성하여, 불용화의 침전물이나 혼탁 등이 발생할 우려가 있다. 이 때문에, 증폭 산물의 유무나 검출 대상 부위의 유전자형(다형)을 광학적 수법에 의해 확인하는 경우, 이러한 침전물이나 혼탁의 발생이 측정 정밀도에 영향을 미칠 가능성이 있다. 그러나, 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율을 전술한 범위로 설정하면, 메커니즘은 불분명하지만, 예컨대, 변성에 의한 침전물 등의 발생에 의한 영향을 충분히 방지할 수 있기 때문에, 광학적 수법에 의한 측정 정밀도를 향상시킬 수 있다. 또한, 전혈 시료 중의 협잡물에 의한 PCR의 저해도 충분히 억제되기 때문에, 증폭 효율을 보다 한층 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트의 사용에 더하여, 또한, 전혈 시료 등의 시료의 첨가 비율을 전술한 범위로 설정함으로써, 시료의 전처리의 필요성을 보다 한층 배제할 수 있다.
또한, 상기 반응액 중의 전혈 시료의 비율은, 전술한 바와 같은 체적 비율(예컨대, 0.1∼0.5 체적%)이 아니라, 헤모글로빈(이하, 「Hb」라고 말한다)의 중량 비율로 나타낼 수도 있다. 이 경우, 상기 반응액에 있어서의 전혈 시료의 비율은, Hb량으로 환산하여, 예컨대, 0.565∼113 g/L의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 2.825∼56.5 g/L의 범위, 더욱 바람직하게는 5.65∼28.25 ㎍/L의 범위이다. 또한, 상기 반응 중에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율은, 예컨대, 상기 체적 비율과 Hb 중량 비율의 양쪽을 만족시켜도 좋고, 어느 한쪽을 만족시켜도 좋다.
전혈로서는, 예컨대, 용혈된 전혈, 미용혈의 전혈, 항응고 전혈, 응고 분획(fraction)을 포함하는 전혈 등의 어떠한 것이어도 좋다.
본 발명에 있어서, 시료에 포함되는 표적 핵산은, 예컨대, DNA이다. 상기 DNA는, 예컨대, 생체 시료 등의 시료에 원래 포함되는 DNA여도 좋고, 유전자 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물 DNA여도 좋다. 후자의 경우, 상기 시료에 원래 포함되어 있는 RNA(토탈 RNA, mRNA 등)로부터 역전사 반응(예컨대, RT-PCR(Reverse Transcription PCR))에 의해 생성시킨 cDNA를 들 수 있다.
본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 있어서, 유전자 증폭 반응의 개시에 앞서, 상기 반응액에 알부민을 더 첨가하는 것이 바람직하다. 이와 같이, 알부민을 첨가하면, 예컨대, 전술한 바와 같은 침전물이나 혼탁의 발생에 의한 영향을 보다 한층 저감시킬 수 있으며, 또한, 증폭 효율도 더욱 향상시킬 수 있다. 구체적으로는, 상기 (Ⅰ)공정의 증폭 반응이나, 단일쇄 DNA로의 해리 공정 전에, 알부민을 첨가하는 것이 바람직하다.
상기 반응액에 있어서의 알부민의 첨가 비율은, 예컨대, 0.01∼2 중량%의 범위이고, 바람직하게는 0.1∼1 중량%이며, 보다 바람직하게는 0.2∼0.8 중량%이다. 상기 알부민으로서는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민, 래트 혈청 알부민, 말 혈청 알부민 등을 들 수 있으며, 이들은 어느 1종류여도 좋고 2종류 이상을 병용해도 좋다.
다음으로, 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 관해서, 전혈 시료에 대하여, DNA를 표적 핵산으로 하고, 상기 프라이머 세트 (1)∼(3)을 포함하는 본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트를 이용한 PCR에 의해, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자의 각 증폭 산물을, 동일 반응액에 있어서 동시에 제조하는 예를 들어서 설명한다. 또한, 본 발명은, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하는 것이 특징이며, 다른 구성 및 조건은 조금도 제한되지 않는다.
우선, PCR 반응액을 조제한다. 본 발명의 프라이머 세트의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않으나, 프라이머 세트 (1)∼(3)의 F 프라이머를, 각각 0.1∼2 μmol/L가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.25∼1.5 μmol/L이며, 특히 바람직하게는 0.5∼1 μmol/L이다. 또한, 프라이머 세트 (1)∼(3)의 R 프라이머를, 각각 0.1∼2 μmol/L가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.25∼1.5 μmol/L이며, 특히 바람직하게는 0.5∼1 μmol/L이다. 각 프라이머 세트에 있어서의 F 프라이머와 R 프라이머와의 첨가 비율(F:R, 몰비)은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 1:0.25∼1:4가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1:0.5∼1:2이다.
반응액에 있어서의 전혈 시료의 비율은, 특별히 제한되지 않으나, 전술한 범위가 바람직하다. 전혈 시료는, 그대로 반응액에 첨가해도 좋고, 미리, 물이나 완충액 등의 용매로 희석하고 나서 반응액에 첨가해도 좋다. 전혈 시료를 미리 희석하는 경우, 그 희석률은 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 반응액에서의 최종적인 전혈 첨가 비율이 상기 범위가 되도록 설정할 수 있으나, 예컨대, 100∼2000배이고, 바람직하게는 200∼1000배이다.
상기 반응액에 있어서의 다른 조성 성분은, 특별히 제한되지 않으며, 종래 공지의 성분을 들 수 있고, 그 비율도 특별히 제한되지 않는다. 상기 조성 성분으로서는, 예컨대, DNA 폴리메라아제, 뉴클레오티드(뉴클레오시드 삼인산(dNTP)) 및 용매를 들 수 있다. 또, 전술한 바와 같이 상기 반응액은 또한 알부민을 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 반응액에 있어서, 각 조성 성분의 첨가 순서는 조금도 제한되지 않는다.
상기 DNA 폴리메라아제로서는, 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 종래 공지의 내열성 세균 유래의 폴리메라아제를 사용할 수 있다. 구체예로서는, 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래 DNA 폴리메라아제(미국 특허 제4,889,818호 및 미국 특허 제5,079,352호)(상품명 Taq 폴리메라아제), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus) 유래 DNA 폴리메라아제(WO 91/09950)(rTth DNA polymerase), 피로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 DNA 폴리메라아제(WO 92/9688)(Pfu DNA polymerase: Stratagenes사 제조), 써모코커스 리토랠리스 (Thermococcus litoralis) 유래 DNA 폴리메라아제(EP-A 455 430)(상표 Vent: Biolab New England사 제조) 등이 상업적으로 입수 가능하고, 그 중에서도, 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래의 내열성 DNA 폴리메라아제가 바람직하다.
상기 반응액 중의 DNA 폴리메라아제의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 1∼100 U/mL이고, 바람직하게는 5∼50 U/mL이며, 보다 바람직하게는 20∼30 U/mL이다. 또한, DNA 폴리메라아제의 활성 단위(U)는, 일반적으로, 활성화연어 정자 DNA를 주형 프라이머로 하고, 활성 측정용 반응액 중, 74℃에서, 30분 동안에 10 ㎚ol의 전체 뉴클레오티드를 산 불용성 침전물에 받아들이는 활성이 1U이다. 상기 활성 측정용 반응액의 조성은, 예컨대, 25 mM TAPS buffer(pH9.3, 25℃), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM 메르캅토에탄올, 200 μM dATP, 200 μM dGTP, 200 μM dTTP, 100 μM 「α-32P」dCTP, 0.25 ㎎/mL 활성화 연어 정자 DNA이다.
상기 뉴클레오시드 삼인산으로서는, 통상, dNTP(dATP, dCTP, dTTP)를 들 수 있다. 상기 반응액 중의 dNTP의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 0.01∼1 mmol/L이고, 바람직하게는 0.05∼0.5 mmol/L이며, 보다 바람직하게는 0.1∼0.3 mmol/L이다.
상기 용매로서는, 예컨대, Tris-HCl, Tricine, MES, MOPS, HEPES, CAPS 등의 완충액을 들 수 있으며, 시판의 PCR용 완충액이나 시판의 PCR 키트의 완충액 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 PCR 반응액은, 또한, 헤파린, 베타인, KCl, MgCl2, MgSO4, 글리세롤 등을 포함해도 좋으며, 이들의 첨가 비율은, 예컨대, PCR 반응을 저해하지 않는 범위에서 설정하면 된다.
반응액의 전체 체적은, 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 사용하는 기기(써멀 사이클러(thermal cycler)) 등에 따라서 적절하게 결정할 수 있으나, 통상, 1∼500 μL이고, 바람직하게는 10∼100 μL이다.
다음으로, PCR을 행한다. PCR의 사이클 조건은 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, (1) 전혈 유래 이중쇄 DNA의 단일쇄 DNA로의 해리, (2) 프라이머의 어닐링, (3) 프라이머의 신장(폴리메라아제 반응)은, 각각 이하와 같다. 또한, 사이클수도 특별히 제한되지 않으나, 하기 (1)∼(3)의 3단계를 1사이클로 해서, 예컨대, 30사이클 이상이 바람직하다. 상한은 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 합계 100사이클 이하, 바람직하게는 70사이클 이하, 더욱 바람직하게는 50사이클 이하이다. 각 단계의 온도 변화는, 예컨대, 써멀 사이클러 등을 이용하여 자동적으로 제어하면 된다. 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 경우, 전술한 바와 같이 증폭 효율이 우수하기 때문에, 종래의 방법에 따르면 50사이클에 3시간 정도를 필요로 하고 있었던 데 비해서, 본 발명에 따르면, 약 1시간 정도(바람직하게는 1시간 이내)로 50사이클을 완료하는 것도 가능하다.
Figure pat00004
이상과 같이 하여, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자의 각 목적 영역의 증폭 산물을, 동일 반응액에 있어서 동시에 제조할 수 있다. 또한, 3종류의 비만 유전자 중 어느 1종류 또는 어느 2종류의 비만 유전자의 각 목적 영역에 상보적인 증폭 산물을 제조하는 경우에는, 예컨대, 프라이머 세트 (1)∼(3) 중 목적 영역에 대응하는 어느 1종류 또는 어느 2종류의 프라이머 세트를 포함하는, 본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트를 사용하면 된다.
본 발명의 증폭 산물의 제조 방법은, 또한, 전술한 증폭 반응에 의해 얻어진 증폭 산물을 검출하는 공정을 포함해도 좋다. 이것에 의해, 증폭 산물의 유무나, 상기 비만 유전자의 목적 영역에 있어서의 유전자형을 검출할 수도 있다. 증폭 산물의 유무는, 종래 공지의 방법에 의해 확인할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 상기 (Ⅰ)공정에 있어서, 상기 반응액에, 또한, β2AR 유전자, β3AR 유전자 또는 UCP1 유전자의 검출 대상 부위에 하이브리다이즈 가능한 프로브(예컨대, 형광 표지화 프로브)를 첨가해 두고, 또한, (Ⅱ)공정으로서, 상기 반응액에 대해서, 상기 프로브에 있어서의 형광 표지의 형광 강도를 측정함으로써 확인할 수 있다. 또한, 증폭시키는 목적 영역이 2개 또는 3개인 경우에는, 예컨대, 상기 (Ⅰ)공정에 있어서, 상기 반응액에, 또한, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자 중 어느 하나의 각 검출 대상 부위에 하이브리다이즈 가능한 프로브(예컨대, 형광 표지화 프로브)를 2종류 또는 3종류 첨가해 두고, 또한, (Ⅱ)공정으로서, 상기 반응액에 대해서, 각 프로브에 있어서의 각 형광 표지의 형광 강도를 측정함으로써 확인할 수 있다. 또한, 비만 유전자에 있어서의 다형의 검출에 대해서는, 본 발명의 일 형태로서, 이하에 설명한다.
<비만 유전자의 다형 해석 방법>
본 발명의 다형 해석 방법은, 비만 유전자에 있어서의 검출 대상 부위의 다형을 해석하는 방법으로서, 상기 비만 유전자가, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자이며, 하기 (ⅰ)∼(ⅳ)공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(ⅰ) 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 의해, 상기 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자에 있어서의 검출 대상 부위를 포함하는 영역을 반응액 중에서 증폭시키는 공정
(ⅱ) 상기 (ⅰ)공정에 있어서의 증폭 산물과, 상기 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자에 있어서의 검출 대상 부위에 하이브리다이즈 가능한 프로브를 포함하는 반응액을 준비하는 공정
(ⅲ) 상기 반응액의 온도를 변화시켜, 상기 증폭 산물과 상기 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널 값을 측정하는 공정
(ⅳ) 온도 변화에 따르는 상기 시그널 값의 변동으로부터, 상기 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 유전자에 있어서의 검출 대상 부위의 다형을 결정하는 공정
이와 같이 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 산물을 제조함으로써, 전술한 바와 같이, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자 중 적어도 하나의 비만 유전자에 있어서의 다형의 검출 대상 부위를 포함하는 목적 영역을 증폭하여, 상기 목적 영역에 있어서의 검출 대상 부위의 다형을 해석할 수 있다.
상기 (ⅰ)공정에 있어서의 프로브는, 특별히 제한되지 않으며, β2AR 유전자의 검출 대상 부위에 하이브리다이즈하는 프로브(이하, 「β2AR 유전자용 프로브」라고도 말한다), β3AR 유전자의 검출 대상 부위에 하이브리다이즈하는 프로브(이하, 「β3AR 유전자용 프로브」라고도 말한다) 및 UCP1 유전자의 검출 대상 부위에 하이브리다이즈하는 프로브(이하, 「UCP1 유전자용 프로브」라고도 말한다)인 것이 바람직하다. 이들 프로브는, 상기 검출 대상 서열을 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브인 것이 바람직하다. 이들 프로브는, 어느 1종류여도 좋고, 어느 2종류 또는 3종류 모두여도 좋으며, 예컨대, 본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트에 의해 증폭시킨 목적 영역의 종류에 따라서 결정할 수 있다. 2종류 또는 3종류의 프로브를 이용한 경우, 예컨대, 동일 반응액을 이용하여, 어느 2개의 검출 대상 부위 또는 상기 3개 모든 검출 대상 부위의 다형을 해석할 수 있다.
상기 비만 유전자에 대한 프로브는, 특별히 제한되지 않으며, 종래 공지의 방법에 의해 설정할 수 있고, 예컨대, 다형의 검출 목적 부위를 포함하는 검출 대상 서열로서, 각 비만 유전자의 센스쇄의 서열에 기초하여 설계해도 좋고, 안티센스쇄의 서열에 기초하여 설계해도 좋다. 또한, 다형의 검출 목적 부위의 염기는, 각 다형의 종류에 따라서 적절하게 결정할 수 있다. 즉, β2AR 유전자의 경우, 서열번호 1에 있어서의 4265번째의 염기에 「A」 및 「G」의 다형이 알려져 있기 때문에, 예컨대, 4265번째가 A인 검출 대상 서열, 및 4265번째가 G인 검출 대상 서열 중 어느 하나에 상보적인 프로브(센스쇄의 검출용 프로브)나, 그 안티센스쇄의 서열에 상보적인 프로브(안티센스쇄의 검출용 프로브)를 들 수 있다. 또한, β3AR 유전자의 경우, 서열번호 2에 있어서의 4134번째의 염기에 「T」 및 「C」의 다형이 알려져 있기 때문에, 예컨대, 4134번째가 T인 검출 대상 서열, 및 4265번째가 C인 검출 대상 서열 중 어느 하나에 상보적인 프로브(센스쇄의 검출용 프로브)나, 그 안티센스쇄의 서열에 상보적인 프로브(안티센스쇄의 검출용 프로브)를 들 수 있다. 또한, UCP1 유전자의 경우, 서열번호 3에 있어서의 292번째의 염기에 「A」 및 「G」의 다형이 알려져 있기 때문에, 예컨대, 4134번째가 A인 검출 대상 서열, 및 4265번째가 G인 검출 대상 서열 중 어느 하나에 상보적인 프로브(센스쇄의 검출용 프로브)나, 그 안티센스쇄의 서열에 상보적인 프로브(안티센스쇄의 검출용 프로브)를 들 수 있다. 이와 같이, 다형이 발생하는 검출 목적 부위의 염기를 전술한 바와 같은 어느 하나의 염기로 설정하여 프로브를 설계해도, 후술하는 바와 같은 방법에 의해, 각 비만 유전자의 검출 목적 부위에 있어서 어떠한 다형을 나타내는지를 판단하는 것이 가능하다.
상기 각 프로브는, 상기 (ⅰ)공정 후, 즉, 상기 비만 유전자의 목적 영역에 대해서 증폭 반응을 행한 후, 증폭 반응액에 첨가할 수도 있으나, 용이하고 또한 신속하게 해석을 행할 수 있다는 점에서, 상기 (ⅰ)공정의 증폭 반응에 앞서, 미리 반응액에 첨가해 두는 것이 바람직하다.
상기 반응액에 있어서의 프로브의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 각 프로브를 10∼400 ㎚ol의 범위가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20∼200 ㎚ol이다. 또한, 프로브의 표지로서 형광 색소를 이용하고 있는 경우, 예컨대, 검출하는 형광 강도를 조정하기 위해서, 표지화 프로브와 동일한 서열인 미표지 프로브를 병용해도 좋으며, 이 미표지 프로브는, 그 3'말단에 인산이 부가되어도 좋다. 이 경우, 표지화 프로브와 비표지 프로브의 몰비는, 예컨대, 1:10∼10:1이 바람직하다. 상기 프로브의 길이는, 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 5∼50 mer이고, 바람직하게는 10∼30 mer이다.
Tm값에 대해서 설명한다. 이중쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열해 가면, 260 ㎚에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이것은, 이중쇄 DNA에 있어서의 양쇄 간의 수소 결합이 가열에 의해 풀려서, 단일쇄 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 이중쇄 DNA가 해리하여 단일쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시 시의 흡광도(이중쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이에 따라 융해가 완료되었다고 판단할 수 있다. 이 현상에 기초하여, 융해 온도 Tm이란, 일반적으로, 흡광도가, 흡광도 전체 상승분의 50%에 도달했을 때의 온도라고 정의된다.
상기 (ⅲ)공정에 있어서, 상기 증폭 산물과 상기 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널의 측정은, 전술한, 260 ㎚의 흡광도 측정이어도 좋으나, 표지 물질의 시그널 측정이어도 좋다. 구체적으로는, 상기 프로브로서, 표지 물질로 표지화된 표지화 프로브를 사용하여, 상기 표지 물질의 시그널 측정을 행하는 것이 바람직하다. 상기 표지화 프로브로서는, 예컨대, 단독으로 시그널을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지화 프로브, 또는 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지화 프로브를 들 수 있다. 전자와 같은 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성하고 있을 때에는 시그널을 나타내지 않고, 가열에 의해 프로브가 유리하면 시그널을 나타낸다. 또한, 후자의 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성함으로써 시그널을 나타내고, 가열에 의해 프로브가 유리하면 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 이 표지에 의한 시그널을 시그널 특유의 조건(흡수 파장 등)으로 검출함으로써, 상기 260 ㎚의 흡광도 측정과 마찬가지로, 융해의 진행 및 Tm값의 결정 등을 행할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 동일 반응액으로 증폭시킨 2종류 또는 3종류의 비만 유전자의 증폭 산물에 대해서 각 다형을 확인할 수도 있다. 이 때문에, 2종류 또는 3종류의 프로브를 사용할 때에는, 각각 다른 조건으로 검출되는 다른 표지(예컨대, 형광 표지)에 의해 표지화되어 있는 것이 바람직하다. 이와 같이 다른 표지을 사용함으로써, 동일 반응액이어도, 검출 조건을 변경시킴으로써, 각 증폭 산물을 별개로 해석하는 것이 가능해진다.
상기 표지화 프로브에 있어서의 표지 물질의 구체예로서는, 예컨대, 형광 색소(형광단)를 들 수 있다. 상기 표지화 프로브의 구체예로서는, 예컨대, 형광 색소로 표지되며, 단독으로 형광을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 형광이 감소(예컨대, 소광)하는 프로브가 바람직하다. 이러한 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)을 이용한 프로브는, 일반적으로, 형광 소광 프로브라고 불린다. 그 중에서도, 상기 프로브로서는, 올리고뉴클레오티드의 3'말단 또는 5'말단이 형광 색소로 표지화되어 있는 것이 바람직하고, 표지화되는 상기 말단의 염기는 C인 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 표지화 프로브가 하이브리다이즈하는 검출 대상 서열에 있어서, 상기 표지화 프로브의 말단 염기 C와 쌍을 이루는 염기 또는 상기 쌍을 이루는 염기로부터 1∼3염기 떨어진 염기가 G가 되도록, 상기 표지화 프로브의 염기서열을 설계하는 것이 바람직하다. 이러한 프로브는, 일반적으로 구아닌 소광 프로브라고 불리며, 소위 QProbe(등록 상표)로서 알려져 있다. 이러한 구아닌 소광 프로브가 검출 대상 서열에 하이브리다이즈하면, 형광 색소로 표지화된 말단의 C가, 상기 검출 대상 DNA에 있어서의 G에 접근함으로써, 상기 형광 색소의 발광이 약해진다(형광 강도가 감소한다)고 하는 현상을 나타낸다. 이러한 프로브를 사용하면, 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다.
상기 형광 색소로서는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있으며, 시판의 형광 색소로서는, 예컨대, BODIPY FL(상표, 몰레큘러 프로브사 제조), FluorePrime(상품명, 아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia)사 제조), Fluoredite(상품명, 밀리포어사 제조), FAM(ABI사 제조), Cy3 및 Cy5(아머샴 파마시아사 제조), TAMRA(몰레큘러 프로브사 제조) 등을 들 수 있다. 3종류의 프로브에 사용하는 형광 색소의 조합은, 예컨대, 다른 조건으로 검출할 수 있으면 되고, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, Pacific Blue(검출 파장 450∼480 ㎚), TAMRA(검출 파장 585∼700 ㎚) 및 BODIPY FL(검출 파장 515∼555 ㎚)의 조합 등을 들 수 있다.
이하에, 전술한 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자의 각 다형을 검출하기 위한 프로브의 서열의 구체예를 나타낸다. 또한, 본 발명은, 이것에는 제한되지 않는다. 하기 프로브 (P1)은, β2AR 유전자용 프로브의 일례이며, (1-1)은 센스쇄를 검출하기 위한 프로브이고, (1-2)는 안티센스쇄를 검출하기 위한 프로브이다. 하기 프로브 (2)는, β3AR 유전자용 프로브의 일례이며, (2-1)은 안티센스쇄를 검출하기 위한 프로브이고, (2-2)는 센스쇄를 검출하기 위한 프로브이다. 하기 프로브 (3)은, UCP1 유전자용 프로브의 일례이며, 안티센스쇄를 검출하기 위한 프로브이다. 또한, 각 프로브 (P1)∼(P3)은, 각각 1종류여도 좋고, 후술하는 바와 같이, 각각 2종류 이상을 병용해도 좋다.
프로브 ( P1 )
(1-1) 서열번호 1에 있어서의 4254번째의 티민 염기(T)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 21∼26염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 티민 염기에 상보적인 아데닌 염기(A)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
(1-2) 서열번호 1에 있어서의 4259번째의 시토신 염기(C)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 15∼19염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기를 5'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
프로브 ( P2 )
(2-1) 서열번호 2에 있어서의 4140번째의 시토신 염기(C)를 1염기째로 하여 5'방향을 향해서 17∼28염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
(2-2) 서열번호 2에 있어서의 4144번째의 구아닌 염기(G)를 1염기째로 하여 5'방향을 향해서 12∼17염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 구아닌 염기에 상보적인 시토신 염기(C)를 5'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
프로브 ( P3 )
서열번호 3에 있어서의 280번째의 시토신 염기(C)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 17∼31염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기를 5'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
상기 프로브 (1-1)에 있어서, 서열번호 1의 4265번째에 상보적인 염기는 y로 표시되고, 상기 y는 T 또는 C이다. 상기 프로브 (1-2)에 있어서, 서열번호 1의 4265번째에 해당하는 염기는 r로 표시되고, 상기 r은 A 또는 G이다. 상기 프로브 (2-1)에 있어서, 서열번호 2의 4134번째에 해당하는 염기는 y로 표시되고, 상기 y는 T 또는 C이다. 상기 프로브 (2-2)에 있어서, 서열번호 2의 4134번째에 상보적인 염기는 r로 표시되고, 상기 r은 A 또는 G이다. 상기 프로브 (3)에 있어서, 서열번호 3의 292번째에 해당하는 염기는 r로 표시되고, 상기 r은 A 또는 G이다.
또한, 상기 프로브 (1), 프로브 (2) 및 프로브 (3)의 구체예를 하기 표에 나타낸다. 하기 표에 있어서의 「Tm(℃)」은, 하기 표의 서열과 완전히 상보적인 서열이 하이브리드한 경우의 Tm(℃)이며, MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/)에 의해, 파라미터를 올리고뉴클레오티드 농도 0.2 μM, 나트륨당량(Na eq.) 50 mM로 해서 산출한 값이다.
Figure pat00005
상기 표에 있어서, 서열번호 69∼74의 올리고뉴클레오티드가, 프로브 (1-1)의 구체예이며, 각 염기서열에 있어서의 「y」는, 이하에 나타내는 바와 같이, T 및 C의 어떠한 것이어도 좋다. 상기 표에 있어서, 「y」가 C인 서열번호 69∼서열번호 74로 나타나는 프로브 (1-1)은, 서열번호 1의 4265번째의 염기가 G인 β2AR 유전자(센스쇄)에 대하여 상보적(퍼펙트 매치)인 프로브이며, 대문자의 염기 C가, 서열번호 1의 4265번째의 염기 G에 상보적인 염기를 나타낸다. 상기 표에 있어서는, 구체예로서, 「y」가 「C」인 프로브의 서열, 및 상기 프로브와 그것에 완전히 상보적인 서열이 하이브리다이즈한 경우의 Tm값(℃)을 나타낸다.
5'-cgcatggcttcyattgggtgcca-3' (서열번호 72: y)
5'-cgcatggcttccattgggtgcca-3' (서열번호 72, 101: y가 C)
5'-cgcatggcttctattgggtgcca-3' (서열번호 72, 102: y가 T)
상기 표에 있어서, 서열번호 112∼116의 올리고뉴클레오티드가, 상기 프로브 (1-2)의 구체예이며, 각 염기서열에 있어서의 「r」은, 전술한 바와 같이 A 및 G의 어떠한 것이어도 좋다. 또한, 상기 표에 있어서, 「r」이 G인 서열번호 112∼서열번호 116으로 나타나는 프로브 (1-2)는, 서열번호 1의 4265번째의 염기가 G인 β2AR 유전자의 상보쇄(안티센스쇄)에 대하여 상보적(퍼펙트 매치)인 프로브이며, 대문자의 염기가, 서열번호 1의 4265번째의 염기를 나타낸다. 상기 표에 있어서는, 구체예로서, 「r」이 「G」인 프로브의 서열, 및 상기 프로브와 그것에 완전히 상보적인 서열이 하이브리다이즈한 경우의 Tm값(℃)을 나타낸다.
Figure pat00006
상기 표에 있어서, 서열번호 75∼86으로 나타나는 프로브 (2-1)은, 서열번호 2에 있어서의 4134번째가 C인 영역과 동일한 서열로 이루어지며, 대문자의 염기가, 서열번호 2에 있어서의 4134번째의 염기를 나타낸다. 또한, 상기 프로브 (2-1)에 있어서, 상기 대문자의 염기는 y로 치환할 수 있으며, 상기 y는 C 및 T의 어떠한 것이어도 좋다. 상기 표에 있어서, 서열번호 117∼128로 나타나는 프로브 (2-2)는, 서열번호 2에 있어서의 4134번째가 C인 영역에 상보적인 서열로 이루어지며, 대문자의 염기가, 서열번호 2에 있어서의 4134번째의 염기에 상보적인 염기를 나타낸다. 또한, 상기 프로브 (2-2)에 있어서, 상기 대문자의 염기는 r로 치환할 수 있으며, 상기 r은 G 및 A의 어떠한 것이어도 좋다. 상기 표에 있어서, 서열번호 87∼100 및 139로 나타나는 프로브 (3)은, 서열번호 3에 있어서의 292번째가 G인 영역과 동일한 서열로 이루어지며, 대문자의 염기가, 서열번호 3의 292번째의 염기를 나타낸다. 또한, 상기 프로브 (3)에 있어서, 대문자의 염기는 r로 치환할 수 있으며, 상기 r은 G 및 A의 어떠한 것이어도 좋다. 또한, 본 발명에 있어서의 프로브의 구체예로서는, 예컨대, 전술한 바와 같이, 상기 표에 나타내는 올리고뉴클레오티드의 상보쇄여도 좋다.
상기 프로브는 일례이며, 본 발명은 이것에는 조금도 한정되지 않는다. β2AR 유전자용 프로브로서는, 프로브 (1-1) 중에서도, 서열번호 72의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드가 바람직하며, 「y」는 전술한 바와 같이 T 및 C의 어떠한 것이어도 좋다. 또한, 프로브 (1-2) 중에서도, 서열번호 114의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드가 바람직하며, 「r」은 A 및 G의 어떠한 것이어도 좋다. 또한, β2AR 유전자용 프로브로서는, 소위 야생형 검출용 프로브와 변이형 검출용 프로브를 병용하는 것이 바람직하다. 여기서, 야생형 검출용 프로브란, 예컨대, 서열번호 1의 4265번째의 염기가 A(또는 G)인 검출 대상 서열(센스쇄) 또는 그 상보쇄(안티센스쇄)를 검출하기 위한 프로브이고, 변이형 검출용 프로브란, 서열번호 1의 4265번째의 염기가 G(또는 A)인 검출 대상 서열(센스쇄) 또는 그 상보쇄(안티센스쇄)를 검출하기 위한 프로브이다. 본 발명에 있어서는, 프로브 (1-1) 중에서도, 예컨대, 「y」가 「C」인 서열번호 69∼74의 염기서열로 이루어지는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드(변이형 검출용 프로브)와, 「y」가 「T」인 서열번호 69∼74의 염기서열로 이루어지는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드(야생형 검출용 프로브)를 병용하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 「y」가 「C」인 서열번호 72로 이루어지는 올리고뉴클레오티드(변이형 검출용 프로브)와, 「y」가 「T」인 서열번호 72의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드(야생형 검출용 프로브)와의 병용이다.
본 발명자들은, 별도로, 다형의 해석에 대해서 연구를 행한 결과, β2AR 유전자 다형(β2AR의 아미노산 16위를 코드하는 부위의 다형: 서열번호 1의 4265번째의 염기의 다형)을 해석하는 경우, 프로브를 이용한 Tm 해석에 의하면, 시그널의 검출이 곤란하다는 지견을 얻었다. 그래서, 본 발명자들은, 더욱 예의 연구를 행한 결과, 전술한 프로브 (1), 특히, 서열번호 72의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드(즉, 서열번호 101의 올리고뉴클레오티드와 서열번호 102의 올리고뉴클레오티드)이면, 후술하는 바와 같이, β2AR 유전자의 증폭 산물과 매치하는 경우의 시그널과 미스 매치하는 경우의 시그널을, 충분히 구별하여 검출 가능한 것을 발견하였다. 서열번호 101로 나타나는 프로브는, 서열번호 1의 4265번째의 염기가 G인 β2AR 유전자(센스쇄)의 검출 대상 서열과 퍼펙트 매치하는 프로브이며, 서열번호 102로 나타나는 프로브는, 서열번호 1의 4265번째의 염기가 A인 β2AR 유전자(센스쇄)의 검출 대상 서열과 퍼펙트 매치하는 프로브이다. 또한, 본 발명은, 전술한 바와 같이, 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트를 사용함으로써, 3종류의 유전자의 각각의 목적 영역을, 동일 반응액에 있어서, 동시에 또한 특이적으로 증폭하는 것이 특징이기 때문에, 얻어진 증폭 산물의 해석에 사용하는 프로브의 서열은, 특별히 제한되지 않는다.
β3AR 유전자용 프로브로서는, 프로브 (2-1) 중에서도, 서열번호 83의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 또한, 프로브 (2-2)로서는, 소위 야생형 검출용 프로브와 변이형 검출용 프로브를 병용하는 것이 바람직하다. 여기서, 야생형 검출용 프로브란, 예컨대, 서열번호 2의 4134번째의 염기가 T인 검출 대상 서열(센스쇄) 또는 그 상보쇄(안티센스쇄)를 검출하기 위한 프로브이고, 변이형 검출용 프로브란, 서열번호 2의 4134번째의 염기가 C인 검출 대상 서열(센스쇄) 또는 그 상보쇄(안티센스쇄)를 검출하기 위한 프로브이다. 본 발명에 있어서는, 예컨대, 서열번호 117∼122의 염기서열로 이루어지는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드(변이형 검출용 프로브)와, 서열번호 123∼128의 염기서열로 이루어지는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드(야생형 검출용 프로브)를 병용하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 서열번호 120의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드(변이형 검출용 프로브)와 서열번호 127의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드(야생형 검출용 프로브)를 병용하는 것이다. 이와 같이 야생형 검출용 프로브와 변이형 검출용 프로브를 병용하는 경우, 예컨대, 각 프로브의 퍼펙트 매치의 Tm값을 어긋나게 해서 설정하는 것이 바람직하다.
UCP1 유전자용 프로브로서는, 프로브 (3) 중에서도, 서열번호 95 또는 서열번호 139의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다.
그리고, 이들 프로브는, 2종류 이상을 사용할 때에는, 전술한 바와 같이, 각각 다른 형광 색소(다른 파장으로 검출되는 형광 색소)로 표지화하는 것이 바람직하다. 예컨대, 상기 표에 나타내는 프로브를 소광 프로브로 하는 경우, 프로브 (1-1) 및 프로브 (2-1)은, 3'말단을 전술한 바와 같은 형광 색소(예컨대, Pacific Blue, BODIPY FL 등)로 표지화하는 것이 바람직하고, 프로브 (1-2), 프로브 (2-2) 및 프로브 (3)은, 5'말단의 시토신을 전술한 바와 같은 형광 색소(예컨대, TAMRA 등)로 표지화하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 표에 나타내는 프로브 (1-1)의 3'말단은 아데닌(A)이지만, 인접하는 시토신(C)이 구아닌(G)과 하이브리다이즈함으로써 소광을 확인할 수 있기 때문에, 구아닌 소광 프로브로서 사용할 수 있다. 또한, 5'말단에 형광 색소를 표지화한 프로브는, 예컨대, 프로브 자체가 신장하는 것을 예방하기 위해서, 그 3'말단에, 또한 인산기가 부가되어도 좋다. 또한, 전술한 바와 같이 야생형 검출용 프로브와 변이형 검출용 프로브를 사용하는 경우, 각각의 형광 색소는, 동일해도 좋고 달라도 좋다.
다음으로, 본 발명의 검출 방법에 대해서, 일례로서, 하기 프로브를 이용하여, β2AR 유전자의 다형(서열번호 1에 있어서의 4265번째의 염기의 다형), β3AR 유전자의 다형(서열번호 2에 있어서의 4134번째의 염기의 다형) 및 UCP1 유전자의 다형(서열번호 3에 있어서의 292번째의 염기의 다형)을 검출하는 방법을 설명한다. 또한, 본 발명은 이것에는 제한되지 않는다.
(프로브)
β2AR 유전자용 프로브
5'-cgcatggcttcCattgggtgcca-(Pacific Blue)-3'(서열번호 72), 또는
5'-(Pacific Blue)-cccaatGgaagccatgc-P-3'(서열번호 114)
β3AR 유전자용 프로브
5'-cgtggccatcgccCggactc-(BODIPY FL)-3'(서열번호 83), 또는;
5'-(BODIPY FL)-ctcggagtccGggc-P-3'(서열번호 120), 및
5'-(BODIPY FL)-ctcggagtccAggc-P-3'(서열번호 127)
UCP1 유전자용 프로브
5'-(TAMRA)-cacagtttgatcGagtgcatttg-3'(서열번호 95), 또는
5'-(TAMRA)-cacagtttgatcGagtg-3'(서열번호 139)
우선, 상기 3종류의 표지화 프로브를 첨가한 반응액을 이용하여, 전술한 바와 같이 PCR을 행해서, 동일 반응액 중에서, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자의 각 목적 영역을 동시에 증폭시킨다.
다음으로, 얻어진 증폭 산물의 해리, 및 해리에 의해 얻어진 단일쇄 DNA와 상기 표지화 프로브와의 하이브리다이즈를 행한다. 이것은, 예컨대, 상기 반응액의 온도 변화에 의해 행할 수 있다.
상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도는, 상기 증폭 산물이 해리할 수 있는 온도이면 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 85∼95℃이다. 가열 시간도 특별히 제한되지 않으나, 통상, 1초∼10분이고, 바람직하게는 1초∼5분이다.
해리한 단일쇄 DNA와 상기 표지화 프로브와의 하이브리다이즈는, 예컨대, 상기 해리 공정 후, 상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도를 강하시킴으로써 행할 수 있다. 온도 조건으로서는, 예컨대, 40∼50℃이다.
그리고, 상기 반응액의 온도를 변화시켜, 상기 증폭 산물과 상기 표지화 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널 값을 측정한다. 구체적으로는, 예컨대, 상기 반응액(상기 단일쇄 DNA와 상기 표지화 프로브와의 하이브리드 형성체)을 가열하고, 온도 상승에 따르는 시그널 값의 변동을 측정한다. 전술한 바와 같이, 예컨대, 구아닌 소광 프로브를 사용한 경우, 단일쇄 DNA와의 하이브리다이즈한 상태에서는, 형광이 감소(또는 소광)하고, 해리한 상태에서는, 형광을 발한다. 따라서, 예컨대, 형광이 감소(또는 소광)하고 있는 하이브리드 형성체를 서서히 가열하고, 온도 상승에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.
형광 강도의 변동을 측정할 때의 온도 범위는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 개시 온도가 실온∼85℃이고, 바람직하게는 25∼70℃이며, 종료 온도는, 예컨대, 40∼105℃이다. 또한, 온도의 상승 속도는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 0.1∼20℃/초이고, 바람직하게는 0.3∼5℃/초이다.
다음으로, 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm값을 결정한다. 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터 각 온도에 있어서의 단위 시간당의 형광 강도 변화량(-d 형광 강도 증가량/dt)을 산출하고, 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수 있다. 또한, 단위 시간당의 형광 강도 증가량(형광 강도 증가량/t)이 가장 높은 점을 Tm값으로서 결정할 수도 있다. 또한, 표지화 프로브로서, 소광 프로브가 아니라, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 프로브를 사용한 경우에는, 반대로, 형광 강도의 감소량을 측정하면 된다.
본 발명에 있어서는, 3개의 유전자의 각 다형을 검출하기 위해서, 3종류의 프로브의 각 표지에 따른 조건으로, 각각의 Tm값을 결정한다. β2AR 유전자용 프로브의 Pacific Blue는, 예컨대, 검출 파장 450∼480 ㎚, β3AR 유전자용 프로브의 BODIPY FL은, 예컨대, 검출 파장 515∼555 ㎚, UCP1 유전자용 프로브의 TAMRA는, 예컨대, 검출 파장 585∼700 ㎚에서 검출할 수 있다.
그리고, 이들 Tm값으로부터, 각 유전자의 검출 대상 부위에 있어서의 유전자형을 결정한다. Tm 해석에 있어서, 완전히 상보인 하이브리드(매치)는, 일염기가 다른 하이브리드(미스 매치)보다도, 해리를 나타내는 Tm값이 높아진다는 결과가 얻어진다. 따라서, 미리, 상기 프로브에 대해서, 완전히 상보인 하이브리드의 Tm값과, 일염기가 다른 하이브리드의 Tm값을 결정해 둠으로써, 증폭 산물이 프로브와 매치인지 미스 매치인지를 결정할 수 있다. 예컨대, 검출 대상 서열에 있어서의 목적 부위의 염기를 변이형(예컨대, 서열번호 1에 있어서의 4265번째의 염기가 G)이라고 가정하고, 그것을 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 사용한 경우, 형성한 하이브리드의 Tm값이, 완전히 상보인 하이브리드의 Tm값과 동일하면, 상기 증폭 산물의 다형은 변이형이라고 판단할 수 있다. 또한, 형성한 하이브리드의 Tm값이, 일염기 다른 하이브리드의 Tm값과 동일(완전히 상보인 하이브리드의 Tm값보다 낮은 값)하면, 상기 증폭 산물의 다형은 야생형(서열번호 1에 있어서의 4265번째의 염기가 A)이라고 판단할 수 있다. 또한, 양방의 Tm값이 검출된 경우에는, 헤테로 접합체라고 결정할 수 있다. 이렇게 해서, 각 표지화 프로브에 대한 Tm값으로부터, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자의 각 다형을 판단할 수 있다. 또한, 형광 강도의 검출에 의해 Tm값을 확인할 때, 매치의 시그널과 미스 매치의 시그널을 충분히 구별할 수 있도록, 전술한 바와 같이, 프로브로서, 동일한 올리고뉴클레오티드 서열인 비표지 프로브를 아울러 사용하는 것이 바람직하다. β2AR 유전자용 프로브, β3AR 유전자용 프로브 및 UCP1 유전자용 프로브 중, 비표지 프로브를 아울러 첨가하는 것은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, β3AR 유전자용 프로브에 대해서 표지화 프로브와 비표지 프로브를 첨가하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서는, 전술한 바와 같이, 상기 프로브를 포함하는 반응액의 온도를 상승시키고(하이브리드 형성체를 가열하고), 온도 상승에 따르는 시그널 변동을 측정하는 방법을 대신하여, 예컨대, 하이브리드 형성 시에 있어서의 시그널 변동의 측정을 행해도 좋다. 즉, 상기 프로브를 포함하는 반응액의 온도를 강하시켜 하이브리드 형성체를 형성할 때에, 상기 온도 강하에 따르는 시그널 변동을 측정해도 좋다.
구체예로서, 단독으로 시그널을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지화 프로브(예컨대, 구아닌 소광 프로브)를 사용한 경우, 단일쇄 DNA와 프로브가 해리하고 있는 상태에서는 형광을 발하고 있으나, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예컨대, 상기 반응액의 온도를 서서히 강하하고, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 감소를 측정하면 된다. 한편, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지화 프로브를 사용한 경우, 단일쇄 DNA와 프로브가 해리하고 있는 상태에서는 형광을 발하고 있지 않으나, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 형광을 발하게 된다. 따라서, 예컨대, 상기 반응액의 온도를 서서히 강하하고, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.
또한, 3종류의 비만 유전자(β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자) 중, 어느 1종류의 유전자의 다형 또는 어느 2종류의 유전자의 다형을 해석하는 경우에는, 예컨대, 프라이머 세트 (1)∼(3) 중 목적 영역에 대응하는 어느 1종류 또는 어느 2종류의 프라이머 세트를 포함하는, 본 발명의 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트를 사용하고, 또한, 목적의 검출 대상 부위에 하이브리다이즈하는 어느 1종류의 프로브 또는 어느 2종류의 프로브를 사용하면 된다.
<β2AR 유전자 해석용 프로브>
본 발명의 비만 해석용 프로브는, 비만 유전자의 다형 해석에 사용하기 위한 프로브로서, 상기 비만 유전자가, β2AR 유전자이며, 하기 (P1)에 나타내는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
(P1)
하기 (1-1) 및 하기 (1-2) 중 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드
(1-1) 서열번호 1에 있어서의 4254번째의 티민 염기(T)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 21∼26염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 티민 염기에 상보적인 아데닌 염기(A)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
(1-2) 서열번호 1에 있어서의 4259번째의 시토신 염기(C)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 15∼19염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기를 5'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
상기 (P1)에 나타내는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 상기 β2AR 유전자용 프로브이며, 전술한 바와 같다.
본 발명의 β2AR 유전자용 프로브에 따르면, β2AR 유전자에 있어서의 β2AR 아미노산 16위를 코드하는 부위를 포함하는 검출 대상 서열을 검출할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 프로브를 이용함으로써, 예컨대, 본 발명의 프로브와 상기 검출 대상 서열과의 하이브리드 형성체의 융해 온도 해석을 우수한 신뢰성으로 행하는 것이 가능하고, 또한, 상기 융해 온도 해석에 의해, 시료 중에 있어서의 상기 검출 대상 서열의 유무나 양의 해석, 상기 검출 대상 서열에 있어서의 상기 검출 대상 부위의 다형(서열번호 1의 4265번째의 염기의 다형)의 결정 등도 우수한 신뢰성으로 행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 β2AR 유전자 해석용 프로브는, 후술하는 바와 같이, β2AR 유전자의 해석, 구체적으로는, 예컨대, 융해 온도의 해석, 융해 온도의 해석에 의한 β2AR 유전자의 다형 해석에 사용할 수 있다. 또한, 전술한 3종류의 비만 유전자의 다형 해석 방법에도 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 β2AR 유전자 해석용 프로브나 해석 방법은, 특히, 비만의 치료나 예방을 행하는 의료 분야에 있어서, 매우 유용한 툴(tool)·해석 방법이라고 말할 수 있다.
상기 β2AR 유전자용 프로브는, 예컨대, 표지 물질이 부가되어 있지 않은 미표지 프로브여도 좋으나,, 표지 물질이 부가된 표지화 프로브인 것이 바람직하다. 표지 부위나 표지 물질은, 전술한 바와 같다.
<β2AR 유전자 해석용 시약>
본 발명의 비만 유전자 해석용 시약은, β2AR 유전자의 해석에 사용하기 위한 시약으로서, 본 발명의 β2AR 유전자 해석용 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다(이하, 「β2AR 유전자 해석용 시약」이라고도 말한다). 본 발명의 해석용 시약은, 후술하는 바와 같이, β2AR 유전자의 해석, 구체적으로는, 예컨대, 융해 온도의 해석, 융해 온도의 해석에 의한 β2AR 유전자의 다형 해석에 사용할 수 있다. 또한, β2AR 유전자를 포함하는 전술한 2종류 또는 3종류의 비만 유전자의 다형 해석 방법에도 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 β2AR 유전자 해석용 시약은, 본 발명의 β2AR 유전자 해석용 프로브를 포함하는 것이 특징이며, 이 이외의 조성 등에 대해서는 조금도 제한되지 않는다.
본 발명의 β2AR 유전자 해석용 시약은, 또한, β2AR 유전자에 있어서의 상기 검출 대상 부위를 갖는 검출 대상 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머로서는, 예컨대, 전술한 β2AR 유전자용 프라이머 세트를 들 수 있다. 이와 같이 β2AR 유전자용 프라이머 세트를 포함하는 본 발명의 해석용 시약을 이용하면, 예컨대, β2AR 유전자의 증폭 반응을 행하고, 상기 반응에 의해 얻어진 증폭 산물을 이용해서, 또한, β2AR 유전자의 해석을 행할 수 있다. 상기 β2AR 유전자용 프라이머에 의해 증폭시키는 영역은, β2AR 유전자에 있어서의 상기 검출 대상 부위를 포함하는 영역이면 된다. 구체예로서는, 예컨대, β2AR 유전자에 있어서, 상기 검출 대상 부위를 갖는 검출 대상 서열, 즉, 본 발명의 프로브를 하이브리다이즈시키는 서열이어도 좋고, 상기 검출 대상 서열을 포함하는 영역이어도 좋다. 이하, 증폭 반응에 의해 증폭시키는 영역을 「목적 영역」이라고도 말한다.
또한, 본 발명의 β2AR 유전자 해석용 시약은, 예컨대, 전혈 등의 생체 시료에 있어서의 β2AR 유전자를 해석할 때에 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명의 β2AR 유전자 해석용 시약이, 본 발명의 β2AR 유전자 해석용 프로브 외에, 상기 β2AR 유전자용 프라이머 세트를 포함하며, 검출 대상 서열의 증폭에 사용할 때에는, 예컨대, 증폭 반응의 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율을 0.1∼0.5 체적%로 하는 것이 바람직하다. 이 점에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 β2AR 유전자 해석용 시약의 형태는, 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 본 발명의 β2AR 유전자 해석용 프로브를 함유하는 액체 시약이어도 좋고, 사용 전에 용매로 현탁하는 건조 시약이어도 좋다. β2AR 유전자 해석용 프로브의 함유량도 특별히 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 β2AR 유전자 해석용 시약은, 예컨대, 동일 반응액에 있어서, 다른 유전자나 다른 다형을 검출하기 위한 프로브나 프라이머를 더 포함해도 좋다. 전술한 바와 같이, β2AR 유전자와 마찬가지로, β3AR 유전자나 CYP2C9 유전자의 다형은, 비만의 치료나 예방의 지표가 되는 것이 알려져 있기 때문에, 예컨대, 어느 한쪽 또는 양쪽을 검출하기 위한 프로브나 프라이머 세트를 더 포함해도 좋다. 이와 같이, 예컨대, 복수의 유전자의 목적 영역을 증폭시키고, 프로브에 의한 검출을 행하는 경우, β2AR 유전자의 목적 영역을 특이적으로 증폭할 수 있기 때문에, 전술한 바와 같은 β2AR 유전자용의 프라이머 세트를 함유시키는 것이 바람직하다.
<β2AR 유전자 해석 방법>
본 발명의 비만 유전자 해석 방법은, β2AR 유전자를 해석하는 해석 방법으로서, 하기 (a)∼(c)공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(a) β2AR 유전자에 있어서의 다형의 검출 대상 부위를 갖는 검출 대상 서열과, 본 발명의 β2AR 유전자 해석용 프로브를 포함하는 반응액을 준비하는 공정
(b) 상기 반응액의 온도를 변화시켜, 상기 검출 대상 서열과 상기 β2AR 유전자 해석용 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널 값을 측정하는 공정
(c) 온도 변화에 따르는 상기 시그널 값의 변동으로부터, 상기 하이브리드 형성체의 융해 온도를 결정하는 공정
이와 같이, 본 발명의 β2AR 유전자 해석용 프로브를 이용함으로써, 예컨대, 상기 검출 대상 서열과 상기 β2AR 유전자 해석용 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널 값의 변동을, 충분히 검출할 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 β2AR 유전자 해석 방법에 따르면, β2AR 유전자의 검출 대상 서열에 관한 융해 온도의 결정을 높은 신뢰성으로 행하는 것이 가능하다. 이것에 의해, 예컨대, β2AR 유전자의 검출 대상 부위를 포함하는 영역에 대해서 핵산 증폭을 행했을 때, 상기 목적 영역의 증폭의 유무를, 융해 온도(Tm)의 해석에 의해 높은 신뢰성으로 판단하는 것도 가능해진다. 또한, 본 발명의 프로브와 상기 검출 대상 서열이 퍼펙트 매치하는 경우의 Tm값과, 미스 매치하는 경우의 Tm값이, 충분히 판별 가능한 차이를 나타내기 때문에, 피검 대상의 β2AR 유전자가, 본 발명의 프로브에 대하여 퍼펙트 매치와 미스 매치 중 어떠한 것인지를 충분히 구별하는 것이 가능하다. 이와 같이 퍼펙트 매치와 미스 매치를 충분히 구별할 수 있으면, 피검 대상의 β2AR 유전자의 다형을 보다 한층 우수한 신뢰성으로 판단할 수 있다. 또한, 본 발명의 β2AR 유전자 해석 방법은, 본 발명의 β2AR 유전자 해석용 프로브를 사용하는 것이 특징이며, 예컨대, 측정하는 시그널의 종류, 측정 방법이나 측정 조건 등은, 조금도 제한되지 않는다.
본 발명의 β2AR 유전자 해석 방법은, 전술한 바와 같이 Tm값의 결정이 가능하기 때문에, 하기 (d)공정을 더 포함해도 좋다.
(d) 결정한 융해 온도로부터, β2AR 유전자의 검출 대상 부위의 다형을 결정하는 공정
본 발명의 β2AR 유전자 해석 방법은, 하기 (x)공정을 더 포함해도 좋다. 이러한 방법에 따르면, 예컨대, β2AR 유전자의 증폭, Tm값의 결정, 또한, 다형의 해석을, 동일한 반응액을 이용하여 연속적으로 행하는 것이 가능하다. 또한, 하기 프라이머로서는, 전술한 β2AR 유전자용 프라이머를 사용할 수 있다.
(x) 시료 중의 핵산을 주형으로 하고, β2AR 유전자에 있어서의 상기 검출 대상 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여, 반응액 중, 상기 검출 대상 서열의 증폭을 행하는 공정
상기 (x)공정에 있어서의 유전자 증폭 방법으로서는, 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 전술한 바와 같은 수법을 채용할 수 있고, PCR법이 바람직하다.
상기 β2AR 유전자 해석용 프로브는, 상기 (x)공정 후, 즉, β2AR 유전자의 증폭 반응을 행한 후, 증폭 반응의 반응액에 첨가할 수도 있으나, 용이하고 또한 신속하게 해석을 행할 수 있다는 점에서, 상기 (x)공정의 증폭 반응에 앞서, 미리 반응액에 첨가해 두는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 (x)공정의 증폭 반응 후의 상기 반응액을, 상기 (a)공정에 있어서의 반응액으로서 사용할 수 있다. 이러한 방법에 따르면, 증폭 반응을 행한 반응액을 그대로 이용하여, 융해 온도 해석을 행할 수 있다.
상기 반응액에 있어서의 프로브의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 각 프로브를 10∼400 nmol의 범위가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20∼200 nmol이다. 또한, 프로브의 표지로서 형광 색소를 이용하고 있는 경우, 예컨대, 검출하는 형광 강도를 조정하기 위해서, 표지화 프로브와 동일한 서열인 미표지 프로브를 병용해도 좋고, 이 미표지 프로브는, 그 3'말단에 인산이 부가되어도 좋다. 이 경우, 표지화 프로브와 비표지 프로브의 몰비는, 예컨대, 1:10∼10:1이 바람직하다. 상기 프로브의 길이는, 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 5∼50 mer이고, 바람직하게는 10∼30 mer이다.
상기 (b)공정에 있어서, 상기 검출 대상 서열과 상기 β2AR 유전자 해석용 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널 값의 측정은, 예컨대, 비표지의 프로브를 이용하여, 전술한 260 nm의 흡광도 측정을 행해도 좋으나, 표지화 프로브를 이용하여, 표지 물질의 시그널 측정을 행하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 상기 β2AR 유전자 해석용 프로브로서, 표지 물질로 표지화된 표지화 프로브를 사용하여, 상기 표지 물질의 시그널 측정을 행하는 것이 바람직하다. 상기 표지화 프로브로서는, 예컨대, 전술한 바와 같은 것을 들 수 있으며, 전술과 동일하게 측정할 수 있다.
본 발명을 적용하는 시료로서는, 예컨대, 주형이 되는 핵산을 포함하고 있으면 되고, 특별히 제한되지 않으나, 전술한 바와 같은 것을 들 수 있다. 또한, 상기 반응액에 있어서의 시료의 첨가 비율은, 예컨대, 전술한 바와 같다.
다음으로, 본 발명의 β2AR 유전자 해석 방법에 대해서, 일례로서, 전혈 시료로부터 PCR에 의해 β2AR 유전자의 증폭을 행하고, 본 발명의 β2AR 유전자 해석용 프로브를 이용하여, β2AR 유전자의 다형(서열번호 1에 있어서의 4265번째의 염기의 다형)을 결정하는 방법을 설명한다. 또한, 특별히 나타내지 않는 한, 전술한 본 발명의 비만 유전자의 다형 해석 방법과 동일하게 행할 수 있으며, 또한, 이것에는 제한되지 않는다.
우선, PCR 반응액을 조제하여 PCR을 행하고, 얻어진 증폭 산물의 해리, 및 해리에 의해 얻어진 단일쇄 DNA와 상기 β2AR 유전자 해석용 프로브와의 하이브리다이즈를 행한다. 그리고, 상기 반응액을 가열하고(상기 단일쇄 DNA와 상기 β2AR 유전자 해석용 프로브와의 하이브리드 형성체를 가열하고), 상기 반응액의 시그널 값을 측정한다. 시그널 값의 측정은, 전술한 바와 마찬가지로, 사용하는 β2AR 유전자 해석용 프로브의 표지의 유무, 및 표지 물질의 종류 등에 따라서 적절하게 결정할 수 있다.
다음으로, 측정한 상기 시그널 값의 변동을 해석하여 Tm값을 결정한다. β2AR 유전자 해석용 프로브가 형광 표지화 프로브인 경우에는, 예컨대, 얻어진 형광 강도로부터 각 온도에 있어서의 단위 시간당의 형광 강도 변화량(-d 형광 강도 변화량/dt 또는 d 형광 강도 변화량/dt)을 산출하고, 가장 큰 절대값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수 있다. 예컨대, 구아닌 소광 프로브의 경우, -d 형광 강도증가량/dt가 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정하거나, 또는, 형광 강도 증가량/dt가 가장 높은 점을 Tm값으로서 결정할 수도 있다. 소광 프로브가 아니라, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 프로브를 사용한 경우에는, 반대로, 형광 강도의 감소량을 측정하면 된다.
그리고, Tm값으로부터, β2AR 유전자의 검출 대상 부위에 있어서의 유전자형을 결정한다. Tm 해석에 있어서, 완전히 상보인 하이브리드(퍼펙트 매치)는, 일염기가 다른 하이브리드(미스 매치)보다도, 해리를 나타내는 Tm값이 높아진다는 결과가 얻어진다. 따라서, 미리, 상기 프로브에 대해서, 완전히 상보인 하이브리드의 Tm값과, 일염기가 다른 하이브리드의 Tm값을 결정해 둠으로써, 증폭 산물이 프로브와 매치인지 미스 매치인지를 결정할 수 있다. 예컨대, 검출 대상 서열에 있어서의 검출 대상 부위의 염기를 변이형(예컨대, 서열번호 1에 있어서의 4265번째의 염기가 구아닌)이라고 가정하고, 그것을 갖는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브(서열번호 2에 있어서의 y가 시토신)를 사용한 경우, 형성한 하이브리드의 Tm값이, 완전히 상보인 하이브리드의 Tm값과 동일한 정도이면, 상기 증폭 산물의 다형은, 변이형이라고 판단할 수 있다. 또한, 형성한 하이브리드의 Tm값이, 일염기 다른 하이브리드의 Tm값과 동일한 정도(완전히 상보인 하이브리드의 Tm값보다 낮은 값)이면, 상기 증폭 산물의 다형은, 야생형(서열번호 1에 있어서의 4265번째의 염기가 아데닌)이라고 판단할 수 있다. 또한, 한쪽의 Tm값만이 검출된 경우에는, 호모 접합성, 양방의 Tm값이 검출된 경우에는, 헤테로 접합성이라고 결정할 수 있다. 이렇게 해서, β2AR 유전자 해석용 프로브에 대한 Tm값으로부터, β2AR 유전자의 다형을 판단할 수 있다.
본 발명의 β2AR 유전자 해석 방법에 따르면, 본 발명의 프로브를 사용함으로써, 전술한 바와 같이, 상기 프로브와 검출 대상 서열이 퍼펙트 매치인 경우의 Tm값과, 미스 매치인 경우의 Tm값이, 충분히 판별 가능한 차이를 나타낸다. 이 차이는, 예컨대, 4℃ 이상이며, 바람직하게는 6℃ 이상이다.
또한, 본 발명에 있어서는, 전술한 바와 같이, 상기 프로브를 포함하는 반응액의 온도를 상승시키고(하이브리드 형성체를 가열하고), 온도 상승에 따르는 시그널 변동을 측정하는 방법을 대신하여, 예컨대, 하이브리드 형성 시에 있어서의 시그널 변동의 측정을 행해도 좋다.
<다형 해석 방법>
본 발명의 다형 해석 방법은, 융해 온도의 해석에 의해 β2AR 유전자에 있어서의 검출 대상 부위의 다형의 해석을 행하는 다형 해석 방법으로서, 본 발명의 β2AR 유전자 해석 방법을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 다형 해석 방법은, 전술한 본 발명의 β2AR 유전자 해석 방법과 동일하게 해서 행할 수 있다.
다음으로, 본 발명의 실시예에 대해서 설명한다. 단, 본 발명은 하기 실시예 에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1
피검자 8명으로부터 헤파린 리튬 채혈관을 이용하여 채혈을 행하였다(샘플 1∼8). 얻어진 혈액 10 μL와 증류수 90 μL를 혼합하고, 또한, 이 혼합액 10 μL와 증류수 90 μL를 혼합하였다. 이들 혼합액 10 μL를, 하기 조성의 PCR 반응액 40 μL에 첨가하고, 써멀 사이클러를 이용하여 PCR을 행하였다. PCR의 조건은, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 56℃에서 10초를 1사이클로 해서 50사이클 반복하고, 또한 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하였다. 그리고, 계속해서, 온도의 상승 속도를 1℃/3초로 하여, 상기 PCR 반응액을 40℃에서 95℃로 가열해 가고, 경시적인 형광 강도의 변화를 측정하였다. 측정 파장은, 450∼480 ㎚(형광 색소 Pacific Blue의 검출), 515∼555 ㎚(형광 색소 BODIPY FL의 검출), 및 585∼700 ㎚(형광 색소 TAMRA의 검출)로 하였다. 또한, 50사이클의 PCR에 필요로 한 시간은 약 1시간이었다.
Figure pat00007
(프로브)
β2AR 유전자용 프로브
5'-cgcatggcttcCattgggtgcca-(Pacific Blue)-3' (서열번호 72)
β3AR 유전자용 프로브 1
5'-cgtggccatcgccCggactc-(BODIPY FL)-3' (서열번호 83)
β3AR 유전자용 프로브 2
5'-cgtggccatcgccCggactc-P-3' (서열번호 83)
UCP1 유전자용 프로브
5'-(TAMRA)-cacagtttgatcGagtgcatttg-3' (서열번호 95)
(프라이머 세트)
β2AR 유전자 F1 프라이머
5'-cccgggaacggcagcgcctt-3' (서열번호 9)
β2AR 유전자 R1 프라이머 mix
5'-cccacacctcgtccctttSctgcgt-3' (서열번호 18)
S는 c 또는 g이며, 양방의 프라이머를 1:1(몰비)로 혼합
β3AR 유전자 F2 프라이머
5'-ccaccgtgggaggcaacc-3' (서열번호 26)
β3AR 유전자 R2 프라이머
5'-ctgcggccagcgaagtc-3' (서열번호 31)
UCP1 유전자 F3 프라이머
5'-ggaagacattttgtgcagcgatttctgattgacc-3' (서열번호 44)
UCP1 유전자 R3 프라이머 mix
5'-cKtagcaaaggagtggcagcaagttctg-3' (서열번호 63)
K는 g 또는 t이며, 양방의 프라이머를 1:1(몰비)로 혼합
β2AR 유전자용 프로브와 매치하는 하이브리드의 Tm값은 70.0℃, 미스 매치하는 하이브리드의 Tm값은 62.0℃, β3AR 유전자용 프로브와 매치하는 하이브리드의 Tm값은 73.0℃, 미스 매치하는 하이브리드의 Tm값은 66.0℃, UCP1 유전자용 프로브와 매치하는 하이브리드의 Tm값은 65.0℃, 미스 매치하는 하이브리드의 Tm값은 60.0℃이다.
샘플 1∼8의 결과를 도 1∼도 3에 도시한다. 이들 도면은, 온도 상승에 따르는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이며, 세로축의 미분값은 「-d 형광 강도 증가량/dt」를 나타내고, 가로축은 온도를 나타낸다(이하, 동일). 도 1∼도 3에 도시하는 바와 같이, 시그널의 피크로부터, 각 샘플에 있어서의 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자의 각 다형을 결정하였다. 이들 실시예의 결과를 뒷받침하기 위해서, 피검자 8명에 대해서, RFLP법에 의해, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자의 각 다형을 확인한 결과, 실시예와 동일한 결과가 얻어졌다. 이와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 사용함으로써, 전처리를 실시하고 있지 않은 전혈 시료를 사용하여, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자를 동일 반응액 중에서 동시에 증폭하고, 또한, 상기 동일 반응액을 이용하여 상기 유전자의 각각의 다형을 해석할 수 있었다.
실시예 2
피검자 3명으로부터 EDTA 채혈관을 이용하여 채혈을 행하였다(샘플 1∼3). 얻어진 혈액 10 μL와 하기 희석액 A 70 μL를 혼합하고, 또한, 이 혼합액 10 μL와 하기 희석액 B 70 μL를 혼합하였다. 얻어진 혼합액 10 μL를 95℃에서 5분간 가열 처리한 후, 하기 조성의 PCR 반응액 46 μL에 첨가하고, 써멀 사이클러를 이용하여 PCR을 행하였다. PCR의 조건은, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 64℃에서 15초를 1사이클로 해서 50사이클 반복하고, 또한 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하였다. 그리고, 계속해서, 온도의 상승 속도를 1℃/3초로 하여, 상기 PCR 반응액을 40℃에서 75℃로 가열해 가고, 경시적인 형광 강도의 변화를 측정하였다. 측정 파장은, 450∼480 ㎚(형광 색소 Pacific Blue의 검출), 515∼555 ㎚(형광 색소 BODIPY FL의 검출), 및 585∼700 ㎚(형광 색소 TAMRA의 검출)로 하였다.
(희석액 A)
10 mM Tris-HCl(pH8), 0.1 mM EDTA, 0.05% NaN3, 0.3% SDS
(희석액 B)
10 mM Tris-HCl(pH8), 0.1 mM EDTA, 0.05% NaN3
Figure pat00008
(프로브)
β2AR 유전자용 프로브
5'-(Pacific Blue)-cccaatGgaagccatgc-P-3' (서열번호 114)
β3AR 유전자용 프로브 1
5'-(BODIPY FL)-ctcggagtccGggc-P-3' (서열번호 120)
β3AR 유전자용 프로브 2
5'-(BODIPY FL)-ctcggagtccAgg-P-3' (서열번호 120)
UCP1 유전자용 프로브
5'-(TAMRA)-cacagtttgatcGagtg-P-3' (서열번호 139)
(프라이머 세트)
β2AR 유전자 F1 프라이머
5'-cgggaacggcagcgccttct-3' (서열번호 109)
β2AR 유전자 R1 프라이머
5'-ccaccacccacacctcgtccct-3' (서열번호 134)
β3AR 유전자 F2 프라이머
5'-gccaccgtgggaggcaacc-3' (서열번호 24)
β3AR 유전자 R2 프라이머
5'-ggctgcggccagcgaagtc-3' (서열번호 28)
UCP1 유전자 F3 프라이머
5'-ggaagacattttgtgcagcgatttctgattgacc-3' (서열번호 43)
UCP1 유전자 R3 프라이머 mix
5'-cKtagcaaaggagtggcagcaagttctg-3' (서열번호 63)
K는 g 또는 t이며, 양방의 프라이머를 1:1(몰비)로 혼합
β2AR 유전자용 프로브와 매치하는 하이브리드의 Tm값은 58℃, 미스 매치하는 하이브리드의 Tm값은 51℃, β3AR 유전자용 프로브와 매치하는 하이브리드의 Tm값은 58℃, 미스 매치하는 하이브리드의 Tm값은 51℃, UCP1 유전자용 프로브와 매치하는 하이브리드의 Tm값은 56℃, 미스 매치하는 하이브리드의 Tm값은 49℃이다.
샘플 1∼3의 결과를 도 4에 도시한다. 이들 도면은, 온도 상승에 따르는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이며, 세로축의 미분값은 「-d 형광 강도 증가량/dt」를 나타내고, 가로축은 온도를 나타낸다. 도 4에 도시하는 바와 같이, 시그널의 피크로부터, 각 샘플에 있어서의 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자의 각 다형을 결정하였다. 이들 실시예의 결과를 뒷받침하기 위해서, 피검자 3명에 대해서, RFLP법에 의해, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자의 각 다형을 확인한 결과, 실시예와 동일한 결과가 얻어졌다. 이와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 사용함으로써, 전처리를 실시하고 있지 않은 전혈 시료를 사용하여, β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자를 동일 반응액 중에서 동시에 증폭하고, 또한, 상기 동일 반응액을 이용하여 상기 유전자의 각각의 다형을 해석할 수 있었다.
실시예 3
β2AR 유전자에 대한 각종 프로브를 제작하여, Tm 해석을 행하였다. 우선, 하기 표 9에 나타내는 프로브와, 상기 각 프로브에 상보적인 하기 표 10에 나타내는 올리고뉴클레오티드(상보쇄 DNA)를 합성하였다. 하기 표 9의 프로브 서열에 있어서, 대문자의 염기가, 서열번호 1에 있어서의 4265번째에 대응하는 염기이며, 이들 프로브는, 센스쇄에 있어서의 4265번째(G, A) 또는 그것과 상보적인 안티센스쇄에 있어서의 염기(C, T)를 검출하기 위한 프로브로서 설계하였다. 하기 표 10에 나타내는 올리고뉴클레오티드는, β2AR 유전자의 센스쇄 또는 센스쇄의 부분 서열이며, 서열번호 1의 4265번째의 염기 또는 그것에 상보적인 염기를 포함하는 서열이다. 그리고, 이들 프로브 및 상보쇄 DNA를 이용하여, 하기 표 11의 조성이 되도록 반응액을 조제하였다. 프로브의 검출 대상쇄가 센스쇄인 경우는, 상보쇄 DNA로서, 1A(4265A) 및 1B(4265G)를 사용하여, 각각을 첨가한 반응액을 조제하였다. 또한, 프로브의 검출 대상쇄가 안티센스쇄인 경우는, 상보쇄 DNA로서, 2A(4265A) 및 2B(4265G)를 사용하여, 각각을 첨가한 반응액을 조제하였다. 이들 반응액을 써멀 사이클러(상품명 Smart Cycler, Cepheid사 제조)를 이용해서, 온도의 상승 속도를 1℃/3초로 하여, 상기 반응액을 45℃에서 95℃로 가열해 가고, 경시적인 형광 강도의 변화를 측정하였다. 측정 파장은, 565∼605 ㎚(TAMRA의 검출, ch3)로 하였다.
Figure pat00009
Figure pat00010
Figure pat00011
실시예 3-1의 프로브를 사용한 결과를 도 5에, 비교예 3-9 및 비교예 3-11의 프로브를 사용한 결과를 도 6에 각각 도시한다. 이들 도면은, 온도 상승에 따르는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프(융해 곡선)이며, 세로축의 미분값은 「-d 형광 강도 증가량/dt」를 나타내고, 가로축은 온도를 나타낸다(이하, 동일). 도 5에 있어서는, 반응액 중에 상기 상보쇄 DNA(1A)를 첨가한 계(系)의 융해 곡선(가느다란 선)과 상기 상보쇄 DNA(1B)를 첨가한 계의 융해 곡선(굵은 선)을 아울러 도시하고, 도 6은 반응액 중에 상기 상보쇄 DNA(2A)를 첨가한 계의 융해 곡선(가느다란 선)과 상기 상보쇄 DNA(2B)를 첨가한 계의 융해 곡선(굵은 선)을 아울러 도시한다.
도 6에 도시하는 바와 같이, 비교예 3-9의 프로브를 사용한 경우, 4265G의 시그널 피크가 검출되지 않았다. 또한, 비교예 3-11의 프로브를 사용한 경우, 상기 프로브와 상보쇄 DNA(2B)와의 퍼펙트 매치를 나타내는 피크의 Tm값(68℃)과, 상기 프로브와 상보쇄 DNA(2A)와의 미스 매치를 나타내는 피크의 Tm값(65℃)의 차이가 작았다(3℃). 이 때문에, 이들 비교예의 프로브를 이용한 융해 곡선으로부터는, 퍼펙트 매치와 미스 매치 중 어떠한 것을 나타내는지, 우수한 신뢰성으로 판단하는 것이 곤란하였다. 또한, 다른 비교예에 대해서도, 도 6에 있어서의 비교예 3-9 또는 비교예 3-11과 동일한 융해 곡선을 나타내었다. 이에 비해서, 실시예 3-1의 프로브를 사용한 경우, 도 5에 도시하는 바와 같이, 상기 프로브와 상보쇄 DNA(1B)와의 퍼펙트 매치를 나타내는 시그널 피크와, 상기 프로브와 상보쇄 DNA(1A)와의 미스 매치를 나타내는 시그널 피크의 양방을 충분히 확인할 수 있었다. 또한, 상기 퍼펙트 매치를 나타내는 피크의 Tm값(75℃)과, 상기 미스 매치를 나타내는 피크의 Tm값(68℃)의 차이가 약 7℃이며, 양자를 판별하기에는 충분한 차이었다. 이 때문에, 실시예의 프로브에 따르면, 퍼펙트 매치와 미스 매치 중 어떠한 것을 나타내는지를 충분히 판단하는 것이 가능하다.
실시예 4
서열번호 1에 있어서의 4265번째가 4265A/4265A인 호모 접합체를 나타내는 인간의 정제 게놈, 및 4265G/4265G의 호모 접합체를 나타내는 인간의 정제 게놈을 준비하였다. 이들 각 정제 게놈 1 μL를, 각각 하기 조성의 PCR 반응액 24 μL에 첨가하고, 써멀 사이클러(상품명 Smart Cycler, Cepheid사 제조)를 이용하여 PCR을 행하였다. PCR의 조건은, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 62℃에서 30초를 1사이클로 해서 50사이클 반복하였다. 그리고, 계속해서, 온도의 상승 속도를 1℃/초로 하여, 상기 반응액을 45℃에서 95℃로 가열해 가고, 경시적인 형광 강도의 변화를 측정하였다. 측정 파장은 Tm 해석을 행하였다. 검출 파장은 505∼537 ㎚(형광 색소 FAM의 검출, 1ch)로 하였다.
Figure pat00012
(프로브)
β2AR 유전자 해석용 프로브
5'-cgcatggcttcCattgggtgcca-(BODIPY FL)-3' (서열번호 72)
(프라이머 세트)
β2AR 유전자용 포워드 프라이머
5'-gggaacggcagcgccttcttgct-3' (서열번호 165)
β2AR 유전자용 리버스 프라이머
5'-tggtgaccgtctgcagacgctcgaac-3' (서열번호 166)
상기 프라이머 세트를 이용한 PCR에 의해 증폭시킨 영역은, 서열번호 1에 있어서의 4265번째를 포함하는 200염기 정도의 DNA쇄이다. 4265G/4265G를 나타내는 게놈으로부터는, 4265번째가 G(안티센스쇄는 C)인 DNA쇄를 증폭시키고, 4265A/4265A를 나타내는 게놈으로부터는, 4265번째가 A(안티센스는 T)인 DNA를 증폭시켰다.
상기 서열번호 72에 나타내는 β2AR 유전자 해석용 프로브와 매치하는 하이브리드의 Tm값은 69℃, 미스 매치하는 하이브리드의 Tm값은 62℃이다.
이들의 결과를 도 7에 도시한다. 도 7은 온도 상승에 따르는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프(융해 곡선)이며, 세로축의 미분값은 「-d 형광 강도 증가량/dt」를 나타내고, 가로축은 온도를 나타낸다(이하, 동일). 도 7에 있어서는, 4265A/4265A 호모 접합체를 나타내는 인간의 정제 게놈을 첨가한 계의 융해 곡선(가느다란 선)과 4265G/4265G 호모 접합체를 나타내는 인간의 정제 게놈을 첨가한 계의 융해 곡선(굵은 선)을 아울러 도시한다.
도 7에 도시하는 바와 같이, 실시예 4의 프로브의 공존하에서, 인간 정제 게놈의 β2AR 유전자에 있어서의 DNA를 증폭시키고, Tm 해석을 행한 결과, 4265번째의 염기를 구별하여 검출하는 것이 가능하였다. 구체적으로, 상기 프로브와 4265G/4265G 호모 접합체 유래의 증폭물과의 퍼펙트 매치를 나타내는 피크의 Tm값(69℃)과, 상기 프로브와 4265A/4265A 호모 접합체 유래의 증폭물과의 미스 매치를 나타내는 피크의 Tm값(62℃)의 차이가 약 7℃이며, 양자를 판별하기에는 충분한 차이였다. 이 때문에, 실시예의 프로브에 따르면, β2AR 유전자에 있어서의 4265번째의 다형을 충분히 해석하는 것이 가능하다.
이상과 같이, 본 발명의 프라이머 세트에 따르면, 비만 유전자(β2AR 유전자, β3AR 유전자 또는 UCP1 유전자)에 있어서의 특정의 다형이 발생하는 부위를 포함하는 영역을, 특이적으로 고효율로 증폭할 수 있다. 이 때문에, 전술한 바와 같은 종래법과는 달리 시간이나 비용을 저감하는 것이 가능해진다. 또한, 이와 같이 다형의 검출 대상 부위를 포함하는 영역이 특이적으로 증폭되기 때문에, 예컨대, 상기 검출 대상 부위를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 사용함으로써, 상기 반응액을 이용하여 그대로 Tm 해석을 행해서, 상기 다형을 타이핑하는 것이 가능해진다. 또한, 하나의 반응액으로 증폭이나 타이핑이 가능하기 때문에, 조작의 자동화도 가능해진다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면, 예컨대, 협잡물이 포함되는 시료(예컨대, 전혈이나 구강 점막 등)여도, 전처리를 생략할 수 있기 때문에, 보다 신속하고 또한 간편하게 증폭 반응을 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면, 종래보다도 우수한 증폭 효율로 증폭 반응을 행할 수 있기 때문에, 증폭 반응도 단축화가 가능하다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트나 이것을 포함하는 시약, 및 이들을 이용한 증폭 산물의 제조 방법에 따르면, 비만 유전자의 다형을 신속하고 또한 간편하게 해석할 수 있기 때문에, 의료 분야에 있어서 매우 유효하다고 말할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ARKRAY, Inc. <120> Primer set and agent for amplification obese gene and use thereof <130> TF07041-01 <150> JP2006-322961 <151> 2006-11-30 <150> JP2006-322960 <151> 2006-11-30 <150> JP2007-232614 <151> 2007-09-07 <160> 167 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 9968 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgcaaaagac atgaagtcat ccttttttat ggctgcacag tattccatgg tgtatatgtg 60 ccacattttc tttatcaagt ctattcttga tgggcatttg ggttggttcc aagtctttgc 120 tattgtgaac agtgctgcaa taaacataca tgtccatgtg tctttatagt agaatgattt 180 ataatcctta gggtatatac caggtaatgg gattgctggg tcaaatggta tttcttgttc 240 tagatccttg agggattgcc acactgtctt ccacaatgtt tgaactaatt tacattccta 300 ccaacagtgt aaaagtgttc ctatttctcc acatcctttc cagcatctgt tgtttcctga 360 cttcctgttt tttttttgag acggagtctc actgtgtcac cccggatgga gtgcagtggc 420 acaatctcgg ctcactgcaa cctccacctc ccaggttcaa gcgattctcc tgtttcagcc 480 cccagagtag gtgagactac aggcatgcca caacttctgg ctaatttttg tatttttatt 540 agagacgaag tttcaccatg ttggtcaggc tgctctcgaa gtcctgacct caggtgatcc 600 acccacctca gcctcccaaa gtgctgggat tacaggcatg agccactgcg cccggtctgt 660 ttcctgatgt gttaatgatc gccattgtat ctggtgtgag atggtatttc attgtggttt 720 tgatttgcat ttcactaata accagtgctg atgatctttt cttcatatgt ttgttggctg 780 cattaatgtc ttcttttgag aagtgtctgt tcatatcctt tgcccacttt ttcatggggc 840 tgtttgtttt ttcttgtaaa tttgtttaag ttctttgtag attctggata ttagcccttt 900 gtcagatgga tagattgcaa aatttttctc ccattctgta ggttgcctgt tcaccctgat 960 gatagtttct tttgctgtgc agaaactctt tagtttaatt agatcccatt tgtcaatttt 1020 ggcttttgtt gccattgctt ttgatgtttt agtcatgaag tctttgccca tgcctatgtc 1080 ctggatgtta ttgcctagat tttcttctag ggtttttatg gttttaggtc ttacgtttaa 1140 gtctttaatt catcttgagt taattcttgt ataaggtgta aggaaggggt ccagtttcag 1200 ttttctgcat atggctagcc agtccttctt gatttagtat ttgtgggttt taaaaaagga 1260 gtttcccaaa atattcagtt aaacttttaa gtgacttacg tgtatatcta aatacatgat 1320 cagttaatat ttgtcttaaa ggggttttct ttgttctttt cttattatag gaaggttaaa 1380 caatatgctt atttatgcca tagcttcaca aacaggaagg aggttttaaa tggtttagtt 1440 ccacaatttg agtagatgca tatttaaaga aacgttgttg cataataaat actgcctctt 1500 cctaaaatgc atcatgccac agccaatttt ggaaaacaca aatatgaggt gagtgtattt 1560 tgaaaactat gtgaatataa tagatcctta attcatattt gtggatttta tgggaaatac 1620 ttgttttcta aggcatctgt cttgcaaaaa gtcagtttct gctatgaagg atgttaaagg 1680 ggatatgtag gttaaattct gtttctgagc tttgcttcca gagtaaacac ccaacttact 1740 tttgccctaa agtattttat tgttctagta gagaagacta acaacatatt ctaaaccact 1800 aagtaattta tgtaaacttc gcttacaaac tatacttgtg tgacacttat atgagcaaaa 1860 gcattttcat atttcttact atatcattca attcttgctt accccaatgg aagtgacttt 1920 atgccccttt agagacaatg gaaatcaggt acttcgtgat ttctcttaaa aaaaaaaaaa 1980 atgaactaga aagctccaag tttggtgaat ctggaacctg ggtattccag ttccagttgt 2040 agcccttcct ccctatccat cactcctgtc tgcatgtaat tatgcaatac attgaaaaga 2100 ttaaaagatg ggtcttggac tcaggcagac ctgggtcaaa tccagattct ggcactgccc 2160 agccattgcc cctgggcaag ccattttcct ctttgaacct catttgtgaa ttaagctaaa 2220 aatagtcccc acccccatgg gactgtggga aggattaaat 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DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 83 cgtggccatc gcccggactc 20 <210> 84 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 84 gtggccatcg cccggactc 19 <210> 85 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 85 tggccatcgc ccggactc 18 <210> 86 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 86 ggccatcgcc cggactc 17 <210> 87 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 87 cacagtttga tcgagtgcat ttgttaatgt g 31 <210> 88 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 88 cacagtttga tcgagtgcat ttgttaatgt 30 <210> 89 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 89 cacagtttga tcgagtgcat ttgttaatg 29 <210> 90 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 90 cacagtttga tcgagtgcat ttgttaat 28 <210> 91 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 91 cacagtttga tcgagtgcat ttgttaa 27 <210> 92 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 92 cacagtttga tcgagtgcat ttgtta 26 <210> 93 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 93 cacagtttga tcgagtgcat ttgtt 25 <210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 94 cacagtttga tcgagtgcat ttgt 24 <210> 95 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 95 cacagtttga tcgagtgcat ttg 23 <210> 96 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 96 cacagtttga tcgagtgcat tt 22 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 97 cacagtttga tcgagtgcat t 21 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 98 cacagtttga tcgagtgcat 20 <210> 99 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 99 cacagtttga tcgagtgca 19 <210> 100 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 100 cacagtttga tcgagtgc 18 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 101 cgcatggctt ccattgggtg cca 23 <210> 102 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 102 cgcatggctt ctattgggtg cca 23 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<210> 112 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 112 cccaatrgaa gccatgcgc 19 <210> 113 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 113 cccaatrgaa gccatgcg 18 <210> 114 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 114 cccaatrgaa gccatgc 17 <210> 115 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 115 cccaatrgaa gccatg 16 <210> 116 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 116 cccaatrgaa gccat 15 <210> 117 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 117 ctcggagtcc gggcgat 17 <210> 118 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 118 ctcggagtcc gggcga 16 <210> 119 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 119 ctcggagtcc gggcg 15 <210> 120 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 120 ctcggagtcc gggc 14 <210> 121 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 121 ctcggagtcc ggg 13 <210> 122 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 122 ctcggagtcc gg 12 <210> 123 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 123 ctcggagtcc aggcgat 17 <210> 124 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 124 ctcggagtcc aggcga 16 <210> 125 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 125 ctcggagtcc aggcg 15 <210> 126 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 126 ctcggagtcc aggc 14 <210> 127 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 127 ctcggagtcc agg 13 <210> 128 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 128 ctcggagtcc ag 12 <210> 129 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 129 catgcccacc acccacacct cgtccct 27 <210> 130 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 130 atgcccacca cccacacctc gtccct 26 <210> 131 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 131 tgcccaccac ccacacctcg tccct 25 <210> 132 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 132 gcccaccacc cacacctcgt ccct 24 <210> 133 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 133 cccaccaccc acacctcgtc cct 23 <210> 134 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 134 ccaccaccca cacctcgtcc ct 22 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 135 caccacccac acctcgtccc t 21 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 136 accacccaca cctcgtccct 20 <210> 137 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 137 ccacccacac ctcgtccct 19 <210> 138 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 138 cacccacacc tcgtccct 18 <210> 139 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 139 cacagtttga tcgagtg 17 <210> 140 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 140 cacccaatgg aagcc 15 <210> 141 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 141 ccaatggaag ccatgc 16 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 142 catggcttcc attgggtgcc 20 <210> 143 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 143 catggcttcc attgggtg 18 <210> 144 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 144 ggcttccatt gggtgcc 17 <210> 145 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 145 ggcacccaat agaagcc 17 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 146 ccggcgcatg gcttccattg 20 <210> 147 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 147 tagaagccat gcgcc 15 <210> 148 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 148 ccaatagaag ccatgcg 17 <210> 149 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 149 ccaatggaag ccatg 15 <210> 150 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 150 tggaagccat gcgcc 15 <210> 151 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 151 caatggaagc catgc 15 <210> 152 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 152 cttccattgg gtgccag 17 <210> 153 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 153 ccattgggtg ccagca 16 <210> 154 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 154 cttccattgg gtgccagcaa ga 22 <210> 155 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 155 gctggcaccc aatggaagcc 20 <210> 156 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 156 ccaatggaag ccatgcgc 18 <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 157 ccaatggaag ccatgcgccg 20 <210> 158 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 158 ccaatggaag ccatgcgcc 19 <210> 159 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 159 ggcttccatt gggtgcca 18 <210> 160 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 160 catggcttcc attgggtgcc ag 22 <210> 161 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA <400> 161 cgccttcttg ctggcaccca atagaagcca tgcgccggac 40 <210> 162 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA <400> 162 cgccttcttg ctggcaccca atggaagcca tgcgccggac 40 <210> 163 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA <400> 163 gtccggcgca tggcttctat tgggtgccag caagaaggcg 40 <210> 164 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA <400> 164 gtccggcgca tggcttccat tgggtgccag caagaaggcg 40 <210> 165 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 165 gggaacggca gcgccttctt gct 23 <210> 166 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 166 tggtgaccgt ctgcagacgc tcgaac 26

Claims (26)

  1. 비만 유전자의 다형 해석에 사용하기 위한 프로브로서,
    상기 비만 유전자가 β2AR 유전자이며,
    하기 (P1)에 나타내는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비만 유전자 해석용 프로브:
    (P1)
    하기 (1-1) 및 하기 (1-2) 중 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드
    (1-1) 서열번호 1에 있어서의 4254번째의 티민 염기(T)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 21∼26염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 티민 염기에 상보적인 아데닌 염기(A)를 3'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드,
    (1-2) 서열번호 1에 있어서의 4259번째의 시토신 염기(C)를 1염기째로 하여 3'방향을 향해서 15∼19염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기를 5'말단으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로브가, 융해 온도의 해석에 의한 β2AR 유전자의 다형 해석에 사용하기 위한 프로브인 비만 유전자 해석용 프로브.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프로브가, 하기 (P1')에 나타내는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브인 비만 유전자 해석용 프로브:
    (P1') 서열번호 72의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 및 서열번호 114의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 프로브가 표지 물질이 부가된 표지화 프로브인 비만 유전자 해석용 프로브.
  5. 제4항에 있어서, 상기 표지 물질이 형광 물질인 비만 유전자 해석용 프로브.
  6. 제5항에 있어서, 상기 표지화 프로브가, 단독으로 형광을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 형광이 소광하는 프로브인 비만 유전자 해석용 프로브.
  7. 제4항에 있어서, 상기 프로브가, 상기 (1-1)의 올리고뉴클레오티드의 3'말단에 상기 표지 물질이 부가된 표지화 프로브인 비만 유전자 해석용 프로브.
  8. 제4항에 있어서, 상기 프로브가, 상기 (1-2)의 올리고뉴클레오티드의 5'말단에 상기 표지 물질이 부가된 표지화 프로브인 비만 유전자 해석용 프로브.
  9. 비만 유전자의 해석에 사용하기 위한 시약으로서,
    상기 비만 유전자가 β2AR 유전자이며,
    제1항에 기재된 비만 유전자 해석용 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 비만 유전자 해석용 시약.
  10. 제9항에 있어서, 상기 시약이, 융해 온도의 해석에 의한 비만 유전자의 다형 해석에 사용하기 위한 시약인 비만 유전자 해석용 시약.
  11. 제9항에 있어서, β2AR 유전자에 있어서의 다형의 검출 대상 부위를 갖는 검출 대상 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 더 포함하는 비만 유전자 해석용 시약.
  12. 제9항에 있어서, 상기 비만 유전자 해석용 시약이, 생체 시료 중의 β2AR 유전자에 있어서의 검출 대상 부위의 다형을 해석하기 위한 시약인 비만 유전자 해석용 시약.
  13. 제9항에 있어서, β3AR 유전자의 검출 대상 부위에 하이브리다이즈 가능한 프로브 및 UCP1 유전자의 검출 대상 부위에 하이브리다이즈 가능한 프로브 중 적어도 하나를 더 포함하는 비만 유전자 해석용 시약.
  14. 제13항에 있어서, 상기 프로브가, (P2')의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프로브 및 (P3')의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프로브 중 적어도 하나인 비만 유전자 해석용 시약:
    (P2') 서열번호 83의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 서열번호 120의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 및 서열번호 127의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드,
    (P3') 서열번호 95의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 및 서열번호 139의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드.
  15. 제12항에 있어서, 상기 생체 시료가 전혈인 비만 유전자 해석용 시약.
  16. 비만 유전자를 해석하는 비만 유전자 해석 방법으로서,
    상기 비만 유전자가 β2AR 유전자이며,
    하기 (a)∼(c)공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 비만 유전자 해석 방법:
    (a) β2AR 유전자에 있어서의 다형의 검출 대상 부위를 갖는 검출 대상 서열과, 제1항에 기재된 비만 유전자 해석용 프로브를 포함하는 반응액을 준비하는 공정,
    (b) 상기 반응액의 온도를 변화시켜, 상기 검출 대상 서열과 상기 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널 값을 측정하는 공정,
    (c) 온도 변화에 따르는 상기 시그널 값의 변동으로부터, 상기 하이브리드 형성체의 융해 온도를 결정하는 공정.
  17. 제16항에 있어서, 하기 (d)공정을 더 포함하는 비만 유전자 해석 방법:
    (d) 결정한 융해 온도로부터, β2AR 유전자의 상기 검출 대상 부위의 다형을 결정하는 공정.
  18. 제16항에 있어서, 상기 비만 유전자가 β2AR 유전자, β3AR 유전자 및 UCP1 유전자의 적어도 하나이고, 상기 (a) 공정에서, 상기 프로브와 하기 (P2')의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프로브 및 하기 (P3')의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프로브 중 적어도 하나를 포함하는 상기 반응액을 준비하는 것인 비만 유전자 해석 방법:
    (P2') 서열번호 83의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 서열번호 120의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 및 서열번호 127의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드,
    (P3') 서열번호 95의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 및 서열번호 139의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드.
  19. 제16항에 있어서, 상기 프로브가, 형광 물질이 부가된 표지화 프로브이며,
    상기 (b)공정에 있어서, 상기 시그널 값으로서, 상기 형광 물질의 형광 강도를 측정하는 비만 유전자 해석 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 표지화 프로브가, 단독으로 형광을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 형광이 소광하는 프로브이며,
    상기 (b)공정에 있어서, 상기 반응액의 온도를 상승시키고, 온도 상승에 따르는 형광 강도의 감소를 측정하는 비만 유전자 해석 방법.
  21. 제16항에 있어서, 하기 (x)공정을 더 포함하는 비만 유전자 해석 방법:
    (x) 시료 중의 핵산을 주형으로 하고, β2AR 유전자에 있어서의 상기 검출 대상 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여, 반응액 중, 상기 검출 대상 서열의 증폭을 행하는 공정.
  22. 제21항에 있어서, 상기 (x)공정에 있어서, 증폭 반응에 앞서, 상기 반응액에 상기 프로브를 첨가하고, 상기 (x)공정에 있어서의 증폭 반응 후의 상기 반응액을, 상기 (a)공정에 있어서의 반응액으로서 사용하는 비만 유전자 해석 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 시료가 생체 시료인 비만 유전자 해석 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 생체 시료가 전혈인 비만 유전자 해석 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 반응액에 있어서의 전혈의 첨가 비율이 0.1∼0.5 체적%인 비만 유전자 해석 방법.
  26. 융해 온도의 해석에 의해 비만 유전자에 있어서의 검출 대상 부위의 다형의 해석을 행하는 다형 해석 방법으로서,
    상기 비만 유전자가 β2AR 유전자이며,
    제16항에 기재된 비만 유전자 해석 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 다형 해석 방법.
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