KR101446556B1

KR101446556B1 - Ｍｔｈｆｒ 유전자 증폭용 프라이머 세트, 그것을 포함하는 ｍｔｈｆｒ 유전자 증폭용 시약 및 그 용도

Info

Publication number: KR101446556B1
Application number: KR1020127013959A
Authority: KR
Inventors: 미츠하루 히라이; 마사히로 고즈카
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2009-11-19
Filing date: 2010-11-19
Publication date: 2014-10-01
Also published as: US20120231463A1; KR20120078739A; JPWO2011062258A1; EP2502994A4; WO2011062258A1; CN102666852A; EP2502994A1

Abstract

[요약] 핵산증폭법에 의해 MTHFR 유전자의 목적 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
F1 프라이머와 R1 프라이머를 포함하는 프라이머 세트(1), 및, F2의 프라이머와 R2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트(2)를 포함하는 프라이머 세트를 사용한다. 이에 따라 예를 들면, 동일 반응액에 있어서 동시에, MTHFR 유전자의 2종류의 다형을 일으키는 부분을 각각 포함하는 2개의 목적 영역을 증폭할 수 있다.
(F1) 염기 길이가 20∼28 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 8715의 구아닌(g)을 3’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
(R1) 염기 길이가 18∼26 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 8817의 시토신(c)을 5’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드
(F2) 염기 길이가 26∼36 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 10590의 구아닌(g)을 3’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
(R2) 염기 길이가 22∼34 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 10695의 시토신(c)을 5’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드

Description

ＭＴＨＦＲ 유전자 증폭용 프라이머 세트, 그것을 포함하는 ＭＴＨＦＲ 유전자 증폭용 시약 및 그 용도{PRIMER SET FOR AMPLIFICATION OF MTHFR GENE, MTHFR GENE AMPLIFICATION REAGENT COMPRISING SAME, AND USE OF SAME}

본 발명은, MTHFR 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 그것을 포함하는 MTHFR 유전자 증폭용 시약 및 그 용도에 관한 것이다.

호모시스테인은, 메티오닌의 대사경로에 있어서의 중간산물이며, 일부는 시스테인으로 대사되며, 일부는 다시 메티오닌으로 대사된다. 호모시스테인은, 생체 내에서 증가하면, 동맥 경화, 관동맥질환, 심질환 등의 심혈관계 질환, 고호모시스테인혈증의 원인으로 되는 것이 보고되어 있다. 호모시스테인의 생산에는, 메틸렌테트라하이드로엽산환원효소(methylene tetrahydrofolic reductase, MTHFR)가 관여하고 있으며, MTHFR 유전자에 있어서의 다형과 상술한 질환과의 관련성도 보고되어 있다(예를 들면, 비특허문헌 1 참조).

구체적으로는, MTHFR 유전자의 다형에 기인하는 MTHFR의 활성 저하가, 혈중 호모시스테인을 증가시켜, 상기 질환의 발증을 야기한다고 여겨지고 있다. MTHFR 유전자의 다형은, 예를 들면, MTHFR*677, MTHFR*1298 등이 알려져 있다. 전자의 MTHFR*677은, MTHFR 유전자에 있어서의 8747번째의 염기가, 야생형은 시토신(c), 변이형은 티민(t)이다. 후자의 MTHFR*1298은, MTHFR 유전자에 있어서의 10649번째의 염기가, 야생형은 아데닌(a), 변이형은 시토신(c)이다. 예를 들면, MTHFR 유전자에, 호모 접합체의 변이 MTHFR*677(T/T)이 생기면, MTHFR 활성이 저하하고, 혈중 호모시스테인량이 상승하는 것이 보고되어 있다. 한편, 메커니즘은 불분명하지만, MTHFR 유전자에, 헤테로 접합체의 변이 MTHFR*1298(A/C) 또는 호모 접합체의 변이 MTHFR*1298(C/C)이 생기면, MTHFR 활성이 저하하고, 예를 들면, 메토트렉세이트 등의 관절 류머티즘 치료약의 필요투여량이 감소하는 것이 보고되어 있다(예를 들면, 비특허문헌 2 참조). 이 때문에, MTHFR 유전자에 대해서, 복수의 다형을 조사하는 것은, 혈중 호모시스테인량의 상승에 의한 심혈관계 질환 등의 질환의 발증, 및 관절 류머티즘 등의 치료약의 투여량을 예측하기 위해서, 극히 중요하다.

한편, 모든 질환의 원인, 개체간의 질환 용이이환성 즉 질환의 걸리기 쉬움, 개체간에 있어서의 약효의 차이 등을 유전자 레벨에서 해석하는 방법으로서, 다형의 검출이 널리 행하여지고 있다. 상기 다형은, 예를 들면, 점돌연변이, 소위 1염기다형(SNP) 등을 들 수 있다. 다형의 일반적인 검출 방법은, 예를 들면, 디렉트 시퀀싱법, RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 해석, ASP-PCR법 등을 들 수 있다. 상기 디렉트 시퀀싱법은, 예를 들면, 시료의 표적 DNA에 대해서, 검출 대상 서열에 상당하는 영역을 PCR(Polymerase chain reaction)에 의해 증폭시켜, 그 전 유전자 서열을 해석하는 방법이다. 상기 RFLP법은, 예를 들면, 우선, 시료의 표적 DNA에 대해서, 검출 대상 서열에 상당하는 영역을 PCR에 의해 증폭시킨다. 그리고, 상기 검출 대상 서열에 있어서의 목적의 변이의 유무에 따라 절단 작용이 다른 제한 효소에 의해, 그 증폭물을 절단하고, 전기영동함으로써 타이핑을 행하는 방법이다. ASP-PCR법은, 예를 들면, 3’말단 영역에 목적의 변이가 위치하는 프라이머를 사용하여 PCR를 행하고, 증폭의 유무에 의해 변이를 판단하는 방법이다.

그러나, 이들 방법은, 예를 들면, 시료로부터 추출한 DNA의 정제, 전기영동, 제한 효소 처리 등이 필수이기 때문에, 시간이나 비용이 든다. 또한 PCR를 행한 후, 반응 용기를 일단 개봉할 필요가 있다. 이 때문에, 상기 증폭물이 다음 반응계에 혼입하여, 해석 정밀도가 저하할 우려가 있다. 또한, 자동화가 곤란하기 때문에, 대량의 샘플을 해석할 수 없다. 또한 상기 ASP-PCR법은, 특이성이 낮다고 하는 문제도 있다.

이와 같은 문제로부터, 최근, 다형의 검출 방법으로서, Tm(Melting Temperature) 해석이 실용화되어 있다. 이것은, 2본쇄 핵산의 융해 온도(Tm)를 해석하는 방법이며, 상기 2본쇄의 융해 곡선의 해석에 의해 행하여지므로, 융해 곡선해석이라고도 불린다. Tm 해석은, 예를 들면, 이하와 같은 방법이다. 우선, 검출 목적의 다형을 포함하는 영역에 상보적인 프로브를 사용하여, 피검 핵산과 상기 프로브와의 하이브리드(2본쇄 핵산)를 형성시킨다. 그리고, 얻어진 하이브리드에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따르는 상기 하이브리드의 1본쇄 핵산에의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 이 검출 결과에 의거하여 Tm값을 결정함으로써, 다형을 판단하는 방법이다. Tm값은, 상기 하이브리드에 있어서의 양 1본쇄 핵산의 상보성이 높을수록 높고, 상보성이 낮을수록 낮아진다. 그래서, 검출 대상 부위의 다형이 X 또는 Y의 경우, 목적의 다형(예를 들면, Y)을 포함하는 핵산과 그것에 100% 상보적인 프로브와의 하이브리드에 대해서, 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 둔다. 계속해서, 상기 피검 핵산과 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정한다. 그리고, 이 측정값이, 상기 평가 기준값과 같으면, 상기 피검 핵산과 상기 프로브와는 퍼펙트 매치이다, 즉, 상기 피검 핵산의 검출 대상 부위가 목적의 다형(Y)이라고 판단할 수 있다. 다른 한편, 상기 측정값이 상기 평가 기준값보다도 낮으면, 상기 피검 핵산과 상기 프로브와는 미스매치이다, 즉, 상기 피검 핵산의 검출 대상 부위가 다른 쪽의 다형(X)이라고 판단할 수 있다. 이와 같은 방법이면, 예를 들면, 상기 프로브를 첨가한 PCR 반응액에 온도 처리를 하고, 시그널 측정을 행하는 것만으로, 다형을 검출할 수 있다. 이 때문에, 검출 장치의 자동화도 가능하다.

그러나, 이와 같은 Tm 해석을 사용한 검출 방법에 관해서도, 예를 들면, PCR에 있어서, 검출 목적의 다형을 포함하는 영역을, 특이적 또한 효율적으로 증폭할 수 없으면 안 된다고 하는 문제가 있다. 특히, 복수의 유전자 다형을 가질 경우에는, 1개의 샘플을 해석하는 데에도 엄청난 노동력을 수반하기 때문에, 대량의 샘플을 해석하는 것은 실용적이지 않다고 하는 문제도 있다.

후쿠자와(Fukuzawa) 외, 「특집 고혈압 최신의 연구 동향기초편」, 일본 임상, 주식회사 일본임상사, 2006년 7월, 64권 증간 5, 173∼176쪽 우라노(Urano) 외,「Polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene were associated with both the efficacy and the toxicity of methotrexate used for the treatment of rheumatoid arthritis,as evidenced by single locus and haplotype analyses.」, Pharmacogenetics, 2002년 4월, 12(3), 183∼190페이지

그래서, 본 발명은, 핵산증폭법에 의해 MTHFR 유전자의 목적의 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 및 프라이머 세트의 제공을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 프라이머는,

하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머,

하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머,

하기 (F2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 또는

하기 (R2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머

인 것을 특징으로 하는, MTHFR 유전자를 증폭하기 위한 프라이머이다.

(F1) 염기 길이가 20∼28 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 8715의 구아닌(g)을 3’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드

(R1) 염기 길이가 18∼26 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 8817의 시토신(c)을 5’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드

(F2) 염기 길이가 26∼36 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 10590의 구아닌(g)을 3’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드

(R2) 염기 길이가 22∼34 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 10695의 시토신(c)을 5’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드

본 발명의 프라이머 세트는,

상기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 및 상기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머의 적어도 한쪽을 포함하는 프라이머 세트(1), 및,

상기 (F2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 및 상기 (R2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머의 적어도 한쪽을 포함하는 프라이머 세트(2)

의 적어도 한쪽을 포함하는 것을 특징으로 하는, MTHFR 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트이다.

본 발명의 유전자 증폭용 시약은, 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 또는 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, MTHFR 유전자 증폭용 시약이다.

본 발명의 증폭 방법은, 반응계에 있어서, 시료 중의 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 또는 프라이머 세트를 사용하여, MTHFR 유전자의 증폭을 행하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, MTHFR 유전자의 증폭 방법이다.

본 발명의 증폭물 검출 방법은, 하기 (A)공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, MTHFR 유전자의 증폭물을 검출하는 증폭물 검출 방법이다.

(A) 본 발명의 증폭 방법에 의해, MTHFR 유전자를 증폭시키는 증폭 공정

본 발명의 다형 검출 방법은, 하기 (A)공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, MTHFR 유전자의 다형 검출 방법이다.

본 발명의 프라이머 및 프라이머 세트에 의하면, MTHFR 유전자에 있어서의 검출 대상 부위(예를 들면, MTHFR*677 또는 MTHFR*1298)를 포함하는 목적의 영역을, 특이적으로 증폭할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 있어서의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 있어서의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.

본 발명에 있어서, MTHFR 유전자에 있어서의 검출 목적의 다형은, 예를 들면, 서열번호 1에 나타내는 MTHFR 유전자의 염기서열에 있어서의 염기번호 8747 및 염기번호 10649의 적어도 한쪽의 염기에 있어서의 다형이다. 서열번호 1의 염기서열에 있어서, 염기번호 8747의 염기(y)는, 야생형이 시토신(c)이며, 변이형은 티민(t)이다. 이하, 이 다형을, MTHFR*677이라고 하고, 야생형의 호모 접합체를 MTHFR*677(C/C) 또는 8747(C/C), 변이형의 호모 접합체를 MTHFR*677(T/T) 또는 8747(T/T), 헤테로 접합체를 MTHFR*677(C/T) 또는 8747(C/T)이라고 한다. 또한 서열번호 1의 염기서열에 있어서, 염기번호 10649의 염기(m)는, 야생형이 아데닌(a)이며, 변이형은 시토신(c)이다. 이하, 이 다형을, MTHFR*1298이라고 하고, 야생형의 호모 접합체를 MTHFR*1298(A/A) 또는 10649(A/A), 변이형의 호모 접합체를 MTHFR*1298(C/C) 또는 10649(C/C), 헤테로 접합체를 MTHFR*1298(A/C) 또는 10649(A/C)이라고 한다. 야생형은, 정상형이라고 할 수도 있다.

MTHFR 유전자의 염기서열은, 예를 들면, NCBI 액세션:No.AY 338232로 등록되어 있다. 서열번호 1의 염기서열은, 상기 액세션 번호의 염기서열에 있어서의 MTHFR 유전자의 완전장(完全長) 서열이다.

본 발명에 있어서, 상기 다형이 발생하는 부위, 예를 들면, 서열번호 1의 서열(센스쇄)에 있어서 염기번호 8747 및 염기번호 10649의 염기, 또는, 그 상보 서열(안티센스쇄)에 있어서 상기 센스쇄의 염기번호 8747 및 염기번호 10649에 대응하는 염기를 「검출 대상 부위」라고 한다. 또한 본 발명에 있어서, 본 발명의 프라이머 및 프라이머 세트에 의해 증폭시키는 영역을, 「목적 영역 또는 증폭 영역」이라고 한다. 상기 목적 영역은, 상기 검출 대상 부위를 포함한다. 상기 목적 영역은, 예를 들면, MTHFR 유전자의 센스쇄에 있어서의 영역이라도 되고, 안티센스쇄에 있어서의 영역이라도 되고, 양쪽이라도 된다. 본 발명에 있어서, 센스쇄 및 안티센스쇄는, 예를 들면, 센스쇄의 증폭물, 안티센스쇄의 증폭물의 의미도 포함한다.

본 발명에 있어서, MTHFR 유전자에 있어서의, 상기 검출 대상 부위를 포함하고, 후술하는 다형 검출용의 프로브가 하이브리다이즈 가능한 영역을, 「검출 대상 서열 또는 하이브리다이즈 영역」이라고 한다. 상기 검출 대상 서열 중에서도, 상기 프로브와 퍼펙트 매치하는 검출 대상 서열을 「퍼펙트 매치 서열」, 상기 프로브와 미스매치하는 검출 대상 서열을 「미스매치 서열」이라고 한다. 본 발명에 있어서, 퍼펙트 매치란, 상기 검출 대상 부위의 염기가 상기 프로브에 있어서의 대응 염기와 상보적인 것을 의미하고, 바람직하게는, 상기 검출 대상 서열과 상기 프로브가, 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 미스매치란, 상기 검출 대상 부위의 염기가 상기 프로브에 있어서의 대응 염기와 비상보적인 것을 의미하고, 바람직하게는, 상기 검출 대상 서열과 상기 프로브가, 상기 검출 대상 부위 이외에 있어서 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 염기서열의 말단이란, 염기서열에 있어서의 5’측 및 3’측의 가장 끝의 염기를 의미한다. 또한 5’말단 영역이란, 염기서열에 있어서의 5’말단으로부터 수 염기의 영역이며, 3’말단 영역이란, 염기서열에 있어서의 3’말단으로부터 수 염기의 영역이다. 상기 수 염기란, 예를 들면, 상기 말단 염기를 포함하는 1∼10염기, 1∼4염기, 1∼3염기, 1∼2염기이다. 본 발명에 있어서, 염기서열의 말단으로부터 Z번째의 염기(Z는 양의 정수)란, 말단의 염기를 1번째로 한 순서이며, 예를 들면, 말단으로부터 1번째의 염기란, 말단의 염기, 말단으로부터 2번째의 염기란, 말단의 이웃의 염기를 의미한다.

본 발명의 프라이머는, 상술한 바와 같이,

하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머,

하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머,

하기 (R2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머

본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트는, 상술한 바와 같이, 상기 프라이머 세트(1) 및 상기 프라이머 세트(2)의 적어도 한쪽을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 프라이머 또는 그것을 포함하는 프라이머 세트에 의해, 예를 들면, MTHFR 유전자에 있어서의 목적의 영역을 특이적으로 증폭하는 것이 가능하다. 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 및 프라이머 세트는, 예를 들면, MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 시약이라고 할 수도 있다.

본 발명의 프라이머 및 프라이머 세트에 의하면, 상술한 바와 같이, MTHFR 유전자의 검출 대상 부위로서, 예를 들면, MTHFR*677 또는 MTHFR*1298을 포함하는 목적 영역을, 특이적으로 증폭할 수 있고, 또한 고효율로 증폭할 수 있다. 이와 같이, MTHFR 유전자의 상기 목적 영역을 특이적으로 증폭할 수 있으므로, 예를 들면, 정밀도 좋게 다형을 검출하는 것도 할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 얻어진 증폭물에 대해서, 또한, 상기 검출 대상 부위에 하이브리다이즈 가능한 프로브를 사용한 Tm 해석을 행함으로써 상기 검출 대상 부위의 다형을, 보다 정밀도 좋게 검출하여, 다형의 접합체형을 판정하는 것이 가능하게 된다. 또한 예를 들면, 1개의 반응계에서, 상기 목적 영역의 증폭 및 다형의 검출이 가능한 것으로부터, 조작의 자동화도 가능하게 된다. 또한, 본 발명의 프라이머 및 프라이머 세트를 사용하면, 예를 들면, 전혈 및 구강점막 등의 협잡물이 포함되는 시료라도, 협잡물의 제거 등의 전처리를 생략할 수 있기 때문에, 보다 신속 또한 간편하게 증폭 반응을 행할 수 있다. 또한 본 발명의 프라이머 및 프라이머 세트를 사용하면, 종래보다 뛰어난 증폭 효율로 증폭 반응을 행할 수 있기 때문에, 증폭 반응의 단축화도 가능하다. 따라서, 본 발명의 프라이머, 프라이머 세트, 이것을 포함하는 시약, 및 이들을 사용한 증폭 방법, 증폭물의 검출 방법 및 다형 검출 방법에 의하면, MTHFR 유전자의 다형을 신속 또한 간편하게 해석할 수 있으므로, 의료 분야에 있어서 대단히 유효하다고 할 수 있다.

본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트는, 예를 들면, 상기 프라이머 세트(1) 및 상기 프라이머 세트(2)의 어느 한쪽만을 포함해도 되고, 상기 프라이머 세트(1) 및 상기 프라이머 세트(2)의 양쪽을 포함해도 된다. 후술하지만, 상기 프라이머 세트(1)에 의해 특이적으로 증폭할 수 있는 목적 영역은, MTHFR 유전자에 있어서, 다형 MTHFR*677이 발생하는 부위를 포함하는 영역이며, 상기 프라이머 세트(2)에 의해 특이적으로 증폭할 수 있는 목적 영역은, MTHFR 유전자에 있어서, 다형 MTHFR*1298이 발생하는 부위를 포함하는 영역이다. 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트가, 예를 들면, 상기 프라이머 세트(1) 및 상기 프라이머 세트(2)의 양쪽을 포함할 경우, MTHFR 유전자에 있어서의, 다형 MTHFR*677이 발생하는 부위를 포함하는 목적 영역과 다형 MTHFR*1298이 발생하는 부위를 포함하는 목적 영역과를, 각각, 동일 반응계에서 동시에 증폭할 수 있다.

상술한 바와 같이, MTHFR 유전자의 이들 2종류의 다형은, 생체내의 호모시스테인량에 영향을 주는 것이 알려져 있다. 이 때문에, 어느 1종류의 다형 뿐만 아니라, 2종류 양쪽의 다형을 조사하는 것이 중요시되고 있다. 그러나, 종래법에서는, 1개의 반응계에 있어서 복수의 서열을 검출하는 것이 곤란하다는 문제가 있다. 이 때문에, MTHFR 유전자의 2종류의 다형, 즉, MTHFR*677 및 MTHFR*1298을 양쪽 조사하기 위해서는, 각각의 다형이 생기는 부위를 포함하는 영역을, 별개인 반응계에 있어서 각각 증폭시켜, 얻어진 증폭물을 별개로 해석할 필요가 있다. 이와 같이, 종래법에서는, MTHFR 유전자만을 주형으로 하고, 또한, MTHFR 유전자에 있어서, 상기 다형이 일어나는 부위를 각각 포함하는 2종류의 목적 영역을 특이적으로 증폭시키는 것은 극히 곤란하다. 그리고, 이와 같이, 1개의 샘플을 해석하는 데에도 엄청난 노동력을 수반하기 때문에, 다수의 샘플을 해석하는 것은 현실적이지 않다고 하는 문제가 있다. 이에 대하여 본 발명의 프라이머 세트에 의하면, 상기 프라이머 세트(1) 및 상기 프라이머 세트(2)의 양쪽을 포함할 경우라도, 각각의 목적 영역을, 동일 반응계에 있어서, 동시에 또한 특이적으로 증폭할 수 있다. 이 때문에, 상술한 종래법과는 달리, 시간 및 비용의 저감이 가능하게 된다. 또한 이와 같이, 동일 반응계에 있어서 2개의 목적 영역이 특이적으로 증폭되므로, 예를 들면, 각각의 목적 영역에 있어서의 검출 대상 부위에 하이브리다이즈 가능한 프로브를 사용하고, Tm 해석을 행함으로써, 상기 2종류의 다형을 각각 검출하고, 또한 접합체형을 판별하는 것이 가능하게 된다. 이와 같이, MTHFR 유전자에 있어서의 2종류의 다형에 대해서, 동일 반응계에서의 해석이 가능하게 되므로, 본 발명의 프라이머 세트는, 예를 들면, 상기 프라이머 세트(1) 및 상기 프라이머 세트(2)의 어느 1종류를 포함하는 경우는 물론, 2종류를 포함하는 것도 바람직하다. 이와 같은 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여, 1개의 목적 영역은 물론, 2개의 목적 영역을 동시에 증폭하면, 종래보다 효율 좋게, MTHFR 유전자의 다형을 검출할 수 있다.

이하, 포워드 프라이머를 F 프라이머, 리버스 프라이머를 R 프라이머라 하기도 한다.

상기 프라이머 세트는, 상술한 바와 같이, 하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 및 하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머의 적어도 한쪽을 포함하는 프라이머 세트이다.

상기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머는, 포워드 프라이머이며, 이하, F1 프라이머라고도 한다. 상기 F1 프라이머는, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서의 부분서열과 동일하다. 즉, MTHFR 유전자의 센스쇄에 있어서의 부분서열과 동일하며, 안티센스쇄에 어닐링 가능하다.

상기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머는, 리버스 프라이머이며, 이하, R1 프라이머라고도 한다. 상기 R1 프라이머는, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서의 부분서열에 상보적이다. 즉, MTHFR 유전자의 안티센스쇄에 있어서의 부분서열과 동일하며, 센스쇄에 어닐링 가능하다.

상기 프라이머 세트(1)는, 예를 들면, 상기 F1 프라이머만을 포함해도 되고, 상기 R1 프라이머만을 포함해도 되고, 바람직하게는 양쪽을 포함한다.

상기 프라이머 세트(1)는, 서열번호 1에 있어서의 염기번호 8716∼8816의 영역을 포함하는 핵산서열 및 그 상보쇄를 증폭시키기 위한 프라이머 세트이다. 이 영역 내의 염기번호 8747의 염기, 즉, 서열번호 1에 있어서의 염기번호 8747의 염기가, 상술한 다형 MTHFR*677이 생기는 부위이다. 이하, 이 프라이머 세트(1)을, 「MTHFR*677용 프라이머 세트」라고도 한다. MTHFR*677의 다형만을 해석할 경우에는, MTHFR*677용 프라이머 세트만을 사용하면 된다.

상기 프라이머 세트(1)에 있어서, 상기 F1 프라이머 및 상기 R1 프라이머는, DNA 중합효소에 의한 증폭의 시작점을 결정하는 역할을 다하는 3’말단의 염기가, 상술한 조건을 충족하고 있으면 된다. 이와 같이 각 프라이머의 3’말단의 염기를 고정함으로써, 상기 프라이머 세트(1)가, 예를 들면, 유사한 타 서열에 결합하는 것을 충분히 방지할 수 있다.

이와 같이, 상기 F1 프라이머 및 상기 R1 프라이머는, 그 3’말단의 염기가 고정되어 있으면 되므로, 상기 각 프라이머의 길이 자체는, 특히 제한되지 않고, 일반적인 길이로 적의 조정할 수 있다. 상기 각 프라이머의 길이는, 예를 들면, 13∼50 염기 길이의 범위이며, 바람직하게는 14∼45 염기 길이, 보다 바람직하게는 15∼40 염기 길이이다. 구체예로서, 상기 F1 프라이머는, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 8715의 구아닌(g)을 3’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드이며, 그 염기 길이가, 예를 들면, 20∼28 염기 길이이며, 바람직하게는, 21∼26 염기 길이, 보다 바람직하게는, 22∼24 염기 길이이다. 상기 R1 프라이머는, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 8817의 시토신(c)을 5’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드이며, 그 염기 길이가, 예를 들면, 18∼26 염기 길이이며, 바람직하게는, 19∼25 염기 길이, 보다 바람직하게는, 21∼23 염기 길이이다. 상기 F1 프라이머와 상기 R1 프라이머는, 3’말단이 각각 고정되어 있으므로, 프라이머로부터 신장하는 영역은, 예를 들면, 상술한 바와 같이 서열번호 1에 있어서의 염기번호 8716∼8816의 영역이지만, 얻어지는 증폭물의 전체의 길이는, 프라이머의 길이에 따라 변화한다.

상기 F1 프라이머는, 예를 들면, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서의 부분서열과 완전히 동일해도 되고, 완전히 동일하지 않아도 된다. 즉, MTHFR 유전자의 센스쇄의 부분서열과, 완전히 동일해도 되고, 완전히 동일하지 않아도 된다. 후자의 구체예로서, 상기 F1 프라이머는, 예를 들면, 상기 센스쇄의 부분서열과 대응시켰을 경우에, 3’말단의 염기를 제외하는 부분에 있어서, 상기 부분서열과 1개∼5개의 염기가 달라 있어도 된다.

상기 R1 프라이머는, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서의 부분서열에, 완전히 상보적이라도 되고, 완전히 상보적이 아니어도 된다. 즉, MTHFR 유전자의 안티센스쇄의 부분서열과, 완전히 동일해도 되고, 완전히 동일하지 않아도 된다. 후자의 구체예로서, 상기 R1 프라이머는, 예를 들면, 상기 안티센스쇄의 부분서열과 대응시켰을 경우에, 상기 3’말단의 염기를 제외하는 부분에 있어서, 상기 부분서열과, 1개∼5개의 염기가 달라 있어도 된다.

이하에, 상기 F1 프라이머 및 R1 프라이머의 구체예를 나타내지만, 본 발명은, 이에 한정되지 않는다.

상기 F1 프라이머와 R1 프라이머와의 조합은 하등 제한되지 않는다. 구체예로서는, 예를 들면, 서열번호 7에 나타내는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 F1-1 프라이머와, 서열번호 15에 나타내는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 R1-1 프라이머를 포함하는 프라이머 세트가 특히 바람직하다. 상기 표에 있어서의 「Tm(℃)」은, 상기 표의 서열과 그것에 완전히 상보적인 서열이 하이브리드한 경우의 Tm(℃)이며, MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/)에 의해, 소정의 파라미터에 기하여 산출한 값이다(이하, 같음). 상기 파라미터는, 파라미터를 올리고뉴클레오티드 농도 0.2μmol/L, 나트륨 당량(Na eq.) 50mmol/L으로 했다. 상기 Tm값은, 예를 들면, 종래 공지의 MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/) 등에 의해 산출할 수 있고, 또한 최근인접법(Nearest Neighbor Method)에 의해서도 결정할 수 있다(이하, 같음).

다음에, 상기 프라이머 세트(2)는, 상술한 바와 같이, 하기 (F2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 및 하기 (R2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머의 적어도 한쪽을 포함하는 프라이머 세트이다.

상기 (F2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머는, 포워드 프라이머이며, 이하, F2 프라이머라고도 한다. 상기 F2 프라이머는, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서의 부분서열과 동일하다. 즉, MTHFR 유전자의 센스쇄에 있어서의 부분서열과 동일하며, 안티센스쇄에 어닐링 가능하다.

상기 (R2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머는, 리버스 프라이머이며, 이하, R2 프라이머라고도 한다. 상기 R2 프라이머는, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서의 부분서열에 상보적이다. 즉, MTHFR 유전자의 안티센스쇄에 있어서의 부분서열과 동일하며, 센스쇄에 어닐링 가능하다.

상기 프라이머 세트(2)는, 예를 들면, 상기 F2 프라이머만을 포함해도 되고, 상기 R2 프라이머만을 포함해도 되며, 바람직하게는 양쪽을 포함한다.

상기 프라이머 세트(2)는, 서열번호 1에 있어서의 염기번호 10591∼10694의 영역을 포함하는 핵산서열 및 그 상보쇄를 증폭시키기 위한 프라이머 세트이다. 이 영역 내의 염기번호 10649의 염기, 서열번호 1에 있어서의 염기번호 10649의 염기가, 상술한 다형 MTHFR*1298이 생기는 부위이다. 이하, 이 프라이머 세트(2)를, 「MTHFR*1298용 프라이머 세트」라고도 한다. 또, MTHFR*1298의 다형만을 해석할 경우에는, MTHFR*1298용 프라이머 세트만을 사용하면 된다.

상기 프라이머 세트(2)에 있어서의 상기 F2 프라이머 및 R2 프라이머는, 상기 프라이머 세트(1)와 같은 이유로부터, 3’말단의 염기가, 상술한 조건을 만족시키고 있으면 된다. 이 때문에, 상기 F2 프라이머 및 R2 프라이머의 길이 자체는 특히 제한되지 않고, 상술한 바와 같은 길이로 적의 조정할 수 있다. 상기 각 프라이머의 길이는, 예를 들면, 13∼50 염기 길이의 범위이며, 바람직하게는 14∼45 염기 길이, 보다 바람직하게는 15∼40 염기 길이이다. 구체예로서, 상기 F2 프라이머는, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 10590의 구아닌(g)을 3’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드이며, 그 염기 길이가, 예를 들면, 26∼36 염기 길이이며, 바람직하게는, 28∼34 염기 길이, 보다 바람직하게는, 30∼32 염기 길이이다. 상기 R2 프라이머는, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 10695의 시토신(c)을 5’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드이며, 염기 길이가, 예를 들면, 22∼34 염기 길이이며, 바람직하게는, 26∼32 염기 길이, 보다 바람직하게는, 27∼29 염기 길이이다. 상기 F2 프라이머와 R2 프라이머는, 3’말단이 각각 고정되어 있으므로, 프라이머로부터 신장하는 영역은, 예를 들면, 상술한 바와 같이 서열번호 1에 있어서의 염기번호 10591∼10694의 영역이지만, 얻어지는 증폭물의 전체의 길이는, 사용하는 프라이머의 길이에 따라 변화한다.

상기 F2 프라이머는, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서의 부분서열과, 완전히 동일해도 되고, 완전히 동일하지 않아도 된다. 즉, MTHFR 유전자의 센스쇄의 부분서열과, 완전히 동일해도 되고, 완전히 동일하지 않아도 된다. 후자의 구체예로서, 상기 F1 프라이머는, 예를 들면, 상기 센스쇄의 부분서열과 대응시켰을 경우에, 3’말단의 염기를 제외하는 부분에 있어서, 상기 부분서열과, 1개∼5개의 염기가 달라 있어도 된다.

상기 R2 프라이머는, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서의 부분서열에, 완전히 상보적이라도 되고, 완전히 상보적이 아니어도 된다. 즉, MTHFR 유전자의 안티센스쇄의 부분서열과, 완전히 동일해도 되고, 완전히 동일하지 않아도 된다. 후자의 구체예로서, 상기 R2 프라이머는, 예를 들면, 상기 안티센스쇄의 부분서열과 대응시켰을 경우에, 상기 3’말단의 염기를 제외하는 부분에 있어서, 상기 부분서열과, 1개∼5개의 염기가 달라 있어도 된다.

이하에, 상기 F2 프라이머 및 상기 R2 프라이머의 구체예를 나타내지만, 본 발명은, 이에 한정되지 않는다.

상기 F2 프라이머와 상기 R2 프라이머와의 조합은 하등 제한되지 않는다. 구체예로서는, 예를 들면, 서열번호 25에 나타내는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 F2-1 프라이머와 서열번호 38에 나타내는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 R2-1 프라이머를 포함하는 프라이머 세트가 특히 바람직하다.

또한 상술한 프라이머 세트(1) 및 (2)의 각 프라이머는, 예를 들면, 증폭 반응의 반응 온도를 올리기 위해서, 종래 공지의 임의인 서열을 5’말단에 부가한 것이라도 된다.

본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트는, 예를 들면, 생체 시료에 있어서의 MTHFR 유전자를 증폭시킬 때에 사용하는 것이 바람직하다. 상기 생체 시료는, 특히 제한되지 않고, 전혈 시료를 들 수 있다. 특히, 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트를, 후술하는 바와 같이, 다형 검출용의 프로브와 함께 사용할 경우, 증폭 반응의 반응계에 있어서의 전혈 시료의 비율(전혈의 함유 비율)을, 예를 들면, 0.1∼0.5체적%으로 하는 것이 바람직하다. 이 점에 대해서는, 후술한다.

<증폭 방법>

본 발명의 증폭 방법은, 상술한 바와 같이, 반응계에 있어서, 시료 중의 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 또는 프라이머 세트를 사용하여, 상기 MTHFR 유전자의 증폭을 행하는 증폭 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, MTHFR 유전자의 증폭 방법이다.

본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 또는 프라이머 세트를 사용하여, 증폭 반응을 함으로써, 상술한 바와 같이, MTHFR 유전자의 목적 영역을 증폭할 수 있다. 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트가, 예를 들면, 상기 프라이머 세트(1) 및 상기 프라이머 세트(2)의 양쪽을 포함할 경우, MTHFR 유전자에 있어서의, 다형 MTHFR*677이 발생하는 부위를 포함하는 목적 영역과 다형 MTHFR*1298이 발생하는 부위를 포함하는 목적 영역을, 동일 반응계에서 동시에 증폭할 수 있다. 본 발명의 증폭 방법은, 상기 본 발명의 프라이머 또는 프라이머 세트를 사용하는 것이 특징이며, 핵산의 증폭법의 종류 및 조건 등은 하등 제한되지 않는다.

상기 증폭 공정에 있어서, 상기 MTHFR 유전자의 증폭은, 프라이머로서 상기 본 발명의 프라이머 또는 프라이머 세트를 사용하는 증폭법에 의해 행할 수 있다. 상기 핵산의 증폭법은, 상술한 바와 같이, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, PCR(Polymerase Chain Reaction)법, NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)법, TMA(Transcription-Mediated Amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법 등을 들 수 있으며, 그 중에서도, PCR법이 바람직하다.

상기 증폭 공정에 있어서의 증폭 반응의 상기 반응계는, 예를 들면, 반응액을 들 수 있다. 상기 반응계는, 예를 들면, 본 발명의 프라이머 또는 프라이머 세트 및 시료를 포함하고, 또한, 용매, 핵산의 증폭에 사용하는 각종 성분 등을 포함해도 된다.

본 발명을 적용하는 시료는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 주형이 되는 핵산을 포함하는 시료를 들 수 있다. 본 발명은, 예를 들면, 협잡물이 포함되는 시료에 적용하는 것이 바람직하다. 상기 협잡물이 포함되는 시료는, 예를 들면, 생체 시료를 들 수 있다. 상기 생체 시료는, 예를 들면, 전혈, 구강내 세포(예를 들면, 구강 점막), 손톱 및 모발 등의 체세포, 생식세포, 객담, 양수, 파라핀 포매 조직, 요, 위액(예를 들면, 위액 세액) 등, 그것들의 현탁액 등을 들 수 있다. 본 발명의 증폭 방법에 의하면, 예를 들면, 여러가지 협잡물이 포함되는 시료, 특히, 전혈 및 구강내 세포 등의 생체 시료라도, 그 영향을 받기 어렵다. 이 때문에, 본 발명에 의하면, MTHFR 유전자의 상기 목적 영역을 특이적으로 증폭할 수 있다. 본 발명에 의하면, 종래법에서는 증폭이 곤란했던 협잡물이 많이 포함되는 시료라도, 예를 들면, 상기 시료로부터의 협잡물의 제거, 상기 시료의 정제 등의 전처리를 행하지 않고, 상기 시료를 그대로 사용하는 것이 가능하다. 따라서, 예를 들면, 상기 시료의 전처리 등의 관점으로부터도, 종래법보다, 본 발명은, 더 신속하게 MTHFR 유전자를 증폭 가능하다고 할 수 있다.

상기 반응계에 있어서, 상기 시료의 비율은, 특히 제한되지 않는다. 상기 시료가, 예를 들면, 생체 시료의 경우의 경우, 상기 반응계에 있어서의 시료의 비율은, 하한이, 예를 들면, 0.01체적% 이상, 바람직하게는, 0.05체적% 이상, 보다 바람직하게는, 0.1체적% 이상이며, 상한이, 예를 들면, 2체적% 이하, 바람직하게는, 1체적% 이하, 보다 바람직하게는, 0.5체적% 이하이다. 구체예로서, 상기 생체 시료가 전혈 시료의 경우, 상기 반응계에 있어서의 상기 전혈 시료의 비율은, 예를 들면, 같다.

증폭 반응 후의 상기 반응계에 대해서, 예를 들면, 후술하는 바와 같이 광학적인 검출을 행할 경우, 상기 반응계에 있어서의 상기 생체 시료의 비율은, 예를 들면, 0.1∼0.5체적%로 설정하는 것이 바람직하다. 상기 생체 시료는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 전혈 시료이다. 상기 반응계에 있어서의 전혈 시료의 비율은, 상술한 바와 같은 체적 비율(예를 들면, 0.1∼0.5체적%)이 아니라, 헤모글로빈(이하, 「Hb」라고 한다)의 중량 비율로 나타낼 수도 있다. 이 경우, 상기 반응계에 있어서의 전혈 시료의 비율은, Hb량으로 환산하여, 예를 들면, 0.565∼113g/L의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 2.825∼56.5g/L의 범위, 보다 바람직하게는, 5.65∼28.25g/L의 범위이다. 또, 상기 반응계에 있어서의 전혈 시료의 비율은, 예를 들면, 상기 체적 비율과 Hb 중량 비율의 양쪽을 만족시켜도 되고, 어느 한쪽을 만족시켜도 된다.

상기 전혈은, 예를 들면, 생체로부터 채취한 전혈, 채취 후에 처리한 전혈의 어느 것이라도 되고, 구체예로서, 용혈한 전혈, 미용혈의 전혈, 항응고 전혈, 응고 획분을 포함하는 전혈 등의 어느 것이라도 된다.

상기 증폭 공정에 있어서, 상기 시료 중의 핵산은, 예를 들면, 1본쇄 핵산이라도 되고, 2본쇄 핵산이라도 된다. 상기 시료 중의 핵산은, 예를 들면, DNA이다. 상기 DNA는, 예를 들면, 생체 시료 등의 시료에 원래 포함되는 DNA라도 되고, 핵산의 증폭법에 의해 증폭시킨 DNA 증폭물이라도 된다. 후자의 경우, 예를 들면, 상기 시료 중의 RNA로부터 합성한 cDNA라도 된다. 상기 시료 중의 상기 RNA는, 예를 들면, 토탈 RNA, mRNA 등을 들 수 있으며, 상기 cDNA는, 예를 들면, 상기 RNA로부터 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)에 의해 합성할 수 있다.

본 발명의 증폭 방법은, 예를 들면, 상기 증폭 공정에 있어서의 증폭 반응의 개시에 전서, 상기 반응계에, 알부민을 더 첨가하는 것이 바람직하다. 알부민의 첨가에 의해, 예를 들면, 상술한 바와 같은 침전물 및 탁함의 발생에 의한 영향을, 더한층 저감할 수 있고, 또한, 증폭 효율을, 더 향상할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 상기 증폭 공정 전에, 알부민을 첨가하는 것이 바람직하다. 상기 증폭 공정 전이란, 예를 들면, 증폭 공정에 있어서, 2본쇄 DNA를 1본쇄 DNA로 해리하기 전이라도 된다.

상기 반응계에 있어서, 알부민의 비율은, 특히 제한되지 않는다. 상기 비율은, 예를 들면, 0.01∼2중량%의 범위, 바람직하게는, 0.1∼1중량%의 범위, 보다 바람직하게는, 0.2∼0.8 중량%의 범위이다. 상기 알부민은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 소 혈청알부민(BSA), 인간 혈청알부민, 래트 혈청알부민, 말 혈청알부민 등을 들 수 있다. 이들은, 어느 1종류라도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다.

다음에, 본 발명의 증폭 방법에 관한 것으로서, 전혈 시료 중의 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트로서 상기 프라이머 세트(1) 및 상기 프라이머 세트(2)를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여, PCR에 의해, 하나의 반응액 중에서, 동시에, MTHFR 유전자의 2개의 목적 영역을 증폭하는 예를 들어서 설명한다. 상기 2개의 목적 영역은, 다형 MTHFR*677이 발생하는 부위를 포함하는 목적 영역과 다형 MTHFR*1298이 발생하는 부위를 포함하는 목적 영역이다. 본 발명은, 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트를 사용하는 것이 특징이며, 다른 구성 및 조건은 하등 제한되지 않는다.

우선, PCR의 반응액을 조제한다. 상기 반응액은, 상기 프라이머 세트 및 상기 전혈 시료를 포함하고, 또한, 상기 증폭 반응에 사용가능한 타 성분을 적의 포함하는 것이 바람직하다.

상기 반응액에 있어서, 각 프라이머의 비율은, 특히 제한되지 않는다. 상기 반응액에 있어서, 상기 F1 프라이머 및 상기 F2 프라이머의 비율은, 각각, 0.1∼2μmol/L이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 0.25∼1.5μmol/L, 특히 바람직하게는, 0.5∼1μmol/L이다. 또한 상기 반응액에 있어서, 상기 R1 프라이머 및 상기 R2 프라이머의 비율은, 각각, 0.1∼2μmol/L이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 0.25∼1.5μmol/L, 특히 바람직하게는, 0.5∼1μmol/L이다. 상기 프라이머 세트(1) 및 상기 프라이머 세트(2)에 있어서, 각각, F 프라이머와 R 프라이머와의 비율(F:R, 몰비)은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 1:0.25∼1:4, 바람직하게는, 1:0.5∼1:2이다.

상기 반응액에 있어서의 상기 전혈 시료의 비율은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 상술한 범위가 바람직하다. 상기 전혈 시료는, 예를 들면, 그대로 상기 반응액에 첨가해도 되고, 미리, 용매로 희석하고 나서 상기 반응액에 첨가해도 된다. 상기 용매는, 예를 들면, 물 및 완충액 등을 들 수 있다. 상기 전혈 시료를 미리 희석할 경우, 희석율은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 상기 반응액에 있어서의 최종적인 전혈 비율이, 상기 범위가 되도록 설정할 수 있다. 상기 희석율의 구체예는, 예를 들면, 100∼2000배, 바람직하게는, 200∼1000배이다.

상기 타 성분은, 특히 제한되지 않고, 종래 공지의 성분을 들 수 있으며, 그것들의 비율은, 특히 제한되지 않는다. 상기 성분은, 예를 들면, 용매 등을 들 수 있다. 상기 성분은, 예를 들면, PCR에 사용하는 각종 성분을 들 수 있으며, 구체예로서, DNA 중합효소 등의 중합효소, 뉴클레오티드 3인산 등을 들 수 있다. 상기 성분은, 예를 들면, 상술한 바와 같이, 알부민을 들 수 있다. 상기 반응액에 있어서, 각 성분의 첨가 순서는 하등 제한되지 않는다.

상기 중합효소는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 종래 공지의 내열성 세균 유래의 중합효소를 사용할 수 있다. 구체예로서, 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래 DNA 중합효소(미국특허 제4,889,818호 및 동 제5,079,352호)(상품명 Taq 중합효소), 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus) 유래 DNA 중합효소(WO 91/09950)(rTth DNA polymerase), 피로코쿠스 퓨리오수스(Pyrococcus furiosus) 유래 DNA 중합효소(WO 92/9689)(Pfu DNA polymerase:Stratagenes사제), 테르모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) 유래 중합효소(EP-A 455430)(상표 Vent:New England Biolabs사제) 등이 상업적으로 입수가능하며, 그 중에서도, 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래의 내열성 중합효소가 바람직하다.

상기 반응액에 있어서, DNA 중합효소의 비율은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 1∼100U/mL, 바람직하게는, 5∼50U/mL, 보다 바람직하게는, 20∼30U/mL이다. DNA 중합효소의 활성 단위(U)는, 일반적으로, 활성화 연어 정자 DNA를 주형 프라이머로 하고, 활성 측정용 반응액 중, 74℃에서, 30분간에 10nmol의 전 뉴클레오티드를 산불용성 침전물로 취입하는 활성이 1U이다. 상기 활성 측정용 반응액의 조성은, 예를 들면, 25mmol/L TAPS 버퍼(pH 9.3, 25℃), 50mmol/L KCl, 2mmol/L MgCl₂, 1mmol/L 머캅토에탄올, 200μmol/L dATP, 200μmol/L dGTP, 200μmol/L dTTP, 100μmol/L 「α-32P」dCTP, 0.25mg/mL 활성화 연어 정자 DNA이다.

상기 뉴클레오티드 3인산은, 보통, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 또는 dUTP)를 들 수 있다. 상기 반응액에 있어서, dNTP의 비율은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 0.01∼1mmol/L, 바람직하게는, 0.05∼0.5mmol/L, 보다 바람직하게는, 0.1∼0.3mmol/L이다.

상기 용매는, 예를 들면, 완충액, 물 등을 들 수 있다. 상기 완충액은, 예를 들면, Tris-HCl, Tricine, MES, MOPS, HEPES, CAPS 등을 들 수 있으며, 시판의 PCR용 완충액 및 시판의 PCR 키트의 완충액 등을 사용할 수 있다.

상기 반응액은, 상기 기타의 성분으로서, 예를 들면, 또한, 헤파린, 베타인, KCl, MgCl₂, MgSO₄, 글리세롤 등을 포함해도 되고, 이들의 비율은, 예를 들면, PCR 반응을 저해하지 않는 범위에서 설정하면 된다.

상기 반응액의 전체적은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 써멀 사이클러 등의 사용하는 기기 등에 따라 적의 설정할 수 있다. 상기 체적은, 보통, 예를 들면, 1∼500㎕이며, 바람직하게는, 10∼100㎕이다.

다음에, PCR를 행한다. 상기 PCR의 사이클 조건은, 특히 제한되지 않는다. 구체예로서, 예를 들면, (1) 2본쇄 DNA의 1본쇄 DNA에의 해리, (2) 상기 1본쇄 DNA에의 프라이머의 어닐링, (3) 프라이머의 신장은, 각각, 하기 표 3의 조건을 예시할 수 있다. PCR의 사이클수는, 특히 제한되지 않고, 하기 (1)∼(3)의 3스텝을 1사이클로 하여, 예를 들면, 30사이클 이상이 바람직하다. 상기 사이클수의 상한은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 100사이클 이하, 바람직하게는, 70사이클 이하, 보다 바람직하게는, 50사이클 이하이다. 각 스텝의 온도 변화는, 예를 들면, 써멀 사이클러 등을 사용하여 자동적으로 제어할 수 있다. 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트를 사용했을 경우, 상술한 바와 같이, 증폭 효율에 뛰어나다. 이 때문에, 종래법에서는, 50사이클에 3시간 정도를 요하고 있었던 것에 대해서, 본 발명에 의하면, 예를 들면, 약 1시간 정도, 바람직하게는 1시간 이내에, 50사이클을 완료하는 것도 가능하다.

이와 같이 하여, 동일한 반응계에 있어서, 동시에, MTHFR 유전자에 있어서의 상기 2개의 목적 영역을 증폭할 수 있다. 상기 2개의 목적 영역 중 어느 한쪽을 증폭할 경우, 예를 들면, 상기 프라이머 세트(1) 및 상기 프라이머 세트(2) 중, 상기 목적 영역에 대응하는 어느 한쪽의 프라이머 세트를, 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트로서 사용하면 된다.

본 발명의 증폭 방법은, 또한, 상기 증폭 공정에 있어서 얻어진 목적 영역의 증폭물을 검출하는 검출 공정을 포함해도 된다. 이것에 의해, 예를 들면, 후술하는 바와 같이, 상기 목적 영역의 증폭의 유무, MTHFR 유전자의 상기 목적 영역에 있어서의 다형, 예를 들면, MTHFR*677 또는 MTHFR*1298을 검출할 수 있다. 상기 증폭의 유무 및 상기 다형의 검출은, 예를 들면, 종래 공지의 방법에 의해 확인할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 상기 증폭 공정에 있어서, 상기 반응계에, MTHFR 유전자의 검출 대상 부위에 하이브리다이즈 가능한 프로브를 더 첨가해 둔다. 상기 프로브는, 예를 들면, 형광 물질을 갖는 표지 프로브를 들 수 있다. 그리고, 상기 증폭 공정 후, 상기 검출 공정에 있어서, 상기 반응계에 대해서, 상기 표지 프로브의 상기 형광 물질에 대해서, 형광 강도를 측정한다. 이것에 의해, 상기 목적 영역의 증폭의 유무 및 상기 검출 대상 부위의 다형을 확인할 수 있다. 또한 증폭시키는 목적 영역이 2개의 경우에는, 예를 들면, 상기 증폭 공정에 있어서, 상기 반응계에, 또한, MTHFR 유전자의 각 검출 대상 부위에 하이브리다이즈 가능한 프로브를 2종류 첨가해 둔다. 그리고, 상기 검출 공정에 있어서, 상기 반응계에 대해서, 상기 각표지 프로브의 상기 형광 물질의 형광 강도를 측정한다. 이것에 의해, 상기 각목적 영역의 증폭의 유무 및 각 검출 대상 부위의 다형을, 각각 확인할 수 있다.

MTHFR 유전자의 상기 목적 영역의 증폭물의 검출, 및, MTHFR 유전자에 있어서의 다형, 예를 들면, MTHFR*677 및 MTHFR*1298의 검출에 대해서는, 각각, 본 발명의 증폭 방법의 그 밖의 형태로서, 이하에 설명한다.

<증폭물 검출 방법>

본 발명의 증폭물의 검출 방법은, 본 발명의 프라이머 또는 본 발명의 프라이머 세트를 사용하는 것을 특징으로 하고, 하기 (A)공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, MTHFR 유전자의 증폭물을 검출하는 증폭물 검출 방법이다.

(A) 본 발명의 MTHFR 유전자의 증폭 방법에 의해, MTHFR 유전자를 증폭시키는 증폭 공정

상기 (A)공정은, 예를 들면, 반응계에 있어서, 시료 중의 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트를 사용하여, MTHFR 유전자를 증폭시키는 증폭 공정이라고 할 수도 있다(이하, 같음).

본 발명의 검출 방법은, 예를 들면, 프로브를 사용하여, 상기 MTHFR 유전자의 증폭물을 검출하는 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면, 하기 (A), (B) 및 (C)공정을 포함하는 것이 바람직하다.

(B) 상기 (A)공정에 있어서의 증폭물 및 상기 MTHFR 유전자의 증폭물에 하이브리다이즈 가능한 프로브를 포함하는 반응계의 온도를 변화시켜, 상기 증폭물과 상기 프로브와의 하이브리드의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하는 측정 공정

(C) 상기 온도 변화에 따르는 상기 시그널값의 변동으로부터, 상기 MTHFR 유전자의 증폭물을 검출하는 검출 공정

본 발명의 증폭물 검출 방법에 있어서, 상기 (A)공정은, 상술한 본 발명의 MTHFR 유전자의 증폭 방법에 있어서의 기재를 인용할 수 있다.

본 발명의 증폭물의 검출 방법은, 예를 들면, 상기 프로브의 존재 하에서, MTHFR 유전자의 증폭을 행해도 된다. 즉, 본 발명의 증폭물의 검출 방법은, 예를 들면, 상기 (A)공정에 있어서, 상기 프로브를 포함하는 상기 반응계에 있어서, MTHFR 유전자의 증폭을 행해도 되고, 또한, 상기 (B)공정에 있어서, 예를 들면, 상기 (A)공정의 상기 반응계의 온도를 변화시켜, 상기 시그널값의 측정을 행해도 된다.

본 발명의 증폭물 검출 방법은, 후술하는 본 발명의 다형의 검출 방법에 있어서의 기재를 인용할 수 있다. 구체적으로, 예를 들면, 본 발명의 증폭물 검출 방법에 있어서의 상기 (A)공정 및 상기 (B)공정은, 후술하는 본 발명의 다형의 검출 방법에 있어서의 (A)공정 및 (B)공정의 기재를 인용할 수 있다. 또한 예를 들면, 본 발명의 증폭물 검출 방법에 있어서의 상기 (C)공정은, 후술하는 본 발명의 다형의 검출 방법에 있어서의 (D)공정을 인용할 수 있고, 구체적으로는, 후술하는 (D)공정에 있어서, 합쳐서 상기 (C)공정에 관하여 설명한다.

<다형 검출 방법>

본 발명의 다형 검출 방법은, 상술한 바와 같이, 하기 (A)공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, MTHFR 유전자의 다형 검출 방법이다.

본 발명의 다형 검출 방법은, 예를 들면, 프로브를 사용하여, MTHFR 유전자의 검출 대상 부위의 다형을 검출하는 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면, 하기 (A), (B) 및 (D)공정을 포함하는 것이 바람직하다.

(B) 상기 (A)공정에 있어서의 증폭물 및 상기 검출 대상 부위에 하이브리다이즈 가능한 프로브를 포함하는 반응계의 온도를 변화시켜, 상기 증폭물과 상기 프로브와의 하이브리드의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하는 측정 공정

(D) 상기 온도 변화에 따르는 상기 시그널값의 변동으로부터, 상기 검출 대상 부위의 상기 다형을 검출하는 검출 공정

본 발명의 프라이머 또는 프라이머 세트를 사용하여, MTHFR 유전자를 증폭함으로써, 상술한 바와 같이, MTHFR 유전자에 있어서의 상기 검출 대상 부위를 포함하는 목적 영역을 증폭할 수 있다. 이 때문에, 예를 들면, 상기 목적 영역에 있어서의 상기 검출 대상 부위의 다형을, 감도 좋게 해석할 수 있다.

상기 증폭 공정(A)은, 상술한 본 발명의 증폭 방법과 같이 행할 수 있다. 본 발명의 증폭물 검출 방법에 있어서, 상기 (A)공정은, 상술한 본 발명의 MTHFR 유전자의 증폭 방법에 있어서의 기재를 인용할 수 있다.

상기 측정 공정(B)에 있어서, 상기 프로브는, 특히 제한되지 않는다. 상기 프로브는, 예를 들면, MTHFR*677의 검출 대상 부위에 하이브리다이즈하는 프로브 및 MTHFR*1298의 검출 대상 부위에 하이브리다이즈하는 프로브를 들 수 있다. 이하, 전자를 「MTHFR*677용 프로브」, 후자를 「MTHFR*1298용 프로브」라고도 한다. 이들 프로브는, MTHFR 유전자에 있어서, 상기 검출 대상 부위를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브인 것이 바람직하다. 본 발명은, 예를 들면, MTHFR*677용 프로브 및 MTHFR*1298용 프로브 중, 어느 1종류를 사용해도 되고, 2종류를 병용해도 된다. 본 발명에 있어서 사용하는 프로브는, 예를 들면, 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 또는 프라이머 세트에 의해 증폭시키는 목적 영역의 종류에 따라, 적의 결정할 수 있다. 2종류의 프로브를 병용함으로써, 예를 들면, 동일 반응계를 사용하여, 2개의 검출 대상 부위의 다형, 즉 MTHFR*677 및 MTHFR*1298을 해석할 수 있다.

상기 프로브는, 예를 들면, MTHFR 유전자의 센스쇄에 하이브리다이즈 가능한 프로브라도 되고, 안티센스쇄에 하이브리다이즈 가능한 프로브라도 된다. 상기 프로브의 설계 방법은, 특히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다. 예를 들면, 상기 검출 대상 부위를 포함하는 검출 대상 서열을, MTHFR 유전자의 센스쇄의 서열로 설정하고, 상기 서열에 의거하여 설계해도 되고, 상기 검출 대상 서열을, 안티센스쇄의 서열로 설정하고, 상기 서열에 의거하여 설계해도 된다. 상기 검출 대상 서열에 있어서의 상기 검출 대상 부위의 염기는, 상기 검출 대상 부위에 있어서의 각 다형의 종류에 따라, 적의 결정할 수 있다.

MTHFR*677의 경우, 서열번호 1에 있어서의 염기번호 8747의 염기로서, 「c」및 「t」가 알려져 있다. 그래서, 예를 들면, 센스쇄에 있어서 염기번호 8747이 시토신(c)인 검출 대상 서열에 상보적인 프로브, 및, 센스쇄에 있어서 염기번호 8747이 티민(t)인 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 들 수 있다. 이들은, 센스쇄에 하이브리다이즈하는 센스쇄의 검출용 프로브라고 할 수 있다. 또한 그 안티센스쇄의 서열에 상보적인 프로브를 들 수 있으며, 이들은, 안티센스쇄에 하이브리다이즈하는 안티센스쇄의 검출용 프로브라고 할 수 있다.

MTHFR*1298의 경우, 서열번호 1에 있어서의 염기번호 10649의 염기로서, 「a」및 「c」가 알려져 있다. 그래서, 예를 들면, 센스쇄에 있어서 염기번호 10649이 아데닌(a)인 검출 대상 서열에 상보적인 프로브, 및, 센스쇄에 있어서 염기번호 10649이 시토신(c)인 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 들 수 있다. 이들은, 센스쇄에 하이브리다이즈하는 센스쇄의 검출용 프로브라고 할 수 있다. 또한 그 안티센스쇄의 서열에 상보적인 프로브를 들 수 있으며, 이들은, 안티센스쇄에 하이브리다이즈하는 안티센스쇄의 검출용 프로브라고 할 수 있다.

이와 같이, 다형이 생기는 검출 대상 부위의 염기를, 상술한 어느 염기로 결정하고, 프로브를 설계해도, 후술의 방법에 의해, MTHFR 유전자의 각 검출 대상 부위가, 어떤 다형을 나타낼지를 판단 가능하다.

상기 프로브의 길이는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 5∼50 염기 길이이며, 바람직하게는, 10∼30 염기 길이이다.

상기 프로브의 구체예는, 예를 들면, 하기 (P1)의 올리고뉴클레오티드, (P1’)의 올리고뉴클레오티드, (P2)의 올리고뉴클레오티드 및 (P2’)의 올리고뉴클레오티드의 적어도 어느 하나를 포함하는 프로브를 들 수 있다.

(P1) 염기 길이가 17∼50 염기 길이이며, 서열번호 1에 있어서의 염기번호 8744∼8760을 포함하는 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어지고, 상기 염기번호 8744의 염기에 상보적인 염기를, 3’말단 영역에 갖는 올리고뉴클레오티드

(P1’) 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드

(P2) 염기 길이가 14∼50 염기 길이이며, 서열번호 1에 있어서의 염기번호 10643∼10656을 포함하는 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어지고, 상기 염기번호 10643의 염기에 상보적인 염기를, 3’말단 영역에 갖는 올리고뉴클레오티드

(P2’) 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드

상기 프로브는, 예를 들면, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브라도 되고, 상기 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브라도 된다.

이들 프로브는, 일례이며, 본 발명은, 이들에는 제한되지 않는다. 이하, 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브를 P1 프로브, 상기 (P1’)의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브를 P1’ 프로브, 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브를 P2 프로브, 상기 (P2’)의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브를 P2’프로브라고 한다. 이들 프로브를, 본 발명의 MTHFR 유전자의 검출용 프로브라고도 한다.

상기 P1 프로브 및 P1’ 프로브는, 상기 MTHFR*677용 프로브의 일례이다. 이들 프로브는, 서열번호 1의 염기서열에 있어서의 염기번호 8747의 염기(y)의 다형(c/t)을 검출하기 위한 프로브이다. 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, MTHFR 유전자의 센스쇄에 상보적이며, 센스쇄와의 하이브리다이제이션에 의해, 상기 다형을 확인할 수 있다. 상기 (P1’)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, MTHFR 유전자의 센스쇄에 상동적이며, 안티센스쇄와의 하이브리다이제이션에 의해, 상기 다형을 확인할 수 있다. 상기 (P1) 및 (P1’)의 올리고뉴클레오티드는, 그 염기 길이가, 상술한 바와 같이, 17∼50 염기 길이이며, 예를 들면, 17∼40 염기 길이가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 17∼30 염기 길이이며, 보다 바람직하게는, 17∼21 염기 길이이다.

상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호 8747의 염기(y)에 대응하는 염기(r)을 포함한다. 상기 r은, 구아닌(g) 또는 아데닌(a)이다. 상기 P1 프로브에 있어서, 「r이 g」의 경우, 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 센스쇄에 있어서의 상기 검출 대상 부위(y)가 야생형(c)인 검출 대상 서열과 퍼펙트 매치하고, 「r이 a」의 경우, 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 센스쇄에 있어서의 상기 검출 대상 부위(y)가 변이형(t)인 검출 대상 서열과 퍼펙트 매치한다. 이 때문에, 상기 증폭 방법에 의해 얻어진 상기 증폭물과 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드가, 퍼펙트 매치인지 아닌지에 의해, 상기 검출 대상 부위의 다형이, 야생형인지 변이형인지를 확인할 수 있다.

상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 상기 염기번호 8744의 염기에 상보적인 염기를, 상기 3’말단 영역에 갖고, 바람직하게는, 3’말단으로부터 세어 1∼4번째의 위치, 보다 바람직하게는, 1∼3번째, 특히 바람직하게는 1번째(3’말단) 또는 2번째에 갖는다. 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 하기 표 4의 서열번호 44∼48 중 어느 하나에 나타내는 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 예시할 수 있다. 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드의 염기서열에 있어서, 염기(r)은, 구아닌(g) 및 아데닌(a)의 어느 것이라도 되며, 바람직하게는, 아데닌(a)이다.

상기 (P1’)의 올리고뉴클레오티드는, 상술한 바와 같이, 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드에 상보적이다. 상기 (P1’)의 올리고뉴클레오티드는, 염기 길이가 17∼50 염기 길이이며, 서열번호 1에 있어서의 염기번호 8744∼8760을 포함하는 염기서열에 상동적인 염기서열로 이루어지고, 상기 염기번호 8744의 염기를, 5’말단 영역에 갖는 올리고뉴클레오티드라고 할 수도 있다.

상기 (P1’)의 올리고뉴클레오티드는, 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드의 경우, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호 8747의 염기(y)를 포함한다. 상기 y는, 시토신(c) 또는 티민(t)이다. 상기 P1’ 프로브에 있어서, 「y가 c」의 경우, 상기 (P1’)의 올리고뉴클레오티드는, 안티센스쇄에 있어서의 상기 검출 대상 부위(r)가 야생형(g)인 검출 대상 서열과 퍼펙트 매치하고, 「y가 t」의 경우, 상기 (P1’)의 올리고뉴클레오티드는, 안티센스쇄에 있어서의 상기 검출 대상 부위(r)가 변이형(a)인 검출 대상 서열과 퍼펙트 매치한다. 이 때문에, 상기 증폭 방법에 의해 얻어진 상기 증폭물과 상기 (P1’)의 올리고뉴클레오티드가, 퍼펙트 매치인지 아닌지에 의해, 상기 검출 대상 부위의 다형이, 야생형인지 변이형인지를 확인할 수 있다.

상기 P2 프로브 및 P2’프로브는, 상기 MTHFR*1298용 프로브의 일례이다. 이들 프로브는, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 10649의 염기(m)의 다형(a/c)의 다형을 검출하기 위한 프로브이다. 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, MTHFR 유전자의 센스쇄에 상보적이며, 센스쇄와의 하이브리다이제이션에 의해, 상기 다형을 확인할 수 있다. 상기 (P2’)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, MTHFR 유전자의 센스쇄에 상동적이며, 안티센스쇄와의 하이브리다이제이션에 의해, 상기 다형을 확인할 수 있다.

상기 (P1) 및 (P1’)의 올리고뉴클레오티드는, 그 염기 길이가, 상술한 바와 같이, 14∼50 염기 길이이며, 예를 들면, 14∼40 염기 길이가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 14∼30 염기 길이이며, 보다 바람직하게는, 14∼19 염기 길이이다.

상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드는, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호 10649의 염기(m)에 대응하는 염기(k)를 포함한다. 상기 k는, 티민(t), 우라실(u) 또는 구아닌(g)이다. 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드에 있어서, 「r가 t 또는 u」의 경우, 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드는, 센스쇄에 있어서의 상기 검출 대상 부위(m)가 야생형(a)인 검출 대상 서열과 퍼펙트 매치하고, 「r가 g」의 경우, 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드는, 센스쇄에 있어서의 상기 검출 대상 부위(m)가 변이형(c)인 검출 대상 서열과 퍼펙트 매치한다. 이 때문에, 상기 증폭 방법에 의해 얻어진 상기 증폭물과 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드가, 퍼펙트 매치인지 아닌지에 의해, 상기 검출 대상 부위의 다형이, 야생형인지 변이형인지를 확인할 수 있다.

상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드는, 상기 염기번호 10643의 염기에 상보적인 염기를, 상기 3’말단 영역에 갖고, 바람직하게는, 3’말단으로부터 세어 1∼4번째의 위치, 보다 바람직하게는, 1∼3번째, 특히 바람직하게는 1번째(3’말단) 또는 2번째에 갖는다. 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 상기 표 4의 서열번호 49∼54 중 어느 하나에 나타내는 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 예시할 수 있다. 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드의 염기서열에 있어서, 염기(k)는, 티민(t), 우라실(u) 및 구아닌(g)의 어느 것이라도 되며, 바람직하게는, 구아닌(g)이다.

상기 (P2’)의 올리고뉴클레오티드는, 상술한 바와 같이, 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드에 상보적이다. 상기 (P2’)의 올리고뉴클레오티드는, 염기 길이가 14∼50 염기 길이이며, 서열번호 1에 있어서의 염기번호 10643∼10656을 포함하는 염기서열에 상동적인 염기서열로 이루어지고, 상기 염기번호 10643의 염기를, 5’말단 영역에 갖는 올리고뉴클레오티드라고 할 수도 있다.

상기 (P2’)의 올리고뉴클레오티드는, 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드의 경우, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호 10649의 염기(m)를 포함한다. 상기 m은, 아데닌(a) 또는 시토신(c)이다. 상기 (P2’)의 올리고뉴클레오티드에 있어서, 「m이 a」의 경우, 상기 (P2’)의 올리고뉴클레오티드는, 안티센스쇄에 있어서의 상기 검출 대상 부위(k)가 야생형(t)인 검출 대상 서열과 퍼펙트 매치하고, 「m이 c」의 경우, 상기 (P2’)의 올리고뉴클레오티드는, 안티센스쇄에 있어서의 상기 검출 대상 부위(k)가 변이형(g)인 검출 대상 서열과 퍼펙트 매치한다. 이 때문에, 상기 증폭 방법에 의해 얻어진 상기 증폭물과 상기 (P2’)의 올리고뉴클레오티드가, 퍼펙트 매치인지 아닌지에 의해, 상기 검출 대상 부위의 다형이, 야생형인지 변이형인지를 확인할 수 있다.

상기 MTHFR*677용 프로브는, 상기 P1 프로브 중에서도, 서열번호 46에 나타내는 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브(P1-1)가 바람직하고, MTHFR*1298용 프로브는, 상기 P2 프로브 중에서도, 서열번호 52에 나타내는 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브(P2-1)가 바람직하다. 상기 표 4에 있어서, 상기 P1 프로브의 「Tm(℃)」은, 상기 염기(r)가 아데닌(a)인 서열과, 거기에 완전히 상보적인 서열이 하이브리드한 경우의 Tm(℃)이며, 상기 MELTCALC 소프트웨어에 의해, 상기 파라미터에 기하여 산출한 값이다. 상기 표 4에 있어서, 상기 P2 프로브의 「Tm(℃)」은, 상기 염기(k)가 구아닌(g)인 서열과, 거기에 완전히 상보적인 서열이 하이브리드한 경우의 Tm(℃)이며, 상술한 바와 같은 방법으로 산출한 값이다.

상기 P1 프로브 및 상기 P2 프로브는, 예를 들면, 상기 표 4에 나타내는 각 서열번호에 나타내는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브라도 되고, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브라도 된다.

상기 프로브는, 예를 들면, 표지 물질을 갖는 표지 프로브가 바람직하고, 예를 들면, 상기 올리고뉴클레오티드가, 상기 표지 물질로 표지(수식)되어 있는 것이 바람직하다. 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 표지 물질에 의해 표지화되는 부위는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 5’말단 영역 또는 3’말단 영역이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 5’말단 또는 3’말단이다. 후술하는 바와 같이, 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 표지 물질에 의해 표지화되는 염기는, 예를 들면, 시토신(c) 또는 구아닌(g)이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 시토신(c)이다. 상기 표지 물질은, 예를 들면, 염기를 직접 표지화해도 되고, 상기 염기를 간접적으로 표지화해도 된다. 후자의 경우, 예를 들면, 상기 염기를 포함하는 뉴클레오티드 잔기의 어느 부위를 표지함으로써, 상기 염기를 간접적으로 표지화할 수 있다.

상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드 및 (P2)의 올리고뉴클레오티드는, 3’말단 영역에, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 예를 들면, 3’말단으로부터 세어 1∼4번째의 염기의 위치에, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 3’말단으로부터 세어 1∼4번째의 염기이며, 보다 바람직하게는, 3’말단으로부터 세어 1∼3번째의 염기, 특히 바람직하게는, 3’말단으로부터 세어 2번째 또는 3’말단의 염기이다. 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 상기 염기번호 8744∼8747의 염기에 상보적인 어느 염기가, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 상기 염기번호 8744의 염기에 상보적인 염기(c)가, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하다. 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 상기 염기번호 10643∼10646의 염기에 상보적인 어느 염기가, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 상기 염기번호 10643의 염기에 상보적인 염기(c)가, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하다.

상기 (P1’)의 올리고뉴클레오티드 및 (P2’)의 올리고뉴클레오티드는, 5’말단 영역에, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 예를 들면, 5’말단으로부터 세어 1∼4번째의 염기의 위치에, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 5’말단으로부터 세어 1∼4번째의 염기이며, 보다 바람직하게는, 5’말단으로부터 세어 1∼3번째의 염기, 특히 바람직하게는, 5’말단으로부터 세어 2번째 또는 5’말단의 염기이다. 상기 (P1’)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 상기 염기번호 8744∼8747의 어느 염기에, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 상기 염기번호 8744의 염기(g)에, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하다. 상기 (P2’)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 상기 염기번호 10643∼10646의 염기의 어느 염기에, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 상기 염기번호 10643의 염기(g)에, 상기 표지 물질을 갖는 것이 바람직하다.

상기 표지 물질은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 상기 표지 프로브가 단독인지, 하이브리드를 형성하고 있는지에 따라, 시그널을 발하는 것이 바람직하다. 상기 시그널의 종류는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 형광, 정색(呈色) 등을 들 수 있다. 상기 정색은, 예를 들면, 발색이라도 되고, 변색이라도 된다. 상기 시그널이 형광의 경우, 시그널값은, 예를 들면, 형광 강도를 들 수 있다. 상기 시그널이 정색의 경우, 상기 시그널값은, 예를 들면, 반사율, 흡광도, 투과율 등을 들 수 있다. 상기 시그널은, 예를 들면, 상기 표지 물질로부터 직접 발생해도 되고, 간접적으로 발생해도 된다.

상기 표지 물질은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 형광단 등의 형광 물질 등을 들 수 있다. 상기 형광 물질은, 예를 들면, 플루오로세인, 인광체, 로더민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있다. 시판의 형광 물질은, 예를 들면, Pacific Blue(상표명, 몰레큘라 프로브사제), BODIPY FL(상표명, 몰레큘라 프로브사제), FluorePrime(상품명, 애머샴 파마시아사제), Fluoredite(상품명, 밀리포어사제), FAM(상표명, ABI사제), Cy3 및 Cy5(상품명, 애머샴 파마시아사제), TAMRA(상표명, 몰레큘라 프로브사제) 등을 들 수 있다. 상기 형광 물질의 검출 조건은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 사용하는 형광 물질의 종류에 따라 적의 결정할 수 있다. 구체예로서, Pacific Blue는, 예를 들면, 검출 파장 450∼480nm, TAMRA는, 예를 들면, 검출 파장 585∼700nm, BODIPY FL은, 예를 들면, 검출 파장 515∼555nm에서 검출할 수 있다. 이와 같은 표지 프로브를 사용하면, 예를 들면, 상기 시그널로서 형광을 검출하고, 상기 시그널값으로서 형광 강도를 측정함으로써, 형광 강도의 변동으로부터, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다.

본 발명은, 상술한 바와 같이, 예를 들면, 동일 반응계에서, MTHFR 유전자의 2개의 목적 영역을 증폭할 수 있다. 이 때문에, 상기 MTHFR*677용 프로브와 상기 MTHFR*1298용 프로브를, 동일 반응계에서 병용함으로써, MTHFR 유전자에 있어서의 MTHFR*677 및 MTHFR*1298의 다형을, 동일 반응계에 있어서 판별할 수 있다. 이 경우, 상기 각 프로브는, 각각, 다른 조건에서 검출되는 다른 표지 물질을 갖는 것이 바람직하다. 이와 같이, 다른 표지 물질을 사용함으로써, 동일 반응계라도, 예를 들면, 검출 조건을 바꿈으로써, 각 검출 대상 부위의 다형을, 별개로 해석 가능하게 된다.

2종류 이상의 프로브를 병용할 경우, 각 프로브는, 예를 들면, 상기 표지 물질로서, 다른 형광 색소, 구체적으로는, 다른 파장에서 검출되는 형광 색소를 갖는 것이 바람직하다. 상기 프로브가 구아닌 소광 프로브의 경우, 예를 들면, 상기 표 4에 나타내는 MTHFR*677용 프로브(P1 프로브) 및 MTHFR*1298용 프로브(P2 프로브)는, 예를 들면, 3’말단 영역, 바람직하게는 3’말단의 시토신(c)을, 상기 형광 색소로 표지화한다. 구체적으로는, 각각, 상기 형광 색소로서, 예를 들면, TAMRA, BODIPY FL 등의 다른 형광 색소로 표지화하는 것이 바람직하다. 상기 프로브의 5’말단을 형광 색소로 표지화했을 경우, 상기 프로브는, 예를 들면, 그 3’말단에, 인산기가 더 부가되어도 된다. 이것에 의해, 예를 들면, 상기 프로브 자체가 신장 하는 것을 방지할 수 있다.

상기 표지 프로브는, 예를 들면, 단독으로 시그널을 나타내고, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지 프로브, 또는, 단독으로 시그널을 나타내지 않고, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지 프로브가 바람직하다. 상기 표지 물질이 형광 물질의 경우, 상기 표지 프로브는, 예를 들면, 상기 형광 물질로 표지화되어, 단독으로 형광을 나타내고, 또한 하이브리드 형성에 의해 형광이 감소(예를 들면, 소광) 하는 프로브가 바람직하다. 이와 같은 현상은, 일반적으로, 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)이라고 불린다. 이 현상을 이용한 프로브는, 일반적으로, 형광 소광 프로브라고 불린다. 그 중에서도, 상기 형광 소광 프로브는, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드의 3’말단 혹은 5’말단이 상기 형광 물질로 표지화되어 있는 것이 바람직하고, 표지화되는 상기 말단의 염기는, 시토신(c) 또는 구아닌(g)이 바람직하다. 상기 말단의 염기가 시토신(c)의 경우, 상기 형광 소광 프로브는, 예를 들면, 피검 핵산과 하이브리드를 형성했을 때, 상기 피검 핵산에 있어서의, 표지화된 말단의 시토신(c)과 쌍을 이루는 염기 또는 상기 쌍을 이루는 염기로부터 1∼3염기 떨어진 염기가 구아닌(g)이 되도록, 상기 형광 소광 프로브의 염기서열을 설계하는 것이 바람직하다. 상기 쌍을 이루는 염기로부터 1염기 떨어진 염기란, 예를 들면, 상기 쌍을 이루는 염기의 이웃의 염기를 의미한다. 이와 같은 프로브는, 일반적으로 구아닌 소광 프로브라고 불리며, 소위 QProbe(등록상표)로서 알려져 있다. 상기 구아닌 소광 프로브가 상기 피검 핵산에 하이브리다이즈하면, 예를 들면, 상기 형광 물질로 표지화된 말단의 시토신(c)이, 상기 피검 핵산에 있어서의 구아닌(g)에 가까이 감으로써, 상기 형광 물질의 발광이 약해진다, 즉 형광 강도가 감소한다고 하는 현상을 나타낸다. 상기 프로브를 사용하면, 예를 들면, 형광 강도의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다. 마찬가지로, 상기 말단의 염기가 구아닌(g)의 경우, 상기 형광 소광 프로브는, 예를 들면, 상기 피검 핵산과 하이브리드를 형성했을 때, 상기 피검 핵산에 있어서의, 표지화된 말단의 구아닌(g)과 쌍을 이루는 염기 또는 상기 쌍을 이루는 염기로부터 1∼3염기 떨어진 염기가 시토신(c)이 되도록, 상기 형광 소광 프로브의 염기서열을 설계하는 것이 바람직하다.

상기 프로브는, 예를 들면, 3’말단에 인산기가 부가되어도 된다. 상술한 바와 같이, 상기 증폭 공정은, 예를 들면, 프로브의 공존 하에서 행해도 된다. 이와 같은 경우, 상기 프로브의 3’말단에 인산기를 부가시켜 두면, 상기 증폭 공정에 있어서 상기 프로브 자체가 신장하는 것을 충분히 방지할 수 있다. 또한 상기 프로브의 3’말단에, 예를 들면, 상술한 바와 같은 표지 물질을 부가함으로써도, 동일한 효과를 얻을 수 있다.

상기 측정 공정(B)의 상기 반응계에 있어서, 상기 프로브의 비율은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 1종류의 프로브에 대해서, 10∼1000nmol/L의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 20∼500nmol/L이다.

상기 프로브가, 상기 표지 물질로서 형광 물질을 갖는 표지 프로브의 경우, 예를 들면, 검출하는 형광 강도를 조정하기 위해서, 상기 표지 프로브와 같은 서열인 비표지 프로브를 병용해도 된다. 상기 비표지 프로브는, 예를 들면, 그 3’말단에 인산이 부가되어도 된다. 상기 표지 프로브와 상기 비표지 프로브와의 몰비는, 예를 들면, 1:10∼10:1이 바람직하다. 상기 반응계에 있어서, 상기 증폭물과 상기 프로브와의 몰비는, 예를 들면, 1:10∼10:1이 바람직하다. 상기 증폭물과 상기 프로브와의 몰비는, 예를 들면, 2본쇄 핵산에 대한 몰비라도 되고, 1본쇄 핵산에 대한 몰비라도 된다.

상기 측정 공정(B)에 있어서, 상기 프로브는, 예를 들면, 상기 증폭 공정(A)에서 얻어진 증폭물을 포함하는 반응계에, 포함되어 있으면 되고, 그 첨가의 타이밍은, 특히 제한되지 않는다. 상기 측정 공정(B)에 있어서의 상기 반응계는, 예를 들면, 상기 증폭 공정(A)에서 얻어진 증폭물과 상기 프로브를 사용하여, 새롭게 조제해도 되고, 상기 증폭 공정(A)에 있어서의 상기 증폭 반응의 반응계라도 된다. 후자의 경우, 상기 프로브는, 예를 들면, 상기 증폭 공정(A) 전 또는 도중에, 상기 증폭 반응의 반응계에 첨가되어도 되고, 상기 증폭 공정(A)의 후, 상기 증폭 반응의 반응계에 첨가되어도 된다. 그 중에서도, 예를 들면, 상기 증폭 공정(A)에 있어서의 상기 증폭 반응의 전에, 미리, 상기 프로브를, 상기 증폭 반응의 반응계에 첨가하는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 증폭 공정(A)은, 상기 프로브의 존재 하, MTHFR 유전자를 증폭시키는 것이 바람직하다. 이에 따라 예를 들면, 상기 프로브의 첨가를 위해, 증폭 반응의 도중 또는 후에, 상기 반응계를 외부 환경에 노출할 필요가 없고, 또한 상기 증폭 반응과 시그널값의 측정을, 연속적으로 행하는 것이 가능하다.

상술한 바와 같이, 상기 측정 공정(B)의 상기 반응계는, 예를 들면, 상기 증폭 공정(A)의 상기 반응계를 사용할 수 있다. 상기 증폭 공정(A)의 상기 반응계에 있어서, 상기 시료의 비율은, 특히 제한되지 않고, 상기 본 발명의 증폭 방법에 있어서 진술한 바와 같다. 여기에서, 상기 시료가 생체 시료이며, 상기 측정 공정(B)에 있어서, 상기 반응계로서 상기 증폭 공정(A)의 상기 반응계를 사용하고, 상기 프로브의 존재 하, 광학적으로 시그널의 검출을 행할 경우, 상기 증폭 공정(A)의 상기 반응계에 있어서의 시료의 비율은, 예를 들면, 0.1∼0.5체적%로 설정 하는 것이 바람직하다. 상기 생체 시료가, 예를 들면, 전혈 시료의 경우, 상기 반응계에 있어서의 시료의 비율은, 예를 들면, 0.1∼0.5체적%이 바람직하다. PCR 등의 증폭 반응에서는, 보통, DNA 변성, 즉 1본쇄 DNA에의 해리를 위해, 시료에 열처리가 실시된다. 그러나, 이 열처리에 의해, 상기 시료에 포함되는 당 및 단백질 등이 변성하여, 불용화의 침전물 및 탁함 등이 발생하는 우려가 있다. 이 때문에, 상술한 바와 같이 시그널을 검출할 경우, 상기 침전물 및 탁함 등의 발생이, 측정정밀도에 영향을 미칠 가능성이 있다. 이에 대하여 상기 증폭 공정(A)의 상기 반응계에 있어서의 상기 시료의 비율을, 예를 들면, 상술한 범위로 설정하면, 메커니즘은 불분명하지만, 변성에 의한 침전물 등의 발생에 의한 영향을 충분히 방지할 수 있고, 광학적 수법에 의한 측정 정밀도의 저하를 방지할 수 있다. 또한 상술한 범위로 설정하면, 예를 들면, 상기 시료 중의 협잡물에 의한 증폭 반응의 저해도 충분히 억제할 수 있어, 증폭 효율의 저하 방지를 더한층 향상할 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 프라이머 또는 프라이머 세트의 사용에 더해서, 또한, 상기 반응계에 있어서의 상기 시료의 비율을 상술한 범위로 설정함으로써 더한층, 시료의 전처리의 필요성을 배제할 수 있다.

상기 시료가 전혈 시료의 경우, 상기 반응계에 있어서의 전혈 시료의 비율은, 상술한 바와 같은 체적 비율, 예를 들면, 0.1∼0.5체적%가 아니라, 예를 들면, 헤모글로빈(이하, 「Hb」라고 한다)의 중량 비율로 나타낼 수도 있다. 상기 반응계에 있어서의 전혈 시료의 비율은, Hb량으로 환산하여, 예를 들면, 0.565∼113g/L의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 2.825∼56.5g/L의 범위, 더 바람직하게는, 5.65∼28.25g/L의 범위이다. 상기 반응계에 있어서의 전혈 시료의 비율은, 예를 들면, 상기 체적 비율과 상기 Hb 중량 비율의 양쪽을 만족시켜도 되고, 어느 한쪽을 만족시켜도 된다.

본 발명의 다형 검출 방법은, 상술한 바와 같은, 소위 Tm 해석에 이용할 수 있다. Tm 해석에 있어서의 Tm값에 관하여 설명한다. 예를 들면, 2본쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열해 가면, 260nm에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이것은, 2본쇄 DNA에 있어서의 양쇄 간의 수소결합이 가열에 의해 풀어져, 1본쇄 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 2본쇄 DNA가 해리해서 1본쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는, 가열 개시 시의 흡광도(2본쇄 DNA만의 흡광도)의 약1.5배 정도를 나타낸다. 이것에 의해, 융해가 완료했다고 판단할 수 있다. 이 현상에 근거하여, 융해 온도(Tm)란, 일반적으로, 흡광도가, 흡광도 전상승분의 50%에 달했을 때의 온도로 정의된다.

상기 측정 공정(B)에 있어서, 상기 증폭물과 상기 프로브와의 하이브리드의 융해 상태를 나타내는 시그널의 측정은, 예를 들면, 상술한, 260nm에 있어서의 흡광도 측정이라도 되고, 상기 표지 물질의 시그널 측정이라도 된다. 구체적으로는, 상기 프로브로서, 상술한 바와 같이, 상기 표지 물질로 표지화된 표지 프로브를 사용하여, 상기 표지 물질의 시그널 측정을 행하는 것이 바람직하다. 상기 표지 프로브는, 예를 들면, 단독으로 시그널을 나타내고, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지 프로브, 또는, 단독으로 시그널을 나타내지 않고, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지 프로브를 들 수 있다. 전자와 같은 프로브이면, 상기 증폭물과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하고 있는 때는 시그널을 나타내지 않고, 가열에 의해 상기 증폭물로부터 상기 프로브가 해리하면 시그널을 나타낸다. 또한 후자의 프로브이면, 상기 증폭물과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성함으로써 시그널을 나타내고, 가열에 의해 상기 증폭물로부터 상기 프로브가 유리하면 시그널이 감소(또는 소실)한다. 따라서, 상기 표지 물질의 시그널의 검출에 의해, 상기 260nm에 있어서의 흡광도 측정과 마찬가지로, 하이브리드의 융해의 진행의 검출, Tm값의 결정 등을 행할 수 있다. 상기 표지 물질의 시그널 검출은, 예를 들면, 상기 표지 물질의 시그널에 특유한 조건으로 검출하면 된다. 상기 검출 조건은, 예를 들면, 여기 파장, 검출 파장 등을 들 수 있다. 상기 표지 프로브 및 상기 표지 물질은, 상술한 바와 같다.

상기 (D)공정 또는 상기 (C)공정에 있어서, 시그널값의 변동으로부터의 상기 다형의 검출은, 종래의 방법에 의해 행할 수 있다. 구체예로서는, 예를 들면, 상기 시그널값의 변동을, 상기 다형 검출용 프로브와 변이형인 검출 대상 서열과의 하이브리드의 변동 및/또는 상기 다형 검출용 프로브와 야생형인 검출 대상 서열과의 하이브리드의 변동과 비교하여, 다형이 변이형인지 야생형인지를 판단할 수 있다. 즉, 변이형과 같으면 변이형, 야생형과 같으면 야생형이라고 판단할 수 있다. 또한 예를 들면, 상기 시그널의 변동으로부터 Tm값을 구하고, 평가 기준의 Tm값과의 비교에 의해, 다형을 판단할 수 있다. 우선, 상기 시그널값의 변동으로부터, Tm값을 구한다. 다음에, 측정한 상기 Tm값을, 미리 구한, 야생형의 검출 대상 서열에 관한 Tm_wt값 및/또는 변이형의 검출 대상 서열에 관한 Tm_mt값과 비교한다. 그리고, 측정한 Tm값이, 평가 기준의 Tm_wt값과 같은 또는 같은 정도이면 야생형, Tm_wt값보다도 낮으면 변이형, 평가 기준의 Tm_mt값과 같은 또는 같은 정도이면 변이형, Tm_mt값보다도 낮으면 야생형이라고 판단할 수 있다.

다음에, 본 발명의 다형의 검출 방법에 대해서, 일례를 들어서 설명한다. 본 예는, 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트로서, 상기 프라이머 세트(1) 및 상기 프라이머 세트(2)를 포함하는 프라이머 세트를 사용하고, 상기 프로브로서, 형광 물질로 표지된 2종류의 하기 프로브를 사용하는 예이다. 본 예에서는, 상기 프라이머 세트를 사용한 PCR에 의해, 하나의 반응액 중에서, MTHFR 유전자의 2개의 목적 영역을 동시에 증폭시키고, 또한, 상기 프로브를 사용하여, MTHFR 유전자에 있어서의 2개의 다형 MTHFR*677 및 MTHFR*1298을 검출한다. 하기 MTHFR*677용 프로브는, 서열번호 46에 나타내는 염기서열로 이루어지고, 염기(r)가 아데닌(a)이며, 3’말단을 형광 색소 TAMRA로 표지화한 프로브이다. 하기 MTHFR*1298용 프로브는, 서열번호 52에 나타내는 염기서열로 이루어지고, 염기(k)가 구아닌(g)이며, 3’말단을 형광 색소 BODIPY FL로 표지화한 프로브이다. 본 발명은, 이들에 제한되지 않는다.

(프로브)

MTHFR*677용 프로브

5'-gtgatgatgaaatcgActc-(TAMRA)-3'(서열번호 55)

MTHFR*1298용 프로브

5'-aagacacttGcttcac-(BODIPYFL)-3'(서열번호 56)

우선, PCR의 반응액을 조제하여, 상술한 바와 같이 PCR를 행하여, 동일 반응액 중에서, MTHFR 유전자의 2개의 목적 영역을 동시에 증폭시킨다. 상기 반응액은, 예를 들면, 상기 프라이머 세트(1), 프라이머 세트(2) 및 시료를 포함하고, 또한, 상기 증폭 반응에 사용가능한 타 성분을 적의 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에 의하면, 상술한 바와 같이, 예를 들면, 전혈 등의 협잡물이 포함되는 시료라도, 전처리를 행하지 않고, 상기 시료를 그대로 사용가능하다.

상기 반응액은, 예를 들면, 상술한 바와 같이, 또한, 상기 프로브를 포함해도 된다. 이 경우, 예를 들면, 상기 프로브의 존재 하, 상기 MTHFR 유전자의 증폭을 행해도 된다.

다음에, 얻어진 증폭물(2본쇄 DNA)의 1본쇄 DNA에의 해리, 및, 해리에 의해 얻어진 상기 1본쇄 DNA와 상기 표지 프로브와의 하이브리다이즈를 행한다. 이것은, 예를 들면, 상기 표지 프로브의 존재 하, 상기 반응액의 온도를 변화시킴으로써 행할 수 있다. 이 경우, 상술한 바와 같이, 미리 상기 표지 프로브를 첨가한 상기 반응액에 대해서, 증폭 반응을 행한 후, 상기 반응액을 온도 변화시키는 것이 바람직하다.

상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도는, 예를 들면, 2본쇄의 상기 증폭물을 1본쇄로 해리할 수 있는 온도를 들 수 있다. 상기 가열 온도는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 85∼95℃이다. 가열 시간은, 특히 제한되지 않고, 보통, 1초∼10분이며, 바람직하게는, 1초∼5분이다.

해리한 1본쇄 DNA와 상기 표지 프로브와의 하이브리다이즈는, 예를 들면, 상기 해리 공정의 후, 상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도를 강하시킴으로써 행할 수 있다. 온도조건은, 예를 들면, 40∼50℃이다. 상기 온도에서의 처리 시간은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 1∼600초이다.

그리고, 상기 반응액의 온도를 변화시켜, 상기 증폭물과 상기 표지 프로브와의 하이브리드의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정한다. 구체적으로는, 예를 들면, 상기 반응액을 가열하고, 즉, 상기 1본쇄 DNA와 상기 표지 프로브와의 하이브리드를 가열하고, 온도 상승에 따르는 시그널값의 변동을 측정한다. 상술한 바와 같이, 구아닌 소광 프로브, 즉, 말단의 시토신(c)이 표지화된 프로브를 사용했을 경우, 1본쇄 DNA와 하이브리다이즈한 상태에서는, 형광이 감소(또는 소광) 하고, 해리한 상태에서는, 형광을 발한다. 따라서, 예를 들면, 형광이 감소(또는 소광)하고 있는 하이브리드를 서서히 가열하고, 온도 상승에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

상기 형광 강도의 변동을 측정할 때, 그 온도범위는, 특히 제한되지 않는다. 상기 시작 온도는, 예를 들면, 실온∼85℃이며, 바람직하게는, 25∼70℃이며, 종료 온도는, 예를 들면, 40∼105℃이다. 온도의 상승 속도는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 0.1∼20℃/초이며, 바람직하게는, 0.3∼5℃/초이다.

다음에, 상기 시그널값의 변동을 해석해서 Tm값을 결정한다. 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터, 각 온도에 있어서의 단위 시간 당의 형광강도변화량(-d형광강도변화량/dt 또는 d형광강도변화량/dt)을 산출하고, 가장 변화한 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수 있다. 상기 표지 프로브가 상기 형광 소광 프로브의 경우, 예를 들면, 형광 강도의 증가량을 측정하고, 단위 시간 당의 형광강도증가량(-d형광강도증가량/dt)이 가장 낮은 값을 나타내는 온도, 또는, 단위 시간 당의 형광강도증가량(d형광강도증가량/dt)이 가장 높은 값을 나타내는 온도를, Tm값으로서 결정할 수도 있다. 한편, 상기 표지 프로브로서, 상기 형광 소광 프로브가 아니라, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 프로브를 사용한 경우에는, 반대로, 형광 강도의 감소량을 측정하면 된다.

상기 표지 프로브로서, 예를 들면, 검출 파장이 다른 표지 물질을 표지한 복수의 프로브를 사용했을 경우, 상기 검출 파장마다, 상기 시그널값의 변동을 해석해도 된다.

상기 Tm값은, 예를 들면, 종래 공지의 MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/) 등에 의해 산출할 수 있고, 또한 최근접염기쌍법(Nearest Neighbor Method)에 의해 결정할 수도 있다.

본 예에 있어서는, 2개의 다형 MTHFR*677 및 MTHFR*1298을 검출하기 위해서, 상기 2종류의 프로브의 각 표지 물질에 따른 조건에서, 시그널값의 측정을 행한다. 그리고, 상기 각 프로브의 시그널에 대해서, 각각의 Tm값을 결정한다. MTHFR*677용 프로브의 TAMRA는, 검출 파장 585∼700nm, MTHFR*1298용 프로브의 BODIPY FL은, 검출 파장 515∼555nm에서, 각각 검출할 수 있다.

그리고, 이들의 Tm값으로부터, 각 검출 대상 부위에 있어서의 유전자형을 결정한다. 즉, 서열번호 1의 염기서열에 있어서의 염기번호 8747및 염기번호 10649의 염기가, 상기 야생형인지, 상기 변이형인지를 결정한다. Tm 해석에서는, 예를 들면, 완전히 상보인 하이브리드(매치)는, 1염기 이상이 다른 하이브리드(미스매치)보다도, 해리를 나타내는 Tm값이 높아진다고 하는 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 미리, 상기 프로브에 대해서, 완전히 상보인 하이브리드의 Tm값과, 1염기가 다른 하이브리드의 Tm값을 결정해 둠으로써, 상기 검출 대상 부위에 있어서의 다형을 결정할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 이하와 같이 결정할 수 있다. 상기 검출 대상 부위의 염기를 변이형, 예를 들면, 서열번호 1에 있어서의 염기번호 8747의 염기가 티민(t)이라 가정하고, 그것을 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 사용했을 경우, 형성한 하이브리드의 Tm값이, 완전히 상보적인 하이브리드의 Tm값과 같으면, 상기 증폭물의 다형은, 변이형의 호모 접합체라고 판단할 수 있다. 또한 형성한 하이브리드의 Tm값이, 1염기 다른 하이브리드의 Tm값과 같으면(완전히 상보적인 하이브리드의 Tm값보다 낮은 값이면), 상기 증폭물의 다형은, 야생형의 호모 접합체, 예를 들면, 서열번호 1에 있어서의 염기번호 8747의 염기가 시토신(c)의 호모 접합체라고 판단할 수 있다. 또한, 양쪽의 Tm값이 검출되었을 경우에는, 헤테로 접합체로 결정할 수 있다. 이와 같이 하여, 상기 각 프로브에 대한 2개의 Tm값으로부터, 다형 MTHFR*677 및 MTHFR*1298의 유전자형을 판단할 수 있다.

이와 같이 시그널값의 변동으로부터 MTHFR 유전자의 다형을 검출할 수 있으므로, 마찬가지로, 상기 다형을 포함하는 상기 목적 영역이 증폭되어 있을 것인지 아닌지도, 검출할 수 있다. 이 때문에, 상기 (D)공정과 같은 방법으로, 상술한 본 발명의 증폭물 검출 방법의 상기 (C)공정을 행함으로써 상기 증폭물의 검출을 행할 수 있다.

본 발명은, 상술한 바와 같이, 상기 프로브를 포함하는 반응계의 온도를 상승시키고, 즉, 하이브리드를 가열하고, 온도 상승에 따르는 시그널 변동을 측정하는 방법 대신에, 예를 들면, 하이브리드 형성시에 있어서의 시그널 변동의 측정을 행해도 된다. 즉, 상기 프로브를 포함하는 반응계의 온도를 강하시켜서 하이브리드를 형성할 때에, 예를 들면, 상기 온도 강하에 따르는 시그널 변동을 측정해도 된다.

구체예로서, 단독으로 시그널을 나타내고, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지 프로브(예를 들면, 구아닌 소광 프로브)를 사용했을 경우를 예로 든다. 이 경우, 상기 표지 프로브는, 1본쇄 DNA와 상기 표지 프로브가 해리하고 있는 상태에서는 형광을 발하고 있지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면, 상기 반응계의 온도를 서서히 강하시켜서, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 감소를 측정하면 된다. 한편, 단독으로 시그널을 나타내지 않고, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지 프로브를 사용했을 경우, 상기 1본쇄 DNA와 상기 표지 프로브가 해리하고 있는 상태에서는 형광을 발하지 않고 있지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 형광을 발하게 된다. 따라서, 예를 들면, 상기 반응계의 온도를 서서히 강하시켜서, 온도하강에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

본 발명에 있어서, MTHFR 유전자의 2종류의 다형 MTHFR*677 및 MTHFR*1298 중 1종류의 다형을 해석하는 경우에는, 예를 들면, 상기 프라이머 세트(1) 및 상기 프라이머 세트(2) 중 목적 영역에 대응하는 1종류의 프라이머 세트를 포함하는, 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트를 사용하고, 또한, 목적의 검출 대상 부위에 하이브리다이즈하는 1종류의 프로브를 사용하면 된다.

본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 시약은, 상술한 바와 같이, 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 또는 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, MTHFR 유전자의 증폭용 시약이다. 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 시약은, 상기 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 것이 특징이며, 이것 이외의 조성 등에 대해서는 하등 제한되지 않는다.

본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 시약은, 예를 들면, 상기 프라이머 세트(1) 및 상기 프라이머 세트(2)의 어느 한쪽을 포함하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 양쪽을 포함한다.

본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 시약은, 예를 들면, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하는 증폭 방법에 의해 얻어지는 증폭물을 검출하기 위해서, MTHFR 유전자의 증폭물 에 하이브리다이즈 가능한 프로브를 더 포함하는 것이 바람직하다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트에 의하면, 예를 들면, 그것에 포함되는 상기 프라이머 세트(1) 및 상기 프라이머 세트(2)의 종류에 따라, MTHFR 유전자에 있어서의 1개 또는 2개의 목적 영역의 증폭물을 얻을 수 있다. 이 때문에, 상기 프로브에 의해, 예를 들면, 증폭의 유무 및 검출 대상 부위의 다형 등을, 상술한 방법에 의해 검출 가능하다. 상기 프로브는, 상술한 바와 같다. 상기 프로브는, 예를 들면, 상기 P1 프로브 및 상기 P2 프로브의 적어도 한쪽을 포함하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 양쪽을 포함한다.

본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 시약은, 예를 들면, 전혈 등의 생체 시료에 있어서의 MTHFR 유전자를 증폭시킬 때에 사용 하는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 시약을, 예를 들면, 상기 프로브와 함께 사용하는 때는, 증폭 반응의 반응계에 있어서의 전혈 시료의 비율을 0.1∼0.5체적%으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 시약은, 이것 외에도, 예를 들면, 핵산의 증폭 반응에 필요한 성분을 포함해도 된다. 구체예로서는, 예를 들면, 상술한 바와 같은, DNA 중합효소 등의 중합효소, 뉴클레오티드 3인산, 완충액, 각종 촉매 등을 들 수 있다. 본 발명의 다형 검출용 시약에 있어서, 각 성분은, 예를 들면, 동일한 용기에 수용되어도 되고, 다른 용기에 수용되어도 된다.

본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 시약의 형태는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트를 함유하는 액체 시약이라도 되고, 사용전에 용매에서 현탁하는 건조 시약이라도 된다. 또한 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트의 함유량도, 특히 제한되지 않는다.

본 발명의 증폭용 시약은, 예를 들면, MTHFR 유전자의 증폭에 사용하는 키트라고도 할 수 있다. 본 발명의 증폭용 키트에 있어서, 각 성분은, 예를 들면, 동일한 용기에 수용되어도 되고, 다른 용기에 수용되어도 된다. 본 발명의 증폭용 키트는, 또한, 사용 설명서를 포함해도 된다.

<증폭물 검출용 시약 및 다형 검출용 시약>

본 발명의 증폭물 검출용 시약은, 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, MTHFR 유전자의 증폭물의 검출용 시약이다. 또한 본 발명의 다형 검출용 시약은, 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, MTHFR 유전자의 다형의 검출용 시약이다. 본 발명에 있어서는, 상기 본 발명의 MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 것이 특징이며, 그 밖의 구성 및 조건은 하등 제한되지 않는다. 본 발명의 증폭물 검출용 시약 및 다형 검출용 시약은, 특히 나타내지 않는 한, 상기 MTHFR 유전자 증폭용 시약과 같다.

본 발명의 다형 검출용 프로브는, 상술한 바와 같으며, 상기 (P1) 및 (P2)의 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 다형 검출 방법은, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 사용하여, MTHFR 유전자의 다형을 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, MTHFR 유전자의 다형 검출 방법이다. 본 발명의 프로브 및 이것을 사용한 각종 방법은, 상술한 기재를 참조할 수 있다.

다음에, 본 발명의 실시예에 관하여 설명한다. 본 발명은, 하기 실시예에 의해 제한되지 않는다. 하기 실시예에 있어서, 특히 나타내지 않는 한, %는, w/v%을 나타낸다.

[실시예]

[실시예1]

본 예에서는, 시료로서, 전처리를 하지 않은 전혈 시료를 사용하여, MTHFR 유전자의 증폭을 행하고, 다형을 해석했다.

피험자 3명에게서, 헤파린 리튬 채혈관을 사용하여, 전혈을 채취했다. 각각, 샘플 1, 2, 3으로 했다. 하기 조성의 희석액 1의 70㎕에, 상기 전혈 10㎕를 첨가해서 혼합하고, 이 혼합액 10㎕를, 하기 조성의 희석액 2의 70㎕에 첨가하여, 희석 시료를 조제했다. 뚜껑 부착 튜브에 상기 희석 시료 17㎕를 넣고, 뚜껑을 연 상태에서, 95℃에서 10분간 가열하여, 상기 희석 시료를 약 4㎕에까지 농축했다. 상기 농축 시료에 하기 표 5에 나타내는 반응 시약 46㎕를 첨가하여, PCR 반응액으로 했다. 상기 PCR 반응액에 대해서, 써멀 사이클러를 사용하여 PCR를 행했다. PCR의 조건은, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃ 1초 및 66℃ 15초를 1사이클로 하여 50사이클 반복, 또한 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리했다. 그리고, 계속하여, 온도의 상승 속도를 1℃/3초로 하여, 상기 PCR 반응액을 40℃에서부터 75℃로 가열해 가며, 경시적인 형광 강도의 변화를 측정하여, Tm 해석을 행했다. 측정 파장은, 515∼555nm(형광 색소 BODIPY FL의 검출) 및 585∼700nm(형광 색소 TAMRA의 검출)으로 했다.

(희석액 1)

농도 성분

10mmol/L Tris-HCl(pH8)

0.1mmmol/L EDTA

0.05% NaN₃

0.3% SDS

(희석액 2)

농도 성분

10mmol/L Tris-HCl(pH8)

0.1mmmol/L EDTA

0.05% NaN₃

(프로브)

MTHFR*677용 프로브

5'-gtgatgatgaaatcgActc-(TAMRA)-3'(서열번호 55)

MTHFR*1298용 프로브

5'-aagacacttGcttcac-(BODIPY FL)-3'(서열번호 56)

(프라이머 세트)

MTHFR*677 F1 프라이머

5'-cagggagctttgaggctgacctg-3'(서열번호 7)

MTHFR*677 R1 프라이머

5'-gatggggcaagtgatgcccatg-3'(서열번호 15)

MTHFR*1298 F2 프라이머

5'-gctgaaggactactacctcttctacctgaag-3'(서열번호 25)

MTHFR*1298 R2 프라이머

5'-gcatcactcactttgtgaccattccgg-3'(서열번호 38)

Tm 해석에 있어서, 형성되는 하이브리드가 퍼펙트 매치의 경우, 평가 기준이 되는 Tm은, 이하와 같다. MTHFR*677용 프로브와 퍼펙트 매치하는 하이브리드의 Tm값은 62.5℃, MTHFR*677용 프로브와 미스매치하는 하이브리드의 Tm값은 56℃, MTHFR*1298용 프로브와 퍼펙트 매치하는 하이브리드의 Tm값은 57℃, MTHFR*1298용 프로브와 미스매치하는 하이브리드의 Tm값은 47℃이다.

이들의 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1은, 온도 상승에 따르는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프다. 도 1에 있어서, 세로축은, 각 온도에 있어서의 형광 강도의 변화(이하, 「형광강도변화량 」이라고도 한다)를 나타낸다. 세로축의 단위는, 미분치 「d형광강도증가량/dt」이며, 「dF/dt」라고 나타낸다. 도 1에 있어서, 가로축은, 측정시의 온도(℃)를 나타낸다.

도 1에 나타내는 시그널의 피크로부터, 각 샘플에 있어서의 MTHFR*677 및 MTHFR*1298의 유전자형을 결정했다. 그 결과, 샘플 1은, MTHFR*677의 유전자형이, 변이형의 호모 접합체 677(T/T)이며, MTHFR*1298의 유전자형이, 야생형의 호모 접합체 1298(A/A)이었다. 샘플 2는, MTHFR*677의 유전자형이, 야생형과 변이형과의 헤테로 접합체 677(C/T)이며, MTHFR*1298의 유전자형이, 야생형과 변이형과의 헤테로 접합체 1298(A/C)이었다. 샘플 3은, MTHFR*677의 유전자형이, 야생형의 호모 접합체 677(C/C)이며, MTHFR*1298의 유전자형이, 야생형의 호모 접합체 1298(A/A)이었다.

상기 실시예 1의 결과를 뒷받침하기 위해서, 상기 샘플 1, 2 및 3에 대해서, 종래법의 RFLP법에 의해, MTHFR*677 및 MTHFR*1298의 유전자형을 확인했다. 종래법의 RFLP법에 의한 상기 각 샘플의 유전자 타입은, 실시예 1과 같은 결과였다.

이와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 사용함으로써, 전처리를 하지 않은 전혈 시료를 사용하여, MTHFR 유전자의 2개의 영역을 동일 반응액 중에서 동시에 증폭하고, 또한, 상기 동일 반응액을 사용하여 2종류의 다형을 해석하여, 접합체형을 판정할 수 있었다.

[실시예 2]

본 예에서는, 시료로서, 정제 핵산을 사용하여, MTHFR 유전자의 증폭을 행하고, 다형을 해석했다.

상기 실시예 1에 있어서의 상기 농축 시약 4㎕ 대신에, 정제한 인간 게놈 4㎕를 사용했다. 그리고, 상기 인간 게놈에 상기 가열 처리를 행하지 않고, 상기 표 5에 나타내는 반응 시약 46㎕를 첨가한 이외는, 상기 실시예 1과 같은 방법으로 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다. 상기 정제 인간 게놈은, 상기 실시예 1의 샘플 1, 2 및 3의 전혈로부터, 조제했다. 구체적으로는, GFX genomic Blood DNA Purification Kit(GE 헬쓰케어 바이오사이언스사제)를 사용하여, 상기 키트 첨부의 게놈 DNA 추출 프로토콜을 따라, 상기 전혈를 정제하여, 상기 정제 인간 게놈을 조제했다.

Tm 해석에 있어서, 형성되는 하이브리드가 퍼펙트 매치의 경우, 평가 기준이 되는 Tm은, 상술한 바와 같다. 즉, MTHFR*677용 프로브와 퍼펙트 매치하는 하이브리드의 Tm값은 62.5℃, MTHFR*677용 프로브와 미스매치하는 하이브리드의 Tm값은 56℃, MTHFR*1298용 프로브와 퍼펙트 매치하는 하이브리드의 Tm값은 57℃, MTHFR*1298용 프로브와 미스매치하는 하이브리드의 Tm값은 47℃이다.

이들의 결과를 도 2에 나타낸다. 동 도면은, 온도 상승에 따르는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프다. 도 2에 있어서, 세로축은, 각 온도에 있어서의 형광 강도의 변화(이하, 「형광강도변화량 」이라고도 한다)를 나타낸다. 세로축의 단위는, 미분값 「d형광강도증가량/dt」이며, 「dF/dt」로 나타낸다. 도 2에 있어서, 가로축은, 측정시의 온도(℃)를 나타낸다.

도 2에 나타내는 시그널의 피크로부터, 각 샘플에 있어서의 MTHFR*677 및 MTHFR*1298의 유전자형을 결정했다. 그 결과, 샘플 1은, MTHFR*677의 유전자형이, 야생형의 호모 접합체 677(C/C)이며, MTHFR*1298의 유전자형이, 변이형의 호모 접합체 1298(C/C)이었다. 샘플 2는, MTHFR*677의 유전자형이, 변이형의 호모 접합체 677(T/T)이며, MTHFR*1298의 유전자형이, 야생형의 호모 접합체 1298(A/A)이었다. 샘플 3은, MTHFR*677의 유전자형이, 야생형과 변이형과의 헤테로 접합체 677(C/T)이며, MTHFR*1298의 유전자형이, 야생형과 변이형과의 헤테로 접합체 1298(A/C)이었다.

상기 실시예 2의 결과를 뒷받침하기 위해서, 상기 샘플 1, 2 및 3에 대해서, 종래법의 RFLP법에 의해, MTHFR*677 및 MTHFR*1298의 유전자형을 확인했다. 종래법의 RFLP법에 의한 각 샘플의 유전자 타입은, 실시예와 같은 결과이었다.

이와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 사용함으로써, MTHFR 유전자의 2개의 영역을 동일 반응액 중에서 동시에 증폭하고, 또한, 상기 동일 반응액을 사용하여 2종류의 다형을 해석하여, 접합체형을 판정할 수 있었다.

[산업상 이용가능성]

이상과 같이, 본 발명의 프라이머 및 프라이머 세트에 의하면, MTHFR 유전자에 있어서의 검출 대상 부위(예를 들면, MTHFR*677 또는 MTHFR*1298)를 포함하는 목적의 영역을, 특이적으로 증폭할 수 있다. 따라서, 본 발명의 프라이머, 프라이머 세트, 이것을 포함하는 시약, 및 이들을 사용한 증폭 방법 및 다형 검출 방법에 의하면, MTHFR 유전자의 다형을 신속 또한 간편하게 해석할 수 있으므로, 의료 분야에 있어서 대단히 유효하다고 할 수 있다.

이상, 실시형태 및 실시예를 참조하여, 본 발명을 설명했지만, 본 발명은, 상기 발명의 범위 내에서 당업자가 이해할 수 있는 여러 가지 변경을 할 수 있다.

이 출원은, 2009년 11월 19일에 출원된 일본출원 특원 2009-264052을 기초로 하는 우선권을 주장하고, 그 개시된 모두를 여기에 도입한다.

SEQUENCE LISTING <110> Arkray Inc. <120> PRIMER SET FOR AMPLIFICATION OF MTHFR GENE, MTHFR GENE AMPLIFICATION REAGENT COMPRISING SAME, AND USE OF SAME <130> TF10044-00WO <150> JP 2009-264052 <151> 2009-11-19 <160> 56 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 15835 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aatcagaggg tttacaggtg gttcagcttc ctcctactct aggttctgtt ccagcaagca 60 attaacgagg tgcgccctta aacgctggag gaaagccaac tggctgctct tgctgttact 120 cctccccccc gcccccgttc ctcactcccc acagccatcc ccactgagaa tctggagttt 180 gaggtcagaa tgaaagagag cagccctaga gggagaaagc tttggcccag ggttcttagt 240 ctggaatcaa ctccttgtct ttggatgtat ccccgtgtag tctgtgcacc tgtgtgtgta 300 tttcagggga agggagcagt gcatttaatc agattgtcaa aagagtctaa gaccccaaat 360 ggttaggtac acagggttag tggtggacag tctgaaagaa atgaacctca cctgggcttt 420 cctctgttgt gccatgtcac cacacaccca ttcactactg tgtgtttgcc cattgctgtg 480 caagtgtttt gtttgttttt aagtgtttgt cttattttct taaccagact gccagatgac 540 cctatgccct ctgttggcct gtctgtgccc tggtggctct gattacttgt ttctgttttt 600 tgtttttgtt tttttttttg agatggagtt ttgcttttgt cgcccaggct ggagtgctat 660 ggcacaatct tggttcactg caacctctgc cttccgggtt caagcgattc tcctgcctca 720 gcctccagag tagctgggat tacaggcgcc cgccaccaaa cctggctaat ttttatattt 780 ttagtagagt cgggatttca ccatgttggc caggctggtc tcaaactcct ggcctcaggt 840 gatccaccca cctcggcctc ccaaagtgct gggattacag gtgtgttttt tgttttttta 900 agagatggag tctcgctatg ttgcccaggc tggccttgaa ctcctgggct caggcaatcc 960 ttctgcctca gccttcccag tagctgggtc actgtgatga tttgaattga attctgtgat 1020 gtgtaagaag agcagcctgc aaggcaagca cagatggggc agcttttgtt ctgagaaatt 1080 cgtgccctta ctgaacttgg gtctggctat ttttggaaca tggccagcat caagttctaa 1140 cccacaacac ggtctttttg gagtagcatg aattcaggag aaatctggct gcatagtcaa 1200 gccctcaccc cttccatcct gtgcacgaac tgtttcaagt aacagatgtt ccaggcagag 1260 ccagccagag tgagctgttc cttctctgga gggtgatctg gtatccctga acgcctgttg 1320 gcctcatctc caccaacccc tgcagtctct gcccctgagt ccccctcctt ccatccgcct 1380 ccccttacta gagcctcagc cctccctcct cgcctggaag ccttgccccc gcccccttgt 1440 gctggctgga 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ggttctagag gagatgtcaa 12360 tgtcattgtc agcttgcact ggggaggatg gaatgtgtgg ggcctctctc ccatgactcg 12420 gcctgtcaaa ccagttgctg ctgttcagaa atggcttctt cgtggagtct tccctgactg 12480 attgggagag gggtggctga tagccctcag acctgtccag actgagaaac tcacgtcccc 12540 actcccctca ccctttgctt atggacgtgc caacgccaca gttcattatt ccgcccacat 12600 ggctgccagt agtcctgata ccttaggtgt ctgcgaaagg gcgtctggca gggctggggt 12660 tggtgacagg cacctgtctc tcccacaggc ctacttagag tttttcactt cccgcgagac 12720 agcggaagca cttctgcaag tgctgaagaa gtacgagctc cgggttaatt accaccttgt 12780 caatgtgaag gtaggccagg ccccagggtt cccacagagt accaggccct tcgttgagca 12840 aacacccagc acctagcctg ggctaggcat tgtgcaagac agagagatac aggcagaact 12900 ggggccctgc tcttaaggag ctcccagcct agagtgaggg aggcagatca atgtgtgacc 12960 accagccagt gtaagtggga aaatcaagtt caggagagga tgctgtcggg tccagaggag 13020 ggatatctca cctgggaggc cagggaaggc ttctcagagg gtcatctgtg ggaatcactg 13080 aggacaaaga ggagttggcc aacaggagag aagggtattc ctgggacagg gcagaggaca 13140 ggcagaggca gtgagctgca ccatctgggg aaaccgggaa catgagcagg aggaggcggg 13200 agtgttaagc aggggccagg cccgcagaga tcatggttgt cctgctggaa tttgagtttt 13260 ccctcaatgc aagggaagcc tttctccagc agtggggtgg cttggttcct gctttatttt 13320 aggcaaatca cagtggatag tcatacggat gagagagatt ggggacggct agagccgggg 13380 aggccagtga agagacccct ggagtgaccc aagccaaaca cactcctgga ggtgggctag 13440 acaagaggga atggatcaga gagtgagcag ggggtgctca aggaggagag gggaagtggc 13500 caggacgcct ctaggttcag gcttgtgtgg ggagagatat cattcacaga tgcaggcaga 13560 ggaggccagg agcggaggca cagggagagg ggagtggagg cgcagggaga gtggaggccg 13620 ggagtggagg cgcaggcaga gggtattgag cccagacagc ctcattgagt caaggctgtc 13680 caggcagtgg gactccagtt gttcttggcc caggtcttac ccccacccca catcccctca 13740 gggtgaaaac atcaccaatg cccctgaact gcagccgaat gctgtcactt ggggcatctt 13800 ccctgggcga gagatcatcc agcccaccgt agtggatccc gtcagcttca tgttctggaa 13860 ggtaaaggag ccgggggcaa gcttgccccg cccacctgga aaaccgtggg gagggattgg 13920 gaccaagtcc caagcgtgtg ctgaaggcca cactggaccc agccttcagg gcacacccag 13980 ctctgactca cccatgtcac tgctgacgca gggtgtttat ttctgggcag gggtgggaag 14040 tgatactggc agtgggcctt gttctattcc gggaaatgtc ctgttgagca gagcccttgg 14100 agagccctgt taatcttgcc tctgtgtgtg tgtgcatgtg tgcgtgtgtg cgggggtatg 14160 tgtgtgtagg acgaggcctt tgccctgtgg attgagcggt ggggaaagct gtatgaggag 14220 gagtccccgt cccgcaccat catccagtac atccacgaca actacttcct ggtcaacctg 14280 gtggacaatg acttcccact ggacaactgc ctctggcagg tggtggaaga cacattggag 14340 cttctcaaca ggcccaccca gaatgcgaga gaaacggagg ctccatgacc ctgcgtcctg 14400 acgccctgcg ttggagccac tcctgtcccg ccttcctcct ccacagtgct gcttctcttg 14460 ggaactccac tctccttcgt gtctctccca ccccggcctc cactccccca cctgacaatg 14520 gcagctagac tggagtgagg cttccaggct cttcctggac ctgagtcggc cccacatggg 14580 aacctagtac tctctgctct agccaggagt ctgtgctctt ttggtgggga gcacttgcgt 14640 cctgcagagg accacagtgg gtggcacctc ctgagaaggc gaggagagtg gttgttgcca 14700 actaagccct cgaaccaagg cagcctccag agccagcctg ggactcccag tgaacttacc 14760 cttggagccc gtgcagtaca ggcaaaacac gcaagggcat caggcactgg tggcatcgta 14820 gaagagatgt ggcaaagtgc tgtacccttc cacctcctag aggtgggcag ctgggcccca 14880 cctacttgtg actgaagggg cacaccactg ccctgcctgc ccacttagcc gtccatggca 14940 ccagccccct ggatgggcat tgggctgaca cctaccatgc tgctttttgg cacagttgtc 15000 tattctgagc cttgagagaa aaagtgcccc ttaagggttg aaggcagtct gaacccttgt 15060 gcttggtggg gctcgtggcc ttcccctttt gcctggctgt ggaggcctga tgctgccccg 15120 ttccctgtca gaggctaaga tgagatttgc cagcacaggg gccccagatc tgcctgggcc 15180 tgtgcagcag cccagcttcc tggtgtattt ttcaggtagg cccttgtcct gccagctgcc 15240 ttcctcatcc cctcgtcctg tcccagaggt tatctgcctg gcctggctcc ccacgagtca 15300 cctgcaagcc ccagggcctg ggggcagtga ctggcaggtg cagatgggct gtttcgtgta 15360 gtggaagagc agcctgatgg ccaagggggt ggacgcaatt gtgggatgtc ctctttactc 15420 ccttcctggc ctcactggct ggggcagagg ggcagccgct aggagagact gaaagcagca 15480 gctaggactg aggagtgggt tttattgtcc ttcagagctc ttcaagctgt cccctctgtc 15540 atcactccct ggatgtgtgg ggcatggttc cttccctggg aaggctaagt tcagttctgt 15600 tttttattct atgagaacaa gtcacagctg cagctgggcc ccatgctctg ccccaagccc 15660 ccaaccccgc ggtgctccgg cggcttcctg tccactctcg gggcccttgg ggcctggctt 15720 gctccagggt cttgggctac tggcagctcc tctccttggg ctcctggctg ccaggcgttg 15780 gtgccacttc ttaaaggcct ggaaccaggg aggagaggaa atgctattgt tgtgg 15835 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 2 cgaagcaggg agctttgagg ctgacctg 28 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 3 gaagcaggga gctttgaggc tgacctg 27 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 4 aagcagggag ctttgaggct gacctg 26 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 5 agcagggagc tttgaggctg acctg 25 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 6 gcagggagct ttgaggctga cctg 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 7 cagggagctt tgaggctgac ctg 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 8 agggagcttt gaggctgacc tg 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 9 gggagctttg aggctgacct g 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 10 ggagctttga ggctgacctg 20 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 11 ggacgatggg gcaagtgatg cccatg 26 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 12 gacgatgggg caagtgatgc ccatg 25 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 13 acgatggggc aagtgatgcc catg 24 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 14 cgatggggca agtgatgccc atg 23 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 15 gatggggcaa gtgatgccca tg 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 16 atggggcaag tgatgcccat g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 17 tggggcaagt gatgcccatg 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 18 ggggcaagtg atgcccatg 19 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 19 gggcaagtga tgcccatg 18 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 20 ggggagctga aggactacta cctcttctac ctgaag 36 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 21 gggagctgaa ggactactac ctcttctacc tgaag 35 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 22 ggagctgaag gactactacc tcttctacct gaag 34 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 23 gagctgaagg actactacct cttctacctg aag 33 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 24 agctgaagga ctactacctc ttctacctga ag 32 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 25 gctgaaggac tactacctct tctacctgaa g 31 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 26 ctgaaggact actacctctt ctacctgaag 30 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 27 tgaaggacta ctacctcttc tacctgaag 29 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 28 gaaggactac tacctcttct acctgaag 28 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 29 aaggactact acctcttcta cctgaag 27 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 30 aggactacta cctcttctac ctgaag 26 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 31 cactccagca tcactcactt tgtgaccatt ccgg 34 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 32 actccagcat cactcacttt gtgaccattc cgg 33 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 33 ctccagcatc actcactttg tgaccattcc gg 32 <210> 34 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 34 tccagcatca ctcactttgt gaccattccg g 31 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 35 ccagcatcac tcactttgtg accattccgg 30 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 36 cagcatcact cactttgtga ccattccgg 29 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 37 agcatcactc actttgtgac cattccgg 28 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 38 gcatcactca ctttgtgacc attccgg 27 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 39 catcactcac tttgtgacca ttccgg 26 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 40 atcactcact ttgtgaccat tccgg 25 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 41 tcactcactt tgtgaccatt ccgg 24 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 42 cactcacttt gtgaccattc cgg 23 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 43 actcactttg tgaccattcc gg 22 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 44 gcgtgatgat gaaatcgrct c 21 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 45 cgtgatgatg aaatcgrctc 20 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 46 gtgatgatga aatcgrctc 19 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 47 tgatgatgaa atcgrctc 18 <210> 48 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 48 gatgatgaaa tcgrctc 17 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 49 tcaaagacac ttkcttcac 19 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 50 caaagacact tkcttcac 18 <210> 51 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 51 aaagacactt kcttcac 17 <210> 52 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 52 aagacacttk cttcac 16 <210> 53 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 53 agacacttkc ttcac 15 <210> 54 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 54 gacacttkct tcac 14 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 55 gtgatgatga aatcgactc 19 <210> 56 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 56 aagacacttg cttcac 16

Claims

하기 (P1)의 올리고뉴클레오티드, 및 (P2)의 올리고뉴클레오티드의 적어도 한쪽의 표지 물질을 갖는 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브인 것을 특징으로 하는, MTHFR 유전자에 하이브리다이즈 가능한 다형 검출용 프로브.
(P1) 서열번호 46에 나타내는 염기서열로 이루어지고, 3' 말단이 표지화되어 있는 올리고뉴클레오티드
(P2) 서열번호 52에 나타내는 염기서열로 이루어지고, 3' 말단이 표지화되어 있는 올리고뉴클레오티드
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제1항 기재의 MTHFR 유전자에 하이브리다이즈 가능한 다형 검출용 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 시약.
제5항에 있어서,
상기 다형 검출용 프로브로서, 상기 (P1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브 및 상기 (P2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브를 포함하는, 다형 검출용 시약.
제5항 또는 제6항에 있어서,
MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트로서, 하기 프라이머 세트(1) 및 하기 프라이머 세트(2)의 적어도 한쪽을 더 포함하는, 다형 검출용 시약.
프라이머 세트(1)
하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 및 하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머의 적어도 한쪽을 포함하는 프라이머 세트
(F1) 염기 길이가 20∼28 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 8715의 구아닌(g)을 3’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
(R1) 염기 길이가 18∼26 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 8817의 시토신(c)을 5’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드
프라이머 세트(2)
하기 (F2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 및 하기 (R2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머의 적어도 한쪽을 포함하는 프라이머 세트
(F2) 염기 길이가 26∼36 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 10590의 구아닌(g)을 3’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
(R2) 염기 길이가 22∼34 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 10695의 시토신(c)을 5’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드
제7항에 있어서,
상기 (F1), (R1), (F2) 및 (R2)의 올리고뉴클레오티드가, 각각, 하기 (F1-1), (R1-1), (F2-1) 및 (R2-1)의 올리고뉴클레오티드인, 다형 검출용 시약.
(F1-1) 서열번호 7에 나타내는 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
(R1-1) 서열번호 15에 나타내는 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
(F2-1) 서열번호 25에 나타내는 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
(R2-1) 서열번호 38에 나타내는 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
제1항 기재의 다형 검출용 프로브를 사용하여, MTHFR 유전자의 다형을 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 MTHFR 유전자의 다형 검출 방법.
제9항에 있어서,
하기 (A), (B) 및 (D)공정을 포함하는, 다형 검출 방법.
(A) 제1항 기재의 다형 검출용 프로브를 포함하는 반응계에 있어서, 시료 중의 핵산을 주형으로 하여, MTHFR 유전자를 증폭시키는 증폭 공정
(B) 상기 (A)공정에 있어서의 증폭물 및 상기 다형 검출용 프로브를 포함하는 반응계의 온도를 변화시켜, 상기 증폭물과 상기 다형 검출용 프로브와의 하이브리드의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하는 측정 공정
(D) 상기 온도 변화에 따르는 상기 시그널값의 변동으로부터, 상기 검출 대상 부위의 상기 다형을 검출하는 검출 공정
제10항에 있어서,
상기 (A)공정이, MTHFR 유전자 증폭용 프라이머 세트로서 하기 프라이머 세트(1) 및 하기 프라이머 세트(2)의 적어도 한쪽을 사용하여, 상기 MTHFR 유전자를 증폭시키는 증폭 공정인, 다형 검출 방법.
프라이머 세트(1)
하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 및 하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머의 적어도 한쪽을 포함하는 프라이머 세트
(F1) 염기 길이가 20∼28 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 8715의 구아닌(g)을 3’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
(R1) 염기 길이가 18∼26 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 8817의 시토신(c)을 5’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드
프라이머 세트(2)
하기 (F2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 및 하기 (R2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머의 적어도 한쪽을 포함하는 프라이머 세트
(F2) 염기 길이가 26∼36 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 10590의 구아닌(g)을 3’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
(R2) 염기 길이가 22∼34 염기 길이이며, 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 10695의 시토신(c)을 5’말단으로 하는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드
제11항에 있어서,
상기 (F1), (R1), (F2) 및 (R2)의 올리고뉴클레오티드가, 각각, 하기 (F1-1), (R1-1), (F2-1) 및 (R2-1)의 올리고뉴클레오티드인, 다형 검출 방법.
(F1-1) 서열번호 7에 나타내는 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
(R1-1) 서열번호 15에 나타내는 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
(F2-1) 서열번호 25에 나타내는 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
(R2-1) 서열번호 38에 나타내는 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드