CN103224980A - 一种检测mthfr基因化疗药物相关snp位点的引物组及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的引物组及其方法。其中引物组包括第一引物组和第二引物组,第一引物组的的正向引物为SEQ ID NO:3所示序列,反向引物为SEQ ID NO:4所示序列;第二组引物的正向引物为SEQ ID NO:5所示序列,反向引物为SEQ ID NO:6所示序列。这本发明的有益效果在于本发明的技术方法是一种体外检测方法,对人体无害;本发明通过测序技术检测样本MTHFR基因677位点和1298位点的基因型,对拟使用化疗药物5-氟尿嘧啶或氨甲喋呤的病人进行个体化用药指导,可提高疗效,降低毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及检测基因化疗相关SNP位点引物组及方法,特别是一种检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的引物组及方法。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在,平均每500~1000个碱基对中就有1个,估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异,这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起,也可由碱基的插入或缺失所致。一般而言,SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对疾病、毒物的易感性与耐受性,疾病临床表现的多样性(clinicalphenotype diversity),以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。
亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydorfolate reductase,MTHFR)是叶酸代谢过程中的关键酶,可将5,10-二甲基四氢叶酸(5,10-MTHF)转变为5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)。5,10-MTHF是胸苷酸合成的重要原料之一,参与DNA的合成与修复;而5-MTHF是体内主要的甲基供体,参与DNA甲基化过程。MTHFR对于DNA的合成、活化及修复有着重要的调控作用。合成该酶基因中的SNP位点——677位点和1298位点的多态性会影响到酶活性,进而影响叶酸正常代谢,导致一系列的反应。所以检测MTHFR基因677位点和1298位点的多态性可作为化疗药物治疗疗效和毒副作用的良好预测指标。
MTHFR基因的多态性影响到5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)的化疗效果。5-氟尿嘧啶为嘧啶类似物,属于抗代谢药的一种,对消化道癌及其他实体瘤有良好疗效。进入体内后,它需经过酶转化为5-氟脱氧尿嘧啶核苷酸而具有抗肿瘤活性。5-氟尿嘧啶能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶,阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶核苷核,干扰DNA合成和修复。对RNA的合成也有一定的抑制作用。研究表明,MTHFR酶活性降低将造成体内5,10-MTHF的浓度升高,5-MTHF水平随之下降,进而提高5-氟尿嘧啶抗肿瘤疗效。MTHFR基因的677位T/T基因型携带者化疗有效率显著高于T/C和C/C基因型携带者,1298位A/A基因型携带者化疗有效率也明显优于于A/C和C/C基因型携带者。
MTHFR基因的多态性也与氨甲喋呤(methotrexate,MTX)药物的毒副作用存在相关性。氨甲喋呤是叶酸拮抗剂,能抑制MTHFR作用,在多种肿瘤疾病,如急性淋巴细胞白血病, 恶性淋巴瘤、头颈部癌、乳腺癌、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌等的化疗中发挥重要作用。但在治疗过程中,患者常出现不良反应,包括胃肠道反应、骨髓移植和肝功能损害等。研究发现,MTHFR基因的677位T/T基因型携带者对氨甲喋呤治疗的毒性反应比C/C的基因型携带者严重。
不同人群对于同样药物的代谢和效应存在着个体化差异,这样的差异是由人的不同基因型所决定的。对于肿瘤患者人群,采用一致的化疗治疗手段可能导致药物疗效和副作用在不同个体上差异很大。因此,如果先检测个体的基因型,再根据检测结果制定相应的个体化用药治疗方法,能够提高疗效,减轻毒副作用和患者负担。这也是当代疾病治疗的发展方向。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的引物组及方法,可测定MTHFR基因677位点和1298位点的基因型,进而为评估化疗药物5-氟尿嘧啶和氨甲喋呤对于受检者的疗效和毒副作用的依据,可用于个体化用药指导。
一种检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的引物组,包括第一引物组和第二引物组,第一引物组的的正向引物为SEQ ID NO:3所示序列,反向引物为SEQ ID NO:4所示序列;第二组引物的正向引物为SEQ ID NO:5所示序列,反向引物为SEQ ID NO:6所示序列。
检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的方法,包括:
(1)采集待检测血液样本,提取基因组DNA;
(2)对待检测样本DNA中的MTHFR基因677位点扩增,所用PCR引物为上述引物组的第一组引物;
(3)对待检测样本DNA中的MTHFR基因1298位点扩增,所用PCR引物为上述引物组的第二组引物;
(4)对PCR反应产物进行测序,分析测序结果,确定677位点和1298位点基因型。
更进一步的,上述PCR反应产物测序前进行正向测序反应扩增、纯化后变性,在正向测序扩增反应时,MTHFR基因677位点正向引物(MTHFR-677F)为SEQ ID NO:3所示序列,MTHFR基因1298位点正向引物(MTHFR-1298F)为SEQ ID NO:5所示序列。
本发明相关引物特性如下:
本发明中用于扩增MTHFR基因677位点的PCR引物,其中正向引物MTHFR-677F的3’末端位于如序列SEQ ID NO:1所示的MTHFR基因第4外显子上游约35bp处;反向引物MTHFR-677R的3’末端位于如序列SEQ ID NO:1所示的MTHFR基因第4外显子下游约18bp处。正反向引物大小分别为19bp,18bp,并能完全扩增MTHFR基因677位点所在区域。SEQID NO:1给出了MTHFR基因第4外显子的基因序列,677位点位于该外显子第79bp处。
本发明中用于扩增MTHFR基因1298位点的PCR引物,其中正向引物MTHFR-1298F的3’末端位于如序列SEQ ID NO:2所示的MTHFR基因第7外显子上游约17bp处;反向引物MTHFR-1298R的3’末端位于如序列SEQ ID NO:2所示的MTHFR基因第7外显子下游约155bp处。正反向引物大小分别为18bp,19bp,并能完全扩增MTHFR基因1298位点所在区域。SEQ ID NO:2给出了MTHFR基因第7外显子的基因序列,1298位点位于该外显子第120bp处。
本发明的特点在于,包括:
(i)本发明的技术方法是一种体外检测方法,对人体无害;
(ii)本发明通过测序技术检测样本MTHFR基因677位点和1298位点的基因型,对拟使用化疗药物5-氟尿嘧啶或氨甲喋呤的病人进行个体化用药指导,可提高疗效,降低毒副作用。
附图说明
图1本发明引物序列设计示意图。
图2检测所设计的引物组特异性的实验电泳图。如图所示,泳道A1、B1、C1、D1分别为4个DNA模板的MTHFR基因677位点经特异扩增后电泳结果;泳道A2、B2、C2、D2分别为4个DNA模板的MTHFR基因1298位点经特异扩增后电泳结果;泳道E1为MTHFR基因677位点空白对照PCR扩增后电泳结果;泳道E2为MTHFR基因1298位点空白对照PCR扩增后电泳结果;Marker代表TAKARA DL1,000DNA分子量标准。
图3样本MTHFR基因677位点和1298位点PCR扩增后的电泳图。如图所示,泳道1为样本DNA的MTHFR基因677位点PCR扩增后电泳结果;泳道2为样本DNA的MTHFR基因1298位点PCR扩增后电泳结果;泳道3为MTHFR基因677位点空白对照PCR扩增后电泳结果;泳道4为MTHFR基因1298位点空白对照PCR扩增后电泳结果;Marker代表TAKARA DL1,000DNA分子量标准。
图4样本DNA的MTHFR基因677位点PCR扩增后进行直接测序的测序结果。由图可知,677位点的基因型为T/T。
图5样本DNA的MTHFR基因1298位点PCR扩增后进行直接测序的测序结果。由图可知,1298位点的基因型为A/A。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例应仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中的未注明具体条件的实验条件和方法,通常按照所属领域实验人员常规采用的方法,例如奥斯伯等主编的《精编分子生物学实验指南(第五版)》所述的条件,或按照制造厂商建议的步骤和条件。
实验例1引物设计
一种检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的引物组,参见图1设计引物,得到如下4个特异性引物MTHFR-677F、MTHFR-677R、MTHFR-1298F和MTHFR-1298R:
引物名称 | 序列 | 序列表中的序列号 |
MTHFR-677F | 5’-tcgccttgaacaggtggag-3’ | SEQ ID NO:3 |
MTHFR-677R | 5’-ggtggagggagcttatgg-3’ | SEQ ID NO:4 |
MTHFR-1298F | 5’-gagtgtgccctgacctct-3’ | SEQ ID NO:5 |
MTHFR-1298R | 5’-tccctaagcccttccaggt-3’ | SEQ ID NO:6 |
引物按照序列表中的序列也可用常规方法合成。
实施例2引物特异性检测
将合成的MTHFR-677F、MTHFR-677R、MTHFR-1298F和MTHFR-1298R两对引物组分别用4个DNA模板进行PCR反应(10μL体系,5μM引物各0.5μL,10×PCRbuffer1μL,10mM dNTP0.4μL,5U/μL LATaq酶0.2μL,ddH2O6.4μL,模板1μL),PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测引物的特异性。引物特异性检测结果参见图2。
PCR产物条带单一且明晰可辨,表明该两对引物组能够用于后续的检测分析。
试验例3采集待检测血液样本,提取基因组DNA,其示例性步骤为:
采用上海飞捷生物技术有限公司DNA fast500小量基因组DNA极速抽提试剂盒(Catalogno.220023)提取血液样本中的基因组DNA,其示例性步骤为:
1.取一无菌的1.5mL离心管,做好标记,加入800μL的红细胞裂解液,再加入400μL的血液样本;
2.上下颠倒混匀,并静置约5min使红细胞充分裂解;
3.将离心管置于离心机内,转速6500rpm,离心1min;
4.离心完成后,倒掉离心管中的上清,留下沉淀,再加入800μL的红细胞裂解液,上下颠倒混匀;
5.将离心管置于离心机内,转速6500rpm,离心1min;
6.离心完成后,用移液器吸取离心管中的上清,尽量吸取干净,留下沉淀,再加入500μL的红细胞裂解液,上下颠倒混匀;
7.将离心管置于离心机内,转速6500rpm,离心1min;
8.离心完成后,用移液器吸取离心管中的上清,尽量吸取干净,然后用移液器将管底的白细胞沉淀吹散;
9.向离心管中加入500μL DA2溶液,上下颠倒混匀;
10.将离心管置于离心机内,转速6500rpm,离心1min;
11.取一吸附柱套入收集管中,做好标记。上一步离心完成后,将离心管内的液体全部转移至吸附柱中;
12.将吸附柱和收集管置于离心机内,转速12000rpm,离心1min;
13.离心完成后,倒掉收集管内的废液,再向吸附柱中加入350μL Wash Buffer溶液。将吸附柱重新套入收集管中;
14.将吸附柱和收集管置于离心机内,转速12000rpm,离心1min;
15.重复步骤13和14一次;
16.离心完成后,倒掉收集管内的废液,将吸附柱重新套入收集管中;
17.将吸附柱和收集管置于离心机内,转速14000rpm,离心3min,甩干吸附柱中残留的液体;
18.将吸附柱转移至一新的1.5mL离心管中,再向吸附柱中加入50μL Elute Buffer,静置2min;
19.将吸附柱和离心管置于离心机内,转速14000rpm,离心3min。离心完成后,离心管内即收集到基因组DNA溶液;
20.使用NanoDrop2000分光光度计对所提取的DNA进行定量。
实验例4MTHFR基因677位点和1298位点的PCR扩增
1、在已标记的PCR管中,按照如下要求配置扩增MTHFR基因677位点的PCR反应体系:
试剂名称 | 用量 |
Premix PrimeSTAR HS | 5μL |
ddH2O | 3μL |
MTHFR-677F引物(浓度5μM) | 0.5μL |
MTHFR-677R引物(浓度5μM) | 0.5μL |
样本DNA(浓度>20ng/μL) | 1μL |
2、在已标记的PCR管中,按照如下要求配置扩增MTHFR基因1298位点的PCR反应体系:
试剂名称 | 用量 |
Premix PrimeSTAR HS | 5μL |
ddH2O | 3μL |
[0061]
MTHFR-1298F引物(浓度5μM) | 0.5μL |
MTHFR-1298R引物(浓度5μM) | 0.5μL |
样本DNA(浓度>20ng/μL) | 1μL |
3、PCR体系配置完后,盖紧PCR管盖,振荡混匀并迅速离心,然后置于PCR仪上运行如下扩增程序:
4、PCR扩增完成后,进行琼脂糖凝胶电泳分析:
4.1制备2%琼脂糖凝胶:称量2g琼脂糖粉,溶于100mL1×TAE缓冲液中,微波炉加热煮沸使其完全溶解。然后加入6μL Golden View核酸染料,混匀后倒入凝胶板中,插入梳子,等待30min直至其凝固。
4.2凝胶完全凝固后,拔出梳子,将凝胶完全浸没入盛有1×TAE缓冲液的电泳槽中,有样品孔的一端放置在靠近阴极一侧。取4μL PCR产物混匀1μL Loading Buffer,加入到凝胶样品孔中。同时在另一样品孔中加入5μLDNA分子量标准Marker。
4.3接通电源,进行琼脂糖凝胶电泳。电泳电压150V,电泳时间15min。
4.4电泳完成后,将凝胶放入数码凝胶成像系统中进行成像并拍摄凝胶照片,保存在电脑中。判断PCR扩增成功的标准是每对引物能扩增出明亮均一、特异性好、大小位置正确的目的条带。若没有扩增出条带,或者出现明显的非特异条带,表明PCR扩增不成功,应重新进行PCR扩增。
4.5电泳结果如图3所示。泳道1中的特异条带代表MTHFR基因677位点的PCR扩增产物,长度为321bp;泳道2中的特异条带代表MTHFR基因1298位点的PCR扩增产物,长度为427bp。
实验例5PCR扩增产物的直接测序
1.PCR扩增产物酶解消化:
1.1在已标记的PCR管中,按照如下要求配置反应体系:
试剂名称 | 用量 |
ddH2O | 1.2μL |
10×SAPBuffer | 0.3μL |
SAP酶(1U/μL) | 1μL |
Exo I酶(5U/μL) | 0.5μL |
PCR扩增产物 | 5μL |
1.2反应体系配置完后,盖紧PCR管盖,振荡混匀并迅速离心,然后置于PCR仪上运行如下反应程序:
反应温度 | 反应时间 | 循环数 |
37℃ | 30min | 1 |
95℃ | 15min | 1 |
12℃ | ∞ | 1 |
1.3反应程序完成后,即得到酶解消化产物。
2.测序反应:
2.1在已标记的PCR管中,按照如下要求配置反应体系:
试剂名称 | 用量 |
ddH2O | 6μL |
5×Sequencing Buffer | 1.8μL |
BigDye v3.1 | 0.4μL |
测序引物(浓度5μM) | 1μL |
酶解消化产物 | 0.8μL |
其中,MTHFR基因677位点的测序引物为MTHFR-677F,即该位点PCR扩增使用的正向引物;MTHFR基因1298位点的测序引物为MTHFR-1298F,即该位点PCR扩增使用的正向引物。
2.2反应体系配置完后,盖紧PCR管盖,振荡混匀并迅速离心,然后置于PCR仪上运行如下反应程序:
2.3反应程序完成后,即得到测序反应产物。
3.乙醇沉淀纯化:
3.1向96孔板的相应孔中每孔加入1μL125mM EDTA溶液和1μL3M乙酸钠溶液(pH=5.2),再加入全部测序反应产物和40μL无水乙醇。
3.2盖上8联管凸盖并压紧,放置在平板振荡器上。振荡器调至7档,振荡至少5min。
3.3用架盘天平配平后,正向放置96孔板到冷冻离心机内,转速2100g,温度4℃,离心30min。
3.4离心完成后,取下8联管凸盖,取3层无尘纸,垫在至少4张吸水纸上,一起放置在96孔板上。用架盘天平配平后,倒置96孔板+无尘纸+吸水纸,转速500g,温度4℃,离心1min,甩干所有上清。
3.5取出96孔板,弃掉无尘纸和吸水纸,每孔加入100μL75%无水乙醇,盖上8联管凸盖,不要混匀,用架盘天平配平后,正向放置96孔板到冷冻离心机内,转速2100g,温度4℃,离心5min。
3.6离心完成后,取下8联管凸盖,取3层无尘纸,垫在至少4张吸水纸上。倒置96孔板至无尘纸+吸水纸上(无尘纸紧贴96孔板),使大部分上清液被无尘纸吸收。
3.7重新取3层无尘纸,垫在至少4张吸水纸上,一起放置在96孔板上。用架盘天平配平后,倒置96孔板+无尘纸+吸水纸,转速500g,温度4℃,离心1min,甩干所有上清。
3.8取出96孔板,弃掉无尘纸和吸水纸,将96孔板放置在避光盒内12-15min,使乙醇挥发干净。
3.9取出96孔板,每孔加入10μL Hi-Di甲酰胺,盖上8联管凸盖,短暂离心96孔板。
3.10将96孔板95℃变性2min,然后冰上保存,准备上机测序。
4.使用3500xL基因分析仪进行测序。
5.测序结果数据分析:使用FinchTV软件打开.ab1格式的测序结果,定位MTHFR基因677位点和1298位点的位置,判断位点的基因型。MTHFR基因677位点的测序结果如图4所示;MTHFR基因1298位点的测序结果如图5所示。
序列表
<110>武汉康圣达医学检验所有限公司
<120>一种检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的方法
<130>
<160>6
<170>PatentIn version3.5
<210>1
<211>194
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
gttaccccaa aggccacccc gaagcaggga gctttgaggc tgacctgaag cacttgaagg60
agaaggtgtc tgcgggagcc gatttcatca tcacgcagct tttctttgag gctgacacat120
tcttccgctt tgtgaaggca tgcaccgaca tgggcatcac ttgccccatc gtccccggga180
tctttcccat ccag194
<210>2
<211>181
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>2
gggcaattcc tcttcccctg cctttgggga gctgaaggac tactacctct tctacctgaa60
gagcaagtcc cccaaggagg agctgctgaa gatgtggggg gaggagctga ccagtgaaga120
aagtgtcttt gaagtcttcg ttctttacct ctcgggagaa ccaaaccgga atggtcacaa180
a181
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tcgccttgaa caggtggag19
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ggtggaggga gcttatgg18
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gagtgtgccc tgacctct18
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tccctaagcc cttccaggt19。
Claims (3)
1.一种检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的引物组,包括第一引物组和第二引物组,第一引物组的的正向引物为SEQ ID NO:3所示序列,反向引物为SEQ ID NO:4所示序列;第二组引物的正向引物为SEQ ID NO:5所示序列,反向引物为SEQ ID NO:6所示序列。
2.一种检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的方法,包括:
(1)采集待检测血液样本,提取基因组DNA;
(2)对待检测样本DNA中的MTHFR基因677位点扩增,所用PCR引物为权利要求1引物组的第一组引物;
(3)对待检测样本DNA中的MTHFR基因1298位点扩增,所用PCR引物为权利要求1引物的第二组引物;
(4)对PCR反应产物进行测序,分析测序结果,确定677位点和1298位点基因型。
3.根据权利要求2所述的检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的方法,其特征在于:上述PCR反应产物测序前进行正向测序反应扩增、纯化后变性,在正向测序扩增反应时,MTHFR基因677位点正向引物(MTHFR-677F)为SEQ ID NO:3所示序列,MTHFR基因1298位点正向引物(MTHFR-1298F)为SEQ ID NO:5所示序列。
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