CN102367479A

CN102367479A - 一种检测egfr基因突变的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN102367479A
Application number: CN2011103307959A
Authority: CN
Inventors: 肖莉; 陈琳玲; 廖端芳; 姬云; 张佳; 李凯
Original assignee: SUZHOU KEBEI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SUZHOU KEBEI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2012-03-07

Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了一种利用PCR扩增检测EGFR基因突变的方法及试剂盒，包括：常规PCR组件，特异性引物；所述特异性引物包括两条正向引物和一条反向引物，其中两条正向引物的序列分别具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ IDNo.3所示核苷酸序列。然后利用电泳分离PCR扩增的目的产物条带的有无，来判断EGFR基因是否存在15nt缺失突变和18nt缺失突变。采用本发明所述检测EGFR基因突变的试剂盒和检测方法检测EGFR基因突变时，快速、准确、方法简单、成本低的优点，有利用临床使用和推广。

Description

一种检测EGFR基因突变的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用PCR扩增检测EGFR基因突变的方法及试剂盒。

背景技术

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种由原癌基因c-(erbB)-2编码的跨膜糖蛋白。它由1186个氨基酸残基组成，分为胞外段、跨膜段和胞内激酶活性段。在EGF作用下，激活的EGFR可刺激肿瘤的生长与进展，包括促进增殖、血管生成、浸润、转移和抑制凋亡。临床研究显示，人类许多的肿瘤都存在一定程度的EGFR高表达，并与患者的病情进展、放化疗敏感性及预后相关。EGFR已成为相关肿瘤尤其是肺癌化疗研究的重要靶标。

肺癌发病率为0.4-1/1000，占肿瘤死亡病例的1/3-1/4，目前肺癌的治疗是以手术为主，其他肺癌治疗措施有放射治疗、化学治疗、免疫治疗、中医中药治疗等。虽然化疗研究使肿瘤的治疗，尤其是5年生存率有了很大提高，但不同肿瘤因发病机理不同，对抗肿瘤药反应差异极大。抑制EGFR活性的EGFR-TK拮抗剂——吉非替尼(gefitinib，ZD1839，Iressa)可竞争细胞表面的表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR-TK)催化区域上的ATP结合点，已被FDA批准用于晚期非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)患者经化疗后继续恶化者的单用疗法。最新研究表明，EGFR的酪氨酸激酶域的体细胞突变与NSCLC患者对吉非替尼的敏感性相关。这些突变均发生在酪氨酸激酶域的ATP结合域附近，88％表现为集19号外显子的非移码缺失突变和21号外显子的单碱基替代突变。而对无EGFR突变的肺腺癌患者或其它类型的肺癌患者，吉非替尼不仅无疗效，还产生严重的不良反应，这一发现已得到了美国国立卫生研究所确认。因此，通过检测EGFR突变，在大量遗传异质性样本中筛选EGFR-TK拮抗剂有疗效的患者，对肺癌的个体化临床治疗具有一定的指导意义。

目前，许多科研机构和生物科技公司正致力于基因突变的研究，已开发了许多有效的检测方法，如PCR-SSCP、TGGE、DGGE等，但这些方法均不适用于涉及体细胞突变(稀有突变)的疾病的检测。有检测机构推出的肺癌体细胞EGFR突变基因相关检测方法，采用单细胞PCR与常规DNA测序相结合。然而，在技术层面上分析，因该方法需要显微镜下选取特定的肿瘤细胞，再对其DNA进行分析，操作复杂，随机性较大，且所需仪器昂贵。该方法的缺点是耗时多、花费大、效率较低，故难以大面积推广应用。

常规DNA测序，对稀有突变的分辨率不到10％(10-1)，常规PCR包括目前有学者采用TaqMan PCR、PNA-LNA(peptide nucleic acid-locked nucleic acid)PCR及Mutant-enriched PCR等方法应用在EGFR的突变检测中，对稀有突变的分辨率也不到1/1000(10-3)。因此，对于这类EGFR基因的稀有频率的体细胞突变虽在肿瘤发生中具有十分重要的意义，但其相应的检测方法却是当代个体化医药学中亟待解决的难题。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种检测EGFR基因突变的方法及试剂盒，通过采用一组特异性PCR引物对待测样本进行扩增，检测是否产生扩增产物条带，以及条带的大小判断EGFR基因型，使得EGFR基因突变的检测更快速、准确、简便、经济。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种检测EGFR基因突变的试剂盒，包括：常规PCR组件，还包括特异性引物；所述特异性引物包括两条正向引物和一条反向引物，其中两条正向引物的序列分别具有SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No.3所示核苷酸序列；所述特异性引物的核苷酸序列具体如下所示：

SEQ ID No.1：5’TTCCCGTCGCTATCAAAACC-3’；

SEQ ID No.2：5’-CGTCGCTATCAAGGAATCGAT-3’；

SEQ ID No.3：5’-AGTGCTGTCTCTAAGGGGC-3’。

上述技术方案中，正向引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和反向引物序列SEQID NO.3检测的位点分别对应EGFR基因19号外显子的15nt缺失突变和18nt缺失突变，正向引物三末端第二个、第三个碱基(下划线标记)为硫化修饰碱基。

上述技术方案中，所述常规PCR组件包括：高保真DNA聚合酶Pfu酶，含有硫酸镁的Pfu缓冲液，dNTPs。

上述技术方案中，所述检测EGFR基因突变的试剂盒还包括两个检测位点的阳性对照突变质粒，和一个野生型阴性对照质粒。所述两个检测位点的阳性对照突变质粒分别为，pGEM-T质粒载体插入包含EGFR基因19号密码子delE746-A750(del 2235-2249)的突变序列，pGEM-T质粒载体插入包含EGFR基因19号密码子del L747-P753insS(del 2240-2257)的突变序列。所述一个野生型阴性对照质粒为pGEM-T质粒载体插入包含EGFR基因19号密码子野生序列。

采用上述检测EGFR基因突变的试剂盒检测待测样本是否存在EGFR基因的2个缺失点突变(19号密码子15nt缺失突变，18nt缺失突)的方法，包括以下步骤：

(1)采用常规方法提取待测组织样本基因组DNA；

(2)以步骤(1)所得样本基因组DNA为模板，采用特异性引物进行多重PCR扩增，根据PCR扩增的结果判断样本中是否含有EGFR基因的突变，所述基因的突变包括：15nt缺失突变和18nt缺失突变；判断规则为：如果出现扩增产物235bp，则表明样本中含有上述15nt缺失突变；如果出现扩增产物228bp，则表明样本中含有上述18nt缺失突变；如果没有出现扩增产物，则表明样本中不含上述2个缺失突变中的任意一种。

上述技术方案中，所述15nt缺失突变为EGFR基因19号外显子的缺失突变del E746-A750(del 2235-2249)，所述18nt缺失突变为EGFR基因19号外显子的缺失突变del L747-P753insS(del 2240-2257)。

上述技术方案中，进行多重PCR扩增时，每25μL的多重PCR扩增体系包括：1μL样本基因组DNA(40ng/μL)，2.5μL 10×含有硫酸镁的Pfu缓冲液，1μL反向引物(10μM)，两条正向引物(10μM)各0.5μL，0.2μL Pfu酶(2.5U/μL)，0.4μL dNTPs(各10μM)，剩下加水补足；多重PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性20秒，68℃退火20秒(退火温度每个循环递减1℃)，72℃延伸30秒，共10个循环；95℃变性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。

进一步的技术方案中，PCR扩增结束后采用常规技术进行纯化和电泳鉴定。

本发明的基本原理为：由于低保真酶对突变的分辨率仅为10^-4，而高保真酶的分辨率为10^-7，远远大于低保真酶对突变的识别能力。采用高保真聚合酶与硫化修饰引物构成的分子开关系统，具备对突变位点高度辨认的能力。对三末端错配的硫化修饰碱基的特异性引物而言，由于其修饰了的三末端耐外切酶的特点，致使高保真聚合酶分子中无法酶解错配碱基，造成“关”闭DNA聚合反应的效果；对于配对的引物，高保真聚合酶则继续完成DNA聚合反应，形成“开”的效应。这种配对引物被延伸，而不配对引物则不被延伸的二元化效果，满足了突变分析时需要对特定位点进行非此即彼的二元化辨认。具体地，当待测样本为EGFR野生型时，两条正向引物的三末端第二个和第三个碱基与EGFR野生型模板序列不配对，且硫化修饰，利用高保真酶的分子开关效应，无目的产物扩增；当待测样本中至少含有EGFR的两个缺失突变中的一个时，两条正向引物的三末端第二个和第三个碱基在与EGFR突变模板互补的情况下，可以扩增出相对应的目的产物。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1.采用本发明所述检测EGFR基因突变的试剂盒和检测方法检测EGFR基因突变时，具备快速的优点，因采用多重PCR技术，在2小时内可检测出三种EGFR基因突变位点，与临床检测金标准序列测定至少所需5小时相比，检测时间大大缩短。

2.采用本发明所述检测EGFR基因突变的试剂盒和检测方法检测EGFR基因突变时，具备敏感性高的优点。本发明所述试剂盒对突变模板最低检测拷贝数可达10拷贝数，且可在多个平台如荧光定量PCR中应用(如图4，5，6，7)。

3.本发明所述检测方法简便、成本低，有利用临床使用和推广。

附图说明

图1为实施例一中含有EGFR基因19号外显子野生型DNA序列的质粒测序图谱；

图2为实施例一中含有EGFR基因19号外显子15nt缺失突变型DNA序列的质粒测序图谱；

图3为实施例一中含有EGFR基因19号外显子18nt缺失突变型DNA序列的质粒测序图谱；

图4为实施例一中分子开关在15nt缺失突变型质粒的敏感性电泳图；

图5为实施例一中分子开关在18nt缺失突变型质粒的敏感性电泳图；

图6为实施例一中分子开关在15nt缺失突变型质粒的敏感性荧光定量PCR扩增曲线；

图7为实施例一中分子开关在18nt缺失突变型质粒的敏感性荧光定量PCR扩增曲线；

图8为实施例二中8个肺癌组织DNA模板的分子开关检测电泳图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：用三条特异性引物检测EGFR野生型质粒样本、EGFR突变型质粒样本。

一种检测EGFR基因突变的试剂盒，包括：常规PCR组件，还包括特异性引物；所述特异性包括两条正向引物和一条反向引物，其中两条正向引物的序列分别具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQID No.3所示核苷酸序列；所述特异性引物的核苷酸序列具体如下所示：

SEQ ID No.1：5’-TTCCCGTCGCTATCAAAACC-3’；

SEQ ID No.2：5’CGTCGCTATCAAGGAATCGAT-3’；

SEQ ID No.3：5’-AGTGCTGTCTCTAAGGGGC-3’；

其中，正向引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和反向引物序列SEQ ID NO.3检测的位点分别对应EGFR基因19号外显子的15nt缺失突变和18nt缺失突变，正向引物三末端第二个、第三个碱基(下划线标记)为硫化修饰碱基；

所述常规PCR组件包括：高保真DNA聚合酶Pfu酶，含有硫酸镁的Pfu缓冲液，dNTPs

述检测EGFR基因突变的试剂盒还包括两个检测位点的阳性对照突变质粒，和一个野生型阴性对照质粒。所述两个检测位点的阳性对照突变质粒分别为，pGEM-T质粒载体插入包含EGFR基因19号密码子del E746-A750(del 2235-2249)的突变序列，pGEM-T质粒载体插入包含EGFR基因19号密码子delL747-P753insS(del 2240-2257)的突变序列。所述一个野生型阴性对照质粒为pGEM-T质粒载体插入包含EGFR基因19号密码子野生序列。

1)用试剂盒中提供的两个检测位点的阳性对照突变质粒，和一个野生型阴性对照质粒，测序验证序列正确。测序结果如图1对应野生型阴性对照质粒的序列测定结果，图2对应EGFR基因19号外显子15nt缺失突变质粒的序列测定结果，图3对应EGFR基因19号外显子18nt缺失突变质粒的序列测定结果。

2)将两个突变质粒等比稀释成10⁵、10⁴、10³、10²、10拷贝数/μL浓度梯度作为PCR扩增模板，分别正向引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和反向引物SEQ ID No.3，对两个质粒模板进行PCR扩增。每25μL的PCR扩增体系包括：1μL质粒DNA，2.5μL 10×含有硫酸镁的Pfu缓冲液，1μL反向引物(10μM)，两条正向引物(10μM)各0.5μL，0.2μL Pfu酶(2.5U/μL)，0.4μL dNTPs(各10μM)，剩下加水补足；PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性20秒，68℃退火20秒(每个循环递减1℃)，72℃延伸30秒，共10个循环；95℃变性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。

3)PCR产物采用凝胶电泳鉴定。结果如图4示引物SEQ ID No.1和SEQ IDNo.3检测15nt缺失突变质粒模板梯度稀释的电泳结果。如图5示引物SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3检测18nt缺失突变质粒模板梯度稀释的电泳结果。结果显示试剂盒最低可检测15nt缺失突变质粒模板的起始模板数为3×10³拷贝；试剂盒最低可检测18nt缺失突变质粒模板的起始模板数为10拷贝。

4)将两个突变质粒等比稀释成10⁵、10⁴、10³、10²、10拷贝数/μL浓度梯度作为PCR扩增模板，分别正向引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和反向引物SEQ ID No.3，对两个质粒模板进行荧光定量PCR扩增。每25μL的PCR扩增体系包括：1μL质粒DNA，1.5μL 20×EvaGreen荧光染料，2.5μL 10×含有硫酸镁的Pfu缓冲液，1μL反向引物(10μM)，两条正向引物(10μM)各0.5μL，0.2μL Pfu酶(2.5U/μL)，0.4μL dNTPs(各10μM)，剩下加水补足；PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性20秒，68℃退火20秒(每个循环递减1℃)，72℃延伸30秒，共10个循环；95℃变性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。

5)直接观测荧光定量PCR结果。结果如图6示引物SEQ ID No.1和SEQID No.3检测15nt缺失突变质粒模板梯度稀释的荧光定量PCR结果。如图7示引物SEQ ID No.2和SEQ ID No.3检测18nt缺失突变质粒模板梯度稀释的荧光定量PCR结果。结果显示试剂盒在荧光定量PCR中最低可检测15nt缺失突变质粒模板的起始模板数为10³拷贝；试剂盒在荧光定量PCR中最低可检测18nt缺失突变质粒模板的起始模板数为10拷贝。

实施例二：检测EGFR野生型样本、EGFR突变型的样本。

1)用常规方法提取人肺癌组织基因组DNA。

2)采用试剂盒引物对人肺癌组织基因组DNA进行缺失突变PCR检测。每25μL的多重PCR扩增体系包括：1μL样本基因组DNA，2.5μL 10×含有硫酸镁的Pfu缓冲液，1μL反向引物，两条正向引物各0.5μL，0.2μL Pfu酶，0.4μLdNTPs，剩下加水补足；多重PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性20秒，68℃退火20秒(每个循环递减1℃)，72℃延伸30秒，共10个循环；95℃变性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。

3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果如图8所示，8例肺癌组织基因组DNA中筛查到3例EGFR基因15nt缺失突变。

Claims

1.一种检测EGFR基因突变的试剂盒，包括：常规PCR组件，其特征在于，还包括特异性引物；所述特异性引物包括两条正向引物和一条反向引物，并且每一条正向引物的三末端第二个、第三个碱基为硫化修饰碱基；其中三条正向引物的序列分别具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No.3所示核苷酸序列；所述特异性引物的核苷酸序列具体如下所示：

SEQ ID No.1：5’TTCCCGTCGCTATCAAAACC-3’；

SEQ ID No.2：5’-CGTCGCTATCAAGGAATCGAT-3’；

SEQ ID No.3：5’-AGTGCTGTCTCTAAGGGGC-3’；

所述常规PCR组件包括：高保真DNA聚合酶Pfu酶，含有硫酸镁的Pfu缓冲液，dNTPs。

2.采用权利要求1所述检测EGFR基因突变的试剂盒检测待测样本是否存在EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用常规方法提取待测组织样本基因组DNA；

3.根据权利要求2所述检测EGFR基因突变的试剂盒检测待测样本是否存在EGFR基因突变的方法，其特征在于，进行多重PCR扩增时，每25μL的多重PCR扩增体系包括：1μL样本基因组DNA，2.5μL 10×含有硫酸镁的Pfu缓冲液，1μL反向引物，两条正向引物各0.5μL，0.2μLPfu酶，0.4μLdNTPs，剩下加水补足；多重PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性20秒，68℃退火20秒，退火温度每个循环递减1℃，72℃延伸30秒，共10个循环；95℃变性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。

4.如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。

5.如SEQ ID No.2所述的核苷酸序列。

6.如SEQ ID No.3所述的核苷酸序列。