CN103205484B - 一种mthfrd基因多态性c677t的检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种MTHFRD基因多态性C677T的检测试剂盒。本发明的试剂盒根据MTHFR基因序列设计FRET特异识别探针对，可以针对MTHFR基因多态性C677T位点特异识别，当多态性位点为野生纯合型CC型时，溶解曲线Tm值为：64.5±1℃，当多态性位点为突变纯合型TT型时，溶解曲线Tm值为：56±1℃，当多态性位点为杂合型CT型时，溶解曲线有两个熔解峰，Tm值为：56±1℃和64.5±1℃。本发明检测试剂盒不仅特异性好，灵敏度高，价格低廉，操作简易，避免了开管操作带来的污染，而且通过检测仪器可以直观判断基因型。
Description
技术领域
本发明属于体外核酸检测领域，涉及采用基于荧光能量传递技术(fluorescenceresonance energy transfer,FRET)的实时荧光PCR技术检测MTHFR基因多态性(C677T)的方法及试剂盒。
背景技术
叶酸是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的化合物，是一种水溶性B族维生素。叶酸对人体的重要营养作用早在1948年即已得到证实。叶酸是人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。叶酸在制造核酸（核糖核酸、脱氧核糖核酸）上扮演重要的角色。叶酸帮助蛋白质的代谢，并与维生素B12共同促进红细胞的生成和成熟，是制造红血球不可缺少的物质。叶酸对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要的作用。人类（或其他动物）如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，还会导致身体无力、易怒、没胃口以及精神病症状。此外，研究还发现，叶酸对孕妇尤其重要。如在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可导致胎儿神经管发育缺陷，从而增加裂脑儿，无脑儿的发生率。其次，孕妇经常补充叶酸，可防止新生儿体重过轻、早产以及婴儿腭裂（兔唇）等先天性畸形。但是适应物极必反的原则，叶酸也不能滥补，长期服用叶酸会干扰孕妈妈的锌代谢，锌一旦摄入不足，就会影响胎儿的发育。
人类基因组DNA中5,10亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢系统中的关键酶，能催化5，10亚甲基四氢叶酸转变为5-甲基四氢叶酸，而后者为同型半胱氨酸转化为蛋氨酸的甲基供体。MTHFR基因677位单核苷酸多态性(C677T)导致第222位丙氨酸被缬氨酸替代，影响酶的催化结构域，形成热不稳定的蛋白质，酶活性降低约70%。从而引起叶酸代谢障碍，引发多种疾病，其中以高同型半胱氨酸血症引起的脑卒中以及新生儿缺陷最为严重。检测MTHFR基因型，可以提示脑卒中风险性，同时还能指导孕妇服用叶酸，降低唐氏综合征、唇腭裂、神经管缺陷等新生儿缺陷。在中国人中，高达17%-47%的人为MTHFR基因异常人群。
MTHFR基因正常的人，摄入的叶酸能够在体内顺利代谢，降低高同型半胱氨酸的水平。这类人脑中风、冠心病和静脉血栓的发病风险较低。MTHFR基因异常的人，摄入的叶酸在体内的代谢途径受阻，可能引起高同型半胱氨酸血症，导致凝血倾向增高，因此发生脑中风、冠心病以及静脉血栓的风险也增高。
我国推荐孕期补充量为400微克/天，对于：MTHFR基因正常的人，摄取推荐量的叶酸，能够显著降低患儿的出生缺陷率。MTHFR基因异常的人，MTHFR酶活性明显降低，对叶酸代谢造成障碍，导致新生儿神经管缺陷、唐氏综合症及唇腭裂等疾病的发病风险明显增高。对于这类人需要补充更多的叶酸才能达到预期的效果。所以对MTHFR基因的检测在临床意义上具有重大的作用。
目前MTHFR基因多态性(C677T)检测方法有以下几种：首先是作为“金标准”的基因测序，具有较高的特异性，并且能够大通量地检测，但是因为测序仪器很昂贵，没有办法普及，如果通过第三方服务来进行检测，则需要较高的时间成本，标本的保存与运输也是一种挑战。基于分子水平，迄今国内外报道对MTHFR基因的检测方法大都是采用PCR-RFLP，此方法以来限制性内切酶消化，电泳分析，酶切不完全往往被误判为杂合子，因为PCR产物要进行开管操作，容易形成气溶胶，导致假阳性的产生。电泳分析需要制备聚丙烯酰胺凝胶，EB染色，费时费力，并且有化学性危害。日前有采用MGB探针的方法，此方法能够避免开盖污染，具有较强的特异性，但是MGB探针的合成要求较高，国内只有数家公司可以合成，并且价格昂贵不适合常规的检查。
发明内容
本发明的目的即在于克服背景技术的以上缺陷，提供一种PCR-FRET法的检测试剂盒，以对MTHFR基因多态性(C677T)进行检测。
本发明的技术方案如下：
一种MTHFRD基因多态性C677T的检测试剂盒，包括如下的引物对：
MTHFR-F：5’-TCATCCCTCGCCTTGAACAG-3’
MTHFR-R：5’-CTCAGCGAACTCAGCACTCC-3’
一种MTHFRD基因多态性C677T的检测试剂盒，根据MTHFR基因序列设计FRET特异识别探针对，可以针对MTHFR基因多态性C677T位点特异识别，当多态性位点为野生纯合型CC型时，溶解曲线Tm值为：64.5±1℃，当多态性位点为突变纯合型TT型时，溶解曲线Tm值为：56±1℃，当多态性位点为杂合型CT型时，溶解曲线有两个熔解峰，Tm值为：56±1℃和64.5±1℃。FRET特异识别探针序列如下：
MTHFR-AP:FAM-5’-GATGATGAAATCGGCTCCCGCAGAC-3’
MTHFR-SP:5’-CAGCCTCAAAGAAAAGCTGCG-3’-ROX
所述的试剂盒中，包括：反应体系（PCR Mix）：75mmol/L Tris-HCl pH 9.0，20mmol/L（NH4）2SO4，0.01%Tween 20，50mmol/L KCl，2mmol/L Mg2+，3.0mmol/L dNTP溶液，0.5μmol/L MTHFR-F，0.05μmol/L MTHFR-R，0.25μmol/L MTHFR-AP，0.2μmol/LMTHFR-SP。酶液包含：5U/μl Taq HS；阴性对照：灭菌超纯水。
PCR-RFLP的原理，是分别设计一对特异引物和一对FRET探针。特异引物用来扩增目标序列，FRET探针作为目标序列的检测信号。FRET探针是依靠荧光能量从一个荧光染料到另一个的传递。两个独立的特异寡核苷酸序列都标记上荧光基团。上游探针在3’末端有一个供体基团，下游探针在5’末有一受体基团。设计探针时他们在与目标序列结合时互相临近，使供体和受体荧光基团紧密接近。一旦探针杂交到模板上，从供体到受体荧光基团的能量传递产生了一个不同波长的荧光信号。供体荧光信号的减弱和受体荧光信号的加强都能分别监测到。因此，只有当两个探针都结合上去才能检测到荧光信号。FRET探针可以进行溶解曲线分析，通过熔解曲线，可以判断出MTHFR基因多态性(C677T)。
本发明采用PCR-FRET法进行检测，不仅特异性好，灵敏度高，价格低廉，操作简易，避免了开管操作带来的污染，而且通过检测仪器可以直观判断基因型。
附图说明
图1为本发明实施例2的结果图。
具体实施方式
实施例1
本发明共检测了106份人类基因组样本，均由厦门市妇幼保健院提供。
血液样本基因组提取，采用天根的血液基因组DNA提取试剂盒提取，详细操作步骤如下：
1、处理血液材料（已添加抗凝剂的血液样本100μl-1ml）：
a.当血液样品体积小于200μl时，可加缓冲液GS补足体积至200μl，再进行下一步实验（如血液样品体积为200μl，可直接进行下一步实验，不需要加入GS）。
b.当血液样品体积超过200μl时，需用细胞裂解液CL处理，具体步骤如下：在样品中加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm（~11500×g）离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀（如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次），向离心收集到的细胞核沉淀中加200μl缓冲液GS，振荡至彻底混匀。
2、加入20μl Proteinase K溶液，混匀。
3、加200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮（如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止）。
注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般56℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。当血液体积≤200μl且没有采用红细胞裂解处理，或是样本储存条件不佳，水浴后颜色可能为深褐色，注意溶液中没有团块等沉淀。
4、加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
5、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收集管中），12000rpm（~13400×g）离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
6、向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g）离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7、向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g）离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8、向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm（~13400×g）离心30sec，倒掉收集管中的废液。
9、将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm（~13400×g）离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。
10、将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12000rpm（~13400×g）离心2min，将溶液收集到离心管中。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rpm（~13400×g）离心2min。洗脱液的PH对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其PH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的PH值调到此范围），PH值低于7.0会降低洗脱效率，且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
将提取好的人类基因组样本存放在-20℃冰箱待用。
实施例2
引物：
MTHFR-F：5’-TCATCCCTCGCCTTGAACAG-3’
MTHFR-R：5’-CTCAGCGAACTCAGCACTCC-3’
探针
MTHFR-AP:FAM-5’-GATGATGAAATCGGCTCCCGCAGAC-3’
MTHFR-SP:5’-CAGCCTCAAAGAAAAGCTGCG-3’-ROX
反应体系（PCR Mix）：75mmol/L Tris-HCl pH 9.0，20mmol/L（NH4）2SO4，0.01%Tween20，50mmol/L KCl，2mmol/L Mg2+，3.0mmol/L dNTP溶液，0.5μmol/L MTHFR-F，0.05μmol/L MTHFR-R，0.25μmol/L MTHFR-AP，0.2μmol/L MTHFR-SP。酶液包含：5U/μlTaq HS；阴性对照：灭菌超纯水。
（1）首先取n×19.8μl PCR Mix于1.5mL的离心管中，再加入n×0.2μl酶液，震荡混均数秒，3000rpm离心数秒；
（2）将配好的PCR反应液以每管20μl的量分装于配套的PCR反应管中；
（3）加入5μl的提取好的人类基因组样本或是阴性对照于PCR反应液中，盖紧PCR反应管的盖子，准备上机；
（4）扩增反应程序：95℃预变性3min；95℃变性10s，57℃退火20s，72℃延伸20s，50个循环。在退火阶段采集荧光数据。采用Rotor-Gene 6000实时荧光PCR仪进行检测在45℃~80℃做熔解曲线分析。
（5）结果如图1所示：样本一的Tm值为64.2℃，判定为野生纯合型；样本二的Tm值为56℃，判定为突变纯合型；样本三有两个熔解峰，Tm值分别为56℃和64.5℃，判定为杂合型；阴性对照没有熔解峰。与测序结果相符。
为验证本方法的准确性，进行了106份基因组样本的验证实验，与测序结果对比，结果如下表：
通过金标准的测序法验证本试剂盒检测准确率为100%。
Claims (1)
1.一种MTHFRD基因多态性C677T的检测试剂盒，包括如下的引物对：
MTHFR-F：5’-TCATCCCTCGCCTTGAACAG-3’
MTHFR-R：5’-CTCAGCGAACTCAGCACTCC-3’；
还包括如下的FRET特异识别探针序列：
MTHFR-AP:FAM-5’-GATGATGAAATCGGCTCCCGCAGAC-3’
MTHFR-SP:5’-CAGCCTCAAAGAAAAGCTGCG-3’-ROX；
以及75mmol/L Tris-HCl pH 9.0，20mmol/L(NH4)2SO4，0.01％Tween 20，50mmol/LKCl，2mmol/L Mg2+，3.0mmol/L dNTP溶液，0.5μmol/L MTHFR-F，0.05μmol/L MTHFR-R，0.25μmol/L MTHFR-AP，0.2μmol/L MTHFR-SP；酶液包含：5U/μl Taq HS；阴性对照：灭菌超纯水。
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