CN104789685A - 一种叶酸需求遗传检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种叶酸需求遗传检测试剂盒及其应用。该试剂盒包括：以CBS基因的699C>T位点、DHFR基因的c.594+59del19位点、GST01基因的428C>A位点、MTHFD基因的1958G>A位点、MTHFR基因的1298A>C位点、MTHFD基因的677C>T位点、MTR基因的-186T>G位点，905G>A位点和2756A>G位点、MTRR基因的c.56+781A＞C位点和66A>G位点、NFE2L2基因的ins1+11108C>T位点、NOS3基因的894G>T位点、RFC1基因的80G>A、TCN2基因776C>G和TYMS基因1494del6等十六个基因突变位点为检测对象而设计的PCR扩增引物和延伸引物，其序列分别如SEQIDNo.1～SEQIDNo.48示；以及，PCR反应试剂，包括聚合酶及缓冲溶液。本发明提供了一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的叶酸利用能力基因突变筛查方法。

Description

一种叶酸需求遗传检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明特别是涉及一种叶酸需求遗传检测试剂盒及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

叶酸是人体必不可少的营养物质，其主要生物学功能是作为甲基供体参与细胞内的甲基化反应和脱氧核糖核酸的合成，叶酸不能被人体直接利用，必需通过一系列活化才能发挥其生理功能，而从食物中摄取的叶酸只有在叶酸还原酶的作用下还原为四氢叶酸，才能参与人体许多重要的生化代谢反应，叶酸缺乏是导致胚胎发育异常的环境因素之一。研究表明，人群中叶酸缺乏会导致胎儿先天性异常，特别是神经管畸形(Neural tube defects，NTDs)的发生，也可以导致其他出生缺陷的发生率，例如先天性心脏病、唇腭裂、以及唐氏综合征等，并可使胚胎发生严重多发畸形，导致胚胎在发育早期即死亡，此外，叶酸缺乏还可以引起早产、流产等不良妊娠的发生。男性缺乏叶酸可以降低精子数量和活力。

在孕妇中大力推广“叶酸强化”，从某种程度上可减少出生缺陷的发生。孕妇一般采用每天服用一粒叶酸片(400微克)的形式补充叶酸，对于叶酸利用能力正常的孕妇这个用量是充足的，但对于叶酸代谢异常的孕妇却远远不够。此外，最近发现“叶酸强化”还存在一定负面效应，大范围人群大量补充叶酸，人为地造成未来的人口对于大量维生素产生依赖性，由此，可能导致人口整体的基因组成发生变化，这种人群对于某些致命的疾病将变得十分脆弱。因此，鉴别出叶酸利用能力正常和叶酸利用能力不足的人群，个性化合理的补充叶酸具有重要的现实意义和长远意义。

部分叶酸利用能力不足的孕妇，其叶酸代谢途径相关酶基因发生了突变，导致了酶分子一个氨基酸的替换，使酶活性大大下降而影响叶酸的利用能力。已经报道叶酸代谢途径中一些酶基因的多态性与神经管畸形、心血管疾病、唐氏综合征、流产、淋巴细胞性白血病、乳腺癌、胃癌、Andesophageal肿瘤、阿尔茨海默病等疾病相关联。

在叶酸利用能力相关的基因检测技术临床应用之前，妇产科医师通常只能建议所有孕妇按照标准量、标准时间来服用叶酸。

目前，传统基因突变检测方法包括：单链构象多态性分析(Single Strand ConformationPolymorphism，SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱(Denaturing High Performance LiquidChromatography，DHPLC)、荧光定量PCR法(含融解曲线法)、直接测序、基因芯片等。这些方法或者检测能力有限、或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是，除基因芯片外，这些方法难以针对不同基因的多个突变位点同时进行高通量检测。而基因芯片技术平台成本昂贵，对环境和人员素质要求高，难以在我国广大医疗机构中普及，因此有必要建立一种高通量、高效能、低成本的叶酸代谢相关酶基因突变筛查方法，以实现临床快速检测和规模化筛查。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种叶酸需求遗传检测试剂盒，其包括：

以CBS基因的699C>T位点、DHFR基因的c.594+59del19位点、GST01基因的428C>A位点、MTHFD基因的1958G>A位点、MTHFR基因的1298A>C位点、MTHFD基因的677C>T位点、MTR基因的-186T>G位点，905G>A位点和2756A>G位点、MTRR基因的c.56+781A＞C位点和66A>G位点、NFE2L2基因的ins1+11108C>T位点、NOS3基因的894G>T位点、RFC1基因的80G>A、TCN2基因776C>G和TYMS基因1494del6等十六个基因突变位点为检测对象而设计的PCR扩增引物和延伸引物，其中，

所述检测CBS基因的699C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示，

所述检测DHFR基因c.594+59del19位点的扩增引物序列如SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示，

所述检测GST01基因的428C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No.5与SEQ ID No.6所示，

所述检测MTHFD基因1958G>A位点的扩增引物序列如SEQ ID No.7与SEQ ID No.8所示，

所述检测MTHFR基因1298A>C位点的扩增引物序列如SEQ ID No.9与SEQ ID No.10所示，

所述检测MTHFD基因677C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No.11与SEQ ID No.12所示，

所述检测MTR基因2756A>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No.13与SEQ ID No.14所示，

所述检测MTR基因的-186T>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No.15与SEQ ID No.16所示，

所述检测MTR基因的905G>A位点的扩增引物序列如SEQ ID No.17与SEQ ID No.18所示，

所述检测MTRR基因66A>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No.19与SEQ ID No.20所示，

所述检测MTRR基因c.56+781A＞C位点的扩增引物序列如SEQ ID No.21与SEQ IDNo.22所示，

所述检测NFE2L2基因ins1+11108C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No.23与SEQ IDNo.24所示，

所述检测NOS3基因的894G>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No.25与SEQ ID No.26所示，

所述检测RFC1基因80G>A位点的扩增引物序列如SEQ ID No.27与SEQ ID No.28所示，

所述检测TCN2基因776C>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No.29与SEQ ID No.30所示，

所述检测TYMS基因1494del6位点的扩增引物序列如SEQ ID No.31与SEQ ID No.32所示，

以及，PCR反应试剂，包括聚合酶及缓冲溶液。

其中，所述PCR反应试剂包括dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg²⁺离子、FastTaq酶、SNaPshot Mix混合液。还包括主要由SAP酶、Exon I酶与配套缓冲液组成的纯化试剂。还可包括单个位点纯合、杂合突变的阳性对照标本和/或阴性对照标本。

进一步地，以CBS基因的699C>T位点、DHFR基因的c.594+59del19位点、GST01基因的428C>A位点、MTHFD基因的1958G>A位点、MTHFR基因的1298A>C位点、MTHFD基因的677C>T位点、MTR基因的-186T>G位点，905G>A位点和2756A>G位点、MTRR基因的c.56+781A＞C位点和66A>G位点、NFE2L2基因的ins1+11108C>T位点、NOS3基因的894G>T位点、RFC1基因的80G>A、TCN2基因776C>G和TYMS基因1494del6等十六个基因突变位点为检测对象而设计的延伸引物分别如SEQ ID No.33～SEQ ID No.48所示。

本发明的另一目的在于提供前述任一项的试剂盒在中国人群的叶酸利用能力基因突变筛选中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种叶酸利用能力基因突变筛选方法，包括：

(1)提供前述任一项所述叶酸需求遗传检测试剂盒，

(2)以所述扩增引物对叶酸代谢基因进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；

(3)以所述延伸引物针对步骤(2)所获纯化产物进行延伸标记反应和二次纯化；

(4)对步骤(3)所获二次纯化产物进行毛细管电泳，并对毛细管电泳结果进行数据采集和分析，获得筛查结果。

本发明的又一目的在于提供一种检测系统，其包含本发明所述试剂盒。

与现有技术相比，本发明的优点在于：该试剂盒能针对目前中国人群叶酸利用能力相关基因突变的特点，选择覆盖范围广泛的16个突变热点作为筛查目标，弥补目前现有突变筛查方法的不足，提供了一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的叶酸利用能力基因突变筛查方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明具体实施例中的SNaPshot实验流程示意图；

图2为本发明具体实施例中的毛细管电泳结果图，其中，电泳顺序由左向右依次为：MTHFR 677C>T、MTR 905G>A、MTHFD 1958G>A、MTR-186T>G、MTR 2756A>G、NFE2L2ins1+11108C>T、MTRR 66A>G、CBS 699C>T、RFC180G>A、GSTO1428C>T、NOS3894G>T、MTHFR 1298A>C、DHFR c.594+59del19、MTRR 56+781A＞C、TCN2776C>G、TYMS 1494del6(理论上的片段长度分别为32bp，25bp、30bp，28bp，35bp，37bp，40bp，42bp，45bp，49bp，50bp,51bp，54bp,56bp,60bp和61bp。实际电泳过程存在飘移现象，即与分子量标记所测片段大小有一定差距，如32bp的野生型MTHFR 677C片段会飘移到25bp的MTR 905G>A片段左面，32bp的突变型MTHFR 677T会在33bp的MTR 2756A>G片段右侧，但不会影响整体结果判读)。

具体实施方式

本发明的一实施方案之中提供了一种叶酸需求遗传检测试剂盒及其应用，它能针对目前中国人群叶酸代谢相关基因突变的特点，选择覆盖范围广泛的16个突变热点作为筛查目标，弥补目前现有突变筛查方法的不足，提供一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的叶酸利用能力基因突变筛查方法。

具体而言，本发明一实施方案提供的一种叶酸需求遗传检测试剂盒包含：

(1)PCR反应试剂，包括dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg²⁺离子、去离子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix混合液；

(2)按一定比例混合的PCR扩增的正向引物和反向引物；各引物的浓度见表1；

(3)按一定比例混合的的延伸引物；各引物的终浓度参见下表1，其为推荐的使用浓度配比，具体在使用时，如果某个电泳峰的峰高过低，可适当增加引物加入量，如果峰过高，可以适当减少引物用量，以达到最佳检测效果。

(4)纯化用SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液；

(5)单个位点纯合、杂合突变的阳性和阴性对照DNA；

(6)使用说明书。

基于该试剂盒的检测方法为：通过多重PCR扩增，使被检测样本的16个目的片段得到扩增富集；然后进行扩增产物的酶反应纯化，去除多余的引物及dNTP“杂质”；再利用针对突变位点设计的16条延伸引物，对16个富集的片段进行单碱基的延伸反应，仅对突变位点的单个碱基进行荧光标记扩增，突变位点匹配上一个荧光标记的双脱氧核苷酸后终止延伸；然后再进行一次扩增产物的酶反应纯化；最后经毛细管电泳进行扩增片段分析，相当于单个位点的微测序，这样可以检测单核苷酸的突变，延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。

所述试剂盒包含检测CBS基因的699C>T位点、DHFR基因的c.594+59del19位点、GST01基因的428C>T位点、MTHFD基因的1958G>A位点、MTHFR基因的1298A>C、MTHFD基因的677C>T位点、MTR基因的-186T>G位点，905G>A位点和2756A>G位点、MTRR基因的c.56+781A＞C位点和66A>G位点、NFE2L2基因的ins1+11108C>T位点、NOS3基因的894G>T位点、RFC1基因的80G>A、TCN2基因776C>G和TYMS基因1494del6十六个基因突变位点的引物。

所述PCR扩增引物及延伸引物用于针对人类基因组中目的区域DNA的扩增以及目的位点的微测序，进而达到基因分型的目的，以实现特定核苷酸变异的检测。

所述PCR扩增引物和延伸引物浓度的优化配置，使其能够在延伸反应时兼顾各个位点的产量，利于后续检测中各个位点突变情况的判断识别。

本实施例中16个突变位点的延伸引物在设计时的指导思想是：根据不同序列情况，在突变点的上游或下游选取正向或反向与突变位点5’端或3‘端序列互补结合的17-25bp的序列；避免序列中有难以解链的二级结构；确保延伸的单个碱基不在序列上，并保证缺失型突变下一个碱基与缺失的碱基为不同碱基；各个延伸引物片段全长应该有一定的差异，通过在片段的5‘端加上若干个T，使得延伸引物长度均匀分布在18-70bp之间(参见表1)，以便于通过毛细管电泳分离检测(其序列参见表1)。16个位点的延伸产物长度见表1。这样经过PCR扩增后，带有不同荧光的不同长度的片段经毛细管电泳后就能够分析出相应片段所携带的碱基类型，进而可以判断是否存在该碱基的突变，并区分属于野生型、纯合突变还是杂合突变，使上述16个位点一次性得到精确的基因分型。

本实施例中设计的PCR扩增引物和延伸引物序列是通过核酸合成仪人工合成，并与PCR扩增反应试剂，包括：dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg²⁺离子、去离子水、FastTaq酶、SNaPshotMix混合液、纯化用SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液；16个位点杂合突变型的混合DNA阳性标本，以及说明书组合起来，提供用于体外检测叶酸利用能力基因突变筛查的试剂盒，其主要功能在于，将所需的试剂集成在一个小盒内，使得核酸片段扩增、纯化可以在试剂盒提供试剂的基础上顺序完成。

表1本实施例中的PCR扩增引物、延伸引物及结果判读

参图1所示，本实施例中的操作包括：

(1)Touchdown多重PCR：反应体系总体积10μL，10×PCR缓冲液1.0μL、MgCl₂(25mM)1.0μL、dNTP(2mM)1.5μL、Primer Mix 1.0μL、FastTaqE(5U/μL)1.25μL、模板DNA(20ng/μL)0.8μL、H₂O 5.55μL；反应程序：95℃预变性4min；94℃变性30s，66℃退火35s，每循环降0.5℃，72℃延伸35s,9个循环；94℃变性30s，58℃退火35s，72℃延伸35s，25个循环；72℃充分延伸10min，4℃保存。PCR反应在9700热循环仪(ABI公司)中进行。

(2)PCR产物纯化：反应体系总体积6μL，ddH₂O 2.6μL、SAP酶(1.0U/μL)2μL、Exon I酶(5.0U/μL)0.4μL、上述PCR产物1.0μL；反应程序，37℃反应80min，80℃终止反应15min，4℃保存。

(3)标记延伸：反应体系总体积6.0μL，ddH₂O 1.8μL，5×Seq Buffer 1.2μL，混合延伸引物(E-Primer)1.0μL、SNaPshot Mix 1.0μL，上述纯化产物1μL；PCR反应程序：96℃预变性1min；96℃变性10s，52℃退火5s，60℃延伸30s，28个循环，4℃保存，PCR反应可选择在9700热循环仪(ABI公司)中进行。

(4)二次纯化：反应总体积7μL，反应结束后每反应产物中加入SAP酶(1.0U/μL)1μL；反应程序：37℃反应60min，75℃灭活反应15min，4℃保存，反应可选择在9700热循环仪(ABI公司)中进行。

(5)毛细管电泳：反应体系总体积10.2μL，Hi-Di甲酰胺(ABI公司)9μL，内标LIZ-120(ABI公司)0.2μL，第二次纯化产物1μL；反应程序：95℃变性5min，立即置冰上5min。在ABI公司遗传分析仪进行毛细管电泳，应用GeneMapper系列软件进行数据的采集和分析。

(6)结果分析：根据峰颜色来区分野生型、杂合突变和纯合突变，得出其多态图谱(图2)，分析其基因型。

本具体实施方式中的PCR扩增引物设计时选择目的区域上下游70-150bp的距离作为引物设计的起始部位，引物与之序列匹配的特异性要好，引物间的退火温度要尽量一致(55℃左右)。使在一个多重PCR反应中的各个扩增引物的扩增效率相当。

本具体实施方式具有高通量、高效能、低成本、简单适用，适合中国人群的叶酸利用能力基因检测。采用多重PCR加上引物延伸微测序技术，在一个反应管中同时完成12个基因16个位点的基因分型的优点：

1、相对于传统Sanger直接测序法，本发明检测方法可同时检测不同基因的16个多态位点，技术稳定，结果容易判读，成本低廉。

2、相对于SSCP和RFLP两种方法，本发明方法不受是否存在限制性酶切位点的限制，且可同时检测多个位点。

3、相对于DHPLC检测方法，本发明检测方法不但可以同时检测多个位点，而且突变具体类型判断更加准确。

4、相对于荧光PCR法，本发明检测方法在一个反应管中可以同时检测16个位点，而荧光PCR法一个反应管种一般最多只能检测3-5个位点。

5、相对于基因芯片技术，本发明检测方法成本低廉，操作简单，凡是具有分子生物学实验相关经验的人员均可完成。

以下进一步结合若干更为具体的实施案例对本发明的技术方案作解释说明。

实施例一：先天性心脏病患者叶酸利用能力基因检测

1、检测样本

样本来源于苏州市立医院生殖与遗传中心非综合征型患者DNA文库，库中所有患者样本收集前均签署了知情同意书。

2、检测方案

见具体实施方式的检测方法。

3、检测结果

160例先心病样本中，发现NFE2L2、DHFR、CBS、MTRR、MTR基因某些SNPs突变分布频率与正常对照组有显著差异,成为影响先天性心脏病发病的独立因素。参见表2。

表2：先天性心脏病患者与正常人叶酸代谢相关基因SNPs分布频率

注：基于X²检验的整体关联P值。

有显著差异的情况

4、本发明方法的检测准确度

此技术检测的结果与突变检测金标准“基因测序”的结果完全相符。

实施例二：早产儿叶酸利用能力基因检测

315例早产样本中，发现多个叶酸代谢相关基因SNPs发生突变分布频率与正常对照组有显著差异,成为影响早产发生的风险因素。参见表3和表4。

表3：早产和足月产叶酸代谢相关基因SNPs分布频率

表4：早产和足月产儿多重突变基因型比较

综上所述，通过本试剂盒检测，可检测出影响叶酸代谢和利用能力的一些已知的常见的突变，将亚健康人群分为疾病风险高、中、低三个亚群，指导这些人群个性化使用叶酸，对高风险人群进行特异性个性化干预。有针对性的合理补充叶酸，可以消除过度“叶酸强化”带来的负面影响。

本试剂盒以我国常见的叶酸代谢异常可能引发的疾病(神经管畸形、心血管疾病、唐氏综合征、流产、淋巴细胞性白血病、乳腺癌、胃癌、andesophageal肿瘤、阿尔茨海默病)为代表性目标疾病，对于降低出生缺陷风险以及阻止亚健康向疾病转变和促进健康恢复起到一定作用，为我国出生缺陷的降低将起到一定作用。

此外，肿瘤生长过程中需要大量合成DNA，由于叶酸对DNA的加工很重要，因此叶酸代谢途径也被作为抗肿瘤治疗的靶点。一个叫甲氨喋呤的化合物就是叶酸的类似物，它可抑制叶酸的代谢，目前仍是临床上多种肿瘤的化疗药物，适用于急性白血病、乳腺癌、绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎、头颈部肿瘤、骨肿瘤、白血病脑膜脊髓浸润、肺癌、生殖系统肿瘤、

肝癌、顽固性普通牛皮癣及自身免疫病等。这类化疗药物对叶酸代谢正常的患者疗效较为明显。因此在使用针对叶酸代谢的抗肿瘤药物之前，也可通过本试剂盒检测，筛选出存在叶酸利用能力低下的个体，指导临床医生合理选择抗肿瘤药物。

本发明的试剂盒在临床应用上具有明显的优势。传统的基因检测技术中每个位点都要单独检测，大大浪费了检测的时间、试剂、人力和物力，效率低。使用本试剂盒检测，在一个反应管中可以同时对16个位点进行检测，最终给出16个位点的基因分型结果。

本发明利用SNaPshot技术检测叶酸利用能力相关酶基因的试剂盒及方法，其原理是：多重PCR扩增目的区域后，经寡核苷酸引物延伸标记扩增，突变位点匹配上一个荧光标记的双脱氧核苷酸后终止延伸。然后通过毛细管电泳进行片段分析，相当于单个位点的微测序，可以检测单核苷酸的突变。延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，根据峰的颜色可以清楚方便的判断为野生型(正常)还是突变型；延伸引物的片段长度决定峰的位置；延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

Claims (9)

1.一种叶酸需求遗传检测试剂盒，其特征在于包括：

以CBS基因的699 C>T位点、DHFR基因的c.594+59del19位点、GST01基因的428C>A位点、MTHFD基因的1958 G>A位点、MTHFR基因的1298 A>C位点、MTHFD基因的677C>T位点、MTR基因的-186 T>G位点，905 G>A位点和2756 A>G位点、MTRR基因的c.56+781A＞C位点和66 A>G位点、NFE2L2基因的ins1+11108 C>T位点、NOS3基因的894 G>T位点、RFC1基因的80 G>A、TCN2基因776 C>G和TYMS基因1494del6等十六个基因突变位点为检测对象而设计的PCR扩增引物和延伸引物，其中，

所述检测CBS基因的699 C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示，

所述检测DHFR基因c.594+59del19位点的扩增引物序列如SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示，

所述检测GST01基因的428 C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No.5与SEQ ID No.6所示，

所述检测MTHFD基因1958 G>A位点的扩增引物序列如SEQ ID No.7与SEQ ID No.8所示，

所述检测MTHFR基因1298 A>C位点的扩增引物序列如SEQ ID No.9与SEQ ID No.10所示，

所述检测MTHFD基因677 C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No.11与SEQ ID No.12所示，

所述检测MTR基因2756 A>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No.13与SEQ ID No.14所示，

所述检测MTR基因的-186 T>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No.15与SEQ ID No.16所示，

所述检测MTR基因的905 G>A位点的扩增引物序列如SEQ ID No.17与SEQ ID No.18所示，

所述检测MTRR基因66 A>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No.19与SEQ ID No.20所示，

所述检测MTRR基因c.56+781 A＞C位点的扩增引物序列如SEQ ID No.21与SEQ IDNo.22所示，

所述检测NFE2L2基因ins1+11108 C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No.23与SEQ IDNo.24所示，

所述检测NOS3基因的894 G>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No.25与SEQ ID No.26所示，

所述检测RFC1基因80G>A位点的扩增引物序列如SEQ ID No.27与SEQ ID No.28所示，

所述检测TCN2基因776C>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No.29与SEQ ID No.30所示，

所述检测TYMS基因1494del6位点的扩增引物序列如SEQ ID No.31与SEQ ID No.32所示，

以及，PCR反应试剂，包括聚合酶及缓冲溶液。

2.根据权利要求1所述叶酸需求遗传检测试剂盒，其特征在于所述PCR反应试剂包括dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg²⁺离子与FastTaq酶。

3.根据权利要求1-2中任一所述叶酸需求遗传检测试剂盒，其特征在于还包括主要由SAP酶、Exon I酶与配套缓冲液组成的纯化试剂。

4.根据权利要求1-2中任一所述叶酸需求遗传检测试剂盒，其特征在于还包括SNaPshotMix混合液。

5.根据权利要求1-2中任一项所述的叶酸需求遗传检测试剂盒，其特征在于还包括单个位点纯合、杂合突变的阳性对照标本和/或阴性对照标本。

6.根据权利要求1-2中任一所述叶酸需求遗传检测试剂盒，其特征在于：以CBS基因的699 C>T位点、DHFR基因的c.594+59del19位点、GST01基因的428C>A位点、MTHFD基因的1958 G>A位点、MTHFR基因的1298 A>C位点、MTHFD基因的677 C>T位点、MTR基因的-186 T>G位点，905 G>A位点和2756 A>G位点、MTRR基因的c.56+781 A＞C位点和66 A>G位点、NFE2L2基因的ins1+11108 C>T位点、NOS3基因的894 G>T位点、RFC1基因的80 G>A、TCN2基因776 C>G和TYMS基因1494del6等十六个基因突变位点为检测对象而设计的延伸引物分别如SEQ ID No.33～SEQ ID No.48所示。

7.权利要求1-6中任一所述试剂盒在中国人群的叶酸利用能力基因突变筛选中的应用。

8.一种叶酸利用能力基因突变筛选方法，其特征在于包括：

(1)提供权利要求1-6中任一项所述叶酸需求遗传检测试剂盒，

(2)以所述扩增引物对叶酸代谢基因进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；

(3)以所述延伸引物针对步骤(2)所获纯化产物进行延伸标记反应和二次纯化；

(4)对步骤(3)所获二次纯化产物进行毛细管电泳，并对毛细管电泳结果进行数据采集和分析，获得筛查结果。

9.一种检测系统，其特征在于包含权利要求1-6中任一所述的试剂盒。