CN102676642A

CN102676642A - 一种基于液相芯片的多靶点定量核酸检测方法

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Publication number: CN102676642A
Application number: CN201110064169XA
Authority: CN
Inventors: 姬云
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-03-17
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明涉及了一种基于液相芯片技术的多重寡核苷酸连接检测反应进行多靶点定量核酸检测的方法，具体步骤包括1)选取待测核酸样本，2)设计MOLD探针，3)MOLD探针的杂交连接，4)PCR扩增，5)液相芯片检测。此方法的灵敏度高，速度快，可用于多重检测样本基因型、DNA甲基化、拷贝数变异、染色体非整倍性异常和基因表达。

Description

一种基于液相芯片的多靶点定量核酸检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种核酸检测方法，尤其涉及了一种基于液相芯片技术的多重寡核苷酸连接检测反应进行多靶点定量核酸检测的方法。此方法可用于样本基因型、DNA甲基化、拷贝数变异、染色体非整倍性异常和基因表达检测。

背景技术

1.基因分型

基因在染色体上的位置称为座位，每个基因都有自己特定的座位。凡是在同源染色体上占据相同座位的基因都称为等位基因。在自然群体中往往有一种占多数的(因此常被视为正常的)等位基因，称为野生型基因；同一座位上的其他等位基因一般都直接或间接地由野生型基因通过突变产生，由于DNA分子中的特点位点发生碱基对的增添、缺失或改变，而引起的基因结构的改变，相对于野生型基因，称它们为突变型基因。在二倍体的细胞或个体内有两个同源染色体，所以每一个座位上有两个等位基因。如果这两个等位基因是相同的，那么就这个基因座位来讲，这种细胞或个体称为纯合体；如果这两个等位基因是不同的，就称为杂合体。在杂合体中，两个不同的等位基因往往只表现一个基因的性状，这个基因称为显性基因，另一个基因则称为隐性基因。由于基因突变通常发生在DNA复制时期，即细胞分裂间期，包括有丝分裂间期和减数分裂间期；同时基因突变和脱氧核糖核酸的复制、DNA损伤修复、癌变和衰老都有关系，基因突变也是生物进化的重要因素之一，通过检测样本的基因型，实现基因分型，除了本身的理论意义以外，对科学研究和生产活动都有广泛的实际意义。

2.DNA甲基化

DNA甲基化是表遗传学上研究最深入的一种机制，是一种酶介导的化学修饰过程。DNA甲基化后核苷酸顺序未变，而基因表达受影响。DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记以及许多人类基因病(如癌症，心血管疾病，糖尿病)发生发展都起重要的作用。

DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶(DNMT)的作用下，基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳原子共价键结合一个甲基基团。CpG二核苷酸序列在基因组中出现的比例远低于基因组中其他二核苷酸序列。但是在基因组中有一些长度约0.5-4kb的区域，这些区域CpG密度很高，称其为CpG岛。56％基因的邻近启动子区域带有CpG岛。在正常的细胞中CpG岛通常是处于非甲基化状态。但是，在癌细胞中，肿瘤相关基因启动子的这些区域发生了超甲基化，这个现象被认为是肿瘤发生过程中最为重要的表观遗传学改变。启动子的甲基化在各个类型的肿瘤的发生中都有被发现，并且和转录水平的基因异常沉默有关。

有关基因启动子异常甲基化与肿瘤发生之间的关系的研究，目前主要集中在以下4类基因：抑癌基因(包括Rb、VHL、p16^INK4a、p15^INK4b、p14^ARF、p73、BRCA1、APC、FHIT、RARB22、RASSF1A)、DNA修复基因(MGMT和hMLH1)、肿瘤分子侵袭转移相关基因(E2cadherin、DAPK、TIMP3)及代谢酶基因(GSTP1)。这些基因涉及细胞间信号转导、细胞周期调控、凋亡、DNA损伤修复及肿瘤的侵袭转移等过程。几乎所有的人类肿瘤中都存在肿瘤相关基因的异常甲基化。

2001年M.Esteller等人对涵盖了肺癌，乳腺癌，结肠癌等15种癌症的600个肿瘤标本进行分析，发现12个重要的肿瘤相关基因的启动子在癌组织中发生了甲基化模式的改变[1]。结果显示，每一类型的肿瘤中都同时存在着多种肿瘤相关基因的异常甲基化，而且不同部位的肿瘤组织中，各种基因的甲基化发生频率是不同的，存在着明显的基因——肿瘤类型相关性。胃肠道肿瘤(如结肠癌、胃癌等)中p16^IN K4a、p14^ARF、MGMT、APC和hMLH1基因的甲基化比率较高；呼吸系统肿瘤(肺癌、头颈部癌)中p16^INK4a、DAPK、MGMT基因的甲基化较常见；乳腺癌、卵巢癌中p16^INK4a、GSTP1、BRCA1、CDH1等基因启动子异常甲基化较为频繁；而恶性血液系统疾病中基因异常甲基化的情况与其它实体瘤明显不同，这些肿瘤中p73、p15的异常甲基化频繁，这两种基因的异常甲基化在其他肿瘤中则很少见。肿瘤组织中这些基因的启动子超甲基化而关闭表达，从而导致了细胞中多个关键的调控通路发生功能紊乱。因此，显而易见的，研究肿瘤细胞异常的表观遗传谱和弄清遗传图谱一样，能够深化对于不同类型肿瘤的发生及发展过程的理解，并且能够用作鉴别肿瘤类型和亚型的辅助手段[2]。

3.拷贝数变异

拷贝数变异(copy number variation，CNV)是指基因组上长度超过1kb的DNA片断，在不同个体间存在拷贝数的差异。产生的机制主要有非等位基因同源重组(Nonallelic homologous recombination，NAHR)和非同源末端连接(nonhomologous end joining，NHEJ)，以NAHR更为常见。这种差异可以表现为拷贝数的增加(insertions和duplications)或减少(deletions和nullgenotypes)。在群体中频率超过1％的CNVs被称谓拷贝数多态性(copy number polymorp hisms)。

2004年美国冷泉港实验室和瑞士洛桑大学的两个研究小组在《自然》和《科学》几乎同时发表论文，报道了人体内拷贝数变异现象的存在。此后，其他研究小组的跟进研究进一步确认了拷贝数变异的存在。CNVs在人类基因组中的分布非常普遍，可影响基因组中超过10％的序列。然而受限于检测手段，这类遗传变异直到最近两年才为研究者所重视，并迅速成为当前人类遗传学研究的热点。不少研究发现，CNVs与不少疾病的发生密切相关，如Di George、Smith-Magenis、Williams-Beuren、HIV病毒易感性、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣相关、肾小球肾炎、Parkinson症、Alzheimer症、精神分裂症等。2008年《科学》和《自然》杂志分别报道了美国和欧洲两项大规模精神分裂症的调查研究，研究者从拷贝数变异上找到了致病的蛛丝马迹。前者由美国国际精神分裂症协会主持开展，3400名分裂症患者和3200名健康人参与了调查。结果显示，某些特定基因的拷贝数突变导致神经分裂的发病几率提高1.15倍。后者由冰岛雷克雅未克的deCODE Genetics生物制药公司和欧洲SGENE协会(由欧洲、美国及中国的18家研究机构组成)共同执行，纳入研究的包括4700名精神分裂症患者及41200名健康人，研究同样表明拷贝数变异的决定因素。

目前CNVs检测的主要采用比较基因组杂交(comparative genomichybridization，CGH)技术，常用的CGH芯片主要有Oligo、Clone array等。检测过程主要如下：将样品及参照样品基因组DNA进行处理，并标记上不同的荧光基团，混合均匀后与微阵列芯片上DNA探针进行杂交。基因组DNA拷贝数量即与杂交后芯片上样品与参照样品荧光强度比值有关，如果样品的基因组某DNA片段拷贝数减少，则该序列位置处样品荧光要弱于参照样品的荧光，反之则强于后者，这样就可以直观地得到基因组DNA发生变异的位点信息及拷贝数量变化信息。其它用于CNVs检测的技术还有荧光定量PCR技术(一个反应只能测定一个CNVs，需要多个重复)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、直接测序(可以检测insertions、Rearrangement breakpoint)、配对端点测序(pairedend sequencing)等。

目前，CNVs检测的技术平台都有一定的局限性：①采用SNP芯片用于CNVs检测时应注意，常见的CNVs会导致SNPs不符合H-W平衡及Mendelian遗传，为了保证SNPs数据的质量，商业化的SNP芯片就会避开这些位于CNVs的SNPs，这样就不能覆盖部分CNVRs；另外，SNP芯片利于区分等位基因，而不利于拷贝数目的检测。②对多等位基因型的CNVs检测结果不理想，因为随着等位基因型的增加，不同拷贝数之间的信号差异变得越来越小。如携带1个拷贝的个体与携带2个拷贝的个体相比，其信号比为1∶2，而携带5个拷贝和6个拷贝的个体，其信号间的比值为5∶6。③Oligo array若要准确测定CNVs的片段大小，则需要有密度足够高的探针，Clone array则易于高估CNVs的片段大小[3]。④现有技术多不能检测平衡重组(balanced rearrangement)，如倒位(inversion)和易位(translocation)等，无法确定重排断裂位点(rearrangement breakpoints)，这不利于对CNVs的功能分析、进化和群体遗传学研究。⑤CNVs的鉴定是通过比较CNVs和标准参照基因之间检测信号的相对比值而实现的，但目前仍没有理想的标准参照基因。缺乏标准参照DNA往往使低拷贝数CNVs的鉴定复杂化，很难通过简单的实验鉴别出究竟是检测样品中出现了缺失CNVs或是参照样品中存在重复CNVs。

4.染色体非整倍性异常

染色体疾病是人类遗传性疾病中的一大类，是由于整条染色体或部分染色体的增加或缺失引起染色体异常所致。因为染色体是基因的载体，一条染色体上可以有成千上万个遗传基因，所以失去或获得整条染色体一般难以存活，是自然流产或夭折的主要原因。同时染色体异常不仅导致胎儿自发流产和儿童夭折频率明显升高，而且发生染色体异常最常见的临床后果还表现为患者出现生长发育迟缓、大多为严重的智力低下以及身体先天性畸形等异常特征。染色体异常(Chromosome Abnormalities)可分成染色体数目异常和染色体结构异常两类。染色体数目异常是指正常细胞内整个染色体组或整条染色体的增多或减少。而染色体结构异常是指部分染色体重复或缺失、染色体内倒位、环状染色体或等臂染色体形成以及染色体间插入、易位或交换等引起的染色体变异。其中，染色体数目异常比染色体结构异常更为常见。染色体数目异常又分为染色体整倍体异常和染色体非整倍体异常。染色体数目若以正常单倍体配子中所含染色体数(n，23条染色体)的整数倍形式增加或减少，则发生染色体整倍体异常。染色体数目若因为某一条染色体数目增加或减少一条或数条而变得不是整倍体，则发生染色体非整倍体异常。在人类染色体整倍体异常中只有三倍体(3n，69条染色体)和四倍体(4n，92条染色体)有过报道，但是大都发现于自发性流产的胎儿。绝大多数的多倍体是无法存活的，即使出生后仍能存活的也通常为与二倍体形成的嵌合体。而人类染色体非整倍体异常是胎儿最常见的一类染色体异常。因染色体非整倍体异常引起的流产大约占总数的1/3，至少1/50的胎儿以及大约1/300的新生儿患有染色体非整倍体异常.根据相关数据统计，主要的临床表现较严重的染色体非整倍体异常类型如表1.

表1常见的染色体非整倍体异常

染色体疾病的主要影响发生在出生前，所以染色体异常的一大临床后果为大约50％或更多的自发性流产胎儿有严重的染色体异常。另外，尽管不同的染色体异常在临床上的表现不尽相同，染色体异常的另一大临床后果还表现为出生缺陷。迄今为止，针对已经出生的患有染色体异常疾病的患者尚无有效的治疗方法。因此检查胎儿是否患有染色体异常是许多孕妇进行产前诊断或产前筛查的一个主要原因。

染色体核型分析(Karyotyping)是诊断染色体异常最为常规的方法、也是检测染色体异常的金标准。它能够准确检测出所有染色体数目异常以及染色体大片段重排和染色体大片段的插入或缺失，但是必须经过细胞培养后才能检测分析的该方法需要两周至三周的时间，而且检测不出染色体小片断的异常。因此这种细胞生物学方法既耗时又耗力。尽管三十多年来一直是染色体异常产前诊断的常规方法，却有明显的不足之处。荧光原位杂交技术则利用荧光标记的特异性探针杂交观察分裂中期染色体或间期细胞核以判断染色体数目和结构的异常。虽然不需要培养细胞，但是需要制备的探针费用昂贵，并且操作过程仍然繁琐耗时以及需要专门的技术人员，很难用于大规模的产前诊断。

另外，基于PCR技术的分子生物学诊断方法因其快速简便、易自动化等特点而迅速发展起来。荧光定量PCR是通过选取特定染色体上的短串联重复序列(sTR)标记进行PCR扩增和毛细管电泳，根据所得的产物峰的数目和面积比例区分出染色体异常患者。不过因为该方法本身存在的缺陷，即使选用两个或多个高度多态性的STR位点检测，该方法仍然存在理论上准确率不能达到100％和判读结果出现假阴性的情况。同时该方法不适合检测于染色体拷贝数缺失，因此单体型染色体非整倍体异常不适合使用荧光定量PCR检测。

5.多重连接探针扩增技术

多重寡核苷酸连接检测技术于2002年由Schouten等首先报道[6]，是近几年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测众多靶基因，目前已经应用于多个领域、多种疾病的研究，如染色体数目异常、遗传性疾病基因缺失重复、基因甲基化检测等。

多重连接探针扩增技术最大的特点是以杂交探针代替基因组DNA作为PCR扩增的模板。其中，杂交探针由两段寡核苷酸序列组成，分别称作左侧杂交探针和右侧杂交探针。如同其它类型的探针一样，左侧和右侧杂交探针均有一段序列与样本DNA完全互补以保证特异性杂交。但不同的是，左侧和右侧杂交探针分别还有一段与样本DNA无关的引物结合序列，因而只需要一对扩增引物即可同时扩增几十个杂交探针。这样不仅极大地减少引物二聚体产生，而且可以消除不同引物扩增引起的效率差异问题，从而能够高效率地同时获得40～50个靶序列信息。

多重连接探针扩增技术以其准确度高和稳定性高的特点被迅速地广泛使用，而且国际上和国内的一些医院已经开始陆续使用该技术作为常规检测方法的辅助检测技术。但MLPA技术存在两个缺点：(1).必须通过繁琐耗时的M13噬菌体克隆才能够得到反应所需的杂交探针。(2).多重连接探针扩增技术中扩增所得的几十个PCR产物需要通过毛细管电泳，依据PCR产物长度的不同从而在电泳结果中相对应的位置进行分辨。由于依赖PCR产物长度的不同才能区分，因此杂交探针的设计变得相对复杂，而且同时检测靶序列的最大重数也受到限制。

6.液相芯片技术

液相芯片是新一代的生物芯片诊断技术平台。该技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，在微球制造过程中，掺入不同比例的染色剂，从而形成不同的荧光色。然后再把针对不同检测物的核酸探针分别以共价方式吸附到不同荧光色的微球上。应用时，先把针对不同检测物的不同荧光色的微球混合，在加入被检测物。在悬液中偶联有特异性探针的微球与待测核酸样本特异性杂交，杂交仅需几十分钟，并加上荧光标记。然后，微球被微量液体传送系统排成单列通过两束激光，一束判定颗粒的颜色从而决定被测物的特异性(定性)；另一束测定微粒上的荧光标记强度从而给被测物定量，所得的数据经电脑处理后可以直接用来判断结果。该技术具有高通量，高速度、敏感性高等特点。

本发明对经典多重寡核苷酸连接检测技术进行改进，用特异性标签序列(Tag)代替M13噬菌体片段，通过化学合成法制备探针，简化了探针的设计和制备步骤。用液相芯片检测PCR扩增产物，提高了检测分辨率，单管反应减少污染，并真正实现了检测的自动化与高通量，为科研和临床应用提供广阔前景。

参考文献

[1]Esteller，M.，Corn，P.G.，Baylin，S.B.，and Herman，J.G.(2001)A genehypermethylation profile of human cancer.Cancer Res 61，3225-9.

[2]姚群峰，周宜开.(2003)基因启动子异常甲基化及其作为肿瘤生物标志物的研究进展.国外医学分子生物学分册25卷，3期，162-165

[3]Carson AR，Feuk L，Mohammed M，et al.Strategies for the detection of copynumber and other structural variants in the human genome[J].Hum Genomic，2006，2：403.

[4]Westman JA.Medical genetics for the modern clinician.Illustrated ed：Lippincott Williams&wilkins，2005：196

[5]Therman E S.Human Chromosomes：Structure，Behaviour，and Effects.3^rded：Heidelberg：Springer，1993

[6]Schouten JP，et al.Relative quantification of 40 nucleic acid sequences bymultiplex ligation-dependent probe amplification[J].Nucleic AcidsRes，2002，30(12)：e57.

发明内容

本发明目的是提供一种基于液相芯片技术的多重寡核苷酸连接检测(Multiplex Oligonucleotide Ligation Detection MOLD)反应多靶点定量检测核酸的方法。此方法的灵敏度高，速度快，可用于多重检测样本基因型、DNA甲基化、拷贝数变异、染色体非整倍性异常和基因表达。

本发明所述的基于液相芯片技术的MOLD反应的多靶点定量核酸检测方法，包括如下步骤，其检测流程如图1所示：

1)选取待测核酸样本，其中包含一段或多段的已知核苷酸序列作为检测的靶序列，每段靶序列长度至少为40bp。本发明用于基因分型或DNA甲基化检测时，靶序列须包含用于基因分型的特定突变位点或DNA甲基化位点。

2)针对待测核酸样本中每段靶序列，设计并制备一组特异性MOLD探针。MOLD探针的组数与待测核酸片段中靶序列个数一致。

i)每组MOLD探针包含左侧探针和右侧探针，其中左探针5’端包含一段上游通用引物序列，3’端包含一段与靶序列特异性杂交的序列，上游通用引物序列与靶序列杂交序列之间插入一段标签(Tag)序列。用于样本基因型或DNA甲基化检测时，左探针与靶序列特异性杂交的序列3’末端与待测的碱基突变位点或甲基化位点配对。其中右探针5’端包含一段与靶序列特异性杂交的序列，3’端包含一段下游通用引物序列。右探针5’末端带有磷酸基团修饰。

ii)同组MOLD探针的左探针3’末端和右探针5’末端与靶序列结合的位点相邻。

iii)不同组的MOLD探针，左探针5’端上游通用引物序列相同，右探针3’端下游通用引物序列相同。上游通用引物序列和下游通用引物序列和待测核酸样本不发生杂交。

iv)不同组的MOLD探针，左探针的标签(tag)序列长度基本相同，都在20-30个碱基左右，但核苷酸序列特异，作为区分不同组的MOLD探针的标识。标签(tag)序列与待测核酸样本不发生杂交。

3)在单一反应管中，待测样品与步骤1所得一组或多组MOLD探针杂交。一组左右探针，两段与靶序列特异性杂交的序列相邻地与待测序列完全互补杂交时，左探针的靶序列杂交序列的3’末端游离羟基同右探针的靶序列杂交序列的5’末端磷酸基团在连接酶的催化作用下形成磷酸二酯键，连接酶将与靶序列完全互补的一组左、右探针连接成一条完整的杂交探针。特定位点发生基因突变和DNA甲基化的待测样本，左探针3’末端与靶序列不能互补配对，连接酶无法完成连接。

4)制备一对通用引物X和Y，其中通用引物X与所有左探针5’端上游通用引物序列互补，通用引物Y与所有右探针3’端下游通用引物序列互补，通用引物Y的5’端用生物素标记。使用通用引物对X、Y，以步骤3中完成连接的探针序列为模板，进行PCR扩增反应。

5)设计一系列与MOLD探针的特异性标签(Tag)序列特异性结合的检测(Anti-tag)序列与xTAG微球表面偶联，同时为减少空间位阻效应的影响在5’端氨基和检测探针之间插入适当长度的间隔序列如图2所示。将步骤4所得PCR扩增产物与液相芯片中的xTAG微球进行杂交，杂交反应后加入链霉素亲和素-藻红蛋白进行反应，然后通过液相芯片设备检测荧光信号。利用能识别不同组MOLD探针的Tag序列的标签(anti-tag)序列，达到多重检测的目的。

其中，步骤2所述的左侧探针的上游通用引物序列和右侧探针的下游通用引物序列是与目的基因无关的。故所有的杂交探针能够共有相同的一对上下游引物序列，从而避免多对引物之间容易出现的非特异性结合以及不同引物扩增引起的扩增效率差异，有助于核酸的多重反应和定量。

其中，步骤3同时加入连接反应和PCR扩增反应的各种试剂，包括DNA连接酶、氯化镁溶液、DNA聚合酶缓冲液、DNA聚合酶、四种脱氧核糖核酸混合溶液、辅酶I(NAD+)溶液。其中DNA连接酶的最适温度为55℃，DNA聚合酶的最适温度为72℃。因此可通过调节反应温度，先激活DNA连接酶进行探针连接反应，再激活DNA聚合酶进行PCR扩增，即可保证先进行连接反应后进行扩增反应的目的，也做到了反应全程闭管操作，有效避免污染。

其中，步骤5所述的间隔臂可以减少空间位阻，提高杂交效率及杂交特异性，常用的间隔臂序列包括多聚dT(poly dT)、(CH2)12、(CH2)6、(CH2)18等。

本发明将多重寡核苷酸连接检测技术与液相芯片技术结合，并对经典多重寡核苷酸连接检测方法进行改进，其特点在于，将经典多重寡核苷酸连接检测的长(左)探针所含M13噬菌体片段用一段特异性标签(tag)序列代替，每个特异性标签序列的长度基本相同，都在20-30个碱基左右，这种特异性标签序列可以与液相芯片的xTAG微球上所携带的检测探针互补配对，我们将探针上的特异性标签称为Tag，而微球上携带的互补杂交探针称为Anti-Tag。首先左、右探针与靶序列杂交互补，在连接酶的作用下，连接成一条完整的寡核苷酸探针序列，然后以连接的探针为模板又一对通用引物进行PCR反应，得到PCR扩增产物后与液相芯片的微球杂交，每个探针的扩增产物携带的Tag都是唯一的，与之互补杂交的xTAG微球也是唯一的，随后通过液相芯片平台进行检测，得出结论。

本发明用于样本基因型和DNA甲基化检测时如图3所示，由于左探针3’末端碱基只能与靶序列特定突变位点的野生型完全回补，当该位点发生碱基突变和甲基化，左、右探针就无法连接成完整的探针，也不能通过通用引物X、Y进行随后的PCR扩增，也就不能通过液相芯片平台检测到对应的荧光信号，因此根据荧光信号的有无就可判断靶序列是否有特定位点突变存在，通过荧光信号强弱变化定量判断基因突变情况。

本方面用于样本拷贝数变异、染色体非整倍性异常和基因表达检测时如图4所示，当样本的待测序列拷贝数发生异常时，直接影响对应的MOLD探针的PCR扩展产物的含量，因此通过液相芯片平台检测到对应的荧光信号强度的变化就可以定量判断待测基因拷贝数变异、染色体非整倍性异常和基因表达异常。

本发明的主要优点在于：

1)本发明的检测方法在扩增产物与微球杂交之前的连接、扩增反应可以实现闭管操作，可有效避免实验室污染。

2)本发明的检测方法步骤简单，因而避免了复杂操作过程中存在的诸多不确定引物，提高了检测准确率和稳定性。

3)本发明所提供的检测方法可以多靶点定量检测核酸，而所需时间大大少于测序技术，更符合临床检测要求。

附图说明

图1MOLD探针结合液相芯片技术多靶点定量检测核酸样本的流程图

图2用于识别不同组MOLD探针的xTAG微球结构示意图

图3本发明用于检测样本基因型、甲基化时探针杂交连接示意图

图4本发明用于检测样本拷贝数变异、染色体非整倍性异常和基因表达时探针杂交连接示意图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：检测样本基因型、甲基化

1)用常规方法从组织及各类体液提取获得DNA样本；

2)根据靶序列设计多重寡核苷酸探针；

每组多重寡核苷酸探针由左侧探针和右侧探针组成。按照从5’端到3’端的方向，左侧探针依次包含上游通用引物序列、标签(Tag)序列和靶序列杂交序列；右侧探针依次包含靶序列杂交序列和下游通用引物结合序列。其中，左探针的靶序列杂交序列的3’末端与野生型待测样本的突变位点互补配对，右探针的5’端带有磷酸基团修饰。

3)多重寡核苷酸探针的杂交连接和PCR扩增；

将适量的DNA连接酶、寡核苷酸探针对(包括左侧探针和右侧探针)、氯化镁溶液、DNA聚合酶、DNA聚合酶反应缓冲液、脱氧核糖核酸混合溶液、辅酶I(NAD+)溶液、正向通用引物和生物素标记的反向通用引物混合均匀，加入适量的样本DNA，加水至10-20微升。

连接-PCR反应条件如下：94℃反应1-3分钟，连接反应进行30个循环：50℃反应20-40秒，94℃反应20-30秒；随后进行45个循环的PCR扩增：94℃反应10-30秒，适当的退货温度反应10-30秒，72℃延伸20秒。反应结束后维持在4℃条件下。

4)PCR产物与杂交xTAG微球，液相芯片检测；

带有检测(Anti-Tag)序列的微球充分混匀后，将微球溶液稀释，稀释液包含了一定量的微球和杂交缓冲液，适量微球溶液与步骤2中的PCR产物混合均匀，进行如下杂交反应：94℃反应1分钟，随后缓慢降温至25℃，降温速率保持在5℃/分钟。反应结束后保持在4℃环境。

用液相芯片仪检测杂交后的微球。如果检测的靶序列发生点突变，那么长、短探针就无法连接，也不能通过通用引物进行随后的PCR扩增，也就不能通过液相芯片平台检测到对应的荧光信号，因此根据荧光信号的改变就可判断靶序列是否有突变，并据区分样本的基因型(包括野生型、杂合突变型和纯合突变型)。

实施例二：检测样本拷贝数变异、染色体非整倍性异常和基因表达

1)用常规方法从组织及各类体液提取获得DNA样本；

2)根据靶序列设计多重寡核苷酸探针；

每组多重寡核苷酸探针由左侧探针和右侧探针组成。按照从5’端到3’端的方向，左侧探针依次包含上游通用引物序列、标签(Tag)序列和靶序列杂交序列；右侧探针依次包含靶序列杂交序列和下游通用引物结合序列。其中，左、右探针的靶序列杂交序列与特定的待测靶序列杂交，右侧探针的5’端带有磷酸基团修饰。

3)多重寡核苷酸探针的杂交连接和PCR扩增；

4)PCR产物与杂交xTAG微球，液相芯片检测；

用液相芯片仪检测杂交后的微球。如果检测的靶序列拷贝数发生，连接形成的杂交探针和PCR扩增产物数量也会发生对应变化，通过液相芯片平台就能检测到对应的荧光信号的变化，因此根据荧光信号的强弱变化就可判断样本的基因拷贝数是否发生变化，并对拷贝数进行定量。

Claims

1.一种基于液相芯片技术的多重寡核苷酸连接检测反应多靶点定量检测核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)选取待测核酸样本；

2)根据待测核酸样本中的靶序列，设计并制备一组或多组特异性MOLD探针；

3)待测核酸样本与MOLD探针杂交，连接酶将与靶序列完全互补的一组左探针和右探针连接成一条完整的杂交探针；

4)用一对通用引物X、Y，聚合酶以完成连接的杂交探针序列为模板，进行PCR扩增反应；

5)用液相芯片中的xTAG微球与PCR扩增产物进行杂交，杂交后加入链霉素亲和素-藻红蛋白进行反应，然后通过液相芯片设备检测荧光信号。

2.根据权利要求1所述的一种基于液相芯片技术的多重寡核苷酸连接检测反应多靶点定量检测核酸的方法，其特征在于所述的MOLD探针的组数与待测核酸样本中靶序列个数一致，每组MOLD探针包含左探针和右探针，其左探针5’端包含一段上游通用引物序列，3’端包含一段与靶序列特异性杂交的序列，上游通用引物序列与靶序列杂交序列之间插入一段标签序列。其右探针5’端包含一段与靶序列特异性杂交的序列，3’端包含一段下游通用引物序列。右探针5’末端带有磷酸基团修饰。

3.根据权利要求1所述的一种基于液相芯片技术的多重寡核苷酸连接检测反应多靶点定量检测核酸的方法，其特征在于所述的一组MOLD探针左探针3’末端和右探针5’末端与靶序列结合的位点相邻。

4.根据权利要求1所述的一种基于液相芯片技术的多重寡核苷酸连接检测反应多靶点定量检测核酸的方法，其特征在于所述的MOLD探针，其左探针包含一段标签序列，标签序列长度基本相同，都在20-30个碱基左右，不同组的MOLD探针的标签序列特异。

5.根据权利要求1所述的一种基于液相芯片技术的多重寡核苷酸连接检测反应多靶点定量检测核酸的方法，其特征在于连接酶在低温下就具有催化活性的，而聚合酶需要高温才可发挥催化活性。

6.根据权利要求1所述的一种基于液相芯片技术的多重寡核苷酸连接检测反应多靶点定量检测核酸的方法，其特征在于用于PCR扩增的通用引物X与左探针5’端上游通用引物序列互补，通用引物Y与右探针3’端下游通用引物序列互补，通用引物Y的5’端用生物素标记。