CN102286629B - 一种遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片 - Google Patents
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Abstract
一种遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片，该基因诊断芯片共有96个突变点序列，包含AD-HSP44个，AR-HSP36个，X-linked-HSP16个，其中SPG3A7个，SPG420个，SPG61个，SPG81个，SPG105个，SPG314个，SPG421个，SPG55个，SPG76个，SPG1121个，SPG154个，SPG175个，SPG112个，SPG24个。其检测步骤包括：制作SUD板；沉淀SUD板；重悬SUD板；制作ASE板；加MEL；PCR前期工作；PCR产物的结合；芯片前样品准备；芯片杂交；清洗芯片；芯片扫描及数据读取；数据分析。本发明之遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片，耗资少，能方便、快速进行筛查。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因诊断芯片，尤其是涉及一种遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片。
背景技术
遗传性痉挛性截瘫（hereditary spastic paraplegia, HSP或SPG），又名家族性Strümpell-Lorrain痉挛性截瘫，是一类主要由皮质脊髓束受损所引起的遗传性神经退行性疾病，具有明显的临床及遗传异质性。HSP可呈常染色体显性遗传(autosomal dominant hereditary spastic paraplegia, AD-HSP)、常染色体隐性遗传(autosomal recessive hereditary spastic paraplegia, AR-HSP)、X连锁遗传(X-linked hereditary spastic paraplegia, X-linked HSP)，某些病例呈散发。
研究表明：遗传性痉挛性截瘫是单个基因的病理性突变而引起的疾病。这是一组遗传异质性很强的疾病，可由不同基因的不同突变引起。因此，找寻及鉴定本病的致病基因及其突变类型不仅是了解、阐明本病发病的必须途径，同时也是建立本病的基因诊断和产前诊断的先决条件。在已了解本病的致病基因及其突变类型之后，可以建立起基于这一基因及其突变类型的诊断技术，以期对临床上可疑的患者进行确凿的基因水平的诊断，还可以通过羊水及脐血的检测，判断胎儿是否携带有这一基因的突变，从而预测胎儿出生后是否会患有这一疾病，并将这一信息提供给孕妇及其家人，从而决定继续或终止妊娠。
由于基因的突变是本病发生的原因，从长远看，对突变的鉴定使我们有可能使用纠正突变的基因疗法或其他针对这一突变的生物学效应的方法去治疗本病。迄今为止，AD-HSP已定位17种基因亚型，AR-HSP已定位21种基因亚型。其突变类型包括：点突变、插入突变、重排突变、缺失突变等多种类型，而点突变占有很重要的地位。
由于遗传性痉挛性截瘫的临床及遗传高度异质性，给基因检测带来巨大困难，且需要耗费相当大的人力和物力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种耗资少，能方便、快速进行筛查的遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片。
本发明解决所述技术问题所采用的技术方案是：
本发明之遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片共有96个突变点序列，包含SPG3A 7个，SPG4 20个，SPG6 1个，SPG8 1个，SPG10 5个，SPG31 4个，SPG42 1个，SPG5 5个，SPG7 6个， SPG11 21个，SPG15 4个，SPG17 5个， SPG1 12个， SPG2 4个。
本发明之遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片96个突变点序列的设计步骤：（1）利用pubmed数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）和万方数据库（http://www.wanfangdata.com.cn）在线查阅遗传性痉挛性截瘫疾病基因相关文献，检索词分别为“hereditary spastic paraplegia OR SPG”和“痉挛性截瘫 OR HSP OR SPG”，选择HSP各基因型中已报导的点突变（错义突变或剪切位点突变）位点，UCSC Genome Bioinformatics网站（http://genome.ucsc.edu）在线查询相应序列，突变点上下游各包含60个碱基，突变位点等位基因用“/”分开（TAG[T/G]ACG），将每个位点编号，输入序列、染色体定位信息，以EXCEL文档保存；（2）将初步选定的点突变位点的序列文档，用芯片设计软件（Asaay Design Tool, ADT）进行评分，得到评分文件，包含设计成功率、最小等位基因频率（minor allele frequencies. MAFs）；（3）合分析各位点评分结果，除去错误序列，选择设计成功率评分大于0.5的位点，进入下一步分析；（3）选择热点突变，选择的突变点，确保两序列之间距离大于60bp，突变点上下游各包含60bp，以避免交叉，影响芯片质量，最终确定96个突变点序列；（4）将SNPs资料交由Illumina公司制备成HSP GoldenGate Universal-32 BeadChips 基因诊断芯片。
本发明之遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片是在光纤微珠上固定能与突变点杂交的探针。
本发明之遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片，耗资少，能方便、快速的进行筛查，由于有多位点，可以有效地减少因个体差异所引起的漏检。
附图说明
图1为 SPG3A 基因c.306C>A突变位点的基因分型示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例
本发明之遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片共有96个突变点序列，包含AD-HSP 44个，AR-HSP 36个，X-linked-HSP 16个，其中SPG3A 7个，SPG4 20个，SPG6 1个，SPG8 1个，SPG10 5个，SPG31 4个，SPG42 1个，SPG5 5个，SPG7 6个， SPG11 21个，SPG15 4个，SPG17 5个， SPG1 12个， SPG2 4个。
本发明之遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片是在光纤微珠上固定能与突变点杂交的探针，所述探针的序列表为：
| 编号 | 序列 |
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| 94 | tcaggggccccgcagcacaatcgagaagaaaggttccagggtgaccttcacgtgccaggcytcctttgacccctccttgcagcccagcatcacctggcgtggggacggtcgagacctccag |
| 95 | tcagtatttctctccattccctcccttgctgcctgcctggatttctcagatgaaggacacmatggtaagttggggaggggtgagagtgtttcccagaaggccaaggagaagggtaaggagg |
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检测步骤包括：制作SUD板；沉淀SUD板；重悬SUD板；制作ASE板；加MEL；PCR前期工作；PCR产物的结合；芯片前样品准备；芯片杂交；清洗芯片；芯片扫描及数据读取；数据分析。
具体操作方法如下：
第一天：
【1】制作SUD板
1.取一个0.2ml 96孔裙边板,标记为SUD 板，每孔加5μl MS1工作液；
2.每孔加5μl 浓度为50ng/μl的DNA模板；
3.盖热盖5秒,盖住96孔SUD 板；
4.SUD 板250×g，离心1分钟；
5.2300rpm震荡，20秒，250×g，离心1分钟；
6.将 SUD 板放入加热箱，95℃，30分钟；
7.取出SUD 板，250×g 离心1分钟。
【2】沉淀SUD板
1.轻轻去掉热盖。
2.每孔加5μl PS1至SUD 板，盖透明膜。
3.250×g 离心1分钟，2300rpm震荡20秒，直到溶液均呈蓝色。
4.去掉透明膜，加15μl 异丙醇至每孔。
5.盖透明膜，1600rpm震荡20秒，离心3000×g，20分钟，离心后底部应有的蓝色沉淀。
6.去掉透明膜，倒掉上清，倒置在吸水纸上，吸收过多的上清液，8g倒置离心1分钟。
7.SUD 板正置室温干燥15 分钟。
【3】重悬SUD板
1.每孔加10μlRS1,溶解DNA沉淀。
2.盖上透明膜，250×g 离心1分钟。
3.2300rpm震荡1min，直至所有沉淀完全被溶解。
【4】制作ASE板
1.SUD 板250×g 离心1分钟。
2.取新的0.2ml96孔裙边板（ASE板），每孔加OPA10μl，OB1 30μl。
3.小心去掉SUD 板的透明膜，从SUD 板中每孔取出10μl 加入至ASE 板。
4.ASE 板盖热盖3秒，离心250×g，1分钟。
5.震荡ASE 板 1600rpm，1分钟，直到所有的磁珠完全重悬。
6.将封膜的ASE 板 放入70℃的加热箱，调为30℃，至少2小时，不超过16小时。
第二天
【5】加MEL
1.从加热箱中取出ASE 板 250×g 离心1分钟。
2.将ASE 板放在磁板上，2分钟。
3.用移液枪去上清50μl，操作不宜太久，磁珠易干，难震起来。
4.加50μl Am1至每孔，盖透明膜。
5.1600rpm 震荡20秒，至磁珠完全震起来。
6.将ASE 板放磁板上2分钟，直到磁珠完全靠在两边。
7.去上清50μl，加50μl AM1至每孔，盖透明膜。
8.1600rpm震荡，20秒，至磁珠完全震起来。
9.将ASE 板放在磁板上，2分钟，去上清50μl。
10.加AM1 50μl至每孔，盖膜。
11.1600rpm 震荡20秒，直到把所有磁珠全部震起来为止。
12.将ASE 板放在磁板上，2分钟，去上清50μl。
13.将ASE 板从磁板上取出，加UB1 50μl 至每孔。
14.ASE 板放在磁板上，2分钟，去上清50μl。
15.将ASE 板从磁板上取出，加UB1 50μl 至每孔。
16.ASE 板放在磁板上，2分钟，去上清50μl。
17.将ASE 板从磁板上取出，在ASE 板 中加MEL 37μl，盖透明膜。
18.1600rpm 震荡1分钟，至磁珠全部震匀。
19.将ASE 板放在45℃加热箱中，15分钟。
【6】PCR前期工作
1.将一个新的裙边板编为PCR板。
2.MMP管中加64μlDNA聚合。
3.颠倒试管多次，混合溶液，将其倒入一个可放试剂的容器中。
4.PCR板中，每孔加混合溶液30μl。
5.盖上透明膜，250×g 离心1分钟。
6.将PCR板置于避光区。
7.将从加热箱中取出ASE 板，放在磁板上，去掉透明膜，去上清。
8.把ASE 板从磁板上取下，加50μl UB1至每孔。
9.把ASE 板放在磁板上，约2分钟，去上清50μl。
10.每孔加35μl IP1，盖膜，1800rpm 震荡，1分钟,95℃加热箱中，1分钟。
11.取出ASE 板，置磁板上2分钟。
12.从ASE 板各取30μl上清液至PCR板，盖膜，置PCR仪上做PCR，总体积60μl。
PCR反应程序：
【7】PCR产物的结合
1.从PCR仪上取下PCR板，250×g 离心1分钟。
2.取20μl MPB至每孔，调移液枪至85μl，上下打匀，将缓冲液与模板充分混匀。
3.每孔各取70μl 加入至过滤板中，过滤板下面套一个96孔板，盖膜，避光，室温孵育60分钟。
【8】芯片前样品准备
1.1000×g离心5分钟，25℃，在96孔过滤板中每孔加50μl UB2，盖盖子。
2.1000×g离心5分钟，25℃，在96孔过滤板下换一个新的96孔板。
3.在新的96孔板中，每孔各加30μl MH1。
4.在96孔过滤板中每孔各加30μl 0.1N NaOH，洗脱DNA。
5.1000×g 离心5min，25℃。
6.离心后的过滤下来的液体前后、左右平行轻摇混匀
7.盖膜，避光，准备芯片上样。
【9】芯片杂交
1. 将96孔过滤板过滤下来的样品每个取15μl 加入芯片。
2. 上好样的芯片放入杂交盒置60℃，30分钟。
3. 30分钟后调为45℃，至少放置16小时，不能超过18小时。
第三天
【10】清洗芯片
1.将芯片从杂交盒中取出后置PB1中，抽提10次。
2.提完后放在另一个PB1中，浸泡5分钟。
3.放入XC4中上下提10次，浸泡5分钟。
4.干燥0.68bar，50-55分钟。
【11】芯片扫描及数据读取
通过激光共聚焦微珠芯片扫描仪用Illumina BeadScan软件进行芯片扫描。
打开电脑，打开激光共聚焦微珠芯片扫描仪→用DMAP软件将每张芯片的Barcode文件在Illumina公司的网站上下载下来，并考入扫描用的电脑→双击打开Illumina BeadScan软件→按Edit →激光共聚焦微珠芯片扫描仪会自动打开Tray →把芯片放入激光共聚焦微珠芯片扫描仪的Tray上，用条形码识别器把芯片上的Barcode扫描→按Scan，激光共聚焦微珠芯片扫描仪开始扫描→扫描完毕按Done →关闭Illumina BeadScan软件，关闭激光共聚焦微珠芯片扫描仪，关电脑。
【12】数据分析
通过激光共聚焦微珠芯片扫描仪扫描后得到的芯片结果，用GenomeStudio软件分析。
双击打开GenomeStudio软件（电脑内存要大于2G）→按Genotyping建立新New Project→按Next→在Projects Repository处选择存储的路径，并建一个新文件的名字，按Next→点击Load sample intensities by selecting directories with intensity files, 按Next→选择.opa文件，选择需要分析的芯片编号Barcode，按Next→点击Import cluster positions from a cluster file，点击Pre-Calculate，按Finish，软件开始分析数据，得到样本基因分型的结果。每个SNP位点在cluster中独立分析，在SNP Graph界面分析每个突变位点的分型，鉴别基因型。芯片上每一个SNP位点的等位基因型被定义为“AA”、“BB”，即样本SNP位点等位基因为纯合型；“AB”为等位基因杂交型（参见图1。图中：左侧椭圆区域点表示基因型为AA，中间椭圆区域点表示基因型为AB，右侧椭圆区域点表示基因型为BB；中间椭圆区域点为样品M6501的基因分型，提示该患者该突变位点的基因分型为AB。实际实验结果为彩图，左侧椭圆区域为红色点，中间椭圆区域为紫色点，右侧椭圆区域为蓝色点）。
<110> 中南大学湘雅医院
<120>一种遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片
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ggctctgatg gtgtccttct tcacctctcc ttttaaggct tctattgtgg ctgaggccta 60
mgattttgtt ccagattggg ctgaaatttt ataccagcaa gtgattctta aaggagactt 120
t 121
<210> 18
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 18
ctaattctga ttataggtta tccagtgaat ctagcagcca atgggcatta gtggtgcagt 60
wctgcaggct acacaatatg aaactaagca tatcttacct tagagaatgt gccaaagcaa 120
a 121
<210> 19
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 19
tagggagagg ccagaacctc ccagcttaga gcccctcaga cttgtatttg cttccagctt 60
saagtctgga tagtcagaag tttgtgacag tgccctccag taatgaagtg gtaactaacc 120
t121
<210> 20
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 20
accaaagaag gttgggattt ccattctcaa ttcattctct attgtttgga gcacagtctg 60
yagcatcttc tttatgtcta ccttgactgt tacaagtgag tactgagaat gcatttgtcc 120
t 121
<210> 21
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 21
gaggaatcct tggtggccag agattggtcc cgggcccttc agctcactga agtgtacggg 60
ygagatgtgg acgatttgag cagcataaag gatgcagtcc tgagctgtgc tgtggcatgt 120
g 121
<210> 22
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 22
attgatggca atctcccctt ctctcctccc tctttcttct cctcctgatg gcattcctca 60
rtttaacagg cgtcatcatt gtcgccgctg tggccggcta gtgtgcagct cctgctccac 120
t 121
<210> 23
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 23
gtttctcttt gtaattcaga tgcagttgat gctccagtcc ctgagcacct gagccagtgt 60
yagaacctga cactctacca gggcttctgt gccatgaagt atgccatcta tgccctctgt 120
g 121
<210> 24
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 24
aaggccaagg accacctgaa gatctacctc caagaaacat cccgcagctc tggaaggaag 60
waaaccacat tcttcagaaa gaagatgact gcagctgatg tgtcaaggta gctggaggtt 120
c 121
<210> 25
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 25
ttatttgttt atttctgatt cctggtctcc ttcctccccc agaaaagcta tgttccatat 60
ygtgacagca aaatgacaag gattctccag gactctctcg ggggaaactg ccggacgact 120
a121
<210> 26
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 26
agtggaagaa gaaatatgag aaggagaagg agaagacaaa ggcccagaag gagacgattg 60
ygaagctgga ggctgagctg agccggtggc gcaatggtta gagagggata ggtgggagtg 120
a 121
<210> 27
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 27
aggggaagcc atatgttttt gaccgtgtat tccccccaaa cacgactcaa gagcaagttt 60
rtcatgcatg tgccatgcag attgtcaaag gtaatagatt tctttttaga atgtctcttc 120
t 121
<210> 28
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 28
ctgaggacct cagttctgca gggtggtgca ggtcctgttt ctcccttgct cctgcagaca 60
ygaatgaaca cagctctcgg agccacagca tcttcctcat caacatcaag caggagaaca 120
t 121
<210> 29
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 29
gtaggtcagc aagactggag cagagggagc cgtgctggac gaggcaaaga atatcaacaa 60
stcactgtca gctctgggca atgtgatctc cgcactggct gagggcactg tgagtgatcc 120
t 121
<210> 30
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 30
cctccagccg ctccggtgga tggactggaa cgccccccag gttcagtacc gcgtgcagtg 60
rcgccctcag gggacacgag ggccctggca ggagcagatt gtcagcgacc ccttcctggt 120
g 121
<210> 31
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 31
ttctgcccct gcgaggtctc ctgttcgctt gtgcaggtga cgtactggag ggagggcagt 60
yagaggaagc acagcaagag acatatccac aaagaccatg tggtggtgcc cgccaacacc 120
a 121
<210>32
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 32
gtgacgacag cctggccgat tatgggggca gcgtggatgt tcagttcaac gaggatggtt 60
ygttcattgg ccagtacagt ggcaagaagg agaaggaggc ggcagggggc aatgacagct 120
c 121
<210> 33
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 33
tggagtttcc catacgaatt ttcatatgga gccgatggtg gtgccaaatt cttggaaaaa 60
ygcctcaagg tttgttagat atttaggtgc atgaaatttc actaataatc tggaattatt 120
t 121
<210> 34
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 34
gtcagccaag aaaagtaaaa cagatgttca ttgcgtttcc tgctttcctt ttcactgaag 60
kttttgcaga tcatcccaga aagcatgttt acatctcttc taaagatcat aaagcttcag 120
a 121
<210> 35
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 35
tgcggcaagg gcctgagcgc aacggtaaca gggggccaga aggggagggg ttccagaggc 60
yaacatcaag ctcattcttt ggagcgggtg tgtcattgtt tgggaaaatg gctaggacat 120
c 121
<210> 36
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 36
tgtttgcctg ctctgctgtg cctgtgtaca tttacttcaa cacctggacc acctgccagt 60
ytattgcctt ccccagcaag acctctgcca gtataggcag tctctgtgct gatgccagaa 120
t 121
<210> 37
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 37
ttactgctgt tgcaagaaac agttcttcct ctttcatttt cctgcagttc caaatgacct 60
yccacctgtt tattgctgca tttgtggggg ctgcagctac actggtttcc ctggtgagtt 120
g 121
<210> 38
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 38
ctccgccccc ttgcctggcc cccgcccctc ccgccgccgg gccggcccct ccgcccgagt 60
ygccgcataa gcggaacctg tactatttct cctacccgct gtttgtaggc ttcgcgctgc 120
t 121
<210> 39
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 39
ggagctgttc caaaaagaaa agacccctta acacacacta gtaattcact gcctcgttca 60
waaacagtta tgaaaactgg atctgcaggc ctttcaggcc accatagagc acctagttac 120
a 121
<210> 40
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 40
gtatcgtaga actaactgag gtcttgtttc ttagtggaac agctgttaaa tttgatgata 60
wagctggtca agacttggca aaacaagcat tgcaagaaat tgttattctt ccttctctga 120
g 121
<210> 41
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 41
tgtaaactaa agtatatatt ttttagttgt tcacagggct tagagctcct gccagagggc 60
wgttactctt tggtccacct gggaatggga agacaatgct ggtaagggtt ctcttcaaat 120
t 121
<210>42
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 42
attttatgtg tataacagta taatgctttg ttttaggtgg gagaaggaga gaaattggtg 60
rgggctcttt ttgctgtggc tcgagaactt caaccttcta taatttttat aggtaagaac 120
a 121
<210> 43
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 43
ctagatgaag ttgatagcct tttgtgtgaa agaagagaag gggagcacga tgctagtaga 60
ygcctaaaaa ctgaatttct aatagaattt gatggtgtaa gtgttgatta tgatattttt 120
a 121
<210> 44
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 44
gctgtttcag ctttaaattc aaaattatat ttctaaaagt gctggatttt tttttttagg 60
ygtttcatca aacgggtata tgtgtcttta ccaaatgagg aggtatgtat ctgtgtttga 120
a 121
<210> 45
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 45
gactactttt gcttaaaaat ctgttatgta aacaaggaag t ccattgacc caaaaagaac 60
yagcacaact tgctaggtga gtaatttgga tttggtttat cttacagctt ttatttattt 120
t 121
<210> 46
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 46
atctatacaa ataatttttt attttaaagc aggacagaag gagcaagctg tggaatggta 60
waagaaaggt attgaagaac tggaaaaagg aatagctgtt atagttacag gacaaggtaa 120
g 121
<210> 47
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 47
gatggatact caggaagtga cctaacagct ttggcaaaag atgcagcact gggtcctatc 60
sgaggtaggt atacaagagc ttaaaacatt tagaactatt tattatacca ccttagaagt 120
t 121
<210> 48
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 48
ttgatcattt gtattgtcat gtgcttttta aaaatctaga tgagaaatat tcgattatct 60
sacttcactg aatccttgaa aaaaataaaa cgcagcgtca gccctcaaac tttagaagcg 120
t 121
<210> 49
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 49
gcgtcagccc tcaaacttta gaagcgtaca tacgttggaa caaggacttt ggagatacca 60
ytgtttaagg aaataccttt gtaaacctgc agaacatttt acttaaaaga ggaaacacaa 120
g 121
<210> 50
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 50
agacgccttc aagctaaaat gatgactaat ttggttatgg ccaaggaccg cttacaactt 60
staggtatca attaatgtat aatttgatgt gggatgtatt ggaaatgtgt gttcaatgaa 120
a 121
<210> 51
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 51
aaaaagaaaa gaatcattaa ttctgaaatt agactgaatg atcatttttt aatatttttc 60
rgacaagact acttttgctt aaaaatctgt tatgtaaaca aggaagtcca ttgacccaaa 120
a 121
<210>52
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 52
aattttagga atgtggacag caaccttgct aaccttataa tgaatgaaat tgtggacaag 60
kaagttttgc catctaaatg ttttatttta tagtttttat attttaattt tacttataaa 120
a 121
<210> 53
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 53
caagacttgg caaaacaagc attgcaagaa attgttattc ttccttctct gaggcctgag 60
ktaagaactt tatattatca tttttctata ataccatctg ttactgaatc catagtagta 120
g 121
<210> 54
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 54
agagctcctg ccagagggct gttactcttt ggtccacctg ggaatgggaa gacaatgctg 60
rtaagggttc tcttcaaatt tgagttttct gttgagatat ttgggataat atgaaaaaaa 120
g 121
<210> 55
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 55
gggagcacga tgctagtaga cgcctaaaaa ctgaatttct aatagaattt gatggtgtaa 60
rtgttgatta tgatattttt aatgtggcag cattttagta tattttccta ttaaatggcc 120
a 121
<210> 56
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 56
tggatttttt tttttaggcg tttcatcaaa cgggtatatg tgtctttacc aaatgaggag 60
ktatgtatct gtgtttgaat tttttttgtt ttagagcaga aacaagaact accatcttga 120
c 121
<210> 57
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 57
tggtttatcc atggtttctg gagtgaaaca gggatctggt cctgctccta ccactcataa 60
kgtattctgg gacagtaact ttaattgctg tctttttgca aatagaaaaa tttttaagat 120
a 121
<210> 58
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
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<222>
<400> 58
tatatggaaa agttattgtt tgtgacaaca acaaatttat tagtgagcta agagatgatt 60
ytttaaaatt tgatgacaag tttgcatatt tagtatccaa catacccatt gagcttctag 120
g 121
<210> 59
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
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<222>
<223>
<220>
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<222>
<400> 59
ttttttcctt gtaggagacc cggtgagcct ccattgataa aaggttggct tccttatctt 60
rgagtggtcc tgaacttacg aaaagacccc ttaaggttca tgaaaacact tcaaaagcaa 120
c 121
<210> 60
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
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<220>
<221>
<222>
<400> 60
cgttttatag aagatggtaa gaagaaaacc acctttttca aaagagggaa aaagctgaag 60
kgttacctaa tgccgtttgg aactggaacc agcaaatgtc caggccgatt ttttgcactt 120
a 121
<210> 61
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 61
ttttaagaca ggcagagaga gctagcaact ttgtggactt gaactcaaac tatttcatat 60
raaatgttaa ttttaacact attcttcctt acaggagttt agatatgatc gttttataga 120
a 121
<210>62
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 62
caagatgcaa ggatggtcag aagtttttca aagcaggcaa gatgtcctgg agaaatatta 60
wgtgcacgag gaccttgaaa taggaggtaa gaacttctga atgagcactt gcctaaaata 120
a 121
<210> 63
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
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<222>
<223>
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<222>
<400> 63
gcttacacgg cggtccccac ggtcctggta acccccctgg gcgcccttgg agtaccgttc 60
sggtgagagc caagattgtg tttggtattt aatgtgtagt gtagatataa caacttttca 120
t 121
<210> 64
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<400> 64
gagatttttg agcagcacct gaagagcctg aagctgaccc agtccagcac cttttactcc 60
yagcgtctgg cagagctgac accaggattc agtggtacgt tctcaacccg cagcctgggc 120
a 121
<210> 65
<211> 121
<212> DNA
<213> 人类
<220>
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<222>
<223>
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<222>
<400> 65
gccaaaaaga gcaagatcct gtccaaggaa gaacagaaag tggttgcgtt tcatgagtcg 60
rgccacgcct tggtgggctg gatgctggag cacacggagg ccgtgatgaa ggtgggtctt 120
g 121
<210> 66
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<212> DNA
<213> 人类
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<400> 66
cctgttcttt ctagctggca aacgcccttc tggaaaagga agtgataaac tatgaggaca 60
ytgaggctct cattggcccg ccgccccatg ggccgaagaa aatgatcgca ccgcagaggt 120
g 121
<210> 67
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<212> DNA
<213> 人类
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<400> 67
ttttttttca gagcttacaa ttgagactgc taacccctac ctttgaaggg atcaacggat 60
wgttgttgaa acaacattta gttcagaatc cagtcagact ctggcaactt ttaggtatgt 120
a 121
<210> 68
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<213> 人类
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<400> 68
gaatgcaggt tgcaaatatt gacaagtttg aagagaagct tcgagcagct gaagatgagc 60
ygaatatcga ggccaaggac aggatcccag tttcctacaa gcgaacagga ttctttggaa 120
a 121
<210> 69
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<212> DNA
<213> 人类
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<400> 69
aatgaggctg cgctgcacgc ggcgcgggag ggacacactt ccgtgcacac tctcaacttc 60
ragtacgccg tggagcgcgt cctcgcaggt acagggggcg cgccctgggt gaaggccctc 120
c 121
<210> 70
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<212> DNA
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<400> 70
tctcatttag gaccgactgt gattcctcca ccacctcact ctgctccttc cctgttgcca 60
rtgtctcgct gactaagggt ggacgtgatc gggtgagtat gggaactaga gagaggtttc 120
a 121
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cctgtgaatc aagatttggg catgttcttg gtcaccattt cctgctacac cagaggtggc 60
ygaatcatct ccacttcttc gcgttcggta agtgttggtg gcctgtctga gaaggtgtgg 120
a 121
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<212> DNA
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ttgttagtga gggaagtcag tcctggctgc tcagtagttt ttcctccaca ggttaacatc 60
ygaaaaagag acaattcccg gaaggaagtc caacgaagga tctctgctca tcagccaggt 120
a 121
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<212> DNA
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taggtagggt catggggatc tggcatgcac ctgtccccag cctctgcttc ccacccccgg 60
saggtgatgc tgcattaccg ctcagacctg ctccagatgc tggacacact ggtcttctct 120
a 121
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cagagcagaa gcagctgctg gaggtggaac tctacgcaga ctatagagag aactcggtga 60
rtgaggtgaa cgagctttat gactaggaga tagcccctcc cattagccca ggattctacc 120
t 121
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aggtcaaatg gatgatgtac tggattatat ttgcactttt caccacagca gagacattca 60
magacatctt cctttgttgg taagtactcc aggagttggg atgtttctaa ggacaatttt 120
g 121
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tttgaacctt ccagctcagt gtgcctctgt ttttcctttg acaggaaatc gatgattgtc 60
yggtccaagc aaaagaccga agttacgatg cccttgtgca cttcgggaag cggggcttga 120
a 121
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cacttcggga agcggggctt gaacgtggcc gccacagcgg ctgtgatggc tgcttccaag 60
ktactgtgct ggaagtacca caactacatg agtctcagtc cctctagtgt gccctgctca 120
t 121
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agcggcaaac acggccagcc taagatgtcc aggagtgctt ctgagagcgc tagcagctca 60
sgtaggtgtc actttacttc ccctctttcc cactccttgg gcctcgcttt cattgagaga 120
g 121
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aagcatccca ctcattttgc aaagcaaaaa tgttagctat acagaccaag ctttcttcag 60
ktttgtcttt tggcccttca gtctcaaatt actctgggcc ccgttggttg atgcggtcta 120
c 121
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atcaagttc catatcatag actttatcat tttataggaa tcagttgatt gggttggaga 60
mtacaatgaa ccattgactg gtttttcatg gagaggtgga tctgagcgag agaccacagg 120
a 121
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caggccgccc acatgctcac agataaccac ctggccccca gtgaggagta tgggctggtg 60
ktaagtagcc ccctcaaccc cagtctccat cctgtggaaa cctttgagag tagtagaaag 120
g 121
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ttgcctgctc tgctgtgcct gtgtacattt acttcaacac ctggaccacc tgccagtcta 60
ytgccttccc cagcaagacc tctgccagta taggcagtct ctgtgctgat gccagaatgt 120
a 121
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aaagcttac cctgcttgctt tttgtgtctt acttaggtgt tctcccatgg aatgctttcc 60
ytggcaaggt ttgtggctcc aaccttctg tccatctgcaa aacagctgag gtgagtgggtta 120
t 121
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aagccctcac tggcacagaa aagctaattg agacctattt ctccaaaaac taccaagact 60
rtgagtatct catcaatgtg taagtacctg ccctcccaca cagacccatc ttttttttccc 120
t 121
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ttgtgtttct acatctgcag gctgatgctg atttctaacc accccatgtc aatcatttta 60
ktttgtgggc atcacctatg ccctgaccgt tgtgtggctc ctggtgtttg cctgctctgc 120
t 121
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caataatgta ctcttcttgc ctgtaggttg cagtgttatt gatggatact cagggaacct 60
ytgatagtca gtcaactttg agagattcag ccacagtatt tgcccttagc acaatgatca 120
g 121
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aaaacttgaa aatactgatt ccttggctac ttagtcccga gagcctagat attaaagaga 60
kcaatgggaa taaaatcacc tgccggggtc tggtggagta cttcaaggta tcactctcat 120
t 121
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<400> 88
acaaaccatt tctggcccca aatgacttgc agaccaaaca cctgcaactt aaggaagaat 60
mtgtgaagct attccgaggg gtgaagaaga tgggtgggga agaatttagc cggcgttacc 120
t 121
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<212> DNA
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agttggagag tgaaatagat gaactttaca tccaatatat caagcacaat gatagcaaaa 60
mtatcttcca tgcagctcgt accccagcca cactgtttgt agtcatcttt atcacatatg 120
t 121
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<212> DNA
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agcctatgca atatgataat gggactgacc cttatcaccc tgtgcacttg ggcatatatc 60
yggtactctg gagaataccg agagctggga gctgtaatag accaggtggc tgcagctctg 120
t 121
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cccatgggcc cacctgctgc atgcacagag ctggccaaag accagaagta ccggattcag 60
ygtggcgccc tgatcctgag caacgtgcag cccagtgaca caatggtgac ccaatgtgag 120
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<212> DNA
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cagctgtggt cccaagtcct gccctgtctc ctgaggctgt tcctccccta gagctgccag 60
mcaagatcct gactgcggac aatcagacgt acatggctgt ccagggcagc actgcctacc 120
t 121
<210> 93
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caggcccgcc ctgctccctc caggctggac gaggatggga caacagtgct tcaggacgaa 60
ygcttcttcc cctatgccaa tgggaccctg ggcattcgag acctccaggc caatgacacc 120
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tcaggggccc cgcagcacaa tcgagaagaa aggttccagg gtgaccttca cgtgccaggc 60
ytcctttgac ccctccttgc agcccagcat cacctggcgt ggggacggtc gagacctcca 120
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tcagtatttc tctccattcc ctcccttgct gcctgcctgg atttctcaga tgaaggacac 60
matggtaagt tggggagggg tgagagtgtt tcccagaagg ccaaggagaa gggtaaggag 120
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ctcctcgtcc tgctcatcct ctgcttcatc aagcgcagca agggcggcaa atactcaggt 60
wgcctctgag ccccacgtga cgggggtgga gccgagggca gagaggagca cctcgcccct 120
t 121
Claims (2)
1. 一种遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片，其特征在于，遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片共有96个突变点序列，包含AD-HSP 44个，AR-HSP 36个，X-linked-HSP 16个，其中SPG3A 7个，SPG4 20个，SPG6 1个，SPG8 1个，SPG10 5个，SPG31 4个，SPG42 1个，SPG5 5个，SPG7 6个， SPG11 21个，SPG15 4个，SPG17 5个， SPG1 12个， SPG2 4个；所述96个突变点序列分别相应于SEQ ID NO：1－96的序列。
2.根据权利要求1所述的遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片，其特征在于，采用Illumina GoldenGate高通量基因芯片，检测步骤包括：制作SUD板；沉淀SUD板；重悬SUD板；制作ASE板；加MEL；PCR前期工作；PCR产物的结合；芯片前样品准备；芯片杂交；清洗芯片；芯片扫描及数据读取；数据分析。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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| CN2011102656539A CN102286629B (zh) | 2011-09-08 | 2011-09-08 | 一种遗传性痉挛性截瘫基因诊断芯片 |
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